KR20200067871A - 무증폭 dna 데이터 저장을 위한 방법, 장치 및 시스템 - Google Patents
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- G06N3/00—Computing arrangements based on biological models
- G06N3/12—Computing arrangements based on biological models using genetic models
- G06N3/123—DNA computing
Abstract
다양한 실시형태들에서, 무증폭 DNA 정보 방법들, 장치들 및 시스템들이 개시된다. 무증폭 정보 저장 및 검색 방법은 인코딩 방식 사용하여 이진과 같은 디지털 데이터를 뉴클레오티드 서열 모티프들로 인코딩하는 단계, 및 무증폭 DNA 기록 프로세스를 사용하여 복제 DNA 분자들을 합성하는 단계를 포함한다. 상기 DNA 에 저장된 정보를 디코딩하는 무증폭 프로세스는 복제 DNA 분자들 중 적어도 하나를, 센서의 측정된 전기 파라미터에서 구별가능한 신호를 생성하는 분자 전자 센서에 노출시키는 단계를 포함하며, 여기서 구별가능한 신호들은 서열 모티프들에 대응하고, 다시 디지털 데이터로의 디코딩을 제공한다.
Description
관련 출원들에 대한 상호 참조
본 출원은 "Methods, Apparatus and Systems for Amplification-Free DNA Data Storage" 라는 명칭으로 2017 년 10 월 10 일자로 출원된 미국 특허 가출원 제 62/570,458 호의 우선권 및 이익을 주장하며, 그 개시물은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
기술 분야
본 개시물은 일반적으로 전자 데이터 저장 및 검색에 관한 것으로, 보다 상세하게는 DNA 분자를 사용하여 디지털 데이터를 저장 및 검색하기 위한 무증폭 DNA 정보 저장 및 검색 시스템에 관한 것이다.
20 세기 디지털 컴퓨팅의 출현은 다량의 디지털 또는 이진 데이터의 아카이브 저장 (archival storage) 에 대한 요구를 생성하였다. 아카이브 저장은 데이터를 긴 시간 기간들, 예컨대, 수 년, 수십 년 또는 그 이상 동안, 매우 낮은 비용으로, 그리고 데이터에 재액세스할 필요가 거의 없는 방법으로, 보관하기 위한 것이다. 아카이브 저장 시스템은 무제한적인 양의 데이터를 매우 낮은 비용으로, 예컨대 긴 시간 기간들 동안 휴면 상태를 유지할 수 있는 물리적인 저장 매체를 통해서 유지하는 능력을 특징으로 할 수도 있지만, 이러한 시스템에서의 데이터 기록 및 복구는 상대적으로 느리거나 또는 아니면 고가의 프로세스들일 수 있다. 현재까지 개발된 아카이브 디지털 데이터 저장의 지배적인 형태들은 자기 테이프, 및, 최근에는, 컴팩트 광학 디스크 (CD) 를 포함한다. 그러나, 데이터 생산이 증가함에 따라, 휠씬 더 높은 밀도, 저 비용, 및 더 길게 지속되는 아카이브 디지털 데이터 저장 시스템들에 대한 요구가 있다.
생물학에서, 생물 (living organism) 의 게놈 DNA 가 디지털 정보 아카이브 저장의 형태로서 기능하는 것으로 관찰되었다. 수천 내지 수백만 년 동안 연장될 수도 있는, 종의 존재의 시간 척도에서, 게놈 DNA 는 사실상 종을 정의하는 유전 생물학적 정보를 저장한다. 종의 생물학, 생식 및 생존에서 구현되는 복잡한 효소적, 생화학 프로세스들은 이 정보 아카이브를 기록, 판독 및 유지하는 수단을 제공한다. 이 관찰은 아마도 DNA 의 기본적인 정보 저장용량이 좀더 일반적인 형태들의 디지털 정보의 고밀도, 장기간 아카이브 저장에 대한 기초로서 활용될 수 있다는 아이디어에 동기를 부여하였다.
DNA 를 정보 저장에 있어서 매력적이게 하는 것은 정보의 분자 스케일 저장에 기인하는 극도로 높은 정보 밀도이다. 예를 들어 이론적으로, 대략 1 ZB (제타바이트, ~1021 바이트들) 로 추정되는, 현재까지 기록된 모든 인간-생성된 디지털 정보는 단지 10 그램의 질량을 가지는, 1022 개 미만의 DNA 염기들, 또는 1 몰의 DNA 염기들의 1/60 에 기록될 수 있다. 높은 데이터 밀도에 추가하여, DNA 는 또한 매우 안정한 분자로, 실질적인 손상없이 수천 년 동안 쉽게 지속될 수 있으며, 영구 동토층에 냉동되거나 또는 호박 내에 둘러싸인 DNA 에서 자연적으로 관찰되는 바와 같이, 수만 년, 또는 심지어 수백만 년 동안, 휠씬 더 오래 잠재적으로 지속될 수 있다.
이러한 매력에도 불구하고, 디지털 정보 저장 및 검색을 위해 단일 분자의 DNA 를 사용하는 것은 DNA 분자 합성, 분자의 손실/분해, 및 분자를 시퀀싱하는데 사용되는 DNA 시퀀서로부터의 신호 검출의 한계에서 분자 구조 오류의 많은 원인들로 인해 비효율적이거나 심지어 불가능할 수 있다. 따라서, 이러한 모든 프로세스들에 관여하는 더 많은 분자를 제공하기 위해 증폭이 통합되는 것이 종종 제안된다. 그러나, 증폭은 DNA 정보 시스템에 비용, 시간 및 운영 복잡성을 추가할 것이다.
따라서, DNA 데이터 저장 시스템을 포함하는 다양한 프로세스에서 증폭 단계의 필요성을 개별적으로 또는 집합적으로 제거하는 특정 프로세스들이 필요하다.
다양한 실시형태들에서, 무증폭 DNA 정보 저장 및 검색 시스템이 개시된다. 다양한 양태들에서, 본 시스템은 DNA 판독 디바이스, 디지털 데이터 인코딩/디코딩 알고리즘, 및 DNA 기록 디바이스를 포함하며, 이들 3 개의 엘리먼트들의 특성들은 다양한 비용 메트릭들을 최소화하거나 또는 감소시키고 전체 시스템 성능을 증가시키도록 공동-최적화된다. 다양한 양태들에서, 공동-최적화는 DNA 판독 및 기록에서 에러들을 균형잡거나, 회피하거나, 또는 정정하는 것을 통해서, 시스템의 에러 레이트를 감소시키는 것을 포함할 수도 있다. 다른 경우, 공동-최적화는 예컨대, 더 느린 속도 DNA 서열 모티프들의 사용을 회피함으로써, 및/또는 시스템의 빠른 동작으로부터 발생하는 에러들을 보상하기 위해 에러 정정/회피를 이용함으로써, 시스템에서 DNA 판독 또는 기록 시간을 감소시키는 것을 포함할 수도 있다.
본 개시의 다양한 실시형태들에서, 정보를 아카이브하는 방법이 설명된다. 이 방법은: 인코딩 방식을 사용하여 하나 이상의 뉴클레오티드들로 정보를 컨버팅하는 단계로서, 상기 뉴클레오티드들은 분자 전자 센서의 측정가능한 전기 파라미터에서 정보와 관련된 구별가능한 신호들을 생성하도록 미리 결정되는, 상기 정보를 컨버팅하는 단계; 하나 이상의 뉴클레오티드들을 뉴클레오티드 서열로 조립하는 단계; 및 DNA 분자의 증폭 없이 복제 DNA 분자들의 풀을 합성하는 단계로서, 각각의 복제 DNA 분자는 뉴클레오티드 서열을 혼입하는, 상기 복제 DNA 분자들의 풀을 합성하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 정보는 이진 데이터의 스트링을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 인코딩 방식은 이진 데이터의 스트링 내의 이진 데이터의 하나 이상의 0/1 비트들을 1 초과의 뉴클레오티드를 포함하는 서열 모티프로 컨버팅한다.
다양한 실시형태들에서, 정보를 컨버팅하는 단계는 이진 데이터의 스트링을 세그먼트들로 분할하는 단계를 포함하며, 각각의 세그먼트는 하나의 시퀀스 모티프를 인코딩한다.
다양한 실시형태들에서, 이진 데이터 비트 0 은 A 의 동종중합체를 인코딩하고, 이진 데이터 비트 1 은 C 의 동종중합체를 인코딩한다.
다양한 실시형태들에서, 뉴클레오티드들 중 적어도 하나는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 하나 이상의 뉴클레오티드들은 동일한 뉴클레오티드들의 변이체와 비교하여 복제 DNA 분자들에서 2 차 구조 형성에 저항하는 뉴클레오티드들을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 인코딩 방식은 도 4 에 도시된 BES1, BES2, BES3, BES4, BES5 및 BES6 중 임의의 하나 또는 조합을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 정보를 아카이브하는 방법은 또한: DNA 분자들의 사전 증폭 없이 복제 DNA 분자들 중 적어도 하나를 분자 전자 센서에 노출시키는 단계; 구별가능한 신호들을 생성하는 단계; 및 상기 구별가능한 신호들을 정보로 컨버팅하는 단계를 포함하고, 상기 분자 전자 센서는 이격된 전극들의 쌍 및 각 전극에 부착된 분자 센서 복합체를 포함하여 센서 회로를 형성하고, 상기 분자 센서 복합체는 이격된 전극들의 쌍에서의 각각의 전극에 전기적으로 배선된 브릿지 분자 및 브릿지 분자에 컨쥬게이트된 프로브 분자를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 복제 DNA 분자들 중 적어도 하나를 분자 전자 센서에 노출시키는 단계는 DNA 분자들의 풀을 버퍼에 현탁시키는 단계, 버퍼의 분취량 (aliquot) 을 취하는 단계, 및 분취량을 센서에 제공하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 버퍼 용액은 변형된 dNTP들을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 센서의 측정가능한 전기 파라미터는 이격된 전극들 사이의 그리고 분자 센서 복합체를 통한 소스-드레인 전류를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 센서용 프로브 분자는 폴리머라제를 포함하고, 센서의 측정가능한 전기 파라미터는 복제 DNA 분자들 중 어느 하나를 처리하는 동안 폴리머라제의 효소 활성에 의해 조절된다.
다양한 실시형태들에서, 폴리머라제는 E. coli Polymerase I 의 클레노브 단편을 포함하고, 브릿지 분자는 이중 가닥 DNA 분자를 포함한다.
본 개시의 다양한 실시형태들에서, 무증폭 DNA 정보 저장 및 검색 시스템에서 이진 데이터의 스트링을 아카이브 및 검색하는 방법이 설명된다. 이 방법은: 이진 데이터의 스트링을 적어도 하나의 이진 비트의 세그먼트들로 분할하는 단계; 각각의 세그먼트를 서열 모티프에 할당하는 단계로서, 각각의 서열 모티프는 적어도 2 개의 뉴클레오티드들을 포함하고, 서열 모티프들은 분자 전자 센서의 측정가능한 전기 파라미터에서 구별가능한 신호들을 생성하도록 미리 결정되는, 상기 각각의 세그먼트를 서열 모티프에 할당하는 단계; 상기 서열 모티프들을 뉴클레오티드 서열로 조립하는 단계; 고체 지지체 상에서 무증폭 DNA 기록 방법을 사용하여 복제 DNA 분자들의 풀을 합성하는 단계로서, 각각의 복제 DNA 분자는 뉴클레오티드 서열을 혼입하는, 상기 복제 DNA 분자들의 풀을 합성하는 단계; 상기 DNA 분자들의 풀을 버퍼에 현탁시키는 단계; 버퍼의 분취량을 취하는 단계; DNA 분자들의 사전 증폭 없이 분취량을 센서에 제공하는 단계; 구별가능한 신호들을 생성하는 단계; 및 상기 구별가능한 신호들을 이진 데이터의 스트링으로 컨버팅하는 단계를 포함하고, 상기 센서는 이격된 전극들의 쌍 및 각 전극에 부착된 분자 센서 복합체를 포함하여 분자 전자 회로를 형성하고, 상기 분자 센서 복합체는 상기 이격된 전극들의 쌍에서 각각의 전극에 전기적으로 배선된 브릿지 분자 및 브릿지 분자에 컨쥬게이트된 프로브 분자를 포함한다.
도 1 은 무증폭 DNA 디지털 데이터 저장 시스템의 실시형태를 도시한다.
도 2 는 무증폭 DNA 디지털 데이터 저장 시스템의 실시형태에 대한 데이터 입력 및 검색의 일반적인 프로세스 흐름을 도시한다.
도 3 은 무증폭 DNA 디지털 데이터 저장 시스템의 실시형태에 대한 데이터 입력 및 검색의 제한된 프로세스 흐름을 도시한다.
도 4 는 DNA 와 함께 사용하기 위한 이진 데이터 인코딩 방식들 (BES) 의 실시형태들을 도시한다.
도 5 는 디지털 데이터 저장에 사용되는 DNA 분자에 대한 DNA 물리적 및 논리적 구조들의 예들을 도시한다.
도 6 은 각 서열의 분자 복제물들 내에서 다수의 별개의 서열들을 생성할 수 있는 다양한 DNA 합성 프로세스들의 실시형태들을 도시하며, 여기서 M 합성 시작 부위를 갖는 N 개의 서열들이 서열마다 제공된다.
도 7 은 브릿지 분자가 전기 회로를 완성하고, 전기 회로 파라미터가 시간에 대해 측정되는, 분자 전자 감지 회로의 일 실시형태를 도시하며, 여기서 측정된 파라미터의 변동들은 브릿지 분자와 그 환경에서의 다른 상호작용하는 분자들과의 상호작용들에 대응한다.
도 8 은 합성 DNA 분자들로 인코딩된 데이터의 판독기로서 사용가능한 폴리머라제-기반 분자 센서의 일 실시형태를 도시한다. 폴리머라제를 포함하는 센서는 별개의 DNA 분자 특징들에 대응하는 모니터링된 전기 파라미터에서 구별가능한 신호를 생성하며, 여기서 이러한 특징들은 정보를 합성 DNA 분자들로 인코딩하는데 사용될 수 있고, 이 분자들은 차례로 센서에 의해 판독될 수 있다.
도 9 는 폴리머라제-기반 분자 센서의 일 실시형태를 도시하고, 여기서 폴리머라제 분자는 소스 및 드레인 전극들을 연결하는 브릿지 분자에 부착되고, 2 개의 상이한 서열 모티프들 AA 및 CCC 은 센서의 모니터링 된 전기 파라미터에서 2 개의 구별가능한 신호들을 생성한다.
도 10 은 본 명세서에서 DNA 판독 디바이스에 사용되는 특정 폴리머라제 분자인 E. coli Polymerase I 의 클레노브 단편의 상세한 단백질 구조를 도시한다.
도 11 은 분자 전자 센서의 일 실시형태를 도시하며, 여기서 폴리머라제는 폴리머라제 상의 특정 위치로부터 전극들 사이를 연결하는 브릿지 분자에 컨쥬게이트된다.
도 12 는 도 11 의 분자 센서의 특정 실시형태를 도시하며, 여기서, 브릿지 분자는 이중 가닥 DNA 를 포함하고, 폴리머-브릿지 컨쥬게이션은 비오틴-스트렙타비딘 결합을 포함하고, 전극들은 브릿지 분자로부터 전극들의 각각으로의 티올-금 결합을 지지하기 위해 금-온-티타늄을 포함한다.
도 13 은 본원의 기본 센서 실험들에 사용된 나노-전극 테스트 칩 및 테스트 셋업의 일 실시형태를 도시한다.
도 14 는 다양한 센서 실험에 사용된 금 나노-도트 접촉부들을 추가로 포함하는 금속 나노-전극의 실시형태를 도시한다.
도 15 는 A, T, C 및 G 의 동종중합체 서열을 처리함으로써 획득된 실험 전류 트레이스를 도시한다.
도 16 은 도 12 의 센서에 의해 생성된 실험 데이터를 도시하며, 도 12 에서 폴리-A 및 폴리-C 의 특정 서열 모티프들은 구별가능한 신호들을 생성하여 이진 데이터를 인코딩할 가능성을 나타내는 것으로 도시된다.
도 17 은 적합한 어댑터, 프라이머 세그먼트, 버퍼 세그먼트 및 데이터 페이로드 세그먼트를 포함하는 DNA 데이터 저장 분자의 물리적 DNA 구조와 논리적 구조 사이의 관계를 도시한다.
도 18 은 저가의 대량 병렬 구성을 위해 칩 상에 DNA 판독기 센서를 배치하는데 사용되는 제조 스택의 일 실시형태를 도시한다.
도 19 는 폴리머라제 센서들의 칩-기반 어레이 및 트랜스-임피던스 증폭기를 포함하는 예시적인 단일 픽셀 회로에 대한 개념적 아키텍처를 도시한다.
도 20 은 256 개 픽셀들의 어레이를 갖는, 도 19 의 픽셀 어레이 칩의 실시형태에 대하여, 완성된 주석이 달린 칩 설계의 실시형태 및 제조된 칩의 광학 현미경 이미지를 도시한다.
도 21 은 도 20 의 제조된 칩의 전자 현미경 이미지의 표현을 도시하고, 적당한 위치에 폴리머라제 분자 복합체 갖는 나노-전극의 삽입을 포함한다;
도 22 는 증폭이 없는 칩 기반 DNA 판독기 센서로 DNA 데이터를 판독하기 위한 완전한 시스템의 실시형태의 개략도를 도시한다.
도 23 는, 도 22 의 다수의 DNA 판독 시스템이 데이터 판독기 서버를 제공하기 위해 집합되고, 시스템이 증폭이 없는, 클라우드-기반 DNA 데이터 아카이브 저장 시스템의 일 실시형태의 개략도를 도시한다.
도 24 는 DNA 를 프로세싱하는 동안 나노포어 이온 전류에서 구별가능한 신호 특징들을 생성하는, 나노포어 이온 전류 센서를 포함하는 DNA 데이터 판독기 센서의 대안적인 실시형태를 도시한다.
도 25 는 탄소 나노튜브를 통과하는 측정된 전류에서 구별가능한 신호 특징들을 생성하는, 양 및 음극들을 포괄하는 탄소 나노튜브 분자 와이어로 복합체화되는 폴리머라제를 포함하는 DNA 데이터 판독기 센서의 일 실시형태를 도시한다.
도 26 은 DNA 특징들에 대응하는 구별가능한 광학 신호들을 생성하는, 단면으로 나타낸, 단일 폴리머라제와 복합체화된 제로 모드 도파관 센서의 일 실시형태를 도시한다.
도 2 는 무증폭 DNA 디지털 데이터 저장 시스템의 실시형태에 대한 데이터 입력 및 검색의 일반적인 프로세스 흐름을 도시한다.
도 3 은 무증폭 DNA 디지털 데이터 저장 시스템의 실시형태에 대한 데이터 입력 및 검색의 제한된 프로세스 흐름을 도시한다.
도 4 는 DNA 와 함께 사용하기 위한 이진 데이터 인코딩 방식들 (BES) 의 실시형태들을 도시한다.
도 5 는 디지털 데이터 저장에 사용되는 DNA 분자에 대한 DNA 물리적 및 논리적 구조들의 예들을 도시한다.
도 6 은 각 서열의 분자 복제물들 내에서 다수의 별개의 서열들을 생성할 수 있는 다양한 DNA 합성 프로세스들의 실시형태들을 도시하며, 여기서 M 합성 시작 부위를 갖는 N 개의 서열들이 서열마다 제공된다.
도 7 은 브릿지 분자가 전기 회로를 완성하고, 전기 회로 파라미터가 시간에 대해 측정되는, 분자 전자 감지 회로의 일 실시형태를 도시하며, 여기서 측정된 파라미터의 변동들은 브릿지 분자와 그 환경에서의 다른 상호작용하는 분자들과의 상호작용들에 대응한다.
도 8 은 합성 DNA 분자들로 인코딩된 데이터의 판독기로서 사용가능한 폴리머라제-기반 분자 센서의 일 실시형태를 도시한다. 폴리머라제를 포함하는 센서는 별개의 DNA 분자 특징들에 대응하는 모니터링된 전기 파라미터에서 구별가능한 신호를 생성하며, 여기서 이러한 특징들은 정보를 합성 DNA 분자들로 인코딩하는데 사용될 수 있고, 이 분자들은 차례로 센서에 의해 판독될 수 있다.
도 9 는 폴리머라제-기반 분자 센서의 일 실시형태를 도시하고, 여기서 폴리머라제 분자는 소스 및 드레인 전극들을 연결하는 브릿지 분자에 부착되고, 2 개의 상이한 서열 모티프들 AA 및 CCC 은 센서의 모니터링 된 전기 파라미터에서 2 개의 구별가능한 신호들을 생성한다.
도 10 은 본 명세서에서 DNA 판독 디바이스에 사용되는 특정 폴리머라제 분자인 E. coli Polymerase I 의 클레노브 단편의 상세한 단백질 구조를 도시한다.
도 11 은 분자 전자 센서의 일 실시형태를 도시하며, 여기서 폴리머라제는 폴리머라제 상의 특정 위치로부터 전극들 사이를 연결하는 브릿지 분자에 컨쥬게이트된다.
도 12 는 도 11 의 분자 센서의 특정 실시형태를 도시하며, 여기서, 브릿지 분자는 이중 가닥 DNA 를 포함하고, 폴리머-브릿지 컨쥬게이션은 비오틴-스트렙타비딘 결합을 포함하고, 전극들은 브릿지 분자로부터 전극들의 각각으로의 티올-금 결합을 지지하기 위해 금-온-티타늄을 포함한다.
도 13 은 본원의 기본 센서 실험들에 사용된 나노-전극 테스트 칩 및 테스트 셋업의 일 실시형태를 도시한다.
도 14 는 다양한 센서 실험에 사용된 금 나노-도트 접촉부들을 추가로 포함하는 금속 나노-전극의 실시형태를 도시한다.
도 15 는 A, T, C 및 G 의 동종중합체 서열을 처리함으로써 획득된 실험 전류 트레이스를 도시한다.
도 16 은 도 12 의 센서에 의해 생성된 실험 데이터를 도시하며, 도 12 에서 폴리-A 및 폴리-C 의 특정 서열 모티프들은 구별가능한 신호들을 생성하여 이진 데이터를 인코딩할 가능성을 나타내는 것으로 도시된다.
도 17 은 적합한 어댑터, 프라이머 세그먼트, 버퍼 세그먼트 및 데이터 페이로드 세그먼트를 포함하는 DNA 데이터 저장 분자의 물리적 DNA 구조와 논리적 구조 사이의 관계를 도시한다.
도 18 은 저가의 대량 병렬 구성을 위해 칩 상에 DNA 판독기 센서를 배치하는데 사용되는 제조 스택의 일 실시형태를 도시한다.
도 19 는 폴리머라제 센서들의 칩-기반 어레이 및 트랜스-임피던스 증폭기를 포함하는 예시적인 단일 픽셀 회로에 대한 개념적 아키텍처를 도시한다.
도 20 은 256 개 픽셀들의 어레이를 갖는, 도 19 의 픽셀 어레이 칩의 실시형태에 대하여, 완성된 주석이 달린 칩 설계의 실시형태 및 제조된 칩의 광학 현미경 이미지를 도시한다.
도 21 은 도 20 의 제조된 칩의 전자 현미경 이미지의 표현을 도시하고, 적당한 위치에 폴리머라제 분자 복합체 갖는 나노-전극의 삽입을 포함한다;
도 22 는 증폭이 없는 칩 기반 DNA 판독기 센서로 DNA 데이터를 판독하기 위한 완전한 시스템의 실시형태의 개략도를 도시한다.
도 23 는, 도 22 의 다수의 DNA 판독 시스템이 데이터 판독기 서버를 제공하기 위해 집합되고, 시스템이 증폭이 없는, 클라우드-기반 DNA 데이터 아카이브 저장 시스템의 일 실시형태의 개략도를 도시한다.
도 24 는 DNA 를 프로세싱하는 동안 나노포어 이온 전류에서 구별가능한 신호 특징들을 생성하는, 나노포어 이온 전류 센서를 포함하는 DNA 데이터 판독기 센서의 대안적인 실시형태를 도시한다.
도 25 는 탄소 나노튜브를 통과하는 측정된 전류에서 구별가능한 신호 특징들을 생성하는, 양 및 음극들을 포괄하는 탄소 나노튜브 분자 와이어로 복합체화되는 폴리머라제를 포함하는 DNA 데이터 판독기 센서의 일 실시형태를 도시한다.
도 26 은 DNA 특징들에 대응하는 구별가능한 광학 신호들을 생성하는, 단면으로 나타낸, 단일 폴리머라제와 복합체화된 제로 모드 도파관 센서의 일 실시형태를 도시한다.
다양한 실시형태들에서, DNA 의 증폭 없이 디지털 정보 저장의 범용 수단으로서 DNA 분자를 활용하는 방법, 장치 및 시스템이 개시된다. 다양한 양태들에서, 물리적 DNA 는 전체 정보 저장 시스템의 임의의 양태 또는 본원의 정보 저장 시스템의 임의의 특정 서브시스템에서 증폭을 요구하지 않는다. 증폭 프로세스는 비용, 시간, 복잡성, 성능 변동성 및 DNA 정보 저장 시스템에 대한 다른 제한의 부담을 부과 할 수 있다. 또한, 증폭은 변형된 염기를 포함하는 DNA 와 양립할 수 없다. 따라서, 본 개시에 따른 DNA 정보 저장을 위한 방법, 장치 및 시스템은 DNA 증폭을 회피하도록 구성된다.
다양한 실시형태들에서, DNA 분자들을 디지털 정보 저장의 범용 수단으로서 이용하는 DNA 데이터 저장 시스템이 개시된다. 특정의 양태들에서, 디지털 정보 저장을 위한 시스템은 DNA 판독 디바이스, 정보 인코더/디코더 알고리즘, 및 DNA 기록 디바이스를 포함한다. 다양한 양태들에서, 시스템은 데이터 아카이브 동작을 지원하기 위해 물리적 DNA 분자를 관리하기 위한 서브시스템을 더 포함한다. 3 개의 엘리먼트들 및 이들의 공동-최적화의 상호관계가 개시된다.
다양한 실시형태들에서, DNA 데이터 저장 시스템을 위한 데이터 판독기가 개시된다. 다양한 양태들에서, DNA 판독 디바이스는 단일 DNA 분자로부터 정보를 추출하는 센서를 포함하며, 따라서 DNA 증폭을 요구하지 않는다. 센서는 칩-기반 포맷으로 배치될 수도 있다. 다양한 예들에서, 이러한 칩-기반 센서 디바이스를 지원하는 데이터 판독 시스템들이 개시된다.
정의들
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "DNA" 는 생물학적 DNA 분자뿐만 아니라, 합성 화학, 예컨대 뉴클레오티드 포스포라미다이트 화학의 다양한 방법들에 의해, 또는 DNA 올리고머의 연속적 결찰에 의해 제조된 완전한 합성 버전을 지칭할 수도 있으며, 또한 다수가 핵산 생화학 분야의 당업자에게 공지된 염기, 당 또는 백본에 존재하는 화학적 변형으로 이루어진 형태들을 지칭할 수도 있으며, 이는 메틸화된 염기, 아데닐화된 염기, 다른 후성적으로 표시된 염기를 포함하거나, 또는 이노신 또는 3-나이트로피롤과 같은 비표준 또는 보편적인 염기, 또는 다른 뉴클레오티드 유사체, 또는 리보베이스 (ribobases), 또는 염기성 부위, 또는 손상된 부위를 포함하며, 또한 PNA (Peptide Nucleic Acids), LNA (Locked Nucleic Acids), XNA (Xeno Nucleic Acids) (HNA (Hexitol Nucleic Acid) 를 포함하는 DNA 의 당 변형 계열), GNA (Glycol Nucleic Acid) 등과 같은 DNA 유사체를 포함하며, 또한 합성 RNA 및 변형된 RNA 형태와 함께 생화학적으로 유사한 RNA 분자를 포함한다. 모든 이들 생화학적으로 밀접하게 관련된 형태들은 주형 단일 가닥, 올리고머가 결합된 단일 가닥, 이중 가닥 DNA, 및 다양한 염기를 변형시키기 위한 그룹과 같은 결합된 그룹을 갖는 이중 가닥을 포함하여 DNA 저장 시스템에 사용되는 데이터 저장 분자를 언급하는 맥락에서 DNA 라는 용어를 사용함으로써 암시된다. 또한, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "DNA" 는 이러한 분자들의 단일 가닥 형태들뿐만 아니라, 불일치 또는 비표준 염기쌍 형성을 함유하는 형태를 포함하는 하이브리드 이중체 형태를 포함하는 이중 나선 또는 이중 가닥 형태, 또는 삼중체 형태와 같은 비표준 헬리컬 형태뿐만 아니라, 올리고뉴클레오티드 프라이머에 결합된 단일 가닥 DNA 와 같은 부분적으로 이중 가닥인 분자들, 또는 헤어핀 이차 구조를 갖는 분자를 지칭할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, DNA 는 몰리머라제와 같은 프로브 분자가 프로세싱하기 위한 기질로서 작용하고, 그렇게 할 경우에, 분자 센서의 모니터링된 전기 파라미터에서 구별가능한 신호를 생성할 수 있는, 결합된 올리고뉴클레오티드 세그먼트 및/또는 섭동 그룹을 가지는 단일 가닥 DNA 성분을 포함하는 분자를 지칭한다.
GATTACA 와 같은, 본원에서 기재된 바와 같은 DNA 서열들은 달리 명시되지 않는 한, 5' 내지 3' 배향의 DNA 를 지칭한다. 예를 들어, 본원에서 기재된 바와 같은 GATTACA 는 단일 가닥 DNA 분자 5'-G-A-T-T-A-C-A-3' 을 나타낸다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 규약은 분자 생물학의 분야에서 사용되는 기록된 DNA 서열들에 대한 표준 규약을 따른다.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드" 또는 "결합 올리고뉴클레오티드" 는 3 내지 100 개 염기, 또는 5 내지 40 개 염기, 또는 10 내지 30 개 염기의 범위의 길이를 갖는 DNA 의 짧은 세그먼트 또는 상기 기재된 유사체 형태를 지칭하며, 주형 가닥에 함유된 상보적 서열과 혼성화할 수 있다. 이러한 혼성화는 완벽한 Watson-Crick 염기쌍 형성 일치를 통한 것일 수도 있거나, 또는 불일치 또는 비표준 염기쌍 형성을 수반할 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로브 분자" 는 분자 센서에서 이격된 전극들의 쌍에서 2 개의 전극들 사이에 전기적으로 배선된 분자를 지칭하며, 분자 상호작용과 관련된 분자 센서의 모니터링된 전기 파라미터에서 섭동을 제공하기 위해 센서 주위의 환경에서 분자와 상호작용할 수 있다. 본원의 프로브 분자는 폴리머라제 분자, 또는 헬리카제 또는 엑소뉴클레아제와 같은 임의의 다른 가공 효소를 포함할 수도 있다. DNA 판독 디바이스로서 사용되는 본원의 분자 센서에서, 프로브 분자는 브릿지 분자와 전극 사이의 직접 결합에 의해 한 쌍의 전극에서 2 개의 이격된 전극들을 가로질러 직접 배선된 브릿지 분자에 컨쥬게이트될 수도 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "폴리머라제" 는 주형 DNA 또는 RNA 가닥에 대해, DNA 또는 DNA 유사체들, 또는 RNA 또는 RNA 유사체들을 혼입시킴으로써, 뉴클레오티드 사슬의 형성을 촉매하는 효소를 지칭한다. 용어 폴리머라제는 DNA 폴리머라제들의 야생-형 및 돌연변이 형태들, 예컨대 Klenow, E. coli Pol I, Bst, Taq, Phi29, 및 T7, RNA 폴리머라제들의 야생-형 및 돌연변이 형태들, 예컨대 T7 및 RNA Pol I, 및 DNA 를 발생시키기 위해 RNA 주형 상에서 작동하는 야생-형 및 돌연변이체 역전사 효소들, 예컨대 AMV 및 MMLV 를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 폴리머라제는 DNA 판독기로서 사용가능한 본원의 분자 센서에서 프로브 분자를 위한 선택이다.
본원에서 사용된 것과 같이, "브릿지 분자" 는 한 쌍의 전극에서 2 개의 이격된 전극 사이에 결합되어 2 개 사이에 전극 갭을 확장하고 분자 센서의 전기 회로를 완성하는 분자를 지칭한다. 다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는 1 nm 내지 100 nm, 또는 일부 경우에는 약 10 nm 와 같은 전극 갭과 대략 동일한 길이를 갖는다. 본원에 사용하기 위한 브릿지 분자들은, 이중 가닥 DNA, 다른 유사한 DNA 듀플렉스 구조들, 예컨대 DNA-RNA, DNA-PNA 또는 DNA-LNA 또는 DNA-XNA 듀플렉스 하이브리드들, 펩타이드들, 단백질 알파-나선 구조들, 항체들 또는 항체 Fab 도메인들, 그래핀 나노리본들 또는 탄소 나노튜브들, 또는 분자 전자소자의 당업자들에게 알려져 있는 넓은 어레이의 분자 와이어들 또는 전도성 분자들 중 임의의 다른 것들을 포함할 수도 있다. 본원의 브릿지 분자는 브릿지 분자로서 작용하는 DNA 분자의 3' 말단 또는 그 근처의 염기 및 5' 말단 또는 그 근처의 염기와 같이, "제 1" 및 "제 2" 말단을 갖는 것으로 기술될 수도 있다. 예를 들어, 각각의 말단은 브릿지 분자의 제 1 말단이 제 1 전극에 결합하고 브릿지 분자의 제 2 말단이 한 쌍의 이격된 전극에서 제 2 전극에 결합하도록 화학적으로 변형될 수도 있다. 이 명명법은 전극 갭에 걸쳐있는 브릿지 분자를 시각화하고 한 쌍의 이격된 전극에서의 각 전극에 결합하는 것을 돕는다. 다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자의 제 1 및 제 2 말단은 브릿지 분자와 프로브 분자, 예컨대 폴리머라제 사이 및/또는 브릿지 분자와 한 쌍의 전극에서의 하나 또는 양자의 전극들 사이에 자가 조립을 제공하도록 화학적으로 변형될 수도 있다. 비 제한적인 예에서, 브릿지 분자의 말단은 티올 (-SH)-금 결합에 의해 한 쌍의 이격된 전극에서 2 개의 전극들의 각각에 결합된다.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "센서 분자 복합체" 또는 "센서 프로브 복합체" 는 2 개의 분자들이 함께 컨쥬게이트된 프로브 분자와 브릿지 분자의 조합, 및 센서 회로 내로 배선된 집합체, 센서 회로 내로 함께 배선된 2 초과의 분자들의 임의의 조합을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "dNTP" 는 DNA 의 생합성에 사용되는 표준적인, 자연 발생 뉴클레오시드 트리포스페이트들 (즉, dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP), 및 염기 변형들, 당 변형들, 또는 포스페이트 기 변형들, 예컨대 알파-티올 변형 또는 감마 포스페이트 변형들, 또는 테트라-, 펜타-, 헥사- 또는 더 긴 포스페이트 사슬 형태들, 또는 사슬 내 베타, 감마 또는 고차 포스페이트들과 같은, 포스페이트들 중 임의의 포스페이트에 컨쥬게이트된 추가적인 기들을 갖는 전술한 것들 중 임의의 것을 운반하는 것들을 포함하여, 이들의 천연 또는 합성 유사체들 또는 변형된 형태들 양자를 지칭한다. 일반적으로, 본원에서 사용할 때, "dNTP" 는 프라이머를 연장함에 따라 폴리머라제 효소에 의해 혼입될 수 있거나, 또는 이러한 효소의 활성 포켓에 진입하여 혼입을 위한 시험 후보물질로서 일시적으로 관여하는 임의의 뉴클레오시드 트리포스페이트 유사체 또는 변형된 형태를 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "버퍼", "버퍼 용액" 및 "시약 용액" 은 분자 센서가 동작하고 공급된 DNA 주형들로부터 신호들을 발생시킬 수 있는 환경을 제공하는 용액을 지칭한다. 다양한 실시형태들에서, 용액은 수용액이며, 이는 염, pH 버퍼, 2가 양이온, 계면 활성제, 차단제, 용매, 주형 프라이머 올리고뉴클레오티드, 센서의 폴리머라제와 복합화하는 다른 단백질과 같은 용해된, 현탁된 또는 유화된 성분을 포함할 수도 있으며, 또한 가능하게는 폴리머라제 기질, 즉 dNTP, 유사체 또는 dNTP 의 변형된 형태, 및 DNA 분자 기질 또는 주형을 포함한다. 비-제한적인 예에서, 버퍼는 저장된 정보의 디코딩을 위해 DNA 를 DNA 판독기에 제공하기 위해, DNA 정보 라이브러리에서 동결 건조된 상태로 남겨진 DNA 분자를 수화 및 현탁시키기 위해 사용된다.
본원에서 사용될 때, "이진 데이터" 또는 "디지털 데이터" 는 표준 이진 코드, 또는 염기 2 {0,1} 알파벳을 이용하여 암호화되는 데이터, 16진 염기 16 알파벳을 이용하여 암호화되는 데이터, 염기 10 {0-9} 알파벳을 이용하여 암호화되는 데이터, ASCII 문자들을 이용하여 암호화되는 데이터, 또는 심볼들 또는 캐릭터들의 임의의 다른 별개의 알파벳을 이용하여 선형 암호화 방식으로 암호화되는 데이터를 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "디지털 데이터 인코딩된 포맷" 은 DNA 에 정보를 인코딩하는데 사용되는 DNA 서열 특징들의 1차 변환, 또는 이러한 분류된 DNA 특징들의 등가 논리 스트링으로부터 유래된 일련의 이진 숫자들, 또는 다른 심볼 숫자들 또는 캐릭터들을 지칭한다. 일부 실시형태들에서, DNA 로서 아카이브될 정보는 이진 데이터로 변환될 수도 있거나, 또는 처음에 이진 데이터로서 존재한 후, 이 데이터는 에러 정정 및 어셈블리 정보와 함께, 구별가능한 DNA 서열 특징들에 의해 제공되는 코드로 직접 변환되는 포맷으로 추가로 인코딩될 수도 있다. 이 후자 연관은 정보의 일차 암호화 포맷이다. 어셈블리 및 에러 정정 절차들의 적용은 다시 소스 정보를 복구하는 것으로의 추가적인, 이차 레벨의 디코딩이다.
본원에 사용된 것과 같이, "구별가능한 DNA 서열 특징" 은 폴리머라제를 포함하는 것과 같은 분자 센서에 의해 처리될 때, 인코딩된 정보에 대응하는 별개의 신호를 생성하는 데이터-인코딩 DNA 분자의 특징을 의미한다. 이러한 특징들은 예를 들어, 상이한 염기들, 상이한 변형된 염기들 또는 염기 유사체들, 상이한 서열들 또는 서열 모티프들, 또는 센서 폴리머라제에 의해 프로세싱될 때 구별가능한 신호들을 발생시키는 특징들을 달성하기 위한, 이들의 조합들일 수도 있다.
본원에서 사용될 때, "DNA 서열 모티프" 는 이러한 문자 서열들의 특정의 세트 중 임의의 멤버를 나타내는 특정의 문자 서열 또는 패턴을 지칭한다. 예를 들어, 다음은 특정 문자 서열들인 서열 모티프들이다: GATTACA, TAC 또는 C. 반대로, 다음은 패턴들인 서열 모티프들이다: G[A/T]A 는 명시적인 서열 세트 {GAA, GTA} 를 나타내는 패턴이고, G[2-5] 는 서열 세트 {GG, GGG, GGGG, GGGGG} 를 지칭하는 패턴이다. 서열들의 명시적인 세트는 모티프의 명백한 설명이고, 이들과 같은 이러한 패턴 속기 표기법들은 이러한 세트들을 기술하는 일반적인 컴팩트한 방법들이다. 이들과 같은 모티프 서열들은 천연 DNA 염기들을 기술할 수도 있거나, 또는 다양한 상황들에서, 변형된 염기들을 기술할 수도 있다. 다양한 상황들에서, 모티프 서열들은 주형 DNA 분자의 서열을 기술할 수도 있고/있거나, 주형을 보충하는 분자 상의 서열을 기술할 수도 있다.
본원에서 사용될 때, "구별가능한 신호들을 갖는 서열 모티프들" 은, 패턴들의 경우들에서, 명시적인 서열들의 제 1 세트를 나타내는 제 1 모티프 패턴이 존재하고 상기 서열들 중 임의의 서열이 제 1 신호를 발생하고, 그리고 명시적인 서열들의 제 2 세트를 나타내는 제 2 모티프 패턴이 존재하고 상기 서열들 중 임의의 서열이 제 2 신호를 발생하고, 제 1 신호가 제 2 신호와 구별가능하다는 것을 의미한다. 예를 들어, 모티프 G[A/T]A 및 모티프 G[3-5] 가 구별가능한 신호들을 생성하면, 세트 {GAA, GTA} 중 임의의 것이 제 1 신호를 생성하고 세트 {GGG, GGGG, GGGGG} 중 임의의 것이 제 1 신호와 구별가능한 제 2 신호를 생성하는 것을 의미한다.
본원에서 사용될 때, "구별가능한 신호들" 은 차이가 특정의 용도를 위해 레버리지될 수 있도록, 센서로부터의 다른 전기 신호와, 정량적으로 (예컨대, 피크 진폭, 신호 지속기간 등) 또는 정성적으로 (예컨대, 피크 형상 등) 뚜렷하게 상이한, 센서로부터의 하나의 전기 신호를 지칭한다. 비-제한적인 예에서, 동작 분자 센서로부터의 2개의 전류 피크들 대 시간은 이들의 진폭들에서 약 1 x 10-10 Amp 이상의 차이가 있으면 구별가능하다. 이 차이는 2개의 피크들을 2개의 별개의 이진 비트 리드아웃들, 예컨대, 0 및 1 로서 이용하기에 충분하다. 일부의 경우, 제 1 피크는 양의 진폭, 예컨대, 약 1 x 10-10 Amp 내지 약 20 x 10-10 Amp 진폭을 가질 수도 있으며, 반면 제 2 피크는 음의 진폭, 예컨대, 약 0 Amp 내지 약 -5 x 10-10 Amp 진폭을 가질 수도 있어, 이들 피크들을 뚜렷하게 상이하게 만들며 상이한 이진 비트들, 즉, 0 또는 1 을 인코딩하는데 사용가능하게 만든다.
본원에 사용된 바와 같이, "데이터 인코딩 DNA 분자" 또는 "DNA 데이터 인코딩 분자" 는 DNA 분자 구조 내에서 데이터를 인코딩하기 위해 합성된 DNA 분자를 지칭하며, 이는 나중에 검색될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "DNA 로부터의 데이터 판독" 은 회로의 모니터링된 전기 파라미터에서 전기 신호 또는 다른 섭동과 같은 구별가능한 이벤트들을 측정하는 임의의 방법을 지칭하며, 이는 정보를 DNA 분자로 암호화하기 위해 합성 DNA 내로 구축되는 합성 DNA 분자의 분자 특징들에 대응한다.
본원에서 사용된 것과 같이, "전극" 은 쌍으로 배치되고 임의의 한 쌍의 전극에서 2 개의 전극들 사이의 나노스케일 사이즈 전극 갭에 의해 이격된, 나노 스케일 전기 도체 (보다 간단히, "나노-전극") 를 지칭한다. 다양한 실시형태들에서, 용어 "전극" 은 소스, 드레인 또는 게이트를 지칭할 수도 있다. 게이트 전극은 소스 전극과 드레인 전극 사이의 갭 영역에 용량성으로 결합될 수도 있고, "매립 게이트", "백 게이트" 또는 "사이드 게이트" 를 포함할 수도 있다. 한 쌍의 이격된 전극들에서의 전극들은 "소스" 및 "드레인" 전극, "양성" 및 "음성" 전극 또는 "제 1" 및 "제 2" 전극으로서 구체적으로 지칭될 수도 있다 (그리고 다양한 도면에서 이와 같이 라벨링된다). 본원의 임의의 도면에서의 전극들이 "양극" 및 "음극" 으로 표시될 때마다, 달리 나타내지 않는다면 (예컨대, 전자가 음극으로 흐를 수도 있는 실시형태), 지시된 극성이 반전될 수도 있음 (즉, 도면에서 이들 2 개의 엘리먼트들의 라벨이 반전될 수 있음) 을 이해해야 한다. 한 쌍의 전극에서 나노-스케일 전극은 약 1 nm 내지 100 nm 로 측정되는 전극 갭에 의해 이격되고, 각각의 전극은 이 동일한 나노스케일 범위에서 폭, 높이 및 길이와 같은 다른 임계 치수들을 가질 수도 있다. 이러한 나노-전극은 전도성 및 기계적 안정성을 제공하는 다양한 재료로 구성될 수도 있다. 이들은 예를 들어 금속 또는 반도체, 또는 이러한 재료의 조합으로 구성될 수도 있다. 금속 전극은 예를 들어 티타늄, 크롬, 백금 또는 팔라듐을 포함할 수도 있다. 한 쌍의 이격된 전극들은 나노-스케일 리소그래피 기술에 의해 기판 상에 배치될 수도 있다.
본원에서 사용된 것과 같이, 용어 "컨쥬게이션 (conjugation)" 은 화학 분야에 공지된 임의의 유형, 예를 들어 공유, 이온성, 반 데르 발스 (Van der Waals) 등의 화학적 연결 (즉, 결합) 을 지칭한다. 폴리머라제와 같은 프로브 분자의 이중 가닥 DNA 분자와 같은 브릿지 분자로의 컨쥬게이션들, 또는 전극으로의 브릿지 분자 또는 전극 상의 금속 침전물 간의 컨쥬게이션들은 컨쥬게이션 화학 분야의 당업자에게 공지된 다양한 종류의 컨쥬게이션 방법, 예컨대 비오틴-아비딘 커플링, 티올-금 커플링, 시스테인-말레이미드 커플링, 금 결합 펩타이드 또는 재료 결합 펩타이드, 클릭 케미컬 커플링, Spy-SpyCatcher 단백질 상호작용 커플링 또는 항체-항원 결합 (예컨대, FLAG 펩타이드 태그/항-FLAG 항체 시스템) 등에 의해 달성될 수도 있다. 한 쌍의 이격된 전극에서 각각의 전극에 대한 프로브 분자의 컨쥬게이션은 프로브 분자 및 한 쌍의 전극을 포함하는 회로 내로의 프로브 분자의 "전기 연결" 또는 "전기 배선" 을 포함한다. 다시 말해서, 프로브 분자는 한 쌍의 전극에서의 각 전극에 컨쥬게이트되어 전극들 사이에 전도성 경로를 제공하며, 그렇지 않으면 이들을 분리하는 전극 갭에 의해 서로 절연될 것이다. 전도성 경로는 프로브 분자의 화학적 결합을 통해, 예컨대 CC 결합을 통해 전자 비편재화 (delocalization)/이동에 의해 제공된다. 재조합 방법들 또는 합성 생물학의 방법들에 의해 폴리머라제와 같은 프로브 분자로 조작된 이러한 컨쥬게이션 부위들은 다양한 실시형태들에서, 시스테인, 알데히드 태그 부위 (예컨대, 펩티드 모티프 CxPxR), 테트라시스테인 모티프 (예컨대, 펩티드 모티프 CCPGCC)) 및 비천연 또는 비-표준 아미노산 (NSAA) 부위 중 임의의 하나를, 예컨대 p-아세틸페닐알라닌 또는 비천연 교차결합 가능한 아미노산을 도입하기 위한 확장된 유전 코드의 사용을 통해, 예컨대, 5-브로모우리딘을 이용한 RNA- 또는 DNA-단백질 교차결합의 사용을 통해 포함할 수도 있다 (Gott, J.M., 등., Biochemistry, 30 (25), pp 6290-6295 (1991) 참조).
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "증폭" 은 DNA 분자의 하나 이상의 카피들을 만드는 분자 생물학 방법을 지칭하며, 적합한 DNA 분자들의 풀에서 수행될 때, 풀의 카피를 집합적으로 아카이브한다. 이러한 카피 방법은 DNA 분자를 RNA 로, 또는 그 반대로 변환하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 PCR 과 같은 모든 형태의 지수 카피를 포함하며, 초기 주형 세트로부터 생성된 카피들의 수가 사이클 수 또는 시간에 따라 지수적으로 증가한다. 이는 분자 생물학 분야의 당업자에게 알려진 PCR 의 많은 변형 또는 확장을 포함한다. 이들은 예를 들어, 등온 방법 및 롤링 서클 방법 및 프라이밍 사이트를 생성하기 위해 닉킹 또는 재조합에 의존하는 방법, 또는 LAMP, DMA 또는 RPA 와 같은 증폭 방법들을 포함한다. 이러한 방법은 또한 선형 증폭 방법을 포함하는데, 여기서 생성된 카피들의 수는 사이클 수 또는 시간, 예컨대 T7 증폭에 따라 또는 열 순환을 갖는 단일 프라이머를 사용하여 또는 프라이머의 폴리머라제 확장을 다시 시작하는 등온 수단으로 선형으로 증가한다. 이는 축퇴 프라이머 또는 랜덤 프라이머의 사용을 포함한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은 증폭은 또한, 단일 가닥 주형의 상보적 가닥을 생성하는 특별한 경우를, 그러한 상보적 가닥이 또한 데이터 저장 프로세스에서 저장된 정보를 나타내는데 사용될 때 - 예를 들어, 저장된 정보를 복구하는 프로세스에서 양자의 가닥들을 판독하는 판독기들의 맥락에서, 명시적으로 포함한다. 이러한 상보적 가닥은 저장 DNA 분자에서의 상보 체와의 이중 가닥 물리적 형태로 유지될 수도 있거나, 또는 저장 시스템에서 상보적 가닥과 분리되어 존재할 수도 있으며, 이 경우에 정보 저장 목적으로 일차 주형의 증폭, 즉 카피를 구성한다. 이는 DNA 판독기가 단일 가닥 주형으로부터 데이터를 판독하는 과정에서 상보적 가닥을 생성하는 경우와 구별되는데, 이는 그 용어가 본 명세서에서 사용될 때 증폭이 아니며 - 이 경우에 그러한 가닥은 단지 판독 프로세스의 부산물이며 그 자체가 단지 정보가 잠재적으로 추출되는 정보 인코딩 분자로 사용되지 않는다. 이러한 부산물 가닥을 생성하는 DNA 판독기는 본원에 기술되고 도 8 내지 도 12 및 도 24 내지 도 26 에 예시 된 폴리머라제 분자 전자 판독기를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 이러한 DNA 판독기 시스템은 증폭이 없다.
무증폭 DNA 디지털 데이터 저장:
저장된 데이터를 아카이브하고 이후 액세스하는데 사용가능한, 본 개시물에 따른 무증폭 DNA 데이터 저장 방법들, 장치들 및 시스템들의 일반적인 양태들이 다양한 도면들을 참조하여 개시된다:
도 1 은 본 개시물에 따른 무증폭 DNA 정보 저장 시스템의 일 실시형태를 도시한다. 도 1 에 도시된 바와 같이, 무증폭 DNA 저장 시스템은 정보 인코더/디코더 알고리즘, DNA 기록 디바이스 (합성기), DNA 판독 디바이스 (시퀀서) 및 아카이브 동작들을 지원하기 위해 라이브러리 물리적 저장부에서 물리적 DNA 분자를 관리하기 위한 라이브러리 관리 서브시스템을 포함한다. 이 예는 저장 동안 DNA 물질을 핸들링하고 유지하는데 사용되고 저장된 아카이브 상에서의 동작들, 예컨대 복제를 실행하는 물리 시스템을 포함하는 DNA 저장 시스템의 주요 엘리먼트들을 나타낸다. 외부 컴퓨터는 시스템의 하이 레벨 제어, 저장을 위한 정보 공급, 및 추출된 정보 수신을 제공한다. 정보는 DNA 서열들로서 인코딩되어, DNA 분자로 합성되고, 저장되고, 그 후 판독되고, 디코딩되고 출력된다. 게다가, 이러한 시스템은 DNA 아카이브 물질 샘플들의 물리적인 I/O 도 또한 가능하다.
도 2 는 일 형태에서 다른 형태로 천이하는 일차 동작 (도 2 에 화살표로 도시됨) 과 함께, 전체 시스템에 존재하는 정보의 주요 페이즈들 (도 2 에 박스로 도시됨) 을 포함하는 일차 DNA 저장 시스템 정보 페이즈들 및 프로세스들을 도시한다. 도 2 에 도시된 바와 같이, 기록, 판독 및 라이브러리 관리의 요소들은 각각, DNA 분자를 물리적으로 프로세싱하는 단계를 포함한다.
도 3 에 도시된 바와 같이, 본 시스템의 일 양태는 (도 2 의) 이들 프로세스들이 저장된 DNA 의 어떠한 증폭도 없다는 것이다. 즉, DNA 저장 시스템은 무증폭이다. 본 명세서에서 보다 상세하게 논의된 바와 같이, 다양한 방법들 및 장치들은 도 3 에 도시된 무증폭 엘리먼트들을 제공한다. 다양한 실시형태들에서, DNA 저장 시스템은 전체적으로 무증폭이다. 즉, 도 2 에 도시된 모든 프로세스가 무증폭이다. 다른 실시형태에서, 본 개시물에 따른 DNA 저장 시스템은 무증폭 엘리먼트를 포함할 수도 있지만, 시스템은 전체적으로 무증폭이 아닐 수도 있다. 그러나, 전체적으로 무증폭이 아닌 시스템 내의 무증폭 엘리먼트들에 의해 별개의 이점들이 여전히 제공된다. 전체적으로 무증폭이 아니지만, 적어도 하나의 증폭 없는 프로세스를 포함하는 그러한 시스템은 본 명세서에서 "감소된 증폭" DNA 정보 저장 시스템으로 지칭된다.
본 개시물에 따른 DNA 데이터 저장 시스템의 각각의 주요 요소는 시스템의 각 요소가 어떻게 DNA 증폭과 관련되거나 DNA 증폭을 수반하는지, 및 관련된 무증폭 요소가 어떻게 DNA 데이터 저장 시스템에 대해 구성될 수 있는지를 포함하여 이하에 상세히 설명된다.
본 개시물의 다양한 양태들에서, DNA 정보 저장 시스템은: 인코더/디코더; DNA 기록 디바이스; 및 DNA 판독 디바이스를 포함한다.
인코더/디코더:
다양한 양태들에서, 인코더/디코더는 2 개의 기능들을 제공하며: 인코더 부분은 주어진 디지털/이진 정보 또는 데이터를 DNA 기록기로의 입력들인 특정 DNA 서열들의 세트로 번역한다. 두 번째로, 디코더 부분은 DNA 판독기에 의해 제공되는 유형의 주어진 DNA 서열들의 세트를, 디지털 정보로 다시 번역한다.
도 4 는 이진 데이터를 DNA 서열로 변환하기 위한 몇몇 이진 인코딩 방식 (본 명세서에서 "BES" 로 지칭됨) 를 도시한다. 본 명세서에서 사용되는 다른 인코딩 방식은 에러 검출 및 에러 정정을 지원할 수 있는 방식을 포함한다. 이러한 예시적인 인코딩 시나리오에서, DNA 로 저장될 원본 디지털 데이터는 일반적으로 전자 이진 데이터로 발생될 것이다. 다양한 예에서, 정보 (예를 들어, 언어, 음악 등) 는 먼저 전자 이진 데이터로 변환될 수 있다. 이 원본 데이터는 그 후 세그먼트들로 분할되고, 재조립 데이터에 의해 증강되며, DNA 데이터 저장에 적합한 에러 정정 인코딩에 의해 변환되어, (도 4 에 예시된 것과 같은) 실제 이진 데이터 페이로드 세그먼트들을 생성할 것이며, 그 후에, 물리적 저장 분자를 생성하기 위해 후속 DNA 합성을 위해 DNA 서열로의 번역을 요구한다. 아래에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, DNA 논리 구조는 특정 데이터가 인코딩되는 데이터 페이로드 세그먼트를 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 데이터 페이로드 세그먼트는 저장 방법에 대한 메타데이터와 함께 저장되는 실제 1차 디지털 데이터를 포함하며, 이는 더 긴 스트링들에의 이러한 정보 단편들의 적합한 어셈블리에 관련된 데이터, 및/또는 패리티 비트들, 검사 합들, 또는 다른 이러한 정보 오버헤드와 같은, 에러 검출 및 정정에 관련된 데이터를 포함할 수도 있다.
이진에서 DNA 서열로의 일차 번역은 다양한 실시형태들에서, 도 4 에 예시된 것과 같은 이진 인코딩 방식 (BES) 에 의해 수행되는 것이다. 이들 인코딩 방식은 인코딩 DNA 분자에 대해 조립되는 대응하는 DNA 세그먼트를 암시하는 구별가능한 신호화 특징들의 목록을 먼저 생성함으로써, 이진 데이터 포맷과 같은 디지털 데이터 포맷으로부터 DNA 분자 서열 포맷으로의 일차 번역을 제공한다. 어느 BES가 적합한지를 선택하는 것은, 부분적으로, (도 8 과 관련하여 아래에서 논의되고 도 8 의 삽입으로 도시 된 것과 같은) 구별가능한 신호 특징들 및 그 배열들의 유형에 의존한다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 적어도 DNA 기록 및 DNA 판독 모두에서 발생할 수 있는 에러들을 감소시키기 위해, 1 비트의 디지털 이진 데이터를 1 초과의 DNA 염기로 변환시키는 것을 포함하는 BES 가 바람직하다.
도 4 는 예시적인 이진 데이터 페이로드, 특정 32 비트 워드 "00101001100111001111101000101101" 로 시작하고, 이진 데이터를 인코딩된 DNA 분자에 대한 하나 이상의 구별가능한 신호 특징들로 변환하는 몇몇 이러한 일차 인코딩을 도시한다. 도 4 에 도시된 바와 같이, BES1 은 데이터의 2 개의 비트들을 1 개의 DNA 문자로 인코딩하는 것, 예를 들어 1 개의 비트를 2 개의 구별가능한 시그널링 특징들 F1 및 F2 로 인코딩하는 것 (이들 특징을 구별할 수 있는 DNA 판독 센서와 함께 사용함) 이며; BES2 는 2 개의 이진수를 2 개의 염기 (1 개의 이진 비트 당 1 개의 DNA 문자) 로 인코딩하는 것, 예를 들어, 2 개의 이진 비트들의 조합 00, 01, 10 및 11 을 4 개의 특징들, F1, F2, F3, 및 F4 로 인코딩하는 것 (이들 특징을 구별하는 DNA 판독 센서와 함께 사용함) 이며; 그리고 BES3 는 서열 통로의 길이가 정보를 인코딩하는데 사용되는 일 예를 보여 주며, 이는 그러한 서열 런들이 DNA 판독 센서로부터 구별가능한 신호를 생성하는 경우에 적합하다. BES3 는 2 개의 이진수를 2 개의 염기 런들, AA 와 CCC (1 개의 이진 비트 당 1 개의 DNA 문자 런) 로 인코딩합니다. 예를 들어, BES3 은 이진 스트링 0, 1 및 00 을 3 개의 구별가능한 특징들 F1, F2 및 F3 로 인코딩한다. BES4 및 BES5 는 본원에서 X, Y, Z 및 W 로 표시되는 염기 유사체의 변형된 염기와 같은 추가 DNA 염기의 가능한 사용을 예시한다. 이러한 유사체가 DNA 판독기로부터 구별가능한 신호를 생성하는 경우, 이는 2 개의 구별가능한 유사체들을 사용하여 이진 코드를 구현하기 위해 BES4 에서와 같이 사용될 수 있다. BES5 는 8 개의 가능한 1/0 3 비트 상태 (3 비트 데이터 당 1 개의 DNA 염기 또는 변형된 염기) 를 인코딩하기 위해, 4 개의 고유 염기 및 4 개의 변형된 염기로 구성된 DNA 분자들을 사용하여, 3 비트의 이진 데이터를 나타내기 위해 총 8 개의 구별가능한 DNA 문자들을 사용한다. BES6 은 이러한 모티프들이 구별가능한 신호 트레이스들을 생성하는 경우에, 이진 정보 (1 개의 이진 비트 당 1 개의 DNA 서열 모티프) 를 인코딩하기 위한 서열 모티프의 사용을 예시한다.
본 명세서에서 사용하기 위한 인코딩 방식은 인코딩 특징의 신호를 구별할 수 있는 폴리머라제-기반 분자 센서와 같은 동족 센서를 가져야만 하며, 따라서 BES 의 선택은 특징을 구별하는 센서의 특성과 직접 관련된다. 16 진, 10 진, ASCII 등과 같은 이진 이외의 디지털 데이터 포맷 또는 알파벳은 도 4 의 BES 와 유사한 방식에 의해 DNA 신호화 특징으로 동일하게 암호화될 수 있다. Lempel-Ziv 인코딩과 같은, 최적의 정보 밀도의 관점에서 나타낸 것들보다 보다 복잡한 방식들은 데이터를 하나의 알파벳으로부터 다른 알파벳으로 고도로 효율적으로 변환하고 압축할 수 있다. 일반적으로, 이진 또는 다른 디지털 데이터 페이로드 스트링 또는 스트링들의 컬렉션을 DNA 서열 스트링 또는 이러한 스트링들의 컬렉션으로 변환하기 위해, 무손실 및 손실 인코딩 또는 압축의 방법들이 입력된 디지털 데이터 페이로드들로부터 DNA 데이터 페이로드들로의 일차 변환을 위한 방식들을 고안하는데 사용될 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 폴리머라제-기반 분자 전자 센서는 센서가 올리고 뉴클레오티드 5'-CCCC-3', 5'-GGGG-3', 및 5'-AAAA-3' 의 구별가능한 신호 특징을 만났을 때, 적합한 버퍼 용액으로 센서에 제공된 합성 DNA 분자에 제시된 각각의 역 상보적 주형 세그먼트 F1 = 5'-GGGG-3', F2 = 5'-CCCC-3', 및 F3 = 5'-TTTT-3' 에 결합될 때, 센서의 모니터링된 전기 파라미터에서 구별가능한 신호들을 생성하였다. 이 실시형태에서, 이진 인코딩 방식이 사용되었으며, 여기서 비트 0 은 GGGG (즉, F1) 로 인코딩되었고, 비트 1 은 CCCC, 즉 F2 로 인코딩되었고, 이진 스트링 00 은 TTTT, 즉 F3 으로 인코딩되었다. 이 인코딩 방식은 TTTT 로서 00 의 인코딩, 즉 GGGGGGGG 로서 인코딩한 0 의 2 개의 연속하는 데이터 비트들이 아닌, 데이터 스트링 00 으로 인코딩하는 것을 포함하였다. 이어서, 이 코딩 방식을 사용하여 합성 DNA 분자에 혼입시키기 위해 "01001" 의 입력 이진 데이터 페이로드를 뉴클레오타이드 서열로 인코딩하였다. F1-F2-F3-F1 의 특징 서열로의 변환은 이진 데이터 01001 의 입력 데이터 스트링을 세그먼트 0, 1, 00 및 1 로 나누고 이들 데이터 세그먼트들을 5'-GGGGCCCCTTTTGGGG-3' 로서 인코딩된 DNA 분자의 DNA 데이터 페이로드 세그먼트로 컨버팅함으로써 시작되었다. 다른 실시형태들에서, 구별가능한 신호 특징들 사이에 삽입된 "구두점" 서열 세그먼트들이 있을 수도 있는데, 이는 구별가능한 특징들, 예를 들어 결합된 올리고뉴클레오티드들을 변경하지는 않고, DNA 합성 화학의 특수 특성들 또는 제약들을 수용하거나, 신호 특징들 사이의 추가된 시간 분리 또는 감소된 입체 장애를 위한 스페이서들을 제공하거나, 또는 DNA 분자의 구조를 향상시키는 것과 같은 이점들을 제공한다. 예를 들어, A 가 그러한 구두점 서열인 경우, DNA 인코딩 서열은 5'-AGGGGACCCCATTTTAGGGGA-3' 이 될 것이다. 일반적으로, 이러한 구두점 서열들 또는 필러 서열들의 삽입은 디지털 데이터 페이로드로부터 합성될 암호화 DNA 서열로 번역하는 프로세스의 부분일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 010011100010 와 같은 이진 데이터로서의 정보는 3 개의 상태들 A, B, C 를 이용하여 인코딩될 수도 있으며, 여기서, 0 은 A 로 인코딩되고, 1 은 B 로 인코딩되고, 00 은 00 이 발생할 때마다 (즉, 00 을 AA 로서 인코딩하지 않기 위해) C 로서 인코딩된다. 이 방식에 따라서, 이진 단어 010011100010 은 인코딩된 형태 ABCBBBCABA 와 같다.
일반적으로, 이진 또는 다른 디지털 데이터 페이로드 스트링 또는 스트링들의 컬렉션을 DNA 서열 스트링 또는 이러한 스트링들의 컬렉션으로 변환하기 위해, 컴퓨터 과학에서 널리 공지된 방법들과 같은, 무손실 및 손실 인코딩 또는 압축의 많은 방법들이 도 4 의 예들을 일반화하는, 구별가능한 특징 DNA 세그먼트들의 스트링들로서의 DNA 서열 데이터 페이로드들로의 입력 디지털 데이터 페이로드들의 1차 변환을 위한 방식들을 고안하는데 사용될 수 있다. 이러한 더 넓은 상황에서, 도 4 에 예시된 BES 방식들은 표준 염기들, 변형된 염기들, 또는 서열 모티프들 또는 런들과 같은, 데이터 인코딩을 위한 알파벳의 심볼들이 될 수 있는 특징 엘리먼트들의 유형을, 이러한 엘리먼트들이 동족 판독기 센서를 가질 경우, 예시한다.
도 5 는 물리적 DNA 분자와 그 안에 인코딩된 디지털 데이터 사이의 관계를 예시한다. 물리적 DNA 는 예를 들어, 저장 시스템의 세부사항에 따라 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수도 있다. 도시된 논리 구조에서, 서열 데이터 페이로드는 에러 정정 및 어드레싱 정보를 포함하는 이진 데이터를 나타내며, 이는 물리적 DNA 분자의 서열의 오직 일부만을 포함한다. 특정 상보적 올리고뉴클레오티드에 대한 결합 부위, 비오틴 부위와 같은 DNA 조작에 유용한 다른 형태의 통상적으로 사용되는 결합기 또는 공간 분리를 제공하는 세그먼트를 보유하는 영역, 또는 판독 또는 기록 시스템들의 특성을 보정하는 데 사용된 서열 세그먼트들과 같은, DNA 의 물리적 핸들링과 관련된 추가 LEFT 및 RIGHT 서열 세그먼트가 있을 수도 있다. 인코더/디코더 프로세스는 일반적으로 물리적 DNA 가 아닌 데이터에 수행되기 때문에, 통상적으로 임의의 형태의 DNA 물리적 증폭을 자체적으로 요구하거나 규정하지는 않는다.
계속해서 도 5 를 참조하여, 도시된 DNA 논리 구조는 정보 전달 DNA 단편의 예시적인 구조이다. 이 예에서, 프라이머 세그먼트는 프라이머 타겟/구조를 포함한다. 추가로, L-버퍼 세그먼트는 인코딩된 서열 및 패리티 비트들과 같은 관련된 에러 정정 서열을 저장하는 정보를 포함하는 데이터 페이로드 세그먼트 전에, DNA 판독기를 위한 신호 교정 서열, 또는 버퍼링 (buffering) 서열을 포함할 수도 있다. R-버퍼 는 DNA 를 판독할 때 주형의 말단에 너무 가까이 가지 않도록 하기 위해 프로브 분자 (예를 들어, 폴리머라제) 를 허용하는 추가 교정 서열 및 버퍼 서열을 포함할 수도 있다. L-어댑터 및 R-어댑터 는 PCR 증폭, 또는 혼성 기반 선택을 위한 외측 프라이밍 부위들을 위한, 또는 캐리어로서의 숙주 유기체 게놈으로의 삽입을 포함한 이러한 삽입을 위한 둘러싸는 캐리어 DNA 를 나타내는, 어댑터들과 같은, 연관된 DNA 세그먼트의 저장 또는 조작과 관련된 서열 엘리먼트들일 수도 있다. 논리 구조의 데이터 페이로드 부분은 일반적으로 아카이브되는 실제 일차 데이터뿐만 아니라, 이 정보의 더 큰 스트링으로의 조립, 또는 에러 검출 및 정정과 같은, 저장 방법에 대한 메타 데이터를 포함할 수도 있다.
DNA 기록 디바이스:
다양한 실시형태들에서, 본원에 사용하기 위한 DNA 기록 디바이스는 주어진 세트의 입력 DNA 서열 데이터를 취하여 이들 서열을 갖는 DNA 분자를 생성한다. 각각의 원하는 서열에 대해, 그 서열을 나타내는 다수의 DNA 분자들이 생성된다. 생성된 분자들의 다중도는 각각의 원하는 서열에 대해 10, 100, 1000, 수백만, 수십억, 또는 수조 개의 DNA 분자들의 복제본들의 범위들이 있을 수 있다. 모든 원하는 서열들을 나타내는 이들 복제본들 모두는 분자들의 하나의 마스터 풀로 모일 수도 있다. 이러한 DNA 기록 시스템들은 전형적으로 기록이 완벽하지 않으며, 만약 N 개의 분자들이 주어진 입력 서열을 나타내도록 합성되면, 이들의 모두가 원하는 서열을 실제로 실현할 수는 없다. 예를 들어, 이들은 잘못된 결실들, 삽입들, 또는 부정확한 또는 물리적으로 손상된 염기들을 포함할 수도 있다. 이러한 시스템은 통상적으로 DNA 분자를 합성하는 몇 가지 주요 수단 의존할 것이며, 예를 들어 화학 반응 및 합성되는 별개의 서열들의 수의 관점에서 대규모로 프로세스들을 수행하기 위한 유체 시스템을 포함한다 (예를 들어, Kosuri and Church, “Large Scale de novo DNA Synthesis: Technologies and Applications,” Nature Methods, 11: 499-509, 2014 참조). DNA 분자들을 합성하는 방법들 및 디바이스들의 비한정적인 예들은 Agilent Technologies 및 Twist BioScience 에 의해 제공되는 상업적 기술을 포함한다.
도 6 은 DNA 분자를 합성하는 방법을 예시한다. 다양한 실시형태들에서, DNA 를 합성하는 일차 방법은 임의의 증폭 절차를 사용하지 않고 동일한 DNA 서열의 많은 경우들을 공동 합성한다. 이러한 방법은 다수의 물리적으로 또는 화학적으로 분리된 반응들을 수행하며, 여기서 각각의 분리된 영역은 각각의 타겟 서열의 합성을 위한 다수의 분자 시작 부위들을 포함한다. 도 6 에서, 분자 시작 부위는 "M" 으로 표시되고, 예를 들어 도시된 바와 같이 고체 지지 표면 상에 위치된다. 별개의 타겟 서열 "N" 은 표면을 따라 별개의 분리된 반응 영역에서 생성되고, 동일한 반응 내에서 모든 시작 부위를 반응시키며, 여기서 이들 반응들은 예컨대 사용된 시스템에 의존하여, 상이한 서열 타겟들에 대해 시간적으로 연속적으로 또는 병렬로 적용될 수도 있다. 이들 결합된 반응들, 예를 들어 도 6 에서 A 로부터 B 로 C 로의 반응들은 하나 이상의 원하는 염기를 그 영역의 시작 부위에서 성장하는 분자에 첨가한다. 이러한 접근법은 고전적인 포스포라미다이트 DNA 합성과 같은 방법들뿐만 아니라, 염기의 효소적 첨가에 의존할 수도 있는 방법, 예를 들어 말단 트랜스퍼라제 효소를 활용하여 염기 첨가를 달성하는 방법을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 뉴클레오티드들은 분자들을 형성하는 기록 프로세스에서의 이들의 합성의 용이성, 합성된 분자들에서 2차 구조를 형성하는 경향의 감소, 및/또는 데이터 디코딩 프로세스 동안 판독의 용이성에 기초하여, 뉴클레오티드 서열들에의 혼입을 위해 우선적으로 선택될 수 있다. 다양한 양태들에서, 불량 기록 모티프들 및 불량 판독 모티프들이 뉴클레오티드 서열들에의 혼입을 위한 뉴클레오티드들의 선택에서 회피되며, 그 뉴클레오티드 서열이 인코딩된 정보를 디코딩하기 위해 판독될 때 상호 구별가능한 신호들을 발생시키는 뉴클레오티드 서열에서의 세그먼트들을 혼입시키는 것에 초점을 둔다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열을 판독할 때에, A 및 T 가 상호 구별가능하며, C 및 G 가 상호 구별가능하며, A, C 및 G 가 상호 구별가능하며, AAA 및 TT 가 상호 구별가능하며, A, GG 및 ATA 가 상호 구별가능하고, C, G, AAA, TTTT, 및 GTGTG 가 상호 구별가능하다. 이들, 및 다수의 다른 세트들의 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 세그먼트들은 판독기에 상호 구별가능한 신호들을 제공하며, 따라서, 정보의 세트를 뉴클레오티드 서열로 인코딩할 때 뉴클레오티드 서열에의 혼입을 위해 고려될 수 있다.
추가적으로, 기록하기 어려운 뉴클레오티드 세그먼트들이 존재하며, 따라서 정보의 세트를 뉴클레오티드 서열로 인코딩할 때 회피되어야 한다. 다양한 실시형태들에서, 뉴클레오티드 서열로의 정보의 세트의 인코딩은 정보의 세트를 판독하기 어렵고 기록하기 어려운 특징들을 회피하는 방법으로 정의하기 위해 에러 정정 인코딩과 함께, 이진 0/1, 3진 (trinary) 0/1/2 또는 4진 (quaternary) 0/1/2/3 코드, 등에 대응할 수도 있는 바와 같은, 인코딩 심볼들로서의 나머지 구별가능한 특징 세트들 중 하나의 사용을 포함한다. 이러한 방법으로, 정보 저장 시스템의 전체 성능이 향상된다.
DNA 판독 디바이스:
다양한 양태들에서, 본원에 사용된 DNA 판독 디바이스는 DNA 분자들의 풀을 취하여 이 풀로부터 샘플링되거나 또는 선택된 분자들의 각각에 대해 측정된 신호들의 세트를 생성하는 디바이스이다. 그 후에, 이러한 신호는 DNA 서열로 번역되거나, 그렇지 않으면 DNA 분자에 존재하는 염기 패턴 또는 모티프를 특성화하기 위해 사용된다. DNA 에 저장된 데이터를 판독하기 위한 현재의 방법은 DNA 샘플로부터 서열의 1 차 회수를 위해 상업적 차세대 DNA 시퀀서에 의존할 수도 있다. 이러한 판독기들은 실제로 단지 시스템에 도입된 DNA 분자들의 작은 부분만을 조사하므로, 단지 작은 분획만이 실제 판독 시도를 경험할 것이다. 따라서 대부분의 입력 DNA 분자가 분석되지 않고 단순히 낭비되는 경우, DNA 판독 이전의 증폭이 일반적이다. 더욱이, 많은 DNA 시퀀싱 방법은 시퀀싱 준비를 위해 표면 또는 비드 상으로 DNA 를 증폭시키는 프로세스의 기본 부분으로서 증폭 단계를 가지며, 예를 들어, 상업용 Illumina HiSeq 시스템 (Illumina, Inc.), 454 시스템 (Roche, Inc.) 또는 Ion Torrent 시스템 (Thermo Fisher, Inc.) 에 의해 예시된 바와 같거나, 또는 검출 프로세스의 제한들을 충족하는데 필요한 충분한 입력 재료를 생성하기 위해 열 순환 터미네이터 시퀀싱 반응을 사용하는 것과 같이 종래의 Sanger 시퀀싱에서 실행되는 것과 같다. 또한, 나노포어 시퀀싱에서 수행되는 증폭 단계가 있을 수도 있다. 다른 방법들은 증폭을 사용하여 시퀀싱을 위한 태그를 추가할 수도 있다.
DNA 시퀀싱 방법은 또한 개별적으로 샘플 제조 단계 동안 증폭 절차의 하나 이상의 라운드에 의존할 수도 있다. 이러한 방법은 후속 프로세싱을 지원하기 위해 어댑터 DNA 세그먼트의 추가에 사용되어 왔다. 또한 일부 시퀀싱 방법은 적어도, 단일 가닥 주형이 Pacific BioSciences, Inc. 의 "Circular Consensus Sequencing" 또는 Oxford Nanopore Technologic, Inc. 의 "2D" 헤어핀 시퀀싱과 같은 시퀀싱을 위해 제시된 상보적 가닥을 가질 것을 요구한다. 입력으로서 단일 가닥 주형이 제시된 경우, 이러한 방법은 실제 시퀀싱이 시작되기 전에 상보적 가닥을 생성하기 위해 적어도 하나의 확장 라운드, 증폭의 형태를 갖는 프로세스를 필요로 한다. 또한, 비효율적인 기공 로딩을 갖는 나노포어 시퀀싱과 같이 일차 시퀀싱 프로세스를 위해 비교적 많은 양의 입력 주형을 필요로 하는 방법은, 또한 요구되는 입력량 하한치를 달성하기 위해 입력 DNA 의 증폭을 요구할 수도 있다.
DNA 라이브러리 관리:
다양한 실시형태에서, DNA 라이브러리 관리는 물리적 DNA 상에서 수행되는 동작 절차들 및 관련 방법들 및 장치들의 컬렉션을 포함한다. 이러한 절차들 중 일부는 용액에서 DNA 를 건조시키고, 건조된 DNA 를 용액으로 재현탁시키고, 물리적 양의 DNA 를 프리저 내부로 및 외부로 전송 및 저장하는 것과 같은 DNA의 물리적 저장 및 검색의 메커니즘과 관련된다. 다른 절차는 데이터의 카피들 형성, 데이터 삭제 및 데이터의 서브세트 선택과 같은 정보 저장 관리와 관련되며, 이 모두는 DNA 재료에 대한 물리적 동작을 수반한다. 풀에서 DNA 를 카피 또는 DNA 를 선택하는 것은 일반적으로 PCR 증폭 또는 선형 증폭 방법을 사용하여 수행되므로, 라이브러리 관리를 위한 일반적인 방법은 DNA 증폭에 의존할 수도 있다. 예를 들어, PCR 프라이머 부위가 적소에 준비된 라이브러리의 경우, DNA의 대표 샘플을 채취한 후, 이를 카피에 필요한 양까지 PCR 증폭함으로써 전체 아카이브를 카피할 수 있다. 추가의 예를 들어, 볼륨-특정 PCR 프라이머로 제조된 라이브러리에 대해, 라이브러리로부터의 볼륨은 전체 라이브러리를 나타내는 작은 DNA 샘플로부터 단지 원하는 볼륨만을 증폭하도록 PCR 프라이머를 사용함으로써 선택될 수 있다.
DNA 디지털 데이터 저장에서 증폭을 위한 동기 부여:
상기 요소들 (DNA 기록기, DNA 판독기) 로부터 구상된 DNA 정보 저장 시스템은 특정 단일 분자 레벨에서 효과적으로 작동하지 않을 수도 있으며, 이는 증폭의 사용을 자극한다. 즉, GATTACA 와 같은 타겟 DNA 데이터 저장 서열이 있다면, 그 서열을 나타내는 오직 단일 물리적 분자만을 만들고, 그 단일 분자를 아카이브하고 핸들링한 다음, 그 단일 분자로부터 데이터를 판독하는 것은 실행가능하지 않을 것이다. 실행 불가능성은 많은 그러한 컴포넌트 프로세스에 존재하는 분자 구조 에러, 분자 손실 및 신호 검출 한계의 많은 원인에 기인한다. 따라서, 프로세스의 다양한 스테이지에서 단일 분자의 증폭이 모든 이들 프로세스들에 관여하는 더 많은 시험 분자를 제공하는 것이 종종 제안된다. 따라서, 본원에서 달성되는 목표는 DNA 데이터 저장 시스템을 포함하는 다양한 프로세스들에서 증폭 단계의 필요성을 개별적으로 또는 집합적으로 제거하는 특정 프로세스들을 제공하는 것이다.
DNA 데이터 저장에서 무증폭 방법 및 장치의 이점:
DNA 정보 저장 시스템에서 무증폭 프로세스에는 많은 이점들이 있다. 일반적으로, 정보 저장 시스템의 맥락에서 DNA 의 증폭은 절차의 요구로부터 직접 비용, 시간 및 동작 복잡성을 시스템에 추가할 것이다. 증폭은 또한 전형적으로 다른 서열들보다 일부 서열을 증폭시키므로, 정보의 손실 또는 부정확한 정보, 또는 정보 복구 시간 또는 비용의 증가를 초래할 수 있는, 저장 시스템의 데이터에 표현적 편향을 도입할 수도 있다. 수반된 효소가 카피 프로세스 동안 에러를 발생할 수 있거나 또는 상이한 주형 DNA들의 서열 부분을 포함하는 키메라 분자 (chimeric molecule) 또는 완전한 카피들이 아닌 부분 분자를 생성할 수 있기 때문에, 증폭은 또한 DNA 서열에서 에러를 생성할 수 있다. 따라서 증폭은 데이터에서 에러를 생성하거나, 또는 스퓨리어스 "잡음" 분자를 생성할 수 있다. 증폭 동안 생성된 다량의 DNA 가 다른 비-증폭 샘플을 오염시킬 수 있고 오염원으로부터 나오는 그러한 샘플들에서 전체 DNA 함량의 상당 부분을 초래할 수 있기 때문에, DNA 증폭은 또한 오염을 초래할 수 있다. 따라서, 증폭은 저장된 데이터의 "손상" 을 생성할 수 있다. 증폭 방법은 또한, 증폭을 달성하기 위해 사용되는 프라이밍 및 효소 연장 프로세스들을 지지하기 위해 DNA 분자의 말단에서 1, 2 또는 그 이상의 플랭킹 프라이머 서열을 필요로 한다. 전형적으로 길이가 6 내지 30 염기 범위인 이러한 프라이머 서열은 DNA 분자들로 합성되어야 하므로, 이는 DNA 기록 프로세스에서 비용, 복잡성 및 에러 잠재성을 증가시킨다.
증폭은 또한 일반적으로 DNA 변형을 재생할 수 없으며, 이들 중 핵산 화학에 대단히 많이 공지되어 있고 본원에 기술된 방법에 사용된다. 따라서, DNA 데이터 저장 시스템의 임의의 지점에서 증폭의 사용은 DNA 데이터 저장 시스템의 성능을 향상시키기 위해 사용될 수 있는 이러한 매우 다양한 변형된 DNA 를 사용하는 능력을 크게 제한한다. 따라서, 이러한 시스템이 그러한 변형된 형태의 DNA 를 정보 저장 분자로 사용될 수 있게 하는 것은 무증폭 시스템의 이점이다. 예를 들어, 변형된 DNA 는 DNA 가 센서에 의해 판독될 때 센서에서 신호 대 잡음을 증가시켜서 판독 시스템의 전력을 크게 향상시키는, DNA 염기 상의 치환기를 포함할 수도 있다. DNA 변형은 기록 프로세스, 생성된 분자의 안정성을 향상시키거나 또는 분자로부터 데이터를 조작 및 판독하는 능력을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 변형된 DNA 를 사용하면 오직 신뢰 기관에게만 알려진, 또는 오직 특수 판독 시스템만이 판독할 수 있는 검출가능한 변형들을 가짐으로써 데이터 보안 또는 암호화를 제공할 수 있다. 잠재적으로 DNA 데이터 저장 시스템의 능력들을 향상시키는데 사용될 이러한 화학 분야의 당업자에게 공지된 많은 유형의 변형들이 있으며, 예컨대 변형된 염기, PNA (Peptide Nucleic Acid) 에서와 같은 DNA 백본의 변형들, 또는 백본의 티올-포스페이트 또는 요오드-포스페이트 변형, 또는 다른 DNA 유사체들, 예컨대 LNA (Locked Nucleic Acids) 또는 다양한 XNA (Xeno Nucleic Acid), 또는 당 고리, 또는 메틸화된 염기 또는 라벨링된 염기에 대한 변형들, 또는 비오틴 또는 다른 컨쥬게이션 또는 결합기와 같은 DNA 분자의 다양한 부위에서의 다른 화학기, 또는 판독기에게 더 강한 신호를 생성하는 기의 첨가이다.
본 개시에 따른 DNA 디지털 데이터 저장 시스템은 전체적으로 증폭이 없거나 또는 적어도 하나의 무증폭 서브시스템을 포함함으로써 운영 비용을 낮추는 이점이 있다. 본 시스템의 추가 이점은 정보를 저장 및/또는 복구하는데 걸리는 시간이 감소될 수도 있다는 것이다. 추가 이점은 시스템이 복잡성을 낮추고 결과적으로 총 소유 비용을 낮추고, 실패 위험을 줄이거나, 또는 실패들 사이의 평균 시간을 늘릴 수 있다는 것이다. 증폭 프로세스에 내재된 표현 편향이 회피되어 DNA 를 기록, 추출 또는 판독할 때, 수반되는 다양한 서열들이 이들 각각의 프로세스들에서 및 정보를 저장 및 검색하기 위한 전체 시스템에서 보다 균등한 표현을 얻는다는 추가 이점이 있다. 증폭으로 인한 도입된 에러 또는 데이터 손상의 형태를 회피하는 것이 추가 이점이다. 증폭 프라이머 서열을 DNA 분자로 합성할 필요성을 회피하는 것이 추가 이점이다. 증폭 부산물에 의한 다른 DNA 데이터 저장 샘플의 잠재적 오염이 제거되어 시스템 무결성, 견고성, 효율성 및 보안성이 향상된다는 추가 이점이 있다. 무증폭 DNA 정보 시스템 또는 서브시스템은 내부에서 DNA 의 염기, 당 또는 백본에 대한 변형을 포함할 수도 있고 보다 효과적인 판독 시스템 (예를 들어, 향상된 센서 신호) 또는 보다 효과적인 기록 시스템 (예를 들어, 보다 효율적인 합성 화학) 을 제공할 수도 있는, 또는 정보를 DNA 로 인코딩하기 위한 더 많은 옵션을 제공할 수도 있는, 변형된 DNA 의 사용과 여전히 호환가능하다.
기록시 증폭을 회피하는 방법:
다양한 실시형태들에서, DNA 를 기록하기 위한 합성 방법이 제공되어 각각의 원하는 서열에 대해 물리적 DNA 분자의 많은 경우를 공동 합성한다. 도 6 은 각각의 타겟 서열에 대한 M 개의 별개의 시작 부위들로부터 N 개의 타겟 서열을 나타내는 DNA 분자를 생성하도록 의도된 합성 프로세스를 도시한다. 그 후에, 프로세스는 지역적으로 또는 화학적으로 분리되고 국소화된 벌크 반응을 통해 이들 M 개의 부위들에 평행하게 하나의 염기 또는 염기 세그먼트를 연속적으로 첨가하는 주기적 합성 반응을 포함한다. 이상적으로, M DNA 분자들이 생성되며, 이들 모두는 타겟 DNA 서열을 나타낸다. 이러한 순환적이고 연속적인 염기 첨가 프로세스의 경우, 각각의 표적 DNA 서열의 공동 합성된 복제물이 자연적으로 생성되므로, 이들은 각각의 타겟 DNA 서열의 M 개의 물리적 사례를 기록하기 위한 무증폭 프로세스를 제공할 수 있다. 이러한 방법은 무증폭 DNA 저장 시스템의 일부일 수 있다. 이러한 DNA 합성 방법의 예는 Twist Bioscience, Inc. 및 Agilent, Inc. 에 의해 상업적으로 수행된 것과 같은 DNA 올리고뉴클레오티드의 인쇄를 위한 잉크젯 프린터 합성 프로세스들, Affymetrix, Inc. 및 Nimblegen, Inc. 에 의해 상업적으로 수행된 것과 같은 DNA 올리고뉴클레오티드의 광 지향성 병렬 합성뿐만 아니라, Applied Biosystems, Inc. 에 의해 그들의 3900 DNA 합성기 (48 개의 병렬 합성 컬럼들) 에서 수행된 것과 같은 다수의 소량 또는 미세 유체 클래식 포스포라미다이트 DNA 합성 반응을 동작시키는 많은 접근법들이 있다. 따라서, 이러한 합성 프로세스 내에서 각각의 타겟 서열의 더 많은 수의 분자를 직접 공동 합성함으로써, 원하는 수의 카피들을 생성하기 위해 합성 후 이들 합성 부산물의 증폭은 회피된다.
판독시 증폭을 회피하는 방법:
현재의 시퀀싱 기술을 사용하여 DNA 를 판독할 때 종종 입력 DNA 를 증폭해야 할 필요가 있다. 일부 방법에서, 이는 방법이 더 많은 입력량을 필요로 하고, 따라서 다양한 샘플 소스들로부터 전형적으로 입수할 수 있는 것보다 상당히 많은 양의 DNA 를 필요로 하기 때문에 발생한다. 다른 방법에서, 시퀀싱 라이브러리의 생성은 증폭 단계를 포함한다. 일반적으로 클론 시퀀싱 방법으로 알려진 다른 방법에서, 시퀀싱될 분자의 다수의 카피들이 시퀀싱 프로세스의 필수 부분으로서 지지체 상에 직접 생성되고 국소화되어야 하며, 예컨대 Solexa/HiSeq 기기 (Illumina, Inc.) 에 사용되는 DNA 클러스터, Ion Torrent 기기 (Thermo Fisher, Inc.) 에 사용된 DNA "SNAP 또는 ISP" 비드, 또는 ABI SOLiD 기기 (Life Technologies, Inc.) 에 필요한 DNA 비드, 또는 DNA 454 기기 (Roche, Inc.) 에 사용되는 비드이다. 이러한 증폭 요건은 적합한 단일 분자 시퀀싱 방법을 사용함으로써 제거될 수 있다. 이러한 방법에서, 단일 DNA 분자는 센서에 의해 분석되어 분자로부터 기본 서열 판독 또는 데이터 추출을 생성한다. 이러한 방법은 원칙적으로, 센서에 의한 분석 이전에 DNA 분자를 증폭시킬 필요가 없다. 따라서, 적합한 단일 분자 DNA 판독 센서를 활용하는 것은 무증폭 판독을 달성할 수 있는 수단을 제공한다. DNA 시퀀싱의 이러한 단일 분자 방법은 도 24 및 도 25 에 예시된다.
또한, 도 25 에 도시된 센서에서와 같이, 폴리머라제가 전기 신호를 생성하기 위해 부착되게 하는 탄소 나노튜브를 사용하는 방법이 중요하다. 그러나, 원칙적으로 이러한 단일 분자 시퀀싱 시스템은 상업적으로 사용되는 것과 같은 DNA 의 무증폭 판독을 제공할 수 있지만, 그러한 시스템은 종종 확립된 프로토콜에서 증폭을 요구하는 것에 주목한다. 예를 들어, 옥스포드 나노포어 미니언 시퀀서 (Oxford Nanopore Minion Sequencer) 는 표준 프로토콜에서 마이크로그램의 양의 입력 DNA 를 필요로 하며, 이는 DNA 데이터 저장의 맥락에서 달성하기 위해 임의의 형태의 증폭을 필요로 한다. 또한, 옥스포드 시스템 "2D" 시퀀싱의 바람직한 시퀀싱 모드는, 샘플 준비 단계에서 헤어핀 어댑터와 결합한 후에 보다 정확한 공통 서열을 생성하기 위해 양자의 가닥들을 판독하기 때문에, 이중 가닥 분자를 갖는 것이 필요하다. 이것은 전형적으로 1 차 단일 가닥 합성 저장 분자를 위한 상보적 DNA 가닥을 합성하기 위해 효소 증폭 단계를 필요로 한다. 다른 시퀀서는 이중 가닥 입력 DNA 를 필요로 할 수도 있으므로, 일차 단일 가닥 합성 저장 분자로부터 상보적 가닥을 생성하기 위해 전형적으로 증폭 단계를 필요로 할 것이다.
판독될 DNA 의 임의의 증폭을 요구하지 않는 단일 분자 DNA 판독기의 실시형태는 도 7 내지 도 23 과 도 25 에 도시된 바와 같이, 그리고 하기에 추가로 설명된 것과 같이, CMOS 센서 픽셀 어레이 칩 상에 배치된 분자 전자 센서이다.
DNA 아카이브 관리에서 증폭을 회피하는 방법:
DNA 데이터 저장 아카이브 관리 시스템이 포함할 수도 있는 주요 동작들이 하기에 고려된다.
1. DNA 저장 아카이브 동작
주어진 아카이브에 대해, 다음 동작을 수행하는 것이 바람직할 수도 있다:
● 아카이브의 카피를 생성한다;
● 데이터를 아카이브에 부가한다;
● 아카이브로부터 타겟팅된 볼륨을 리드아웃한다;
● 아카이브로부터 볼륨을 삭제한다; 그리고
● 아카이브를 탐색한다.
다양한 실시형태에서, 본 개시물에 따른 DNA 아카이브는 그의 주요 물리적 상태에서 DNA 분자의 풀 (즉, 혼합물) 로서 존재하며, 각각의 원하는 DNA 서열은 다수의 분자 표본들로 표현된다. 이 DNA 분자 풀은 건조한 상태 또는 용액 상태로 저장될 수 있다. 임의의 경우에, 아카이브는 이들 동작들을 수행하기 위해 호환가능한 버퍼 용액 내에서 일시적으로 최대 동작 온도들까지 상승될 수 있다. 이들 동작들은 물리적 저장 시스템에 의해 효율적으로 수행될 것이며, 이는 튜브들의 핸들링을 자동화, 액체 핸들링, 생화학 반응들을 수행하는 것, 및 물리적인 아카이브 물질을 유지하고 조작하는 것에 관련된 다른 절차들을 포함할 수도 있다.
이러한 저장 관련 동작들은 다음과 같이 증폭과 함께 일반적으로 수행되는 것과 같은 동작들을 수행하는 것과 달리 증폭 없이 달성될 수 있다.
2. 카피:
아카이브를 카피하는 것은 간단히 스톡 용액의 분취량을 취함으로써 임의의 증폭 없이 수행될 수도 있다. 이는 향후 정보 검색을 지원하고, 또한 아마도 추가의 카피와 같은 제한된 수의 추가 아카이브 동작들을 지원하기에 충분한 양이 취득되는 한, 기능적 카피를 제공한다. 대조적으로, 카피는 예컨대 인코딩 DNA 분자 증폭 프라이머 부위들에 포함시키는 것에 의해 증폭을 통해 보다 일반적으로 수행될 것이고, 따라서 스톡으로부터의 작은 샘플이 취득된 다음, 선형 또는 지수적 증폭 반응에서 프라이밍 및 증폭이 뒤따르며, 원본 아카이브의 기능적 카피를 나타내는 상당량의 재료를 획득할 수 있다. 따라서, 아카이브를 카피하기 위한 이러한 증폭 프로세스들을 회피하는 유리한 방법이 제공된다.
무증폭 DNA 판독 시스템을 사용하여 아카이브로부터 모든 정보를 판독한 다음, 무증폭 DNA 기록 시스템을 사용하여 모든 정보를 새로운 DNA 아카이브에 기록함으로써 증폭 없이 아카이브의 카피를 수행할 수 있으며, 이로써 원래 DNA 데이터 아카이브의 DNA 데이터 카피를 달성할 수 있다.
3. 부가:
데이터를 아카이브에 부가하거나 또는 아카이브들을 병합하는 것은 추가적인 DNA 또는 아카이브 재료를 풀링 (pooling) 하고 혼합함으로써 간단히 달성될 수 있다. 이는 증폭이 필요하지 않다.
4. 타겟화된 판독
아카이브 내 개별 "볼륨들" 에 대한 작업은 DNA 분자들로 서열-특정 올리고뉴클레오티드 결합 부위들을 인코딩함으로써 증폭 없이 수행될 수 있으며, 각각의 볼륨에 대한 상이한 식별자/결합 서열이 이렇게 액세스가능하게 된다. 그 후, 특정의 볼륨을 리드아웃하기 위해, 혼성-기반 캡처는 원하는 결합 서열들을 갖는 특정 DNA 단편들만을 선택하기 위해 사용될 수 있다. 이 프로세스는 증폭이 없을 수 있다. 볼륨 식별자들은 또한 DNA 를 뉴클레오티드 변형들과 합성함으로써 추가될 수 있으며, 따라서 관련된 결합 타겟들은 DNA-서열 특정 혼성 그 자체를 통하지 않고, 합성에 사용된 염기들에 관한 다른 변형들에 있다. 예를 들어, 비오티닐화된 염기, 또는 다양한 합텐 변형을 갖는 염기, PNA, 비표준 DNA 염기 또는 항체 결합을 위한 에피토프 타겟들을 보유하는 세그먼트들의 사용, 또는 개선된 결합 친화성을 위한 PNA 프라이머 부위의 사용은 모두 유사하게 합성에 의도적으로 도입된 이들 변형에 대해 대응하는 상호작용 파트너를 통해 DNA 의 서브세트를 결합 또는 조작하는 선택적인 능력을 제공한다. 이들 무증폭 타겟팅 방법은 모두 관심 있는 타겟 볼륨을 증폭시키기 위해 PCR 유사 프로세스에 의존하는 타겟팅된 판독과 대조적이다.
무증폭 타겟화된 판독의 다른 실시형태는 아카이브, 또는 아카이브의 대표적인 샘플이 먼저 무증폭 판독기에 제공되어 전체 아카이브의 정보 내용으로부터 판독 샘플링을 획득하는 프로세스이다. 판독들이 그들에 볼륨 식별자가 있다고 가정하면, 원하는 볼륨으로부터의 판독 데이터는 모든 이러한 판독 데이터로부터 정보학적으로 선택되어 정보학 선택을 통해 타겟화된 판독을 달성한다. 다른 이러한 실시형태는 단편에서 볼륨 식별자를 실시간으로 판독할 수 있는 판독기에 의존하고, 식별자가 타겟 볼륨에 있지 않은 경우 다른 DNA 단편을 중단시키거나, 또는 거부하고 및 획득하지만, 그렇지 않으면 타겟 볼륨 식별자를 검출할 경우에 판독을 완료하여 타겟화된 판독을 달성한다. 이것은 동적 정보학 선택이며, 타겟화된 볼륨을 판독하는 과정에서 덜 불필요한 정보를 판독하는 이점을 갖는다. 이러한 능력을 제공할 수 있는 판독기는 나노포어 시퀀싱 센서의 특정 실시형태들뿐만 아니라, 하기에 상세히 기술된 분자 전자 센서를 포함한다.
5. 탐색
리터럴 입력 스트링에 대한 아카이브의 탐색은 탐색 스트링 또는 관심 있는 스트링을 DNA 형태로 인코딩하고, 원하는 DNA 서열에 대한 상보적 형태 또는 관련 프라이머를 합성하고, 이들 원하는 서열 단편의 아카이브로부터 혼성화 추출물을 사용함으로써 달성될 수 있다. 회수된 DNA의 양을 정량화하거나, 또는 DNA 데이터 판독기를 사용하여 회수된 재료를 조사함으로써 히트들을 식별할 수 있다. 탐색은 존재 유무를 보고할 수 있거나, 또는 완전한 판독을 위해 탐색 스트링을 포함하는 연관된 단편들을 회수할 수 있다. 대조적으로, 탐색 타겟을 증폭시키거나 이러한 타겟들을 포착한 후에 결과를 증폭시키기 위한 PCR 유사 프로세스에 의존하는 탐색 방법은 회피될 것이다.
무증폭 판독의 실시형태들:
다양한 실시형태들에서, 본원의 무증폭 DNA 판독은 단일 DNA 분자가 전류와 같은 센서 회로의 전기 파라미터를 모니터링하는 전기 회로에 혼입된 폴리머라제 또는 다른 프로브 분자에 의해 처리될 때 단일 DNA 분자의 모든 전자 측정을 포함한다. DNA 데이터 저장 판독을 위한 실시형태에서, 이들 센서는 전류 측정 회로를 제공하는 큰 픽셀 어레이를 갖는 CMOS 센서 어레이 칩 상에 배치된다. 이러한 센서 칩은 수백만 개의 센서들을 가질 수도 있으며, 센서들 각각은 연속적인 DNA 분자를 처리하여, 필요한 양의 입력 DNA 가 수백만의 총 분자만큼 낮을 수도 있다. 이를 통해 DNA를 사전 증폭하거나 특정 타겟 DNA 분자를 판독 프로세스의 일부로서 증폭할 필요 없이 DNA 분자를 매우 확장가능하고 빠르게 판독하는 것을 제공한다.
본원에서의 DNA 정보 저장 시스템의 다양한 실시형태들에서, DNA 판독 디바이스는 저장된 DNA 정보를 판독하는 전체 레이트가 대규모 아카이브 정보 취출에서의 실용적인 사용을 위해 충분히 빠르고 충분히 큰 볼륨일 수 있도록, 각각의 특정의 DNA 분자로부터 염기들의 고속 판독이 가능한 대규모 병렬 DNA 시퀀싱 디바이스를 포함한다. 염기들을 판독하는 레이트는 저장된 DNA 분자들의 길이에 관련된, 데이터 취출에 대한 최소 시간을 설정한다.
도 7 은 분자가 전기 회로를 완성하고, 전기 회로 파라미터가 시간에 대해 측정되어 신호를 제공하는, 무증폭 DNA 판독이 가능한 분자 전자 센서용의 분자 전자 감지 회로의 일 실시형태를 도시하며, 여기서 신호의 변동들은 분자의 그 환경에서의 다른 분자들과의 상호작용들을 반영한다. 도 7 에 도시된 바와 같이, 분자 전자 센서 회로 (1) 는 단일 프로브 분자 (2) (또는 대안적으로, 2 또는 적은 수의 분자를 포함하는 센서 복합체) 가 한 쌍의 이격된 나노-스케일 전극들 (3 및 4) 간에 전극 갭 (9) 을 스팬함으로써 완전한 전기 회로를 형성하는 회로를 포함한다. 전극들 (3 및 4) 은 양극 및 음극, 또는 소스 및 드레인 전극일 수도 있으며, 이 경우 지지층 (5) 상에 배치된다. 센서 분자는 특정 부착 지점들 (6 및 7) 에 의해 각각의 전극에 전기적으로 컨쥬게이트될 수도 있다. 특정 양태들에서, 회로의 전자 파라미터 (100) 는 센서 분자 (2) 가 다양한 상호작용 분자들 (8) 과 상호 작용하여 측정된 전자 파라미터에서 신호들 (101) 을 제공함에 따라 측정된다. 측정된 파라미터 (100) 는 전극들 사이와 시간에 대한 센서 분자 (2) 를 통해 지나가는 전류 (i) 와 함께, 도 7 에 (I) 대 (t) 의 도면으로 도시된 것과 같은, 상호작용하는 분자 (8) 와 센서 분자 (2) 사이의 분자 상호작용을 나타내는 측정된 파라미터에서의 전기 신호 (101) 를 포함할 수도 있다.
도 8 은 DNA 판독기 디바이스로서 본원에서 사용하기 위한 폴리머라제-기반 분자 전자 센서의 일 실시형태를 도시한다. 도 8 에 도시되고 폴리머라제 또는 다른 가공 효소를 포함하는 것과 같은 센서는 폴리머라제가 DNA 상의 별개의 분자 특징들 (도 8 에서 "FEAT 1", "FEAT 2" 등으로 약칭됨) 에 직면할 때 시간에 따라 모니터링된 전류에서 구별가능한 신호를 생성한다. 이러한 별개의 분자 특징은 정보를 합성 DNA 분자로 인코딩하기 위해 계획된 배열에서 사용될 수 있으며, 이는 차례로 모니터링된 전기 파라미터에서 구별가능한 신호가 보일 것이라는 것을 알고 센서를 통해 판독될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 개별 센서 회로의 분자 복합체는 타겟 DNA 분자와 결합하여 DNA 주형을 프로세싱함에 따라 전기 신호들을 발생시키는 단일 폴리머라제 효소 분자를 포함한다. 적합한 조건들 하에서, 이러한 폴리머라제는 신호 트레이스에서 2 개의 상이한 피크 형상들/진폭들로 도 8 에 예시된 바와 같은, 주형 DNA 분자의 특정의 별개의 특징들에 대응하는 구별가능한 전기 신호 특징들을 발생시킬 것이다. 이러한 구별가능한 신호 특징들은 위에서 논의된 도 4 의 인코딩 방식들과 같은 매우 다양한 인코딩 방식들을 통해서 정보를 합성 DNA 분자들로 인코딩하는데 사용될 수 있으며, 따라서 이러한 센서는 인코딩된 데이터용의 판독기를 제공한다.
도 9 는 폴리머라제 분자가 그 말단에서 소스 및 드레인 전극에 컨쥬게이트된 브릿지 분자에 컨쥬게이트되어 전극 쌍 사이의 갭에 걸쳐있는 실시형태를 도시한다. 즉, 센서는 폴리머라제 및 브릿지 분자를 추가로 포함하는 분자 센서 복합체를 포함한다. 센서는 도시된 바와 같이 매립된 게이트 전극을 더 포함 할 수도 있으며, 이는 회로의 감도를 추가로 변조하는데 사용될 수 있다. 전극들 사이의 전류는 측정된 전기 파라미터이다. 폴리머라제가 도시된 것과 같은 적합한 버퍼 용액 및 dNTP들의 존재 하에서, 프라이밍된, 단일-가닥 DNA 분자와 같은 적합한 주형과 결합할 때, 상보 가닥을 합성할 때에 폴리머라제의 활성은 효소 활성의 상세한 동력학에 관련된 측정된 신호들에서의 교란들을 초래한다. 이 경우, 전극들을 통과하는 전류 대 시간의 플롯은 프로세싱 중인 DNA 분자의 구조적 특징들에 대응하는 구별가능한 특징들 (예컨대, 진폭 변형들) 을 가진 신호를 제공한다. 이 실시형태에서, 2 개의 상이한 서열 모티프 AA 및 CCC 는 폴리머라제에 의해 발생할 때 2 개의 구별가능한 신호를 제공하기 위해 인코딩된 DNA 분자에 사용된다. 이러한 방식으로, 모티프 AA 및 CCC 는 이진 비트 0 에 AA 를 사용하고 이진 비트 1 에 CCC 를 사용하는 것과 같이, 이진 비트 0/1 을 주형 DNA 로 인코딩하는 수단을 제공한다. 중요하게도, DNA 서열의 단일 염기 해상도 없이도, 대신에 구별가능한 서열 모티프에 의존함으로써, 정보의 유용한 인코딩 및 판독이 가능하며, 이는 판독에서 단일 염기 해상도를 필요로 하는 단일 비트/단일 DNA 염기 BES 를 사용하는 것에 대한 명백한 이점이다.
도 10 은 본원의 분자 센서의 프로브 분자, 구체적으로 E. coli 클레노브 단편으로서 사용하기 위한 예시적인 폴리머라제 효소들 중 하나의 상세한 단백질 해부학 및 DNA 결합을 도시한다. 도시된 구조는 PDB ID 1KLN 이다. 상세한 구조와 그것이 주형 DNA 와 결합하는 방식은 DNA 와의 상호작용을 방해하지 않고 단백질 또는 DNA 의 신호화 부분들을 근접성을 통한 향상된 신호 생성을 위한 분자 브릿지 근처에 위치시키기 위해, 효소를 회로에 가장 잘 컨쥬게이트하는 방법의 선택을 알려준다. 효소의 나선, 시트 및 루프 부분은 DNA 가 효소와 결합되는 이러한 형태에서 지적된다.
도 11 은 DNA 판독 디바이스로서 사용가능한 분자 센서 (130A) 의 실시형태들을 도시하며, 여기서 폴리머라제 효소 (134A) 는 효소 (134A) 상의 특정 부위와 브릿지 분자 (133A) 상의 특정 부위 사이의 결합을 나타내는 컨쥬게이션 지점 (135A) 에서, 분자형 브릿지 분자 (133A) 에 컨쥬게이트된다. 도시된 바와 같이, 브릿지 분자 (133A) 는 이격된 전극들 각각에 결합되어 전극 갭 (139A) 에 걸쳐있다. 브릿지 분자 (133A) 는 컨쥬게이션 지점들 (131A 및 132A) 에서 전극들의 쌍의 전극들의 각각에 결합하도록 기능화된 제 1 및 제 2 말단을 포함한다.
도 12 는 DNA 정보 저장 및 검색 시스템에서 DNA 를 판독하기 위한 폴리머라제-기반 분자 센서 (130B) 의 하나의 특정 실시형태의 분자 구조를 도시하며, 여기서 폴리머라제 (134B) 는 20 nm 길이 (= 6 나선형 턴) 이중 가닥 DNA 를 포함하는 브릿지 분자 (133B) 에 컨쥬게이트된다. 센서 (130B) 는 SiO2 와 같은 기판 층 상에 배치되고 약 10 nm 로 이격된, 한 쌍의 이격된 크롬 전극 (138B 및 139B) 을 더 포함한다. 각각의 전극 (138B 및 139B) 상에는 브릿지 분자의 각 전극으로의 결합에 참여하는 금 (131B) 의 증착물들이다. 도시된 DNA 브릿지 분자 (133B) 는 DNA 브릿지의 제 1 및 제 2 말단 상의 티올 기를 통해 금-온-크롬 전극에 컨쥬게이트되고, 황-금 결합 (132B) 을 통해 금에 결합하며, 여기서 폴리머라제 (134B) 는 스트렙타비딘 분자 (136B) 에 결합되고, 차례로 폴리머라제 (134B) 상의 특정 비오티닐화된 부위 (135B) 를 통해 폴리머라제 (134B) 에 결합된, DNA 브릿지 (135B) 상의 중심에 위치한 비오티닐화된 염기에서의 DNA 브릿지 분자 (133B) 에 컨쥬게이트된다. 이러한 방식으로, 스트렙타비딘 (136B) 은 2 개의 비오틴-스트렙타비딘 연결들 (135B) 을 통해 폴리머라제 (134B) 를 DNA 브릿지 분자 (133B) 에 연결한다. 진행성 효소 분자 센서 (130B) 는 DNA 기질 분자 (137B) 를 변위시키는 것으로 도시된다. 논의된 바와 같이, DNA 기질 분자 (137B) 는 결합된 DNA 올리고뉴클레오티드 세그먼트들 또는 섭동 기들과 같은 신호화 특징의 배열을 포함하는 정보로 암호화될 수도 있다.
본원에서 사용하기 위한 분자 전자소자 센서의 다양한 실시형태들에서, 폴리머라제는 Klenow, Taq, Bst, Phi29 또는 T7 의 천연 또는 돌연변이체 유형일 수도 있거나, 또는 역전사 효소일 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 돌연변이화된 폴리머라제 형태들은 폴리머라제에의 특정의 컨쥬게이션 부위들의 도입을 통해서, 가교 분자, 아암 분자 또는 전극들에의 폴리머라제의 부위 특이적 컨쥬게이션을 가능하게 할 것이다. 재조합 방법들 또는 합성 생물학의 방법들에 의해 폴리머라제와 같은 프로브 분자로 조작된 이러한 컨쥬게이션 부위들은 다양한 실시형태들에서, 시스테인, 알데히드 태그 부위 (예컨대, 펩티드 모티프 CxPxR), 테트라시스테인 모티프 (예컨대, 펩티드 모티프 CCPGCC)) 및 비천연 또는 비-표준 아미노산 (NSAA) 부위 중 임의의 하나를, 예컨대 p-아세틸페닐알라닌 또는 비천연 교차결합 가능한 아미노산을 도입하기 위한 확장된 유전 코드의 사용을 통해, 예컨대, 5-브로모우리딘을 이용한 RNA- 또는 DNA-단백질 교차결합의 사용을 통해 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는, 이중 가닥 DNA, 다른 유사한 DNA 듀플렉스 구조들, 예컨대 DNA-RNA, DNA-PNA 또는 DNA-LNA 또는 DNA-XNA 듀플렉스 하이브리드들, 펩타이드들, 단백질 알파-나선 구조들, 항체들 또는 항체 Fab 도메인들, 그래핀 나노리본들 또는 탄소 나노튜브들, 또는 분자 전자소자의 당업자들에게 알려져 있는 넓은 어레이의 분자 와이어들 또는 전도성 분자들 중 임의의 다른 것들을 포함할 수도 있다. 이러한 분자들에의 폴리머라제의 컨쥬게이션들, 또는 이러한 전극들에의 분자들의 컨쥬게이션들은 컨쥬게이션 화학의 당업자들에게 알려져 있는 다양한 종류의 컨쥬게이션 방법들, 예컨대 비오틴-아비딘 커플링들, 티올-금 커플링들, 시스테인-말레이미드 커플링들, 금 또는 물질 결합 펩티드들, 클릭 화학 커플링, Spy-SpyCatcher 단백질 상호작용 커플링, 항체-항원 결합 (예컨대, 플래그 펩티드 태그/안티-플래그 항체 시스템) 등에 의할 수도 있다. 전극들에의 커플링은 물질 결합 펩티드들을 통하거나, 또는 아지드 또는 아민 기들과 같은 컨쥬게이션을 위한 적합한 관능기들을 제공하기 위해 전극 표면 상에의 SAM (자기-조립-단일층) 또는 다른 표면 유도체화의 사용을 통할 수도 있다. 전극들은 전기 전도성 구조들을 포함하며, 이는 임의의 금속, 예컨대 금, 은, 백금, 팔라듐, 알루미늄, 크롬, 또는 티타늄, 이러한 금속들의 임의의 조합인 층들, 예컨대 크롬 상의 금, 또는 반도체들, 예컨대 도핑된 실리콘, 또는 다른 실시형태들에서, 콘택 지점이 전극에의 분자 복합체의 화학적 자기-조립을 유도하는 부위가 되는, 제 2 물질을 포함하는 지지체 상의 제 1 물질의 콘택 지점을 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 도 12 에 도시된 센서와 같은 센서에서 측정된 전기 파라미터는 일반적으로 센서가 활성인 동안 측정가능한 센서 회로의 임의의 전기적 특성일 수 있다. 일 실시형태에서, 파라미터는 고정된 또는 가변적인 전압이 전극들 사이에 인가될 때, 연속적으로 또는 이산 시간들에서 샘플링되는, 시간에 대한, 전극들을 통과하는 전류이다. 다양한 실시형태들에서, 게이트 전극은 측정 동안 고정된 또는 가변적인 게이트 전압을 인가하는, 매립된 게이트 또는 후면 게이트와 같은 분자 구조에 용량성으로 커플링된다. 다양한 다른 실시형태들에서, 측정된 파라미터는 시간에 대해 연속적으로 측정되거나 또는 주기적으로 샘플링된, 2개의 전극들 사이의 저항, 컨덕턴스, 또는 임피던스일 수도 있다. 다양한 양태들에서, 측정된 파라미터는 전극들 사이의 전압을 포함한다. 게이트 전극이 있으면, 측정된 파라미터는 게이트 전압일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 도 12 의 센서와 같은 분자 전자 센서에서 측정된 파라미터는 커패시턴스, 또는 회로에 커플링된 커패시터에 축적된 전하 또는 전압의 양을 포함할 수도 있다. 측정은 측정 프로세스가 I-V 또는 C-V 곡선을 캡처하는 것을 포함하는, 전압 분광법 측정일 수 있다. 측정은 주파수 응답 측정일 수 있다. 모든 이러한 측정들에서, 모든 이러한 측정된 파라미터들에 대해, 게이트 전극이 측정 동안 분자 복합체 근처에서 고정된 또는 가변적인 게이트 전압을 인가하는 실시형태들이 있다. 이러한 게이트는 전형적으로 마이크론 거리 내에, 다양한 실시형태들에서는, 분자 복합체의 200 nm 거리 내에 물리적으로 위치될 것이다. 전기 측정들에 대해, 일부 실시형태들에서, 센서와 접촉하는 용액 내에 Ag/AgCl 기준 전극, 또는 백금 전극과 같은 기준 전극이 존재하고, 용액을 안정하거나 관측된 전위로 유지하고 전기 측정들을 더 잘 정의되거나 또는 제어되게 하기 위해 접지와 같은 외부 전위로 유지될 것이다. 게다가, 전기 파라미터 측정을 수행할 때, 다양한 다른 전기 파라미터들은 규정된 값들에서 고정되어 유지되거나, 또는 예를 들어, 소스-드레인 전극 전압, 게이트 전극이 있으면 게이트 전압, 또는 소스-드레인 전류와 같은, 규정된 패턴으로 변화될 수도 있다.
DNA 분자의 구별가능한 특징들을 측정하는데 도 12 에 예시된 센서와 같은 센서의 사용은 DNA 주형들을 발생시키고 임의의 배경 잡음보다 위의 강하고 구별가능한 신호들 (즉, 높은 신호-대-잡음비, 또는 "SNR") 을 발생시키기 위해, 폴리머라제가 활성화시킬 폴리머라제에 대해 적합한 물리적 및 화학적 조건들을 유지하여야 한다. 이를 달성하기 위해, 폴리머라제는 수성 버퍼 용액에 존재할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 버퍼 용액은 염들, 예컨대 Nalco 또는 KCl, pH 버퍼들, 트리스-HCl, 다가 양이온 보조인자들, Mg, Mn, Ca, Co, Zn, Ni, Fe 또는 Cu, 또는 다른 이온들, Tween 과 같은 계면활성제들, EDTA 와 같은 킬레이트제들, DTT 또는 TCEP 와 같은 환원제들, 베타인 또는 DMSO 와 같은 용매들, PEG 와 같은 볼륨 농축제들, 및 분자 생물학 애플리케이션들에서 폴리머라제 효소들에 대해 사용되고 분자 생물학 분야의 당업자에게 알려져 있는 버퍼들의 전형적인 임의의 다른 성분의 임의의 조합을 포함할 수도 있다. 센서 신호들은 또한 특정의 범위의 pH 또는 온도로, 또는 특정의 이온 강도로 유지되는 이러한 버퍼들에 의해 향상될 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 이온 강도는 예를 들어, 약 0.3 nm 내지 약 100 nm 의 범위, 특정의 실시형태들에서는, 약 1 nm 내지 약 10 nm 의 범위일 수도 있는, 전기 신호 생성에 양호한 용액 내 Debye 길이 (전하 스크리닝 거리) 를 획득하도록 선택될 수도 있다. 더 큰 Debye 길이들을 갖도록 제형화된 이러한 버퍼들은 PCR 과 같은 표준 분자 생물학 절차들에서 정해진 순서로 사용되는 버퍼 농도들에 비해 10, 100, 1000, 100,000 또는 1,000,000 배 만큼 더 희석되거나 더 낮은 이온 강도를 가질 수도 있다. 또한, 버퍼 조성물들, 농도들 및 조건들 (예를 들어, pH, 온도, 또는 이온 강도) 은 또한 DNA 분자들에 저장된 데이터를 판독하는 상황에서 센서의 신호-대-잡음비 (SNR), 신호 발생의 전체 레이트, 또는 정보 생산의 전체 레이트를 순조롭게 증가시키기 위해 효소 동력학을 변경하도록 선택되거나 또는 최적화될 수도 있다. 이는 이들 방법들에 의해 폴리머라제 활성을 느리게 하거나 또는 빠르게 하거나, 또는 폴리머라제의 충실도 또는 정확도를 변경하는 것을 포함할 수도 있다. 이 최적의 버퍼 선택 프로세스는 모든 이러한 파라미터 변형들의 매트릭스로부터 시험 조건들을 선택하는 단계, 예컨대, 구별가능한 특징들의 식별, 또는 주형을 프로세싱할 때 특징 식별의 과속과 관련된 성능 지수를 실험으로 측정하는 단계, 및 최적의 파라미터 조합들을 추론하기 위해, 통계 실험 설계 (DOE) 방법들에 적용되는 탐색 전략들과 같은, 다양한 탐색 전략들을 이용하는 단계로 구성된다.
DNA 분자의 구별가능한 특징들을 측정하는데 도 12 의 센서와 같은 센서의 사용은 폴리머라제가 주형 단일-가닥 DNA 분자 상에 프로세스적으로 작용하여 상보 가닥을 합성할 수 있도록, 폴리머라제에 dNTP들의 공급이 제공되어야 한다. 표준 또는 천연 dNTP들은 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP 이며, 이는 효소가 이들 상에서 기질들로서 작용하도록 요구되는 형태로, DNA 가닥에의 중합을 위해, A, C, G, 및 T 염기 단량체들을 제공한다. 천연 또는 돌연변이인, 폴리머라제 효소들은 또한 구별가능한 신호들의 발생을 향상시키거나 또는 가능하게 할 수도 있는, 이들 천연 dNTP들의 유사체들, 또는 변형된 형태들을 수용할 수도 있다.
본원에서의 DNA 판독의 다양한 양태들에서, 시스템이 대표적인 현재 차세대, 광학 염료-라벨링된 종결부위 시퀀서들에서와 같이, 10 분당 1 염기의 속도로 DNA 분자를 판독하면, 300 개의 염기 DNA 분자를 판독하는 것은 판독을 위해 샘플을 준비하는데 요구되는 임의의 시간에 더해서, 적어도 3,000 분 (50 시간) 을 소요한다. 이러한 상대적으로 느린 시스템들은 따라서 5 시간 내에 판독될 수 있는 30 염기 판독들과 같은, 더 많은 수의 더 짧은 판독들로 정보를 저장하는 것을 선호한다. 그러나, 이는 더 많은 수의 전체 판독들을 필요로 하므로, 시스템은 이러한 시퀀서들에서의 경우와 같이, 수십억 이상의 이러한 판독들을 지원해야 한다. 현재 세대의 광학 대규모 병렬 시퀀서들은 6-분 사이클 당 DNA 의 30 억개의 문자들, 또는 대략 분 당 10억 비트들, 또는 초 당 2 MB 의 등가량을 판독하지만, 100 개의 염기 DNA 단어들로서 저장된 데이터에 있어, 이는 또한 600 분 (5 시간) 을 필요로 할 것이다. 전형적인 책이 1 MB 의 텍스트 데이터를 포함할 수도 있기 때문에, 실현가능한 영역 내에서, 이것은 상대적으로 낮은 데이터 판독의 레이트로 볼 수 있다. 전체 레이트는 실현가능하지만, 기본 시간 당 느린 속도는 단일 책의 데이터를 판독하는데 매우 비효율적으로 만들며, 이상적으로는 5 시간 동안 동시에 36,000 권의 책들의 대량 판독에 적합하다. 따라서, 또한 이 현재의 능력에서의 스케일러빌리티의 부족, 그리고 또한 판독 디바이스의 높은 자본 비용 (현재 $100,000 내지 $1,000,000 범위의 광학 DNA 시퀀서들 비용) 이 있다. 더 중요하게는, 이러한 현재의 시스템들 상에서, 인간 게놈의 DNA 가치, 1000억개의 염기들을 시퀀싱하는 비용은 대략 $1,000 이며, 이는 정보를 판독하는 비용이 200 기가-비트들 당 $1,000 당 , 또는 GB 당 $40 임을 의미한다. 이는 10,000 GB 당 $1, 또는 GB 당 $0.0001 로, 400,000배 더 적은 자기 테이프 스토리지 또는 CD들로부터 정보를 판독하는 비용보다 근본적으로 더 높다. 따라서, DNA 를 판독하는 비용은 다른 이점들을 고려하지 않고, 대규모, 장기 아카이브 저장에 매력적이게 만들기 위해서는, 수십 배의 크기만큼, 심지어 1,000,000배 만큼 감소되어야 한다. 이러한 향상들은 최초 상업적 시퀀서들이 제조된 이후 이미 발생된 시퀀싱 비용들에서 백만 배 감소로 입증된 바와 같이, 실제로 가능할 수도 있다.
다양한 실시형태에서, 본 시스템의 DNA 판독기는 현재 가용 광학 차세대 시퀀싱 기구들에 비해, 실질적으로 더 낮은 기구 자본 비용들, 및 더 높은 당-염기 판독 속도, 및 런 당 판독들의 총 수에서의 더 큰 스케일러빌리티를 포함한다. 다양한 양태들에서, 본원에서 사용하기 위한 판독 디바이스는 속도 및 스케일러빌리티를 증가시키고 자본 비용들을 감소시키기 위해 CMOS 칩 센서 어레이 디바이스에 기초한다. 이러한 디바이스의 실시형태는 CMOS 센서 어레이 디바이스를 포함하며, 각각의 센서 픽셀은 요구되는, PCR 과 같은, 임의의 분자 증폭 또는 복제 없이 DNA 의 단일 분자를 판독할 수 있는 분자 전자 센서를 포함한다. 다양한 실시형태들에서, CMOS 칩은 스케일러블 픽셀 어레이를 포함하며, 각각의 픽셀은 분자 전자 센서를 포함하며, 이러한 센서는 효소가 DNA 주형 분자를 프로세싱함에 따라 전류 (또는, 관련된 전기 파라미터들, 예컨대 전압, 컨덕턴스, 등) 의 서열-관련 조절들을 발생하도록 구성된, 가교 분자 및 폴리머라제 효소를 포함한다.
본 DNA 데이터 저장 시스템에서 DNA 판독기 디바이스로서 사용가능한 예시적인 분자 센서 및 칩 조합이 도 12, 도 13, 및 도 18 내지 도 23 에 도시된다. 논의된 바와 같이, 도 12 는 금속 전극 상의 금 콘택들에의 커플링을 위한 5' 말단들 양자에서의 티올 기들과 함께, 약 20 nm 길이 (~60 염기들) 를 갖는 이중 가닥 DNA 의 브릿지를 더 포함하는 브릿지 및 프로브 분자 센서 복합체를 포함하는 예시적인 분자 센서를 예시한다. 도 12 의 실시형태는 DNA 로 이루어진 분자 와이어에 커플링된 폴리머라제 효소를 포함하며, 이는 폴리머라제 효소가 프라이밍된 DNA 주형을 프로세싱함에 따라 서열-관련된 신호들을 발생시킬 수 있는 센서를 형성하기 위해 나노-전극 쌍에 연결된다.
도 13 에 예시된 바와 같이, 이러한 나노-센서는 CMOS 센서 픽셀 어레이의 픽셀들 상으로 사후-프로세싱함으로써 배치될 수 있으며, 이는 병렬로 동작하는 다수의 센서들로부터 이들 신호들을 발생시키는데 필요한 모든 지원 측정, 리드아웃 및 제어 회로부를 더 포함한다. 도 13 은 분자 센서들 내 다양한 전기적 컴포넌트들 및 접속들의 일 실시형태를 예시한다. 도면의 상부 부분에, 전극-기판 구조 300 의 단면이, 전압들을 인가하고 센서의 가교 분자를 통해서 전류들을 측정하기 위한 분석기 301 에의 부착과 함께, 예시된다. 도면의 하부 부분에, 브릿징 회로들에 사용가능한 전극 어레이 302 의 사시도가 예시된다. 전극들의 각각의 쌍은 제 1 금속 (예컨대, "금속-1"), 및 전극들을 분리하는 간극 근처 각각의 전극 단부에서의 제 2 금속 (예컨대, "금속-2") 의 접촉점 또는 아일랜드를 포함한다. 다양한 예들에서, 금속-1 및 금속-2 는 동일한 금속 또는 상이한 금속들을 포함할 수도 있다. 다른 양태들에서, 접촉점들은 상이한 금속을 포함하는 금속 전극들 상부의 금 (Au) 아일랜드들이다. 다양한 실험들에서, 접촉점들은 예컨대, 티올-금 결합을 통한, 전극 쌍들 사이의 각각의 간극 상에 걸친 단일 가교 분자의 자기-조립을 지원하는 금 (Au) 비드들 또는 금 (Au)-코팅된 전극 팁들을 포함한다.
도 14a 내지 도 14c 는 DNA 센서들에서의 가교 결합을 위한 금 금속 도트 콘택들을 포함하는 전극들의 전자 현미경 (EM) 이미지들의 도면들을 나타낸다. 이 예에서, 전극들은 실리콘 기판 상에 있으며, e-빔 리소그래피를 통해서 제조되었다. 도 14a 는 금 도트 접점을 갖는 티타늄 전극의 어레이를 도시한다. 도 14b 는 근접한 EM 이미지에서 금 도트 접촉부 및 약 15 nm 금-금 간격을 갖는 약 7 nm 의 전극 갭을 도시한다. 도 14c 에서, 근접한 EM 은 전극들의 팁들에 위치된 대략 10 nm 사이즈의 금 도트들을 나타낸다.
도 15 는 도 12 의 센서로 DNA 혼입 신호들을 측정함으로써 얻어진 전류 대 시간 플롯들을 개시한다. 플롯들은 혼입 및 중합을 위해 다양한 프라이밍된, 단일 가닥 DNA 시퀀싱 주형들 및 dNTP들이 공급되고 있는 센서로부터 유래하는 전류 신호들을 나타낸다. 각 경우에, 주요 신호 스파이크들은 별개의 혼입 이벤트들로부터의 신호들을 나타내며, 여기서, 폴리머라제 효소는 다른 염기를 연장 가닥에 추가한다. 도 15 의 좌상부에서, 주형은 20 개의 T 염기들이고; 우상부에서, 주형은 20 개의 G 염기들이고; 좌하부에서, 주형은 20 개의 A 염기들이고; 우하부에서, 주형은 20 개의 C 염기들이다. 대략 관측된 혼입의 레이트는, 레이트 제한 인자들 (예컨대, 낮은 dNTP 농도) 로 인해 초 당 ~1 염기의 낮은 레이트를 제외하고는, 표준 효소 동역학과 일치하는, 초 당 약 10 내지 20 개의 염기들이다.
도 16 은 도 12 의 센서로부터 얻어진 실험 데이터를 도시하며, 여기서 특정 서열 모티프가 0/1 이진 데이터를 인코딩하는데 사용가능한 신호를 생성했다. 도 12 의 센서는 DNA 가교에 컨쥬게이트된 Klenow 폴리머라제를 포함하며, 이는 실험 주형 DNA 에서의 인코딩 DNA 서열 모티프들 20A, 3C 및 30A 으로부터 구별가능한 신호들을 발생시킨다. 이러한 신호들은 표준 1X Klenow 버퍼 및 상대적으로 높은 농도의 dTTP, (10μM), 및 100배 낮은 농도의 다른 dNTP들과 함께, 도 12 의 센서를 이용하여 발생되었다. 다른 dNTP들의 더 낮은 농도, 특히 낮은 dGTP 농도는 농도-제한된 혼입의 레이트를 통해서 CCC 영역으로부터의 구별가능한 신호를 용이하게 한다. 그 결과, 폴리-A 트랙이 높은 스파이크 신호 특징을 갖고 폴리-C 트랙이 낮은 트로프 신호 특징을 가지므로, 이는 용이하게 구별가능하다. 피크들 및 트로프는 0/1 이진 데이터를 예시된 간단한 방법으로 인코딩하는데 사용가능하며, 0 은 폴리-A 트랙에 의해 인코딩되고 수 초 지속기간을 갖는 높은 피크 신호들로부터 판독되며, 1 은 CCC 트랙에 의해 인코딩되고 수 초 지속기간을 갖는 낮은 트로프 특징들로부터 판독된다.
DNA 분자의 구별가능한 특징들을 측정하는데 본 개시물의 센서들의 사용은 연관된 신호들을 발생시키는 과정에서, 프라이밍된, 단일-가닥 주형 DNA 분자들이 폴리머라제에 상보 가닥의 중합을 위한 기질로서 제공될 것을 필요로 한다. 합성 DNA 분자들에 정보를 인코딩하는 상황에서, 이들 주형 분자들은 전체적으로 화학적으로 합성될 수도 있으며, 따라서, 다양한 실시형태들에 대해 구별가능한 신호들의 발생을 가능하게 하거나 또는 향상시키는데 사용될 수도 있는 천연 DNA 의 것들 이상의 화학적 또는 구조적 변형들 또는 특성들이 제공될 수 있다. 폴리머라제, 천연 또는 조작된 돌연변이체는 기질로서 DNA 의 아주 많은 이러한 변형된 또는 유사한 형태들을 수용할 수 있으며, 이들 중 다수는 분자 생물학 분야의 당업자에게 널리 알려져 있다. 주형 DNA 에의 이러한 변형들의 사용은 구별가능한 신호들을 갖는 특징들을 생성하는데 사용될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 주형으로서 폴리머라제에 제공되는 DNA 는 폴리머라제에 대한 개시 부위로서 작용하기 위한 일부 유형의 프라이밍된 (이중 가닥/단일 가닥 전이) 부위를 포함한다. 디지털 데이터를 DNA 에 저장하기 위해, 다양한 실시형태들에서, 이 프라이밍은 인코딩 분자로 사전-조립될 것이며, 따라서 DNA 주형 분자들을 프라이밍하는데 추가적인 샘플 준비가 불필요하다.
DNA 주형에서의 2차 구조가 폴리머라제의 프로세스적 작용을 방해할 수 있기 때문에, DNA 데이터 판독기 센서들에 사용되는 DNA 데이터 인코딩 주형 분자들 내 2차 구조를 감소시키거나, 회피하거나, 또는 제거하는데 유리할 수도 있다. 2차 구조 간섭을 감소시키는 다수의 방법들이 분자 생물학 분야의 당업자에게 알려져 있다. 2차 구조를 감소시키거나, 회피하거나 또는 제거하기 위한 방법은 Phi29 또는 Bst 또는 T7, 이들의 천연 또는 돌연변이 형태들과 같은, 강한 2차 구조 치환 능력들을 소유하는 폴리머라제들을 이용하는 단계; 버퍼에 용매들, 예컨대 베타인, DMSO, 에틸렌 글리콜 또는 1,2-프로판디올을 첨가하는 단계; 버퍼의 염 농도를 감소시키는 단계; 용액의 온도를 증가시키는 단계; 및 단일 가닥 결합 단백질 또는 축퇴 (degenerate) 결합 올리고뉴클레오티드들을 첨가하여 단일 가닥을 따라서 혼성화하는 단계를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이들과 같은 방법들은 2차 구조 간섭을 인코딩 DNA 를 프로세싱하는 폴리머라제로 감소시키고 적합한 신호들을 발생시키는 유익한 효과를 가질 수 있다.
본 개시물에 따른 DNA 데이터 판독을 위한 원치 않는 2차 구조를 감소시키는데 이용가능한 추가적인 방법들은 합성 화학에 의해 생성되는 DNA 분자들에 특성들을 첨가하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 개시물의 일부 실시형태들에서, DNA 분자 자체를 인코딩하는 데이터는 예컨대, G:C 염기 짝짓기를 약화시키는 G 대신 디아자-G (7-디아자-2'- 데옥시구아노신) 을 이용하여, 또는 백본을 강화하여 2차 구조를 감소시키는 가닥 내 잠긴 핵산 (LNA) 을 이용함으로써, 2차 구조를 감소시키는 염기 유사체들로부터 합성될 수 있다. 이러한 효과들을 가진 다양한 이러한 유사체들이 핵산 화학 분야의 당업자에게 알려져 있다.
DNA 데이터 인코딩 방식이 주형 서열을 결정하고 따라서 2차 구조가 되기 쉬운 서열들을 회피하는 인코딩 방식을 선택할 가능성이 있기 때문에, DNA 데이터 판독 센서에 대한 원치 않는 2차 구조를 감소시키기 위해 추가적인 방법들이 본 개시물에서 이용가능하다. 따라서 이러한 2차 구조 회피 ("SSA") 인코딩 방식들이 본 개시물의 유익한 양태이다. 일반적으로, 구별가능한 신호 서열 특징들을 인코딩 엘리먼트들로서 이용하는 본원에서 설명된 바와 같은 인코딩 방식들에 대해, 인코딩의 선택에 옵션들이 존재하는 한, 모든 이러한 대안적인 방식들이 고려될 수 있으며, 더 적은 (또는, 가장 적은) 2차 구조를 발생하는 방식들이 사용하기에 유리할 것이다. 대안적인 방식들은 특정의 디지털 데이터 페이로드에 대해, 또는 인코딩될 이러한 데이터 페이로드들의 대표 모집단에 걸쳐서 통계적으로 평가된다.
예를 들어, 센서가 3 개의 구별가능한 신호 서열 특징들: AAAAA, TTTTT, 및 CCCCC 을 제공하는 실시형태에서 SSA 인코딩의 중요성이 예시된다. 모든 3 개의 특징들이 동일한 가닥에서 (또는, 다른 스트랜드들 상에서) 인코딩에 사용되면, AAAAA 및 TTTTT 인코딩 엘리먼트들이 상보적이어서, 가닥 내에서 또는 DNA 가닥들 사이에서, 혼성화하여 2차 구조를 초래할 가능성이 높다. 따라서, 데이터가 비트 0 이 AAAAA 로 인코딩하고 비트 1 이 CCCCC 로 인코딩하는 (즉, TTTTT 의 사용을 완전히 무시하는) 방식에 의해 전체적으로 대신 인코딩되었다면, 모든 잠재적 이차 구조가 회피된다. 따라서, 이 인코딩 (또는, 다른 SSA 선택, 비트 0 이 TTTTT 로 인코딩하고 비트 1 이 CCCCC 로 인코딩함) 은 심지어 3 개의 사용가능한 인코딩 엘리먼트들 중 하나를 포기함으로써 정보 밀도가 감소되더라도, 자기-상보적 서열들을 이용하는 방식보다 바람직하다. 따라서, 일반적으로, SSA 코드들은 인코딩 옵션들이 있고 DNA 2차 구조가 형성될 가능성이 있을 때 사용될 수 있다. 이 예에 나타낸 바와 같이, DNA 2차 구조를 감소시키기 위한 바람직한 SSA 코드들은 구별가능한 신호 상태들에 대해 이론적으로 가능한 것보다 정보 밀도가 더 적을 수도 있다. 그러나, 이러한 상충관계는 DNA 2차 구조에 관련된 데이터 손실을 회피함으로써, 정보 밀도의 순 이득, 또는 관련된 전체 비용 또는 속도 향상들을 초래할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 2차 구조를 감소시키기 위한 방법들은 단일 가닥을 보호하기 위한 결합 올리고뉴클레오티드들의 사용을 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드들은 인코딩 특징들에 우선적으로 결합하는 서열 또는 서열 구성으로 선택된다. 이러한 결합 올리고뉴클레오티드들은 단일 가닥 및 일반적인 축퇴 올리고뉴클레오티드들을 더욱 효과적으로 보호할 수도 있다. 예를 들어, 3 개의 구별가능한 신호 서열 특징들 AAAAA, TTTTT, 및 CCCCC 로 위에서 설명된 경우에, 모든 3 개가 인코딩 특징들로 사용될 수 있으며, 이들은 주형을 올리고뉴클레오티드들 TTTTT, AAAAA, 및 GGGGG 에, 또는 DNA 대신, RNA, LNA 또는 PNA 형태들과 같은, 이들의 향상된 결합 유사체들에 결합함으로써, 단일 가닥 형태로 보호될 수 있다. 따라서, 인코딩 특징들에 우선적으로 결합하는 결합 올리고뉴클레오티드들의 사용은 원치 않는 2차 구조 효과들을 완화시키는 다른 수단이지만, 이러한 결합 올리고뉴클레오티드들은 올리고뉴클레오티드들 자체가 방해하지 않도록 가닥-치환 폴리머라제들, 예컨대 Klenow, Bst 또는 Phi29 의 천연 또는 돌연변이 형태들로 사용되어야 한다. 2차 구조를 회피하기 위한 추가적인 방법은 폴리머라제 개시를 위한 프라이머 부위에서 틈 또는 간극을 갖는, 주로 이중 가닥 형태로, 그리고 분자의 나머지는 DNA 분자가 분자들 내 또는 분자들 사이에, 단일-가닥 상호작용들로 인해 2차 구조 없이, 용액 내에서 실질적으로 듀플렉스 형태로 존재하도록, (헤어핀 벤드가 있거나 없이) 듀플렉스 형태로 정보 인코딩 DNA 를 준비하는 것이다.
다양한 실시형태들에서, 동족 분자 센서에 의한 판독을 위한 정보를 인코딩하는데 사용되는 DNA 분자들은 인코딩 및 디코딩 프로세스들뿐만 아니라 판독 프로세스를 용이하게 하는 아키텍처로 준비될 수 있다. DNA 아키텍처의 다양한 실시형태들이 도 17 에 예시된다. (도면의 상부에) 디지털 데이터 저장 시스템에서 사용하기 위한 정보 인코딩 분자의 논리적 형태들과 함께, 프라이밍된 단일-가닥 DNA 주형의 대표적인 물리적 형태가 예시된다. 예시적인 형태들은 정보 코딩 DNA 분자들, (예컨대, "프라이머" 로서 표시된, 사전-프라이밍된 또는 자기-프라이밍된) 프라이머, ("L-버퍼" 및 "R-버퍼" 으로서 나타낸) 좌측 및 우측 버퍼 세그먼트들 및 데이터 페이로드 세그먼트 ("데이터 페이로드") 의 조작을 용이하게 하기 위해, ("L 어댑터" 및 "R 어댑터" 로 나타낸) 좌측 및 우측 어댑터들을 포함할 수도 있다.
도 17 을 계속 참조하면, 어댑터들은 예를 들어, 저장된 데이터를 복제하는데 사용되는 범용 증폭 프로세스들을 위한 프라이머들을 포함할 수도 있거나, 또는 풀로부터의 분자들의 타겟화된 선택을 위해, 혼성 캡처 부위들 또는 다른 선택적 결합 표적들을 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태에서, 프라이머 세그먼트는 프라이머 타겟/구조를 함유하고, L-버퍼 세그먼트는 판독기에 대한 신호 교정 서열, 또는 데이터 페이로드 세그먼트 이전의 버퍼링 서열을 포함할 수도 있으며, 이는 인코딩된 서열 및 관련 에러 정정 서열, 예컨대 패리티 비트뿐만 아니라 이 정보를 더 큰 스트링으로 조립하는 것과 관련된 것과 같은 저장 방법에 대한 메타데이터를 저장하는 정보를 포함한다. 다양한 양태들에서, R-버퍼 는 추가적인 교정 서열뿐만 아니라, 데이터를 판독할 때 폴리머라제 효소가 주형의 말단에 너무 가까워지는 것을 방지하는 버퍼 서열을 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, L-어댑터 및 R-어댑터 는 PCR 증폭, 또는 혼성 기반 선택을 위한 외측 프라이밍 인용들을 위한, 또는 캐리어로서의 숙주 유기체 게놈으로의 삽입을 포함한 이러한 삽입을 위한 둘러싸는 캐리어 DNA 를 나타내는, 어댑터들과 같은, 연관된 DNA 세그먼트의 저장 또는 조작과 관련된 서열 엘리먼트들일 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 어댑터들은 예를 들어, 살아있는 숙주 게놈들에, 예컨대 박테리아 플라스미드들 또는 생물들의 다른 게놈 성분들에 저장된 DNA 데이터 분자들의 경우, 주변 또는 캐리어 DNA 를 포함할 수도 있다.
도 17 를 추가로 참조하면, L-버퍼 및 R-버퍼 세그먼트들은 폴리머라제 결합 풋프린트를 지원하는 DNA 세그먼트들을 포함할 수도 있고, 그 세그먼트들은 데이터 페이로드 영역으로부터 유래하는 신호들을 해석하는 것을 돕기 위해 사용되는 다양한 교정 또는 개시 서열들을 포함할 수도 있다. 이들 버퍼 세그먼트들은 고유한 분자들을 구별하거나, 또는 동일한 기원의 단일 분자로부터 유래된 복제 분자들을 식별하는데 사용되는 분자 바코드 서열들을 포함할 수도 있다. DNA 올리고 합성에서의 당업자에게 알려져 있는, 하나의 이러한 바코딩의 방법은 예를 들어, 합성 단계들을 특정의 염기들 대신 축퇴 염기들의 혼합물들로 수행함으로써 이루어지는, 전형적으로 1 내지 20 개의 염기들 길이인 짧은 무작위 N-mer 서열의 첨가를 포함한다.
도 17 을 계속 참조하면, DNA 논리 구조들은 특정의 데이터가 인코딩된 데이터 페이로드 세그먼트를 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 데이터 페이로드 세그먼트는 저장 방법에 대한 메타데이터와 함께 저장되는 실제 1차 디지털 데이터를 포함하며, 이는 더 긴 스트링들에의 이러한 정보 단편들의 적합한 어셈블리에 관련된 데이터, 및/또는 패리티 비트들, 검사 합들, 또는 다른 이러한 정보 오버헤드와 같은, 에러 검출 및 정정에 관련된 데이터를 포함할 수도 있다.
본 개시물의 다양한 양태들에서, 관심 DNA 데이터 페이로드는 DNA 스토리지로부터의 디지털 데이터의 보다 강건한 복구를 제공하기 위해 폴리머라제 센서에 의해 여러 번 프로세싱된다. 다른 양태들에서, 이러한 페이로드들의 평균 컬렉션은 여러 번 일부 예상된 횟수로 프로세싱된다. 이들 예들은 다수의 관측들을 집계함으로써 인코딩 구별가능한 특징들의 더 정확한 추정으로부터 이점을 얻는다. 다중 프로세싱은 또한 기본 푸아송 샘플링 통계적 다양성을 극복하여 높은 신뢰도로, 관심 데이터 페이로드가 적어도 한번, 또는 적어도 일부 바람직한 최소의 횟수로 샘플링되고 관측되도록 보장하는 이점을 갖는다.
다양한 실시형태들에서, 이러한 반복 질의들의 횟수는 1 내지 약 1000배의 범위, 또는 약 10 내지 100배의 범위이다. 그러한 다수의 관측들은: (i) 폴리머라제 센서에 의한 동일한 물리적인 DNA 분자의 관측들, 및/또는 (ii) 동일한 데이터 페이로드를 운반하는 다수의, 물리적으로 별개의 DNA 분자들을 프로세싱하는 하나 이상의 폴리머라제 센서들을 포함할 수도 있다. 후자의 경우에, 동일한 데이터 페이로드를 가진 이러한 다수의, 물리적으로 별개의 DNA 분자들은 동일한 벌크 합성 반응에 의해 발생된 DNA 분자들, 동일한 데이터 페이로드를 타겟팅하는 별개의 합성 반응들로부터 얻어진 분자들, 또는 PCR, T7 증폭, 롤링 서클 증폭, 또는 분자 생물학 분야의 당업자에게 알려진 복제의 다른 형태들과 같은, 증폭 또는 복제 방법들을 적용함으로써 발생된 복제 분자들일 수도 있다. 이러한 다수의 관측들의 집계는 평균화 또는 투표, 최대 우도 추정, 베이지안 추정, 은닉 Markov 방법들, 그래프 이론 또는 최적화 방법들, 또는 심층 학습 신경망 방법들과 같은 다수의 방법들을 통해서 이루어질 수도 있다.
본 개시물의 다양한 실시형태들에서, DNA 에 저장된 디지털 데이터는 예컨대, 대규모 자기 테이프 저장 시스템들에서 가능한 것처럼, 디지털 데이터의 복구를 위해 초 당 1 기가바이트에 근접하는 높은 레이트로 판독된다. 폴리머라제 효소의 최대 프로세싱 속도가 유형에 따라서 초 당 100-1000 염기들의 범위이기 때문에, 폴리머라제-기반 센서의 비트 복구 레이트가 비견할만한 속도에 제한된다. 따라서, 다양한 실시형태들에서, 수백만 개의 센서들이 원하는 데이터 판독 용량을 달성하기 위해 비용 효과적인 포맷으로 배치된다.
다양한 실시형태들에서, 다수의 개별 분자 센서들이 CMOS 센서 픽셀 어레이 칩 상에 대규모 센서 어레이로 배치되며, 이는 가장 비용-효과적인, 반도체 칩 제조 프로세스이다. 도 18 은 칩 상에 분자 센서들의 대규모 병렬 어레이를 생성하는데 사용가능한 제조 스택의 일 실시형태를 예시한다. 이 예에서, 센서 측정 회로부는 CMOS 칩 상에 스케일러블 픽셀 어레이로서 배치되며, 나노-스케일 리소그래피 프로세스는 나노-전극들을 제조하는데 사용되며, 용액 내에서의, 분자 자가-조립 화학 반응들은 분자 복합체를 센서 어레이의 각각의 나노-전극 상에 확립하기 위해 사용된다. 이 제조 스택의 결과는 도 18 의 저부에 나타낸 완성된 DNA 판독기 센서 어레이 칩이다. 다양한 실시형태들에서, 나노 규모 리소그래피가 CMOS 칩 제조의 경제성을 레버리지하기 위해, 28 nm, 22 nm, 20 nm, 16 nm, 14 nm, 10 nm, 7 nm 또는 5 nm 노드들과 같은, 고분해능 CMOS 노드를 이용하여 이루어진다. 이에 반해, 픽셀 전자 기술은 180 nm, 130 nm, 90 nm, 65 nm, 40 nm, 32 nm 또는 28 nm 와 같은, 혼합된 신호 디바이스들에 더 적합한 더 거친 노드에서 이루어질 수도 있다. 대안적으로, 나노-전극들은 e-빔 리소그래피, 나노-임프린트 리소그래피, 이온 빔 리소그래피, 또는 극 UV 또는 심 UV 리소그래피, 다수의 패터닝, 또는 페이즈 시프팅 마스크들의 임의의 조합들과 같은 포토리소그래피의 진보된 방법들과 같은, 나노제조의 당업자에게 알려져 있는 다양한 다른 제조 방법들 중 임의의 방법에 의해 제조될 수도 있다.
도 19 는 DNA 판독기를 위한 고레벨 CMOS 칩 픽셀 어레이 아키텍처의 일 실시형태를 도면의 좌측에 보다 상세하게 도시한다. CMOS 칩 픽셀 어레이 아키텍처는 연관된 전력 및 제어 회로와 바이어스, 아날로그-디지털 컨버터 및 타이밍과 같은 주요 블록을 갖춘 확장가능한 센서 픽셀들의 어레이를 포함한다. 도면에서의 삽입부는 단일 폴리머라제 분자 센서를 나타내는 작은 브릿지 구조로서 개별 센서 픽셀을 나타내며, 여기서 이 개별 전자 센서는 픽셀 어레이에 위치된다. 도 19 는 또한, 어레이 내의 폴리머라제 분자 전자 센서 회로 픽셀의 일 실시형태의 세부 사항들을 (도면의 우측에) 예시한다. 예시된 바와 같이, 완전한 센서 회로는 트랜스-임피던스 증폭기, 전압 바이어스가능 소스, 드레인 및 (옵션적으로) 게이트 전극, 및 리셋 스위치와 함께, 소스 및 드레인 전극 사이에 (브릿지 및/또는 아암 분자들과 함께 또는 이들 없이) 전기적으로 연결된 폴리머라제 효소를 포함한다. 예시된 피드백 커패시터는 증폭기의 안정성을 향상시키기 위해 옵션적이다. 본 실시형태에서 픽셀 회로의 출력 (측정가능한 전자 파라미터) 은 전류이며, 이는 폴리머라제의 활성과 관련된 섭동에 대해 모니터링된다. 즉, 트랜스 임피던스 증폭기에서 출력되는 전류는 섭동에 대해 모니터링되는 이 센서 픽셀의 측정가능한 전기 파라미터이다. 2 개의 전극들 중 하나가 접지될 수 있으며, 이 경우 바이어스가능 전압이 전극을 가로질러 공급된다는 점에 유의해야 한다.
도 20 는 주석이 달린 칩 설계 레이아웃 파일 및 비교를 위한 대응하는 완성된 칩의 일 실시형태를 예시한다. 도 20 에서, (A) 는, 좌측에, 칩의 바이어스 (190), 어레이 (191) 및 디코더 (192) 영역들의 위치를 도시하도록 주석이 달린, 256 개 픽셀을 갖는 도 19 의 CMOS 픽셀 어레이의 일 실시형태의 완성된 설계이다. 설계 레이아웃은 또한 테스트 구조 (193) 영역을 포함한다. 도 20 에서, (B) 는, 우측에, TSMC Inc. 반도체 파운드리 (San Jose, CA) 에서 TSMC 180 nm CMOS 프로세스로 패시베이션 층 없이 제조된, 최종 설계에 기초한 대응하는 완성된 칩의 광학 현미경 이미지의 도면이다.
도 21 은 도 20 의 완성된 CMOS 칩 (200) 의 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지의 예시를 도시하며 (256 픽셀 어레이, 2 mm x 2 mm), 이는 80 μm 픽셀 (201) 의 서브-광학 표면 특징과 특히 노출된 비아 (소스, 게이트 및 드레인) 를 명확하게 도시하며, 여기서 나노-전극들은 후 처리에 의해 증착되고 도 19 에서 우측에 도시된 바와 같이 증폭기 회로에 전기적으로 연결된다. 도 21 에서의 100 nm SEM 이미지 (202) 의 최우측 도면은 제자리에 분자 복합체를 갖는 이격된 나노전극들의 e-빔 리소그래피 제조된 쌍을 도시한다. 도 21 의 우측 하단의 스케치 (203) 는 각각 금 도트 접점으로 라벨링된 폴리머라제 분자 복합체 (207), 이격된 전극 (204 및 205) 을 포함하는 진행성 효소 분자 전자 센서의 예시이며, 여기서 전극 갭 (206) 은 약 10 nm 이다.
DNA 판독기 디바이스의 다양한 실시형태들에서, 나노-스케일 제조 기술들과 함께 CMOS 칩 디바이스의 사용은, 궁극적으로 휠씬 저렴한 비용, 높은 처리량, 빠르고, 스케일러블 시스템을 야기한다. 예를 들어, 이와 같은 센서들은 DNA 주형들을 초 당 10 이상의 염기들의 레이트로, 현재의 광학 시퀀서들보다 100 배 이상 더 빠르게 프로세싱할 수 있다. CMOS 칩 기술의 사용은 반도체 산업의 거대한 기반구조를 레버리지하는 대량-생산가능한 포맷으로 스케일러빌리티 및 낮은 시스템 비용을 보장한다. 언급한 바와 같이, DNA 센서에 존재할 수도 있거나, 또는 (예컨대, 더 낮은 시간 해상도에서 효소 또는 버퍼 또는 온도 또는 환경 인자들, 또는 샘플 데이터를 수정함으로써) 더 빠른 판독 속도로 발생할 수도 있는 모든 에러 모드들 또는 정확도 한계들이 설명된 전체 인코더/디코더-판독기-기록기 프레임워크에서 보상될 수 있다.
본 개시물의 다양한 실시형태들에서, 본원에서 사용하기 위한 DNA 판독기 칩은 적어도 1,000,000 개의 센서들, 적어도 10,000,000 개의 센서들, 적어도 100,000,000 개의 센서들, 또는 적어도 10억개의 센서들을 포함한다. 10 kHz 의 전형적인 센서 데이터 샘플링 레이트로 인식하고 측정 당 1 바이트를 기록하면, 100,000,000 개의 센서 칩은 원시 신호 데이터를 초 당 1 테라바이트 (TB) 의 레이트로 발생한다. 얼마나 많은 센서들이 단일 칩 상에서 바람직한지를 고려할 때, 하나의 중요 고려사항은 바람직한 디지털 데이터 판독 레이트들과 비교한, 이러한 칩이 DNA 에 저장된 디지털 데이터를 디코딩할 수 있는 레이트이다. 예를 들어, 초 당 최대 약 1 기가바이트의 레이트로 디지털 데이터를 판독하는 것이 바람직하다. DNA 로서 암호화된 디지털 데이터의 각각의 비트는, 이 정보를 저장하는데 사용된 신호 사용의 특징을 고려할 때, 다수의 신호 측정들이 복구될 것을 필요로 할 것이므로, 측정된 신호에 대한 이 원시 신호 데이터 생산 레이트가 암호화된 디지털 데이터의 복구 레이트보다 휠씬 더 높을 것이라는 점에 유의한다. 예를 들어, 1 비트의 저장된 디지털 데이터를 복구하기 위해 10 개의 신호 측정이 필요한 경우, 각 측정은 8 비트 바이트이며, 이는 1 비트의 저장된 디지털 데이터를 복구하기 위한 80 비트의 신호 데이터의 인자이다. 따라서, 디지털 데이터 판독 레이트들은 센서 원시 신호 데이터 획득 레이트보다 대략 100배 더 느릴 것으로 예상된다. 이러한 이유로, 1 기가바이트/sec 의 바람직한 디지털 데이터 판독 레이트를 달성하는 것은 사용가능한 원시 신호 데이터의 거의 0.1 TB/sec 를 필요로 할 것이다. 또, 단일 칩 내 모든 센서들이 사용가능한 데이터를 생성할 수 있는 것이 아니라면, DNA 로서 저장된 데이터로부터의 원하는 최종 디지털 데이터 복구 레이트들에 기초하여, 원시 데이터의 최대 1 TB/sec 를 발생시키는 칩들에 대한 요구가 바람직하다. 다양한 실시형태들에서, 이러한 복구 레이트들은 100,000,000 개의 센서 픽셀 칩에 대응한다.
본 개시물의 다양한 실시형태들에서, 다수의 칩들이 원하는 시스템-레벨 디지털 데이터 판독 레이트들을 달성하기 위해 판독기 시스템 내에 배치된다. 도 18 의 DNA 데이터 판독기 칩은 다양한 실시형태들에서, DNA 에 저장된 디지털 데이터를 판독하기 위한 완전한 시스템의 부분으로서 배치된다.
완전한 시스템의 일 실시형태의 특징들이 도 22 에 예시된다. 다양한 양태들에서, 그리고 도 22 를 참조하면, 완전한 디지털 데이터 판독 시스템은 단일 칩의 한계들을 넘어서 데이터 판독 처리량을 제공하기 위해, 다수의 칩들의 어레이에 대한 스테이징 영역을 갖는 마더보더를 포함한다. 이러한 칩들은 유동 셀들에, 센서 시스템 액체 시약들의 추가 및 제거를 제어하는 유체공학 액체 핸들링 시스템과 함께, 개별적으로 하우징된다. 게다가, 유체공학 시스템은 데이터 저장소 소스로부터 발생하는 DNA 암호화 데이터를 용액 형태로 수신한다. 마더보드는 또한 일차 신호 프로세서로 표시된, 1 초당 1TB 를 초과하거나 초당 10TB 를 초과하거나 초당 100TB 를 초과하는 것과 같이 매우 높은 레이트로 원시 신호 데이터를 수신 및 감소시킬 수 있는 적절한 1 스테이지 데이터 프로세싱 유닛을 포함할 것이다. 이 일차 프로세서는 FPGA, GPU, 또는 DSP 디바이스, 또는 커스텀 신호 프로세싱 칩 중 하나, 다수, 또는 조합들을 포함할 수도 있으며, 이는 선택적으로 프로세싱 파이프라인을 위한 유사한 이러한 신호 프로세서들의 스테이지들이 뒤따를 수도 있다. 이 일차 파이프라인의 데이터 출력은 전형적으로 솔리드 스테이트 드라이브와 같은 고속 데이터 저장 버퍼로 전송되며, 여기로부터의 데이터는 CPU-기반 서브-시스템에서 추가적인 프로세싱 또는 디코딩을 경험하며, 이로부터 데이터가 저 속도 대용량 저장 버퍼, 예컨대 하드 드라이브 또는 솔리드 스테이트 드라이브 또는 이러한 드라이브들의 어레이로 버퍼링된다. 거기로부터, 목적지로의 디코딩된 데이터의 후속 전송을 핸들링하는 보조 데이터 전송 컴퓨터 서브-시스템으로 전송된다. 모든 이들 시스템 동작들은 이들 기능 유닛들 및 프로세스들의 상호작용을 모니터링, 조정 및 제어하는 보조 제어 컴퓨터의 하이-레벨 제어 하에 있다.
일부 실시형태들에서, 판독기 시스템 내 칩들은 1회용이며 특정의 듀티 사이클, 예컨대 24 시간 내지 48 시간 이후 교체될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 칩들은 이러한 사용 구간 이후 제자리에 재조정될 수도 있으며, 이에 의해, 분자 복합체, 어쩌면 컨쥬게이션 기들이 제거된 후, 심각한 화학적 용액 노출들을 통해서 새로운 이러한 컴포넌트들로 대체된다. 제거 프로세스는 전극들에 인가되는 증가된 전압들, 전극들에 인가되는 교류 전압, 또는 전압 스윕과 같은, 구동 제거를 구동하기 위해 전극들에 인가되는 전압들을 이용하는 것을 포함할 수도 있다. 프로세스는 또한 높은 몰농도 우레아, 또는 구아니딘 또는 다른 카오트로픽 염들, 프로테아제들, 예컨대 단백분해효소 K, 산들, 예컨대 HCl, 염기들, 예컨대 KOH 또는 NaOH, 또는 이러한 용도들을 위한 분자 생물학 및 생화학 분야에 널리 공지된 다른 제제들과 같은 그러한 기들을 변성, 용해 또는 해리, 또는 아니면 제거하는 화학물질들의 사용을 포함할 수도 있다. 이 프로세스는 또한 분자 복합체 내 광-절단성 기들 또는 컨쥬게이션 기들과 함께, 상승된 온도 또는 광과 같은, 제거를 구동하기 위해 적용된 온도 또는 광의 사용을 포함할 수도 있다.
도 23 는 클라우드 기반 DNA 데이터 아카이브 저장 시스템의 실시형태를 도시하며, 여기서 도 22 에 요약된 바와 같은 완전한 판독기 시스템은 전체 아카이브 저장 및 검색 시스템의 클라우드 DNA 판독기 서버를 제공하기 위해 집성된 형식으로 배치된다. 도 23 는 표준 저장 포맷 (좌상부) 을 가진 클라우드 컴퓨팅 시스템을 도시한다. 그러한 표준 클라우드 컴퓨팅 시스템은 표시된 바와 같은 DNA 아카이브 데이터 저장 능력이 제공된다. 일부 클라우드-기반 DNA 합성 시스템은 클라우드 컴퓨터로부터 이진 데이터를 수신하여 물리적인 데이터 암호화 DNA 분자들을 발생시킬 수 있다. 이 서버는 출력 분자를 우측 하단의 DNA 데이터 저장 아카이브에 저장했으며, 여기서 일반적으로 데이터를 암호화하는 물리적 DNA 분자는 건조 또는 동결 건조 형식으로 또는 용액에, 주변 온도 또는 냉각 또는 냉동으로 저장될 수 있다. 이 아카이브로부터, 데이터가 취출될 때, 아카이브로부터의 DNA 샘플이 DNA 데이터 판독기 서버로 제공되고, 이는 다시 디코딩된 이진 데이터를 일차 클라우드 컴퓨터 시스템으로 출력한다. 이 DNA 데이터 판독기 서버는 일차 클라우드 저장 시스템의 원래 데이터 포맷으로 다시 DNA 유래 데이터의 최종 디코딩을 수행하는 추가 컴퓨터들과 조합하여 도 22 에 표시된 종류의 다수의 DNA 판독기 칩 기반 시스템에 의해 전력공급될 수도 있다.
도 24, 도 25 및 도 26 은 무증폭 판독을 지원할 수도 있고 센서 내에 폴리머라제 (또는 다른 가공 효소) 를 포함하는 다른 단일 분자 DNA 판독기의 관련 사용을 예시한다. 도 26 은 제로 모드 도파관 폴리머라제 광학 센서를 단면도로 도시한다.
다양한 실시형태들에서, 분자 전자소자 센서는 도 24 에 예시된 구성을 포함한다. 이 경우, 기본적인 전자 측정들이 막의 양 측면 상의 전극들, 막에 국재된 기공, 및 기공의 양면 상에 있는 수용액 상으로 구성된 나노포어 이온성 전류 센서로 이루어진다. 이 실시형태에서, 기공은 (파선 화살표 및 "i" 로 표시된) 이온 전류의 통과를 조절한다. 기공은 천연 또는 돌연변이화된 생물학적 단백질 나노포어를 포함할 수도 있으며, 막은 지질 막, 또는 이의 합성 유사체를 포함할 수도 있다. 기공은 또한 고체 상태 기공을 포함할 수도 있으며, 막은 SiN, 또는 테프론과 같은 고체 물질로 이루어지는 박막을 포함한다. 기공은 동일한 극성, 또는, 예시된 바와 같이, 대향 극성의 전극들을 가질 수도 있다. 도 24 에 나타낸 바와 같이, 폴리머라제 분자는 막을 통해서 기공의 부분으로서 매립된 적은 개수의 분자들을 포함하는 분자 복합체의 부분으로서 그리고 폴리머라제에의 컨쥬게이션을 제공하기 위해, 기공과 추가로 복합체화된다. 폴리머라제가 DNA 주형을 프로세싱함에 따라, 기공을 통한 이온성 전류가 이 활성에 의해 조절되어, 별개의 서열 특징들에 대응하는 구별가능한 신호 특징들을 발생시킨다. 나노-전기 측정의 상이한 기하학적 구조를 제외하고는, 달리, 고려사항들은 본원에서 이미 검토된 것들과 동일하다. 즉, 폴리머라제-기반 DNS 디지털 데이터 판독기의 나노-기공 전류 센서 버전들은 본원에서 유사하게 사용된다. 다양한 실시형태들에서, 폴리머라제는 기공에 직접적이고 구체적으로 컨쥬게이트되며, 여기서 변형된 dNTP 는 DNA 서열 특징으로부터 구별가능한 신호를 생성하는데 사용된다. 나노포어 센서에서 신호들을 발생시키기 위해, 이러한 dNTP 변형들은 dNTP 의 γ-포스페이트 상의 기들을 포함할 수도 있으며, 이는 dNTP 가 폴리머라제에 의해 혼입을 경험하는 동안 기공을 차단함으로써, 전류 억제 특징들을 초래할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 이러한 변형들은 트리-포스페이트 사슬을 4, 5, 6 또는 최대 12 포스페이트들까지 연장하는 것, 및 폴리머라제 혼입에 의해 제거되는 2 이상의 위치에서 말단 포스페이트 기들, 또는 기들을 포스페이트들 중 임의의 포스페이트에 첨가하는 것을 포함하며, 이러한 기들은 PEG 중합체들 또는 DNA 중합체들을 포함하는 것과 같이, 기공에 들어가서 기공을 차단할 수도 있는 중합체들을 포함한다. 기공에의 폴리머라제 컨쥬게이션은 분자 테더, 또는 Spy-SpyCatcher 단백질-기반 컨쥬게이션 시스템, 또는 기타 등등과 같은, 가능한 컨쥬게이션 화학들 중 임의의 하나를 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, DNA 를 판독하기 위한 분자 전자 센서는 탄소 나노튜브를 포함한다. 도 25 에 도시된 바와 같이, 브릿지 분자는 탄소 나노튜브를 포함한다 (양극과 음극 사이의 갭을 브릿지하는 도 26 의 굵은 수평 바로 표시된). 다양한 양태들에서, 탄소 나노튜브 가교는 단일 또는 다중 벽 탄소 나노튜브를 포함하며, 다수의 가능한 컨쥬게이션 화학들 중 임의의 컨쥬게이션 화학을 이용하여 특정의 부위에서 폴리머라제 분자에 컨쥬게이트된다. 이러한 컨쥬게이션은 예를 들어, 나노튜브에 나노튜브 상의 피렌의 π-적층을 통해서 부착되는 피렌 링커를 포함할 수도 있거나, 또는 탄소 나노튜브 상에 존재하는 결함 부위에의 부착을 포함할 수도 있다. 이 경우, 탄소 나노튜브 분자 와이어를 통과하는 전류는 주위 환경에서 고도로 민감한 다른 분자들인 것으로 알려져 있다. 또한, 탄소 나노튜브를 통과하는 전류는 폴리머라제 효소들을 포함한, 그 나노튜브에 적절하게 컨쥬게이트된 효소 분자의 활성에 민감한 것으로 알려져 있다. 이 특정의 실시형태에 있어서, 위에서 개시된 모든 본 개시물의 양태들은 관련된 유익한 양태들, 인코딩 방식들, 칩 포맷들, 시스템들 및 클라우드 기반 DNA 디지털 데이터 저장 시스템들을 포함하여, DNA 분자들에 저장된 디지털 데이터를 판독하기 위한 탄소 나노튜브 기반 센서를 제공하기 위해, 이 경우에 적용된다.
광학 신호들을 발생시키는 대안적인 센서는 도 26 에 예시된 센서와 같은, 제로 모드 도파관 센서이다. 이러한 센서는 내부 전반사 모드에서, 얇은 기판에 인가되는 여기 필드의 소멸 구역에서, 금속성 웰의 저부에 컨쥬게이트된, 나타낸 바와 같은 단일 폴리머라제를 포함할 수도 있다. 폴리머라제에는 절단가능한 포스페이트 기 상에 염료 라벨들을 갖는 dNTP들 및 프라이밍된 주형이 제공된다. 이러한 dNTP 가 혼입될 때, 염료 라벨은 소멸 필드에 유지되며, 대응하는 염료 에너지 스펙트럼 또는 컬러의 광자들을 방출하도록 자극된다. 그 결과는, 적합한 조건들 하에서, 이러한 센서는 표시된 바와 같은 구별가능한 광학 신호들을 발생시킬 수도 있으며 이는 디지털 정보를 DNA 분자들로 인코딩하는데 사용될 수 있다는 것이다. 여기서, 구별가능한 신호들은 상이한 에너지 분포, 또는 칼라의 광자 방출들, 또는 상이한 구별가능한 스펙트럼들, 또는 스펙트럼들의 상이한 지속기간 또는 강도 또는 형상 대 시간을 갖는 방출들, 또는 구별가능한 특징들을 초래하는 이러한 요소들의 임의의 조합일 수도 있다. 도 26 에 표시된 이 제로 모드 도파관 센서 실시형태에 있어서, 다양한 실시형태들에서 위에서 개시된 모든 본 개시물의 양태들은 또한 DNA 분자들에 저장된 디지털 데이터를 판독하기 위한 제로 모드 도파관-기반 센서, 및 관련된 유익한 양태들, 인코딩 방식들, 칩 포맷들 (이 경우, 이미지 센서 칩들과 같은 광 센서 칩들) 을 제공하기 위해 이 경우에도 적용되며, 시스템들 및 클라우드 기반 DNA 디지털 데이터 저장 시스템들이 이러한 센서에 적용될 수도 있다.
추가 실시형태들
다양한 실시형태들에서, 무증폭 DNA 아카이브 저장 시스템은: (i) DNA 데이터 분자를 기록하기 위한 무증폭 서브시스템; (ii) DNA 데이터 분자를 관리하기 위한 무증폭 서브시스템; 및 (iii) DNA 데이터 분자를 판독하기 위한 무증폭 서브시스템을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 감소된 증폭 DNA 아카이브 저장 시스템은 DNA 데이터 분자를 기록하기 위한 무증폭 서브시스템을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 감소된 증폭 DNA 아카이브 저장 시스템은 DNA 데이터 분자를 관리하기 위한 무증폭 서브시스템을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 감소된 증폭 DNA 아카이브 저장 시스템은 DNA 데이터 분자를 판독하기 위한 무증폭 서브시스템을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, DNA 데이터 분자를 기록하기 위한 무증폭 서브시스템은 분리된, 국소화된 포스포라미다이트 합성 반응의 사용을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, DNA 데이터 분자를 관리하기 위한 무증폭 서브시스템은 증폭 없이 카피하기 위한 분취량을 취하는 것을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, DNA 데이터 분자를 관리하기 위한 무증폭 서브시스템은 증폭 없이 볼륨을 선택하거나 데이터를 탐색하기 위한 혼성화의 사용을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, DNA 데이터 분자를 판독하기 위한 무증폭 서브시스템은 단일 분자 DNA 시퀀싱 시스템의 사용을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, DNA 데이터 분자를 판독하기 위한 무증폭 서브시스템은 DNA 의 단일 분자 분석을 수행하는 분자 전자 센서의 사용을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, DNA 데이터 분자를 판독하기 위한 무증폭 서브시스템은 폴리머라제를 포함하고 DNA 의 단일 분자 분석을 수행하는 분자 전자 센서의 사용을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, DNA 데이터 분자를 판독하기 위한 무증폭 서브 시스템은 CMOS 센서 픽셀 칩 상에 센서 어레이로서 배치된 복수의 분자 전자 센서의 사용을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 클라우드 기반 DNA 데이터 저장 정보 시스템은 상기 무증폭 또는 감소된 증폭 서브시스템들 중 임의의 것을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 무증폭 DNA 데이터 저장 및 검색 시스템에서 데이터를 검색하는 방법은: a. DNA 분자 저장 아카이브로부터 샘플을 획득하는 단계; 및, b. 증폭이 없는 판독기로 샘플로부터 DNA 데이터를 판독하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 무증폭 DNA 데이터 저장 방법은: a. 무증폭 방법으로 DNA 데이터를 기록하는 단계; b. 무증폭 방법으로 아카이브를 조작하는 단계; 및 c. 무증폭 DNA 판독기로 DNA 데이터를 판독하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 상기 방법은 클라우드 기반 시스템을 사용하여 수행된다.
다양한 실시형태에서, 무증폭 DNA 데이터 저장 시스템에서 데이터를 검색하기 위한 장치는 DNA 분자로 인코딩된 데이터를 판독하기 위한 무증폭 DNA 판독기 디바이스를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 무증폭 DNA 데이터 저장을 위한 장치는: a. 무증폭 방법으로 DNA 데이터를 기록하기 위한 장치; b. 무증폭 방법으로 아카이브를 조작하기 위한 장치; 및 c. 무증폭 DNA 판독기로 DNA 데이터를 판독하기 위한 장치를 포함한다.
무증폭 DNA 정보 저장 방법, 장치 및 시스템이 제공된다. "다양한 실시형태들", "일 실시형태", "실시형태", "예시적인 실시형태" 등에 대한 참조들은, 설명된 실시형태가 특정한 피처, 구조, 또는 특징을 포함할 수도 있지만, 모든 실시형태가 반드시 그 특정한 피처, 구조, 또는 특징을 포함하지 않을 수도 있는 것을 조합 등으로서 나타낸다. 또한, 이러한 문구들은 반드시 동일한 실시형태를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특정한 피처, 구조 또는 특징이 실시형태와 관련하여 설명될 때, 명시적으로 설명되는지 여부에 따라, 다른 실시형태들과 관련하여 그러한 피처, 구조 또는 특징에 영향을 미치도록 당업자의 지식 내에 있다는 것이 제시된다. 설명을 읽은 후, 대안적인 실시형태들에서 본 개시를 구현하는 방법은 관련 기술 분야의 당업자에게 명백할 것이다.
특정 실시형태들과 관련하여 이점, 다른 장점 및 문제에 대한 해결책이 설명되었다. 그러나, 임의의 이점, 장점 또는 해결책이 발생되게 하거나 더 현저하게 할 수도 있는 이점들, 장점들, 문제에 대한 해결책들, 및 임의의 엘리먼트(들)이 임의의 본 개시물의 중요한, 요구되는 또는 필수적인 특징들 또는 엘리먼트들로서 해석되지는 않아야 한다. 따라서, 본 개시의 범위는 첨부된 청구항들 이외의 다른 것에 의해 제한되지 않으며, 단수의 요소에 대한 언급은 명시적으로 언급되지 않는 한 "하나 및 오직 하나만" 을 의미하는 것이 아니라 "하나 이상" 을 의미하는 것으로 의도된다. 또한, 'A, B 및 C 중 적어도 하나' 또는 'A, B 또는 C 중 적어도 하나' 와 유사한 문구가 청구범위 또는 명세서에서 사용되는 경우, 그 문구는 A 만이 실시형태에 존재할 수도 있고, B 만이 실시형태에 존재할 수도 있고, C 만이 실시형태에 존재할 수도 있는 것을 의미하거나, 또는 엘리먼트들 A, B 및 C 의 임의의 조합; 예를 들어 A 및 B, A 및 C, B 및 C, 또는 A 및 B 및 C 이 단일 실시형태에 존재할 수도 있는 것을 의미하도록 해석된다.
당업자들에게 알려져 있는 앞서 설명된 다양한 실시형태들의 엘리먼트들에 대한 모든 구조적, 화학적 및 기능적 균등물들이 본원에 참조로 명백히 포함되며, 본 청구항들에 의해 포괄되도록 의도된다. 더욱이, 본 개시물에 의해 해결하고자 하는 각각의 모든 문제를 해결하기 위해 디바이스 또는 방법이 필요한 것은 아니며, 본 발명의 청구범위에 포함된다. 또한, 본 개시물의 엘리먼트, 컴포넌트 또는 방법 단계는 그 엘리먼트, 컴포넌트 또는 방법 단계가 청구범위에 명시적으로 언급되는지의 여부에 관계없이 대중에게 전용되도록 의도되지 않는다. 청구항 엘리먼트는 그 엘리먼트가 "를 위한 수단" 이라는 문구를 사용하여 명시적으로 언급되지 않는 한, 35 U.S.C. 112 (f) 를 적용하도록 의도되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다", "포함하는", 또는 임의의 다른 변형물들은, 엘리먼트들의 리스트를 포함하는 분자, 조성물, 프로세스, 방법, 또는 디바이스가 오직 그들의 엘리먼트들만을 포함하는 것이 아니라 그러한 분자, 조성물, 프로세스, 방법, 또는 디바이스들에 명시적으로 열거되거나 내재하지 않은 다른 엘리먼트들을 또한 포함할 수도 있도록, 비-독점적인 포함을 커버하도록 의도된다.
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acgcgctatt ggagtc 16
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aaaaacccaa ccccccaacc c 81
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cccaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 53
Claims (15)
- 정보를 아카이브하는 방법으로서,
인코딩 방식을 사용하여 하나 이상의 뉴클레오티드들로 상기 정보를 컨버팅하는 단계로서, 상기 뉴클레오티드들은 분자 전자 센서의 측정가능한 전기 파라미터에서 상기 정보와 관련된 구별가능한 신호들을 생성하도록 미리 결정되는, 상기 정보를 컨버팅하는 단계;
상기 하나 이상의 뉴클레오티드들을 뉴클레오티드 서열로 조립하는 단계; 및
DNA 분자들의 증폭 없이 복제 DNA 분자들의 풀을 합성하는 단계로서, 각각의 복제 DNA 분자는 상기 뉴클레오티드 서열을 혼입하는, 상기 복제 DNA 분자들의 풀을 합성하는 단계를 포함하는, 정보를 아카이브하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 정보는 이진 데이터의 스트링을 포함하는, 정보를 아카이브하는 방법. - 제 2 항에 있어서,
상기 인코딩 방식은 상기 이진 데이터의 스트링 내의 이진 데이터의 하나 이상의 0/1 비트들을 1 초과의 뉴클레오티드를 포함하는 서열 모티프로 컨버팅하는, 정보를 아카이브하는 방법. - 제 3 항에 있어서,
상기 정보를 컨버팅하는 단계는 상기 이진 데이터의 스트링을 세그먼트들로 분할하는 단계를 포함하며, 각각의 세그먼트는 하나의 서열 모티프를 인코딩하는, 정보를 아카이브하는 방법. - 제 4 항에 있어서,
상기 이진 데이터 비트 0 은 A 의 동종중합체를 인코딩하고, 상기 이진 데이터 비트 1 은 C 의 동종중합체를 인코딩하는, 정보를 아카이브하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 하나 이상의 뉴클레오티드들 중 적어도 하나는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 정보를 아카이브하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 하나 이상의 뉴클레오티드들은 동일한 뉴클레오티드들의 변이체와 비교하여, 상기 복제 DNA 분자들에서 이차 구조 형성에 저항하는 뉴클레오티드들을 포함하는, 정보를 아카이브하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 인코딩 방식은 BES1, BES2, BES3, BES4, BES5 및 BES6 중 임의의 하나 또는 조합을 포함하는, 정보를 아카이브하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 DNA 분자들의 사전 증폭 없이 상기 복제 DNA 분자들 중 적어도 하나를 상기 분자 전자 센서에 노출시키는 단계;
상기 구별가능한 신호들을 생성하는 단계; 및
상기 구별가능한 신호들을 상기 정보로 컨버팅하는 단계를 더 포함하고,
상기 분자 전자 센서는 이격된 전극들의 쌍 및 각 전극에 부착된 분자 센서 복합체를 포함하여 센서 회로를 형성하고, 상기 분자 센서 복합체는 상기 이격된 전극들의 쌍에서의 각각의 전극에 전기적으로 배선된 브릿지 분자 및 상기 브릿지 분자에 컨쥬게이트된 프로브 분자를 포함하는, 정보를 아카이브하는 방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 복제 DNA 분자들 중 적어도 하나를 상기 분자 전자 센서에 노출시키는 단계는 상기 DNA 분자들의 풀을 버퍼에 현탁시키는 단계, 상기 버퍼의 분취량 (aliquot) 을 취하는 단계, 및 상기 분취량을 상기 센서에 제공하는 단계를 포함하는, 정보를 아카이브하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
버퍼 용액은 변형된 dNTP들을 포함하는, 정보를 아카이브하는 방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 센서의 상기 측정가능한 전기 파라미터는 상기 이격된 전극들 사이의 그리고 상기 분자 센서 복합체를 통한 소스-드레인 전류를 포함하는, 정보를 아카이브하는 방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 프로브 분자는 폴리머라제를 포함하고, 상기 센서의 상기 측정가능한 전기 파라미터는 상기 복제 DNA 분자들 중 어느 하나를 처리하는 동안 상기 폴리머라제의 효소 활성에 의해 조절되는, 정보를 아카이브하는 방법. - 제 13 항에 있어서,
상기 폴리머라제는 E. coli Polymerase I 의 클레노브 단편을 포함하고, 상기 브릿지 분자는 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는, 정보를 아카이브하는 방법. - 무증폭 DNA 정보 저장 및 검색 시스템에서 이진 데이터의 스트링을 아카이브하고 검색하는 방법으로서,
상기 이진 데이터의 스트링을 적어도 하나의 이진 비트의 세그먼트들로 분할하는 단계;
각각의 세그먼트를 서열 모티프에 할당하는 단계로서, 각각의 서열 모티프는 적어도 2 개의 뉴클레오티드들을 포함하고, 상기 서열 모티프들은 분자 전자 센서의 측정가능한 전기 파라미터에서 구별가능한 신호들을 생성하도록 미리 결정되는, 상기 각각의 세그먼트를 서열 모티프에 할당하는 단계;
상기 서열 모티프들을 뉴클레오티드 서열로 조립하는 단계;
고체 지지체 상에서 무증폭 DNA 기록 방법을 사용하여 복제 DNA 분자들의 풀을 합성하는 단계로서, 각각의 복제 DNA 분자는 상기 뉴클레오티드 서열을 혼입하는, 상기 복제 DNA 분자들의 풀을 합성하는 단계;
상기 DNA 분자들의 풀을 버퍼에 현탁시키는 단계;
상기 버퍼의 분취량을 취하는 단계;
상기 DNA 분자들의 사전 증폭 없이 상기 분취량을 상기 센서에 제공하는 단계;
상기 구별가능한 신호들을 생성하는 단계; 및
상기 구별가능한 신호들을 상기 이진 데이터의 스트링으로 컨버팅하는 단계를 포함하며,
상기 센서는 이격된 전극들의 쌍 및 각 전극에 부착된 분자 센서 복합체를 포함하여 분자 전자 회로를 형성하고, 상기 분자 센서 복합체는 상기 이격된 전극들의 쌍에서의 각각의 전극에 전기적으로 배선된 브릿지 분자 및 상기 브릿지 분자에 컨쥬게이트된 프로브 분자를 포함하는, 이진 데이터의 스트링을 아카이브하고 검색하는 방법.
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