ES2636664T3 - Microelectrodos nanoestructurados y dispositivos de biodetección que los incorporan - Google Patents

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Abstract

Dispositivo de biodetección que comprende: un sustrato; al menos un cable eléctricamente conductor sobre el sustrato; una capa aislante que recubre el cable, teniendo la capa aislante una abertura que define un espacio en el que se expone una parte del cable; y un microelectrodo nanoestructurado depositado dentro de la abertura, en el que el microelectrodo está adaptado por medio de un sistema de indicador electrocatalítico para generar una carga en respuesta a un estímulo biomolecular; en el que: el microelectrodo nanoestructurado puede presentar una sonda biomolecular en la superficie del mismo, y el microelectrodo nanoestructurado está en contacto eléctrico con la parte expuesta del cable.

Description

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Los dispositivos que comprenden NME, tal como se describen en el presente documento, pueden usarse junto con sondas apropiadas para detectar la presencia o ausencia de biomarcadores particulares en una muestra. Una “muestra” o “muestra biológica” como en el presente documento se refiere a cualquier material natural (por ejemplo 5 vegetal, animal, de algas, bacteriano o viral) o sintético que contiene ADN, ARN y/o proteínas, incluyendo, por ejemplo, muestras clínicas, tales como tejidos, cultivos celulares o fluidos aislados de un individuo (incluyendo sin limitación sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, linfa, lágrimas, orina, saliva, mucosa, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo y secciones de tejido), entorno (por ejemplo, muestras de agua, alimento o aire). Las muestras biológicas pueden procesarse adicionalmente a través de una variedad de medios, incluyendo lisis (eléctrica, mecánica y química), electroforesis, digestión enzimática. Lo más a menudo, la muestra se ha extraído de un organismo, pero el término “muestra biológica” también puede referirse a células o tejido analizados in vivo, es decir, sin extracción. Normalmente, una “muestra biológica” contendrá células, pero el término también puede referirse a material biológico no celular, tal como fracciones no celulares de sangre, saliva u orina. “Una muestra biológica” se refiere además a un medio, tal como un caldo de nutrientes o gel en el que se ha propagado un
15 organismo, que contiene componentes celulares, tales como proteínas o moléculas de ácido nucleico.
Las sondas para su uso con los presentes NME descritos pueden estar compuestas por ácidos nucleicos. Una “sonda de ácido nucleico” se refiere a un ácido nucleico (por ejemplo un ácido ribonucleico (ARN), ácido desoxirribonucleico (ADN) o un análogo de los mismos, incluyendo, por ejemplo, un ácido péptido-nucleico (PNA), que contiene una estructura principal compuesta por unidades de N-(2-aminoetil)-glicina unidas mediante péptidos en lugar de desoxirribosa o ribosa unidas mediante uniones de fosfodiesterasa, que pueden unirse a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria a través de uno o más tipos de enlaces químicos, habitualmente a través de apareamiento de bases complementarias, habitualmente a través de la formación de puentes de hidrógeno. Tal como se usa en el presente documento, una sonda de ácido nucleico puede incluir bases naturales
25 (es decir, A, G, C, o T) o estar modificada en bases (7-desazaguanosina, inosina, etc.) o en restos de azúcar. Además, las bases en una sonda pueden unirse mediante una unión distinta de un enlace fosfodiéster, siempre que no interfiera con la hibridación. Un experto en la técnica entenderá que las sondas pueden unirse a secuencias diana que carecen de complementariedad completa con la secuencia de sonda dependiendo de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Evaluando para determinar la presencia o ausencia de la sonda, puede detectarse la presencia o ausencia de la secuencia o subsecuencia seleccionada. Se describen métodos para detectar ácidos nucleicos diana usando sondas de ácido nucleico, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º 7.361.470 titulada “Electrocatalytic Nucleic Acid Hybridization Detection” y el documento US 2005/0084881 del mismo nombre.
“Hibridación” se refiere a cualquier procedimiento mediante que cual una hebra de ácido nucleico se une con una
35 hebra complementaria a través de apareamiento de bases. “Condiciones de hibridación” se refiere a condiciones convencionales a las que se usan moléculas de ácido nucleico para identificar moléculas ácido nucleico similares. Tales condiciones convencionales se dan a conocer, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989 (véanse específicamente las páginas 9.31-9.62). Además, se dan a conocer fórmulas para calcular las condiciones de hibridación y lavado apropiadas para lograr hibridación que permite grados variables de apareamiento erróneo de nucleótidos, por ejemplo, en Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284. Los ejemplos no limitativos de condiciones de hibridación incluyen condiciones de hibridación de baja rigurosidad, condiciones de hibridación de rigurosidad media y condiciones de hibridación de alta rigurosidad.
45 En otra realización, la sonda es un péptido (compuesto, por ejemplo, por 4-40 aminoácidos) o proteínas (por ejemplo anticuerpo) que puede unirse a, o interaccionar de otra manera con, una diana de biomarcador (por ejemplo receptor
o ligando) para proporcionar una indicación de la presencia del ligando o receptor en la muestra. Se describen métodos para detectar analitos usando sondas de péptido o proteína, por ejemplo en la solitud de patente internacional WO 2007/094805 (PCT/US2006/013771) titulada “Method for Electrocatalytic Protein Detection”.
Las sondas pueden incluir un grupo funcional (por ejemplo, tiol, ditiol, amina, ácido carboxílico) que facilita la unión con un NME. Las sondas también pueden contener otras características, tales como espaciadores longitudinales, regiones bicatenarias y/o monocatenarias, ligadores de poliT, dúplex bicatenarios como ligadores rígidos y espaciadores de PEG.
55 Tal como se describió anteriormente, la nanoestructura de superficie del NME puede estar controlada, y puede influir en la sensibilidad y/o eficacia de un dispositivo que tiene el NME. En el ejemplo 1, se investigó la influencia de la nanoestructura de superficie sobre la eficacia de detección para ácidos nucleicos. Se compararon dos tipos diferentes de NME, se comparó un NME nanoestructurado más finamente obtenido con un potencial de deposición bajo con uno texturizado de manera más gruesa obtenido con un potencial de deposición más alto.
Mientras que pudieron detectarse concentraciones de tan sólo 1 pM con el NME nanoestructurado más finamente obtenido con un potencial de deposición bajo, el límite de detección aumentó hasta 10 pM para el texturizado de manera más gruesa obtenido con un potencial de deposición más alto. Estos resultados demuestran que el aumento 65 de la nanoestructuración contribuye a capacidades de biodetección más sensibles en una plataforma de electrodo. Este análisis reveló que los NME estructurados más finamente mostraron mayor capacidad de respuesta a
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concentraciones sub-nM de secuencias diana.
La sensibilidad de 10 aM observada en este caso con los NME dados a conocer y el sistema de indicador electrocatalítico proporciona un límite de detección bajo para un sensor libre de marcador y PCR; el límite de
5 detección corresponde a la detección de < 100 copias de la secuencia diana. Aunque se ha logrado anteriormente la medición de 60-1000 copias de la secuencia diana con detectores electroquímicos que emplean una lectura catalítica de múltiples etapas (Munge et al., Anal. Chem. 77: 4662, Nicewamer-Pena et al., Science 294:137, Park et al., Science 295 :1503, Sinensky et al., Nat. Nano. 2: 653, Steemers et al., Nat. Biotechnol. 18:91, Xiao et al., J. Am. Chem. Soc. 129:11896, Zhang et al., Nat. Nano. 1: 214, Zhang et al., Anal. Chem. 76:4093), el dispositivo dado a conocer proporciona esta medición en una plataforma basada en chip con lectura en una sola etapa.
El ejemplo 2 describe el uso de una plataforma de electrodos multiplexados, tal como se describe en el presente documento, para leer directamente un panel de biomarcadores de cáncer en muestras relevantes clínicamente usando señales electrónicas. El sistema combina electrodos nanotexturizados con lectura catalítica rápida para
15 lograr un objetivo que viene de largo: el análisis multiplexado de biomarcadores de cáncer usando una plataforma económica y práctica.
El ejemplo 3 describe el uso de un chip basado en NME para detectar microARN, una de las dianas de detección más difíciles. La lectura electrónica de perfiles de microARN ofrece un método rápido, aunque altamente preciso, para someter a ensayo directamente muestras de ARN para determinar secuencias específicas sin la necesidad de amplificación de diana.
Aunque los ejemplos proporcionados se refieren a la detección de biomarcadores cáncer, pueden ser posibles otras aplicaciones para el dispositivo de NME, que puede implicar detectar ADN, ARN y/o proteínas. Los ejemplos 25 incluyen la obtención de perfiles de genes de cáncer de mama (por ejemplo, detectando marcadores de ARN); la obtención de perfiles de genes relacionados con leucemia (por ejemplo, detectando marcadores de ARN); la obtención de perfiles de mutaciones de citocromo P450 que afectan al metabolismo de fármacos (por ejemplo warfarina) (por ejemplo, detectando marcadores de ADN y ARN); la obtención de perfiles de mutaciones asociadas con enfermedades genéticas (por ejemplo fibrosis quística) (por ejemplo, detectando marcadores de ADN); la detección y tipaje de virus (por ejemplo VPH y VIH) (por ejemplo, detectando marcadores de ADN y ARN); la detección de proteínas relacionadas con cáncer usando un formato de inmunoensayo electroquímico (por ejemplo antígeno específico de próstata (PSA)) (por ejemplo, detectando marcadores proteicos); y la detección de microARN para identificar cáncer. Los dispositivos de biodetección que incorporan estos NME pueden adaptarse para detectar estas otras biomoléculas uniendo sondas adecuadas al NME y/o seleccionado una reacción electrocatalítica
35 adecuada que va a detectarse, tal como se conoce comúnmente en la técnica.
Un experto en la técnica entenderá que son posibles variaciones sin apartarse de la presente divulgación. Todos los ejemplos y las realizaciones descritas se proporcionan sólo con fines de ilustración y no pretenden ser limitativas.
Ejemplo 1. Parámetros para fabricar NME
En este ejemplo, se usó Pd como material de electrodo. Para investigar la dependencia del tiempo de la electrodeposición, se monitorizaron las estructuras de los NME de Pd que estaban electrodepositándose en función del tiempo. Se realizaron experimentos de electrodeposición dependiente del tiempo a -100 mV usando HCl 0,5 M
45 como electrolito de soporte. Se formaron estructuras de Pd durante (a) 25, (b) 50, (c) 125, (d) 250 y (e) 500 s. Tras 50 s, se observaron estructuras con diámetros promedio de 1,3 µm y alturas de 0,5 µm, y tras 500 s los electrodos de Pd tenían normalmente 8 µmy5 µm de diámetro y altura. Las estructuras más pequeñas producidas con tiempos de deposición más cortos presentaban normalmente depresiones en el centro de los microelectrodos, lo que puede indicar que la nucleación se produce preferentemente en el límite de la abertura.
Otro parámetro controlable que puede influir en la estructura final del NME es el potencial de deposición. Específicamente, el tamaño y la morfología de otro parámetro controlable que puede influir en la estructura final del NME es el potencial de deposición. Específicamente, el tamaño y la morfología de superficie de los NME pueden controlarse de este modo. Los fractales dendríticos son fenómenos generalmente observados en crecimiento no en 55 equilibrio tal como el crecimiento de copos de nieve, la agregación de partículas de hollín y la solidificación de metales. Tales estructuras fractales también se obtienen mediante electrodeposición no en equilibrio de metales y se usan como sistemas modelo para el estudio de procesos de ramificación y de crecimiento fractal (Fleury, Nature 1997, 390, 145-148). Generalmente se cree que la morfología de cristales depende fuertemente de la “distancia” de sus condiciones de formación con respecto al equilibrio termodinámico: condiciones cercanas al equilibrio conducen a cristales poliédricos rodeados por caras cristalinas termodinámicamente estables, pero el aumento de esta “distancia” hace que el crecimiento de los frentes de cristales con superficies planas sea inestable formando dendritas (Fukami et al. J. Phys. Chem. C 2007, 111, 1150-1160). En el caso de electrodeposición de metales, tal “distancia” puede ajustarse de manera continua y reversible simplemente cambiando el potencial de deposición y un potencial más negativo puede ejercer una fuerza impulsora superior y por tanto aumentar la “distancia” con respecto
65 al equilibrio para la electrocristalización. Por tanto, la electrodeposición puede controlarse espacial y cinéticamente para producir NME en matriz con morfologías bien definidas variadas.
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de silicio de 3” usando una capa gruesa de dióxido de silicio hecho crecer térmicamente. Se depositó una capa de oro de 350 nm sobre el chip usando evaporación de oro asistida por haz de electrones. Se creó un patrón en la película de oro usando fotolitografía convencional y un procedimiento de despegue. Se depositó una capa de 500 nm de dióxido de silicio aislante usando deposición química en fase de vapor. Se imprimieron aberturas de 500 nm
5 sobre los electrodos usando fotolitografía convencional, y se expusieron zonas de conexión de 2 mm x 2 mm usando fotolitografía convencional.
Fabricación de microelectrodos nanoestructurados. Se limpiaron los chips enjuagándolos en acetona, IPA y agua DI durante 30 s y se secaron con un flujo de nitrógeno. Se realizó toda la electrodeposición a temperatura ambiente con un potenciostato Epsilon de Bioanalytical Systems con un sistema de tres electrodos que presenta un electrodo de referencia de Ag/AgCl y un electrodo auxiliar de alambre de platino. Se usaron aberturas de 500 nm sobre los electrodos fabricados como electrodo de trabajo y se pusieron en contacto usando las zonas de conexión expuestas. Se sumergió una parte de 2 mm del chip en el baño de galvanización que contenía cloruro de paladio (II) 5 mM y ácido perclórico 0,5 M, y se incubó durante aproximadamente 5 min antes de la galvanización. Se mantuvieron las
15 zonas de conexión libres de disolución. Se fabricaron NME de Pd usando amperimetría de potencial de CC a un potencial aplicado de -100 mV durante 6 s.
Modificación de NME con sondas de PNA. Se disolvieron sondas de PNA tiolado monocatenario en una disolución tampón (pH 7) que contenía fosfato de sodio 25 mM y cloruro de sodio 25 mM a una concentración de 500 nM. Entonces se calentó la disolución a 50ºC durante 10 minutos para disolver completamente las moléculas de PNA. Entonces se añadió una cantidad adecuada de MCH 10 mM para preparar la concentración de MCH final de 100 nM. Se depositaron rápidamente 10 µl de esta mezcla sobre un chip que presentaba NME de Pd usando una micropipeta manual. Entonces se incubó este chip cubierto con la disolución de sondas de PNA en una cámara de humedad oscura durante la noche a 4ºC. Se enjuagaron vigorosamente los NME de Pd modificados con sondas con
25 la disolución tampón anterior antes de las mediciones. Para experimentos multiplexados, se usaron chips con ocho cables tratables individualmente.
Hibridación con dianas. Las disoluciones de hibridación contenían diversas concentraciones de dianas en fosfato de sodio 25 mM (pH 7,0) y NaCl 25 mM. Se incubaron los NME de Pd con 10 µl de disolución de diana a 37ºC en una cámara de humedad durante 30 min para permitir que las moléculas de sonda inmovilizadas se hibridaran con las moléculas diana. Entonces se enfrió el chip y se lavó vigorosamente con tampón antes del análisis electroquímico.
Mediciones electroquímicas. Se realizaron mediciones electroquímicas con un analizador electroquímico (BASi, West Lafayette, EE.UU.) en una disolución que contenía Ru(NH3)63+ 10 mM, Fe(CN)63-4 mM, fosfato de sodio 25
35 mM (pH 7,0) y NaCl 25 mM. Se realizó voltametría cíclica (CV) antes y después de la adición de disoluciones de diana a una velocidad de barrido de 100 mV/s. Se realizó voltametría de pulso diferencial (DPV) con un escalón de potencial de 5 mV, una amplitud de pulso de 50 mV, una anchura de pulso de 50 ms y un periodo de pulso de 100 ms. Se recogieron señales de voltametría cíclica antes y después de la hibridación con una velocidad de barrido de 100 mV/s. Se cuantificó la corriente reductora limitante (I) restando el fondo a 0 mV de la corriente catódica a -300 mV en una señal de voltametría cíclica. Se calcularon los cambios en la señal correspondientes a la hibridación de la siguiente manera: ΔI = (Ids-Iss)/Iss x 100% (ss = antes de la hibridación, ds = después de la hibridación). Se determinó el límite de detección como la primera concentración en la que la señal de la que se restó el fondo (ΔI no complementaria) era 2 veces más alta que la desviación estándar de muestra control no complementaria 10 fM.
45 Obtención de imágenes de SEM. Se empleó un instrumento de SEM HITACHI S-3400 (Hitachi High Technologies America, Inc., Pleasanton, CA) para estudiar la morfología y dimensión de los NME electrodepositados. Se fijó el chip sobre un adaptador de SEM de acero inoxidable usando cinta adhesiva de doble cara de carbono negro. Se adquirió la imagen de SEM usando el modo electrónico secundario a 20 kV.
Extracción de ARN para análisis de PCR y protocolo de amplificación. Se extrajo el ARN total de las líneas celulares con el kit mirVana (Ambion). Se evaluó la calidad de las muestras mediante análisis de RT-PCR del control endógeno RNU44 usando el ensayo de microARN TaqMan® de Applied Biosystems. Este ensayo incluye una etapa de transcripción inversa (RT) usando el kit de transcripción inversa de microARN TaqMan® (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) en el que un cebador de RT de tallo-bucle se hibrida específicamente con una molécula de mir y
55 entonces se somete a transcripción inversa con una transcriptasa inversa MultiScribe. En resumen, la mezcla de transcripción inversa incluye cebadores de RT de tallo-bucle 50 nM, 1x tampón RT, 0,25 mM de cada uno de los dNTP, transcriptasa inversa MultiScribe 3,33 U/µl e inhibidor de ARNasa 0,25 U/µl. Entonces se incubó la reacción de 7,5 µl en un termociclador 7900 de Applied Biosystems durante 30 minutos a 16ºC, 30 minutos a 42ºC, 5 minutos a 85ºC y entonces se mantuvo a 4ºC. Posteriormente se amplificaron los productos de RT con cebadores específicos de secuencia (cebador de hsa-mir-21 4373090 y cebador de hsa-mir-205 4373093 de Applied Biosystems) usando el sistema de PCR en tiempo real 7900 HT de Applied Biosystems. La mezcla de PCR de 10 µl contiene 0,67 µl producto de RT, 1x4 mezcla maestra de PCR universal TaqMan®, sonda TaqMan® 0,2 µM, cebador directo 1,5 µM y cebador inverso 0,7 µM. Se incubaron las reacciones en una placa de 384 pocillos a 95ºC durante 10 minutos seguido por 40 ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto.
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