KR20180123062A - 정보 저장을 위한 방법, 조성물, 및 장치 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은, 하전된 중합체, 예컨대 DNA를 사용하여 정보를 저장하는 신규한 시스템으로서, 상기 중합체의 단량체는 기계 판독 가능한 코드, 예컨대 이진 코드에 상응하고, 중합체는 나노포어를 포함하는 신규한 나노칩 장치을 사용하여 합성 및/또는 판독될 수 있는 것인 시스템; 나노칩 포맷에서 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위한 신규한 방법 및 장치; 토포이소머라제를 사용하여 3'에서 5' 방향으로 DNA를 합성하기 위한 신규한 방법; 중합체가 나노포어를 통과함에 따라 정전 용량 변동량을 측정함으로써 하전된 중합체, 예컨대 DNA의 서열을 판독하기 위한 신규한 방법 및 장치를 제공하고; 추가로 상기에서 유용한 화합물, 조성물, 방법 및 장치도 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 2월 29일 출원된 미국 가특허 출원 제62/301,538호, 및 2016년 10월 31일 출원된 미국 가특허 출원 제62/415,430호를 우선권으로 주장하고, 상기 가특허 출원들은 각각 그 내용 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
분야
본 발명은 중합체, 예컨대 핵산을 합성하고 서열분석하는 나노포어 장치를 사용하는, 정보 저장 및 검색에 유용한 신규 방법, 조성물 및 장치에 관한 것이다.
물리적 매체에 또는 물리적 매체 상에 더욱더 많은 데이터를 저장하고자 하는 것이 계속해서 요구되고 있으며, 그의 능력이 점점 더 커짐에 따라 저장 장치의 크기는 점점 더 작아지고 있다. 보고에 따르면, 데이터 저장량은 그 크기가 매 2년마다 배가되고 있으며, 한 연구에 따르면, 2020년까지 우리들이 작성하고, 복사하는 데이터의 양은 매년 44 제타바이트, 또는 44조 기가바이트에 달하게 될 것이다. 추가로, 현 데이터 저장 매체, 예컨대, 하드 드라이브, 광학 매체, 및 자기 테이프는 상대적으로 불안정적이고, 장기간의 저장 후 손상된다.
장기간, 예컨대, 수십 년 또는 수백 년 동안 대용량의 데이터를 저장할 수 있는 대체 접근법이 절실히 요구되고 있다.
일부는 데이터 저장을 위해 DNA를 사용하는 것을 제안하여 왔다. DNA는 매우 안정적이고, 이론상으로 방대한 양의 데이터를 코딩할 수 있고, 매우 긴 기간 동안 데이터를 저장할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Bancroft, C., et al., Long-Term Storage of Information in DNA, Science (2001) 293: 1763-1765]를 참조한다. 추가로, 저장 매체로서의 DNA는 전통적인 디지털 저장 매체의 보안 위험에 취약하지 않다. 그러나, 이러한 아이디어를 실행하는 실질적인 접근법은 아직까지는 없다.
예를 들어, WO 2014/014991에는 96 비트(96 뉴클레오티드) 데이터 블록, 19 뉴클레오티드 어드레스 서열, 및 증폭 및 서열분석을 위한 측면 서열을 이용하여 DNA 올리고뉴클레오티드 상에 데이터를 저장하는 방법으로서, 여기서, 정보는 이진 포맷으로 뉴클레오티드 1개당 1 비트로 코딩되는 것인 방법이 기술되어 있다. 이어서, PCR을 사용하여 서열을 증폭시키고, 고속 서열분석기, 예컨대, 일루미나 하이Seq(Illumina HiSeq) 장치를 이용하여 서열분석함으로써 코드를 판독한다. 이어서, 어드레스 태그를 이용하여 데이터 블록 서열을 올바른 순서로 배열하고, 어드레스 및 측면 서열을 필터링하고, 서열 데이터를 이진 코드로 번역한다. 상기 접근법은 상당한 한계를 가지고 있다. 예를 들어, 96 비트 데이터 블록은 (문자 또는 공간당 종래의 1 바이트, 또는 8 비트를 사용하여) 단 12개의 문자만을 코딩할 수 있다. "하우스키핑" 정보 대비, 저장되는 유용한 정보의 비는 낮고 - 서열 정보 중 대략 40%는 어드레스 및 측면 DNA가 차지한다. 명세서는 54,898개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 북을 코딩하는 것을 기술한다. 올리고뉴클레오티드를 합성하는 데 사용되는, 잉크젯 인쇄식 고성능 DNA 마이크로칩은 올리고의 크기를 제한하였다(기술된 159-mer가 상한이었다). 추가로, 올리고뉴클레오티드 판독을 위해서는 증폭 및 단리가 요구되는데, 이로 인해 오류가 발생할 가능성이 추가로 도입된다. WO 2004/088585A2; WO 03/025123 A2; 문헌 [C. BANCROFT: "Long-Term Storage of Information in DNA", Science (2001) 293 (5536): 1763c-1765]; [COX J P L: "Long-term data storage in DNA", Trends in Biotechnology (2001)19(7): 247-250] 또한 참조한다.
25년 넘게 인정받아 온 바와 같이, DNA의 잠재적인 정보 밀도 및 안정성을 통해 데이터 저장을 위한 것으로서, 관심의 대상이 되는 비히클을 획득하였지만, 상기와 같은 형태로 다량의 데이터를 기록하고, 판독하기 위한 실질적인 접근법은 여전히 없다.
본 발명자들은 핵산 서열을 합성하는 나노유체 시스템 및 서열을 판독하는 나노포어 판독기를 사용하는 새로운 핵산 저장 접근법을 개발해 왔다. 본 발명자들의 접근법을 통해 길이가 수백, 수천, 또는 심지어는 수백만 개의 염기인 길이에 달하는 DNA 가닥을 합성, 저장, 및 판독할 수 있게 되었다. 서열은 길기 때문에, 정보를 확인하는 데에는 단지 비교적 작은 비율의 서열이 차지하고 있으며, 이에 정보 밀도는 상기 기술된 접근법보다 훨씬 더 높다. 추가로, 일부 실시양태에서, 핵산은 합성됨에 따라 나노칩 상에 특정 위치를 가지게 되며, 이로써, 상기 서열은 심지어 정보 확인 없이도 확인될 수 있다. 나노챔버에서 수행되는 서열분석은 매우 신속하고, 나노포어를 통한 서열 판독은 대략 1초당 최대 백만 개의 염기 정도로 극도로 빠를 수 있다. 단 2가지의 염기 유형을 필요로 하기 때문에, 서열분석은 4가지 뉴클레오티드 염기 유형(아데닌, 티민, 시토신, 구아닌)을 구별하여야 하는 서열분석 방법보다 더욱 빠르고, 더욱 정확할 수 있다. 특정 실시양태에서, 두 염기는 서로 쌍을 형성하지 않고, 2차 구조를 형성하지 않을 것이며, 이는 또한 크기가 다를 것이다. 예를 들어, 아데닌 및 시토신이 이러한 목적을 위해서는 하이브리드화하는 경향이 있는 아데닌 및 티민보다, 또는 크기가 유사한 아데닌 및 구아닌보다 더 우수할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 시스템은 데이터를 코딩하는 긴 중합체를 합성하는 데 사용될 수 있고, 이는 증폭 및/또는 유리될 수 있고, 이어서, 상이한 서열분석기에서 서열분석될 수 있다. 다른 실시양태에서, 시스템은 맞춤형 DNA 서열을 제공하는 데 사용될 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 시스템은 DNA 서열을 판독하는 데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서 사용되는 나노칩은 1 이상의 나노포어에 의해 연결된 2 이상의 개별 반응 구획을 포함하는데, 이는 성분 중 적어도 일부는 혼합되지 못하게 막지만, 극소량의 DNA 단일 분자, 또는 다른 하전된 중합체, 예컨대, RNA 또는 펩티드 핵산(PNA: peptide nucleic acid)은 제어가능한 방식으로 한 반응 구획에서 또 다른 구획으로 건너갈 수 있게 허용한다. 한 구획에서 또 다른 구획으로의 중합체(또는 단량체에 부가되는 중합체의 말단)의 이동을 통해, 예를 들어, 너무 크기 때문에, 또는 기판 또는 벌키한 부분에 테더링되어 있기 때문에 나노포어를 통해 건너가지 못하게 저지되는 효소를 사용하여 중합체의 조작/반응, 예컨대, 염기 부가가 순차적으로 진행될 수 있다. 나노포어 센서는 중합체의 이동 또는 위치 및 그의 상태, 예를 들어, 그의 서열 및 시도된 반응의 성공 여부를 보고한다. 이를 통해 데이터는 기록, 저장, 및 판독될 수 있고, 예를 들어, 염기 서열은 기계 판독 가능한 코드, 예를 들어, 이진 코드에 상응하며, 여기서, 각각의 염기 또는 염기 군은 1 또는 0에 상응한다.
따라서, 본 발명은 그 중에서도 특히 하기 실시양태를 포함한다,
· 2 이상의 별개의 단량체를 포함하는 전기적으로 하전된 중합체, 예컨대, DNA의 합성을 위한 나노칩으로서, 나노칩은, 각각의 반응 챔버가 전해질 유체를 포함하는 것인, 하나 이상의 나노포어에 의해 분리되어 있는 2개 이상의 반응 챔버, 전기적으로 하전된 중합체를 챔버로 끌어들이기 위한 하나 이상의 전극, 및 단량체 또는 올리고머의 중합체에의 부가를 촉진시키기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 것인 나노칩. 나노칩은 임의적으로 DNA를 가이드, 전달 및/또는 제어하는 기능성 소자로 구성될 수 있고, 나노칩은 임의적으로 DNA가 원활하게 유동할 수 있도록 또는 DNA가 부착될 수 있도록 선택된 물질로 코팅되거나, 또는 제조될 수 있고, 나노칩은 나노포어에 인접하게 전극을 제공하고, 그를 제어하는 나노회로 소자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 나노포어는 임의적으로 각각 나노포어를 통과하는 중합체의 이동을 제어할 수 있고/거나, 나노포어와 중합체의 계면에서의 전위, 전류, 저항 또는 정전 용량의 변화를 검출함으로써, 중합체가 하나 이상의 나노포어를 통과함에 따른 중합체의 서열을 검출할 수 있는 전극과 결합되어 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, 올리고머는 폴리머라제 또는 부위 특이적 리콤비나제를 사용하여 합성된다. 일부 실시양태에서, 중합체는 합성이 진행되는 동안 서열분석되고, 이로써, 검출될 수 있고, 임의적으로, 오류는 보정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 그렇게 수득된 중합체는 나노칩에 저장되고, 중합체 서열에 코딩된 정보를 액세스하기 위해 요구될 때에 서열분석될 수 있다.
· 기술된 바와 같은 나노칩을 사용하여 중합체, 예컨대, DNA를 합성하는 방법.
· 서열이 실질적으로 오직 비하이브리드화 뉴클레오티드, 예를 들어, 아데닌 및 시토신 뉴클레오티드(A 및 C)로만 구성되어 있고, 이는 이진 코드에 상응하는 서열로 배열되어 있는 것인, 데이터 저장 방법에서 사용하기 위한 단일 가닥 DNA 분자.
· 이중 가닥 DNA가 추가로 포함하는, 이진 코드에 상응하는 뉴클레오티드 서열 시리즈를 포함하는 이중 가닥 DNA.
· 나노포어 서열분석기를 사용하여 DNA에 코딩된 이진 코드를 판독하는 방법.
· 이진 코드에 상응하는 서열로 배열되어 있는 2 이상의 별개의 단량체를 포함하는 전기적으로 하전된 중합체, 예컨대, DNA를 제조하는 상기 나노칩을 사용하여 데이터를 저장하는 방법 및 데이터 저장용 장치.
본 발명의 추가의 적용가능성 측면 및 분야는 하기 제공되는 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 상세한 설명 및 구체적인 예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 명시하기는 하지만, 이는 단지 예시 목적의 것이며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
본 발명은 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 더욱 상세하게 이해될 것이다:
도 1은 나노포어에 의해 천공되어 있는 분리막, 및 막 양쪽에 전극을 포함하는, 간단한 2 챔버 나노칩 디자인의 다이어그램을 보여주는 것이다.
도 2 및 3은 하전된 중합체, 예컨대, DNA가 어떻게 양극 방향으로 끌어들여지는지를 보여주는 것이다.
도 4 및 5는 중합체가 전극의 극성을 역전시킴으로써 뒤로 이동될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
도 6은 DNA 합성을 위한 2 챔버 나노칩 디자인을 보여주는 것으로서, 여기서, 폴리머라제 효소는 한 챔버에 위치하고, 탈블로킹 효소는 나머지 다른 한 챔버에 존재하고, 그 중 어느 것도 나노포어를 통과할 수 없다.
도 7은 3' 블로킹된 dATP(A)가 좌측 챔버를 통해 유동하고, DNA를 챔버 내로 이동시키기 위해 전류가 '정방향'으로 설정되었을 때의 아데닌 뉴클레오티드 부가를 보여주는 것이다.
도 8은 추가의 뉴클레오티드가 부가될 수 있게 하는 올리고뉴클레오티드의 탈보호화를 보여주는 것이다. 예를 들어, 탈보호화는 DNA가 챔버 내로 이동한 후, 전류를 '역방향'으로 설정함으로써 이루어진다.
도 9는, 앞서 상기 챔버 중에 'A'가 존재하였던 것에서 제시된 바와 같이, 3' 블로킹된 dCTP(C)의 부가를 보여주는 것이다. 특정 실시양태에서, 유체 유동을 사용하여 상기 챔버의 내용물을 교체한다.
도 10은 유동 챔버가 시약을 제공하기 위해 단일 레인이 되는 동안, 다중의 개별 유지 챔버가 어떻게 제공될 수 있는지를 보여주는 것이다.
도 11은 챔버에 부착시킴으로써(도에서 상단의 DNA 단편), 또는 나노포어를 통과할 수 없는 벌키한 구조에 커플링시킴으로써(도에서 하단의 DNA 단편), DNA를 그의 챔버와 결합된 상태로 유지시키는 접근법을 보여주는 것이다. 본 시스템에서 DNA의 말단은 계속해서 유동 챔버 내로 이동할 수 있고, 추가의 뉴클레오티드를 받을 수 있지만, 나머지 다른 한 말단은 유치 챔버에 그대로 유지된다.
도 12는 DNA가 챔버의 벽에 부착되어 있고, 다중 전극에 의해 제어되는 구성을 보여주는 것이다.
도 13은 원하는 경우, DNA가 어떻게 챔버에 유지될 수 있는지, 간단하게는 전극의 극성을 제어함으로써 유지될 수 있음을 보여주는 것이다.
도 14는 챔버 표면에 결합된 DNA와 함께, 양쪽을 통과하는 자유 유동성 시약을 포함하는 어레이를 보여주는 것이다.
도 15는 제조 비용을 더 저렴하게 만드는, 전극이 분리막에 인접한 측면에 위치하는 것인 대안적 디자인을 보여주는 것이다.
도 16은 3 구획 배열을 보여주는 것으로서, 여기서, DNA는 전극에 의해 구획에서 구획으로 이동할 수 있다. 상기 시스템은 합성 동안 시약의 유의적인 유동을 필요로 하지 않는다.
도 17은 시약이 3 구획 배열에서 어떻게 구성될 수 있는지 그 방식의 예를 보여주는 것이다.
도 18은 막 양쪽에 전극 소자를 가지는 나노포어에 인접하게 테더링된 올리고뉴클레오티드를 도시한 것이다.
도 19는 나노포어를 포함하는 막 양쪽의 유동 레인과 함께, 상기 막을 따라 부착되어 있고, 각각은 나노포어에 인접한 전극의 제어하에 있는 것이 DNA 분자 시리즈를 도시한 것이다. 예를 들어, 도시된 바와 같이, 좌측 유동 레인은 완충제 세정제/3' 블로킹된 dATP(A)/완충제 세정제/3' 블로킹된 dCTP(C)/완충제 세정제의 플로우를 제공하고, 여기서, DNA 분자는 오직 원하는 뉴클레오티드가 존재하는 경우에만 유동 챔버 내로 이동하게 된다. 우측 레인은 뉴클레오티드의 3' 말단을 탈보호화하고, 또 다른 뉴클레오티드가 부가될 수 있도록 허용하기 위한 탈블로킹제(들)를 제공한다. 한 실시양태에서, 탈블로킹제(들)는 좌측 레인이 완충제로 세척되는 동안에 그때 유동하게 된다. 또 다른 실시양태에서, 탈보호화제(들)는 너무 벌키하기 때문에 나노포어를 통해 좌측 레인으로 건너가지 못한다.
도 20-22은 데이터를 코딩하는 데 사용된 비트가 토포이소머라제를 사용하여 부착된 짧은 올리고머인, 개념 입증 실험을 개략적으로 도시한 것이다.
도 23은 정전 용량 변동량을 사용하여 중합체 서열을 판독하는 것인, 나노포어 서열분석기 포맷을 도시한 것이다. 상기 정전 용량 판독 도식에서, 전극은 나노포어를 포함하는 막에 의해 분리된, 커패시터의 상단 및 하단 플레이트를 형성한다. 커패시터는 공진 회로에 포매되어 있고, 여기서, 맥동 직류는 나노포어를 통해 하전된 중합체를 끌어들일 수 있다. 중합체, 예컨대, DNA가 나노포어를 통과함에 따라, 고주파수 임피던스 분광법을 사용하여 정전 용량의 변화가 측정된다. 특히 DNA인 경우에 본 접근법의 주된 이점은 측정 주파수가 매우 높을 수 있고(매 사이클마다 효과적으로 측정이 진행될 수 있고, 이에 100 MHz 주파수는 초당 1억 번의 측정에 상응한다), 나노포어를 통한 단량체의 전달 속도보다 훨씬 더 클 수 있다는(DNA는 예를 들어, 어떤 식으로든 제약을 받지 않는다면, 전류에 대한 반응으로 초당 약 100만 개의 뉴클레오티드인 속도로 나노포어를 통과하게 될 것이다) 점이다.
도 24는 예컨대, 2 비트 또는 이진 코딩을 위해 2가지 상이한 유형의 단량체 또는 올리고머를 부가하는 데 적합한 이중 부가 챔버 레이아웃을 도시한 것이다. 상부 도면은 상면도를 보여주는 것이다. 하부 도면은 측면 단면도를 보여주는 것이다. 본 실시양태에서 전체 장치는 독립적으로 제조된, 최대 3개의 층으로부터 어셈블리될 수 있고, 웨이퍼 본딩에 의해 연결될 수 있거나, 단일 기판을 에칭하여 형성될 수 있다. 칩은 전기 제어 층(1), 제1 및 제2 부가 챔버로의 나노포어 입구 사이에 고정된 하전된 중합체(예컨대, DNA)와 함께, 저장 챔버 위에 2개의 부가 챔버를 함유하는 유체 층(2), 및 전기 접지 층(3)을 포함한다.
도 25는 도 24의 이중 부가 챔버 레이아웃의 작동을 도시한 것이다. 각 부가 챔버의 기저부에 나노포어(4)가 있다는 것을 관찰하게 될 것이다. 나노포어는 예를 들어, FIB를 이용하는 드릴링, TEM, 또는 습식 또는 건식 에칭에 의해, 또는 절연 파괴를 통해 제조된다. 나노포어를 포함하는 막(5)의 두께는 예컨대, 1 원자 층 내지 10 nm 두께이다. 이는 예컨대, SiN, BN, SiOx, 그래핀, 전이 금속 디칼코게나이드, 예컨대, WS2 또는 MoS2로 제조된다. 나노포어 막(5) 아래에는 부가 챔버 중 하나에서의 단량체 또는 올리고머의 부가 이후에 중합체의 탈보호화를 위한 시약을 함유하는 저장 또는 탈블로커 챔버(6)가 존재한다(단량체 또는 올리고머는 말단 보호된 형태로 부가되고, 이에 한 번에 오직 단 하나의 단일 단량체 또는 올리고머가 부가된다는 것을 기억할 것이다). 중합체(7)는 전기 제어 층(1) 중의 전극의 극성을 변화시킴으로써 부가 챔버의 안으로 또는 밖으로 끌어들여질 수 있다.
도 26은 도 24 및 25와 유사한 레이아웃의 상면도를 도시한 것으로, 유사하지만 여기는 공동 저장 또는 탈블로커 챔버를 공유하는 4개의 부가 챔버가 존재하고, 중합체는 4개의 각 챔버로의 접근이 이루어지는 지점(9)에 테더링되어 있다. 상기 레이아웃의 단면도는 도 24 및 25에 도시된 것과 같을 것이며, 하전된 중합체는 전기 제어 층(도 24에서 (1))에서 전극 작동에 의해 4개의 각 부가 챔버 내로 이동될 수 있다.
도 27은 다중 중합체가 동시에 합성될 수 있도록 허용하는, 도 24 및 25에 도시된 바와 같은 이중 부가 챔버의 다중 세트를 가지는 나노포어 칩의 상면도를 도시한 것이다. 단량체(여기서는 A 및 G로 표시되는 dATP 및 dGTP 뉴클레오티드)는 연속 유동 경로를 통해 각 챔버 내로 로딩된다. 하나 이상의 공동 탈블로커 유동 셀은 부가 챔버 중 하나에서의 단량체 또는 올리고머의 부가 이후에 중합체가 탈보호화될 수 있게 한다. 이는 또한 중합체가 요구에 따라 예를 들어, DNA인 경우, 제한 효소를 사용하여, 또는 화학적 분리에 의해 나노포어에 인접한 표면으로부터 분리될 수 있게 하고, 외부에서 수집될 수 있게 허용한다. 상기의 특정 실시양태에서, 탈블로커 유동 셀은 부가 챔버를 충전시키는 데 사용되는 유체 로딩 채널에 수직으로 위치한다.
도 28은 이중 부가 챔버 레이아웃을 위한 배선에 관한 추가의 상세도를 도시한 것이다. 전기 제어 층(1)은 금속 또는 폴리실리콘으로 제조된 배선을 포함한다. 배선 밀도는 3D 적층에 의해 증가되고, 전기적 절연은 (예컨대, PECVD, 스퍼터링, ALD 등을 통해) 유전체 증착에 의해 제공된다. 한 실시양태에서, 부가 챔버 중 상단 전극에의 접촉(11)은 심도 반응성 이온 에칭(DRIE: Deep Reactive Ion Etch)에 의해 실리콘 관통 전극(TSV: Through Silicon Via)을 사용하여(극저온 또는 BOSCH프로세스) 이루어진다. 개별 전압 제어(12)를 통해 각각의 부가 챔버는 개별적으로 어드레싱될 수 있고, 이를 통해서 다중 중합체 서열은 동시에 미세 조정될 수 있다. 도면에서 우측은 다중 부가 셀로의 배선을 보여주는 상면도를 도시한 것이다. 전기 접지 층(3)은 (제시된 바와 같이) 공통될 수 있거나, 또는 셀 사이의 교차 커플링을 감소시키기 위해 분할되어 있을 수 있다.
도 29는 부가 챔버를 위한 제어 전극(13)이 챔버 상단에 있는 대신 두루마리 방식으로 챔버 측면에 증착될 수 있는 것인, 대안적 구성을 도시한 것이다.
도 30은 실시예 3에 기술된 바와 같은 토포이소머라제 첨가 프로토콜이 작동하였는지를 확인하는 SDS-PAGE 겔을 도시한 것이며, 여기서, A5 및 B5 예상 생성물에 상응하는 밴드가 명확하게 육안으로 관찰된다.
도 31은 실시예 5의 PCR 생성물이 올바른 크기를 가진 것임을 확인시켜 주는 아가로스 겔을 도시한 것이다. 레인 0은 25개의 염기쌍 래더이고; 레인 1은 실험의 생성물이며, 라인은 예상 분자량에 상응하고; 레인 2는 음성 대조군 #1이고; 레인 3은 음성 대조군 #2이고; 레인 4는 음성 대조군 #4이다.
도 32는 실시예 5에 기술된 바와 같은 제한 효소가 예상 생성물을 제조한다는 것을 확인시켜 주는 아가로스 겔을 도시한 것이다. 좌측의 래더는 100개의 염기쌍 래더이다. 레인 1은 비분해된 NAT1/NAT9c이고, 레인 2는 분해된 NAT1/NAT9c이다. 레인 3은 비분해된 NAT1/NAT9cI이고, 레인 4는 분해된 NAT1/NAT9cI이다.
도 33은 나노포어 인근에의 DNA의 고정화를 도시한 것이다. 패널(1)은 좌측 챔버에서 한쪽 말단에 오리가미(origami) 구조를 가지는 DNA를 보여주는 것이다(실제 나노칩에서는 처음에 좌측 챔버에 상기와 같은 오리가미 구조가 다수 존재한다). 패널(2)는 우측에 양극을 가지는 시스템을 나타낸 것으로서, 상기 양극은 DNA를 나노포어 쪽으로 유도한다. DNA 가닥은 나노포어를 통과할 수 있지만, 오리가미 구조는 너무 커서 통과하지 못하며, 이에, DNA는 '움직일 수 없는 상태'가 된다. 전류 전원을 오프하면(패널 3), 이로써, DNA는 확산될 수 있다. 적합한 화학법을 사용할 경우, DNA 가닥의 말단은 나노포어 인근 표면과의 접촉시, 그에 결합할 수 있다. 패널(4)에서, 오리가미 구조를 DNA로부터 절단하는 제한 효소를 첨가한다. 챔버를 세척하여 효소 및 잔류 DNA를 제거한다. 최종 결과물은, 나노포어를 통해 전후로 이동할 수 있는, 나노포어 인근에 부착된 단일 DNA 분자이다.
도 34는 기본 기능성 나노포어를 도시한 것이다. 각 패널에서, y축은 전류(nA)이고, x축은 시간(s)이다. 좌측 패널 "RF 잡음 스크리닝"은 패러데이 케이지의 유용성을 나타낸 것이다. 나노포어가 없는 칩을 유동 셀에 배치하고, 300 mV를 가한다. 패러데이 케이지의 리드를 닫았을 때(첫 번째 화살표 표시), 잡음이 감소되었음을 관찰할 수 있다. 래치를 닫았을 때(두 번째 화살표 표시), 작은 스파이크가 발생한다. 전류는 ~0 nA인 것에 주의한다. 포어 제조 후(가운데 패널), 300 mV를 인가하면(화살표 표시) ~3.5 nA의 전류가 일어난다. DNA를 접지 챔버에 적용시키고, +300 mV를 인가하였을 때, 전류가 일시적으로 감소함에 따른 DNA 이동(우측 패널)을 관찰할 수 있다(주의, 이 경우, TS 완충제: 50 mM 트리스, pH 8, 1 M NaCl이 사용된다). 본 DNA 이동 실험을 위해 람다 DNA가 사용된다.
도 35는 DNA 오리가미 구조의 주요 피쳐: 큰 단일 가닥 영역, 입방체 오리가미 구조, 및 오리가미 구조 인근에 존재하는 2개의 제한 부위(SwaI 및 AlwN1)를 나타낸 간략도를 도시한 것이다.
도 36은 제조된 DNA 오리가미 구조의 전자 현미경 영상을 도시한 것이고, 이는 예상된 토폴로지를 나타낸다. 오리가미는 5 mM 트리스 염기, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl, 5 mM MgCl2에서 제조된다. 오리가미 구조를 유지시키기 위해서는 Mg++ 농도는 ~5 mM, 또는 Na+/K+ 농도는 약 1 M인 것이 바람직하다. 오리가미 구조는 500 nM으로 4℃에서 보관된다.
도 37은 올바른 어셈블리 및 기능을 확인하기 위한 DNA 오리가미의 제한 분해를 도시한 것이다. 가장 왼쪽에 있는 레인은 MW 표준을 제공한다. 오리가미를 AlwN1 및 Swa1로 분해함으로써 제한 부위를 시험한다. 4개의 시험 레인은 하기와 같은 시약을 함유한다(단위는 ㎕이다):
시험 레인(1)은 음성 대조군이고; (2)는 Swa1에 의한 분해이고; (3)은 AlwN1에 의한 분해이고; (4)는 Swa1/AlwN1에 의한 이중 분해이다. 분해는 실온에서 60분 동안, 이어서, 37℃에서 90분 동안 수행된다. 에티디움 브로마이드 염색으로 시각화된 아가로스 겔 1/2x TBE-Mg(5 mM MgCl2을 포함하는 1/2x TBE). 어느 효소든 그에 의한 개별 분해는 겔에서 어떤 이동 효과도 보이지 않은 반면, 두 효소로 함께 이루어진 분해(레인 4)를 통해서는 예상대로, 상이한 길이의 두 단편이 생성되었다.
도 38은 비오틴 표지화된 올리고뉴클레오티드의 스트렙트아비딘 코팅된 비드에의 결합 대 대조군 BSA 코팅된 비드에의 결합을 도시한 것이다. y축은 형광 단위이고, '결합 이전'은 비드에의 결합 이전의 시험 용액으로부터의 올리고 형광이고, (-) 대조군은 BSA 접합된 비드의 두 상이한 배치에의 결합 이후에 관찰된 형광이고, SA-1 및 SA-2는 스트렙트아비딘 접합된 비드의 두 상이한 배치에의 결합 이후에 관찰된 형광이다. BSA 접합된 비드 경우에는 겉보기상 소량의 결합이 관찰되었지만, 스트렙트아비딘 접합된 비드 경우에는 훨씬 더 많은 결합이 관찰되었다.
도 39는 상이한 완충제 시스템, MPBS 및 HK 완충제 중에서의 비오틴 표지화된 올리고뉴클레오티드의 스트렙트아비딘 코팅된 비드에의 결합 대 대조군 BSA 코팅된 비드에의 결합을 도시한 것이다. 좌측 막대 'Neg Ctrl'은 비드에의 결합 이전의 시험 용액으로부터의 올리고 형광이다. 가운데 칼럼은 'BSA 비드'의 형광을 보여주는 것이고, 우측 칼럼은 각각 BSA 또는 스트렙트아비딘 비드에의 결합 이후의 'SA 비드'의 것을 보여주는 것이다. 두 완충제 시스템 모두에서, 형광은 스트렙트아비딘 비드에 의해 대조군 대비로 감소된 상태이고, 이는 비오틴 표지화된 올리고뉴클레오티드가 상이한 완충제 시스템 중에서 스트렙트아비딘 코팅된 비드에 잘 결합한다는 것을 시사하는 것이다.
도 40은 표면이 한쪽 면은 스트렙트아비딘으로 코팅되고, 나머지 다른 한쪽은 BSA로 코팅된, 기능성 접합된 SiO2 나노포어를 도시한 것이다. x축은 시간이고, y축은 전류이다. 도트 표시는 전류가 역전된 지점을 나타낸다. 전류가 역전될 때 단기간의 오버슈트가 존재하고, 이어서, 전류는 대략 동일한 절대값으로 안정된다. 나노포어는 200 mV에서는 ~+3 nA, 및 -200 mV에서는 ~-3 nA의 전류를 나타낸다.
도 41은 나노포어 내로 삽입된 오리가미 DNA 구조를 나타낸 대표도를 보여주는 것이다.
도 42는 단일 가닥 DNA의 나노포어에 인접한 스트렙트아비딘 코팅된 표면에의 부착을 나타낸 대표도를 보여주는 것이다.
도 43은 나노포어 인근의 표면에 부착된 오리가미 DNA의 실험 결과를 보여주는 것이다. 전류는 양방향으로 +2.5 nA 또는 -2.5 nA인데, 이는 +/- ~3nA인 원래의 전류보다 작은 값이고, 이는 오리가미 구조에 의해 부분적으로 차단되었다는 것을 반영하는 것이다. x축은 시간(s)이고, y축은 전류(nA)이고, 동그라미 표시는 전압 변환점을 나타낸다.
도 44는 전류를 약간 하강시키는 결과를 초래하는, 오리가미 DNA의 삽입을 보여주는 것이다. 전류 방출시, 오리가미는 즉시 나노포어로부터 빠져 나간다. x축은 시간(s)이고, y축은 전류(nA)이고, 동그라미 표시는 전압 변환점을 나타낸다.
도 45는 전류 인가에 의해 이루어지는 제어된 방식의 나노포어를 통한 DNA 가닥의 전후 이동을 나타낸 대표도를 보여주는 것이다. 좌측에서, DNA는 포어에 있고, 이에 관찰되는 전류는 포어에 DNA가 없을 때의 전류보다 더 낮은 값이 될 것이다. 전류 역전시(우측), 포어에 DNA는 없고, 이로써, 전류에는 변함이 없을 것이다.
도 46은 상기 대표도를 확인하는 실험 결과를 보여주는 것이다. 양의 전압을 인가하였을 때, 전류는 ~3 nA로, 이는 전형적으로, 포어 개방시 관찰되는 전류와 유사한 값이다. 전압 역전시, 전류는 ~-2.5 nA이다. 이는 전형적으로, 포어 개방시 관찰되는 전류보다 더 낮고, 전형적으로, 포어가 DNA 가닥에 의해 차단되었을 때 관찰되는 전류와 일치한다. 수회의 순차적인 전압 변환은 일관된 결과를 나타내며, 이는 DNA가 도 45에 도시된 바와 같이 구성에 교대로 존재한다는 것을 제안한다.
도 47은 DNA를 나노포어에 인접한 표면에 연결시키는 상이한 접합 화학법을 보여주는 것이다.
도 1은 나노포어에 의해 천공되어 있는 분리막, 및 막 양쪽에 전극을 포함하는, 간단한 2 챔버 나노칩 디자인의 다이어그램을 보여주는 것이다.
도 2 및 3은 하전된 중합체, 예컨대, DNA가 어떻게 양극 방향으로 끌어들여지는지를 보여주는 것이다.
도 4 및 5는 중합체가 전극의 극성을 역전시킴으로써 뒤로 이동될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
도 6은 DNA 합성을 위한 2 챔버 나노칩 디자인을 보여주는 것으로서, 여기서, 폴리머라제 효소는 한 챔버에 위치하고, 탈블로킹 효소는 나머지 다른 한 챔버에 존재하고, 그 중 어느 것도 나노포어를 통과할 수 없다.
도 7은 3' 블로킹된 dATP(A)가 좌측 챔버를 통해 유동하고, DNA를 챔버 내로 이동시키기 위해 전류가 '정방향'으로 설정되었을 때의 아데닌 뉴클레오티드 부가를 보여주는 것이다.
도 8은 추가의 뉴클레오티드가 부가될 수 있게 하는 올리고뉴클레오티드의 탈보호화를 보여주는 것이다. 예를 들어, 탈보호화는 DNA가 챔버 내로 이동한 후, 전류를 '역방향'으로 설정함으로써 이루어진다.
도 9는, 앞서 상기 챔버 중에 'A'가 존재하였던 것에서 제시된 바와 같이, 3' 블로킹된 dCTP(C)의 부가를 보여주는 것이다. 특정 실시양태에서, 유체 유동을 사용하여 상기 챔버의 내용물을 교체한다.
도 10은 유동 챔버가 시약을 제공하기 위해 단일 레인이 되는 동안, 다중의 개별 유지 챔버가 어떻게 제공될 수 있는지를 보여주는 것이다.
도 11은 챔버에 부착시킴으로써(도에서 상단의 DNA 단편), 또는 나노포어를 통과할 수 없는 벌키한 구조에 커플링시킴으로써(도에서 하단의 DNA 단편), DNA를 그의 챔버와 결합된 상태로 유지시키는 접근법을 보여주는 것이다. 본 시스템에서 DNA의 말단은 계속해서 유동 챔버 내로 이동할 수 있고, 추가의 뉴클레오티드를 받을 수 있지만, 나머지 다른 한 말단은 유치 챔버에 그대로 유지된다.
도 12는 DNA가 챔버의 벽에 부착되어 있고, 다중 전극에 의해 제어되는 구성을 보여주는 것이다.
도 13은 원하는 경우, DNA가 어떻게 챔버에 유지될 수 있는지, 간단하게는 전극의 극성을 제어함으로써 유지될 수 있음을 보여주는 것이다.
도 14는 챔버 표면에 결합된 DNA와 함께, 양쪽을 통과하는 자유 유동성 시약을 포함하는 어레이를 보여주는 것이다.
도 15는 제조 비용을 더 저렴하게 만드는, 전극이 분리막에 인접한 측면에 위치하는 것인 대안적 디자인을 보여주는 것이다.
도 16은 3 구획 배열을 보여주는 것으로서, 여기서, DNA는 전극에 의해 구획에서 구획으로 이동할 수 있다. 상기 시스템은 합성 동안 시약의 유의적인 유동을 필요로 하지 않는다.
도 17은 시약이 3 구획 배열에서 어떻게 구성될 수 있는지 그 방식의 예를 보여주는 것이다.
도 18은 막 양쪽에 전극 소자를 가지는 나노포어에 인접하게 테더링된 올리고뉴클레오티드를 도시한 것이다.
도 19는 나노포어를 포함하는 막 양쪽의 유동 레인과 함께, 상기 막을 따라 부착되어 있고, 각각은 나노포어에 인접한 전극의 제어하에 있는 것이 DNA 분자 시리즈를 도시한 것이다. 예를 들어, 도시된 바와 같이, 좌측 유동 레인은 완충제 세정제/3' 블로킹된 dATP(A)/완충제 세정제/3' 블로킹된 dCTP(C)/완충제 세정제의 플로우를 제공하고, 여기서, DNA 분자는 오직 원하는 뉴클레오티드가 존재하는 경우에만 유동 챔버 내로 이동하게 된다. 우측 레인은 뉴클레오티드의 3' 말단을 탈보호화하고, 또 다른 뉴클레오티드가 부가될 수 있도록 허용하기 위한 탈블로킹제(들)를 제공한다. 한 실시양태에서, 탈블로킹제(들)는 좌측 레인이 완충제로 세척되는 동안에 그때 유동하게 된다. 또 다른 실시양태에서, 탈보호화제(들)는 너무 벌키하기 때문에 나노포어를 통해 좌측 레인으로 건너가지 못한다.
도 20-22은 데이터를 코딩하는 데 사용된 비트가 토포이소머라제를 사용하여 부착된 짧은 올리고머인, 개념 입증 실험을 개략적으로 도시한 것이다.
도 23은 정전 용량 변동량을 사용하여 중합체 서열을 판독하는 것인, 나노포어 서열분석기 포맷을 도시한 것이다. 상기 정전 용량 판독 도식에서, 전극은 나노포어를 포함하는 막에 의해 분리된, 커패시터의 상단 및 하단 플레이트를 형성한다. 커패시터는 공진 회로에 포매되어 있고, 여기서, 맥동 직류는 나노포어를 통해 하전된 중합체를 끌어들일 수 있다. 중합체, 예컨대, DNA가 나노포어를 통과함에 따라, 고주파수 임피던스 분광법을 사용하여 정전 용량의 변화가 측정된다. 특히 DNA인 경우에 본 접근법의 주된 이점은 측정 주파수가 매우 높을 수 있고(매 사이클마다 효과적으로 측정이 진행될 수 있고, 이에 100 MHz 주파수는 초당 1억 번의 측정에 상응한다), 나노포어를 통한 단량체의 전달 속도보다 훨씬 더 클 수 있다는(DNA는 예를 들어, 어떤 식으로든 제약을 받지 않는다면, 전류에 대한 반응으로 초당 약 100만 개의 뉴클레오티드인 속도로 나노포어를 통과하게 될 것이다) 점이다.
도 24는 예컨대, 2 비트 또는 이진 코딩을 위해 2가지 상이한 유형의 단량체 또는 올리고머를 부가하는 데 적합한 이중 부가 챔버 레이아웃을 도시한 것이다. 상부 도면은 상면도를 보여주는 것이다. 하부 도면은 측면 단면도를 보여주는 것이다. 본 실시양태에서 전체 장치는 독립적으로 제조된, 최대 3개의 층으로부터 어셈블리될 수 있고, 웨이퍼 본딩에 의해 연결될 수 있거나, 단일 기판을 에칭하여 형성될 수 있다. 칩은 전기 제어 층(1), 제1 및 제2 부가 챔버로의 나노포어 입구 사이에 고정된 하전된 중합체(예컨대, DNA)와 함께, 저장 챔버 위에 2개의 부가 챔버를 함유하는 유체 층(2), 및 전기 접지 층(3)을 포함한다.
도 25는 도 24의 이중 부가 챔버 레이아웃의 작동을 도시한 것이다. 각 부가 챔버의 기저부에 나노포어(4)가 있다는 것을 관찰하게 될 것이다. 나노포어는 예를 들어, FIB를 이용하는 드릴링, TEM, 또는 습식 또는 건식 에칭에 의해, 또는 절연 파괴를 통해 제조된다. 나노포어를 포함하는 막(5)의 두께는 예컨대, 1 원자 층 내지 10 nm 두께이다. 이는 예컨대, SiN, BN, SiOx, 그래핀, 전이 금속 디칼코게나이드, 예컨대, WS2 또는 MoS2로 제조된다. 나노포어 막(5) 아래에는 부가 챔버 중 하나에서의 단량체 또는 올리고머의 부가 이후에 중합체의 탈보호화를 위한 시약을 함유하는 저장 또는 탈블로커 챔버(6)가 존재한다(단량체 또는 올리고머는 말단 보호된 형태로 부가되고, 이에 한 번에 오직 단 하나의 단일 단량체 또는 올리고머가 부가된다는 것을 기억할 것이다). 중합체(7)는 전기 제어 층(1) 중의 전극의 극성을 변화시킴으로써 부가 챔버의 안으로 또는 밖으로 끌어들여질 수 있다.
도 26은 도 24 및 25와 유사한 레이아웃의 상면도를 도시한 것으로, 유사하지만 여기는 공동 저장 또는 탈블로커 챔버를 공유하는 4개의 부가 챔버가 존재하고, 중합체는 4개의 각 챔버로의 접근이 이루어지는 지점(9)에 테더링되어 있다. 상기 레이아웃의 단면도는 도 24 및 25에 도시된 것과 같을 것이며, 하전된 중합체는 전기 제어 층(도 24에서 (1))에서 전극 작동에 의해 4개의 각 부가 챔버 내로 이동될 수 있다.
도 27은 다중 중합체가 동시에 합성될 수 있도록 허용하는, 도 24 및 25에 도시된 바와 같은 이중 부가 챔버의 다중 세트를 가지는 나노포어 칩의 상면도를 도시한 것이다. 단량체(여기서는 A 및 G로 표시되는 dATP 및 dGTP 뉴클레오티드)는 연속 유동 경로를 통해 각 챔버 내로 로딩된다. 하나 이상의 공동 탈블로커 유동 셀은 부가 챔버 중 하나에서의 단량체 또는 올리고머의 부가 이후에 중합체가 탈보호화될 수 있게 한다. 이는 또한 중합체가 요구에 따라 예를 들어, DNA인 경우, 제한 효소를 사용하여, 또는 화학적 분리에 의해 나노포어에 인접한 표면으로부터 분리될 수 있게 하고, 외부에서 수집될 수 있게 허용한다. 상기의 특정 실시양태에서, 탈블로커 유동 셀은 부가 챔버를 충전시키는 데 사용되는 유체 로딩 채널에 수직으로 위치한다.
도 28은 이중 부가 챔버 레이아웃을 위한 배선에 관한 추가의 상세도를 도시한 것이다. 전기 제어 층(1)은 금속 또는 폴리실리콘으로 제조된 배선을 포함한다. 배선 밀도는 3D 적층에 의해 증가되고, 전기적 절연은 (예컨대, PECVD, 스퍼터링, ALD 등을 통해) 유전체 증착에 의해 제공된다. 한 실시양태에서, 부가 챔버 중 상단 전극에의 접촉(11)은 심도 반응성 이온 에칭(DRIE: Deep Reactive Ion Etch)에 의해 실리콘 관통 전극(TSV: Through Silicon Via)을 사용하여(극저온 또는 BOSCH프로세스) 이루어진다. 개별 전압 제어(12)를 통해 각각의 부가 챔버는 개별적으로 어드레싱될 수 있고, 이를 통해서 다중 중합체 서열은 동시에 미세 조정될 수 있다. 도면에서 우측은 다중 부가 셀로의 배선을 보여주는 상면도를 도시한 것이다. 전기 접지 층(3)은 (제시된 바와 같이) 공통될 수 있거나, 또는 셀 사이의 교차 커플링을 감소시키기 위해 분할되어 있을 수 있다.
도 29는 부가 챔버를 위한 제어 전극(13)이 챔버 상단에 있는 대신 두루마리 방식으로 챔버 측면에 증착될 수 있는 것인, 대안적 구성을 도시한 것이다.
도 30은 실시예 3에 기술된 바와 같은 토포이소머라제 첨가 프로토콜이 작동하였는지를 확인하는 SDS-PAGE 겔을 도시한 것이며, 여기서, A5 및 B5 예상 생성물에 상응하는 밴드가 명확하게 육안으로 관찰된다.
도 31은 실시예 5의 PCR 생성물이 올바른 크기를 가진 것임을 확인시켜 주는 아가로스 겔을 도시한 것이다. 레인 0은 25개의 염기쌍 래더이고; 레인 1은 실험의 생성물이며, 라인은 예상 분자량에 상응하고; 레인 2는 음성 대조군 #1이고; 레인 3은 음성 대조군 #2이고; 레인 4는 음성 대조군 #4이다.
도 32는 실시예 5에 기술된 바와 같은 제한 효소가 예상 생성물을 제조한다는 것을 확인시켜 주는 아가로스 겔을 도시한 것이다. 좌측의 래더는 100개의 염기쌍 래더이다. 레인 1은 비분해된 NAT1/NAT9c이고, 레인 2는 분해된 NAT1/NAT9c이다. 레인 3은 비분해된 NAT1/NAT9cI이고, 레인 4는 분해된 NAT1/NAT9cI이다.
도 33은 나노포어 인근에의 DNA의 고정화를 도시한 것이다. 패널(1)은 좌측 챔버에서 한쪽 말단에 오리가미(origami) 구조를 가지는 DNA를 보여주는 것이다(실제 나노칩에서는 처음에 좌측 챔버에 상기와 같은 오리가미 구조가 다수 존재한다). 패널(2)는 우측에 양극을 가지는 시스템을 나타낸 것으로서, 상기 양극은 DNA를 나노포어 쪽으로 유도한다. DNA 가닥은 나노포어를 통과할 수 있지만, 오리가미 구조는 너무 커서 통과하지 못하며, 이에, DNA는 '움직일 수 없는 상태'가 된다. 전류 전원을 오프하면(패널 3), 이로써, DNA는 확산될 수 있다. 적합한 화학법을 사용할 경우, DNA 가닥의 말단은 나노포어 인근 표면과의 접촉시, 그에 결합할 수 있다. 패널(4)에서, 오리가미 구조를 DNA로부터 절단하는 제한 효소를 첨가한다. 챔버를 세척하여 효소 및 잔류 DNA를 제거한다. 최종 결과물은, 나노포어를 통해 전후로 이동할 수 있는, 나노포어 인근에 부착된 단일 DNA 분자이다.
도 34는 기본 기능성 나노포어를 도시한 것이다. 각 패널에서, y축은 전류(nA)이고, x축은 시간(s)이다. 좌측 패널 "RF 잡음 스크리닝"은 패러데이 케이지의 유용성을 나타낸 것이다. 나노포어가 없는 칩을 유동 셀에 배치하고, 300 mV를 가한다. 패러데이 케이지의 리드를 닫았을 때(첫 번째 화살표 표시), 잡음이 감소되었음을 관찰할 수 있다. 래치를 닫았을 때(두 번째 화살표 표시), 작은 스파이크가 발생한다. 전류는 ~0 nA인 것에 주의한다. 포어 제조 후(가운데 패널), 300 mV를 인가하면(화살표 표시) ~3.5 nA의 전류가 일어난다. DNA를 접지 챔버에 적용시키고, +300 mV를 인가하였을 때, 전류가 일시적으로 감소함에 따른 DNA 이동(우측 패널)을 관찰할 수 있다(주의, 이 경우, TS 완충제: 50 mM 트리스, pH 8, 1 M NaCl이 사용된다). 본 DNA 이동 실험을 위해 람다 DNA가 사용된다.
도 35는 DNA 오리가미 구조의 주요 피쳐: 큰 단일 가닥 영역, 입방체 오리가미 구조, 및 오리가미 구조 인근에 존재하는 2개의 제한 부위(SwaI 및 AlwN1)를 나타낸 간략도를 도시한 것이다.
도 36은 제조된 DNA 오리가미 구조의 전자 현미경 영상을 도시한 것이고, 이는 예상된 토폴로지를 나타낸다. 오리가미는 5 mM 트리스 염기, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl, 5 mM MgCl2에서 제조된다. 오리가미 구조를 유지시키기 위해서는 Mg++ 농도는 ~5 mM, 또는 Na+/K+ 농도는 약 1 M인 것이 바람직하다. 오리가미 구조는 500 nM으로 4℃에서 보관된다.
도 37은 올바른 어셈블리 및 기능을 확인하기 위한 DNA 오리가미의 제한 분해를 도시한 것이다. 가장 왼쪽에 있는 레인은 MW 표준을 제공한다. 오리가미를 AlwN1 및 Swa1로 분해함으로써 제한 부위를 시험한다. 4개의 시험 레인은 하기와 같은 시약을 함유한다(단위는 ㎕이다):
시험 레인(1)은 음성 대조군이고; (2)는 Swa1에 의한 분해이고; (3)은 AlwN1에 의한 분해이고; (4)는 Swa1/AlwN1에 의한 이중 분해이다. 분해는 실온에서 60분 동안, 이어서, 37℃에서 90분 동안 수행된다. 에티디움 브로마이드 염색으로 시각화된 아가로스 겔 1/2x TBE-Mg(5 mM MgCl2을 포함하는 1/2x TBE). 어느 효소든 그에 의한 개별 분해는 겔에서 어떤 이동 효과도 보이지 않은 반면, 두 효소로 함께 이루어진 분해(레인 4)를 통해서는 예상대로, 상이한 길이의 두 단편이 생성되었다.
도 38은 비오틴 표지화된 올리고뉴클레오티드의 스트렙트아비딘 코팅된 비드에의 결합 대 대조군 BSA 코팅된 비드에의 결합을 도시한 것이다. y축은 형광 단위이고, '결합 이전'은 비드에의 결합 이전의 시험 용액으로부터의 올리고 형광이고, (-) 대조군은 BSA 접합된 비드의 두 상이한 배치에의 결합 이후에 관찰된 형광이고, SA-1 및 SA-2는 스트렙트아비딘 접합된 비드의 두 상이한 배치에의 결합 이후에 관찰된 형광이다. BSA 접합된 비드 경우에는 겉보기상 소량의 결합이 관찰되었지만, 스트렙트아비딘 접합된 비드 경우에는 훨씬 더 많은 결합이 관찰되었다.
도 39는 상이한 완충제 시스템, MPBS 및 HK 완충제 중에서의 비오틴 표지화된 올리고뉴클레오티드의 스트렙트아비딘 코팅된 비드에의 결합 대 대조군 BSA 코팅된 비드에의 결합을 도시한 것이다. 좌측 막대 'Neg Ctrl'은 비드에의 결합 이전의 시험 용액으로부터의 올리고 형광이다. 가운데 칼럼은 'BSA 비드'의 형광을 보여주는 것이고, 우측 칼럼은 각각 BSA 또는 스트렙트아비딘 비드에의 결합 이후의 'SA 비드'의 것을 보여주는 것이다. 두 완충제 시스템 모두에서, 형광은 스트렙트아비딘 비드에 의해 대조군 대비로 감소된 상태이고, 이는 비오틴 표지화된 올리고뉴클레오티드가 상이한 완충제 시스템 중에서 스트렙트아비딘 코팅된 비드에 잘 결합한다는 것을 시사하는 것이다.
도 40은 표면이 한쪽 면은 스트렙트아비딘으로 코팅되고, 나머지 다른 한쪽은 BSA로 코팅된, 기능성 접합된 SiO2 나노포어를 도시한 것이다. x축은 시간이고, y축은 전류이다. 도트 표시는 전류가 역전된 지점을 나타낸다. 전류가 역전될 때 단기간의 오버슈트가 존재하고, 이어서, 전류는 대략 동일한 절대값으로 안정된다. 나노포어는 200 mV에서는 ~+3 nA, 및 -200 mV에서는 ~-3 nA의 전류를 나타낸다.
도 41은 나노포어 내로 삽입된 오리가미 DNA 구조를 나타낸 대표도를 보여주는 것이다.
도 42는 단일 가닥 DNA의 나노포어에 인접한 스트렙트아비딘 코팅된 표면에의 부착을 나타낸 대표도를 보여주는 것이다.
도 43은 나노포어 인근의 표면에 부착된 오리가미 DNA의 실험 결과를 보여주는 것이다. 전류는 양방향으로 +2.5 nA 또는 -2.5 nA인데, 이는 +/- ~3nA인 원래의 전류보다 작은 값이고, 이는 오리가미 구조에 의해 부분적으로 차단되었다는 것을 반영하는 것이다. x축은 시간(s)이고, y축은 전류(nA)이고, 동그라미 표시는 전압 변환점을 나타낸다.
도 44는 전류를 약간 하강시키는 결과를 초래하는, 오리가미 DNA의 삽입을 보여주는 것이다. 전류 방출시, 오리가미는 즉시 나노포어로부터 빠져 나간다. x축은 시간(s)이고, y축은 전류(nA)이고, 동그라미 표시는 전압 변환점을 나타낸다.
도 45는 전류 인가에 의해 이루어지는 제어된 방식의 나노포어를 통한 DNA 가닥의 전후 이동을 나타낸 대표도를 보여주는 것이다. 좌측에서, DNA는 포어에 있고, 이에 관찰되는 전류는 포어에 DNA가 없을 때의 전류보다 더 낮은 값이 될 것이다. 전류 역전시(우측), 포어에 DNA는 없고, 이로써, 전류에는 변함이 없을 것이다.
도 46은 상기 대표도를 확인하는 실험 결과를 보여주는 것이다. 양의 전압을 인가하였을 때, 전류는 ~3 nA로, 이는 전형적으로, 포어 개방시 관찰되는 전류와 유사한 값이다. 전압 역전시, 전류는 ~-2.5 nA이다. 이는 전형적으로, 포어 개방시 관찰되는 전류보다 더 낮고, 전형적으로, 포어가 DNA 가닥에 의해 차단되었을 때 관찰되는 전류와 일치한다. 수회의 순차적인 전압 변환은 일관된 결과를 나타내며, 이는 DNA가 도 45에 도시된 바와 같이 구성에 교대로 존재한다는 것을 제안한다.
도 47은 DNA를 나노포어에 인접한 표면에 연결시키는 상이한 접합 화학법을 보여주는 것이다.
바람직한 실시양태(들)에 관한 하기의 설명은 사실상 단지 예시적인 것이며, 이는 결코 본 발명, 그의 적용 또는 용도를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
전반에 걸쳐 사용되는 바, 범위는 상기 범위 내에 포함되어 있는 각각의 모든 값을 기술하기 위한 속기법으로서 사용된 것이다. 범위 내의 임의의 값은 범위의 종점으로서 선택될 수 있다. 추가로, 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그의 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 본 개시내용의 정의 및 인용된 참고문헌의 정의가 상충하는 경우, 본 개시내용이 조정한다.
달리 명시되지 않는 한, 본원 및 본 명세서 다른 곳에서 표시된 모든 백분율 및 양은 중량%를 지칭하는 것으로 이해하여야 한다. 주어진 양은 물질의 활성 중량을 기초한다.
본원에서 사용되는 바, "나노칩"이란, 유체를 함유하는 다중 챔버 및 임의적으로 유체 유동을 허용하는 채널을 포함하는 나노유체 장치를 지칭하는 것이며 여기서, 나노칩 피쳐의 임계 치수, 예를 들어, 챔버를 서로 나누는 소자의 너비는 두께가 1 원자 내지 10 ㎛, 예컨대, 1 ㎛ 미만, 예컨대, 0.01-1 ㎛이다. 나노칩 내에서의 물질의 유동은 전극에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 RNA는 음으로 하전된 것이기 때문에, 이들은 양으로 하전된 전극으로 끌어들어질 것이다. 예컨대, 문헌 [Gershow, M, et al., Recapturing and Trapping Single Molecules with a Solid State Nanopore, Nat Nanotechnol. (2007) 2(12): 775-779](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)를 참조한다. 일부 경우에서는 또한 유체 유동은 게이트 소자에 의해, 및 유체를 나노칩 안으로 또는 밖으로 플러싱, 주입 및/또는 흡인함으로써 조절될 수 있다. 시스템은 핵산(DNA/RNA)의 정확한 다중화된 분석을 수행할 수 있다. 특정 실시양태에서, 나노칩은 규소 물질, 예를 들어, 이산화규소 또는 질화규소로 제조될 수 있다. 질화규소(예컨대, Si3N4)는 화학적으로 비교적 불활성이고, 심지어 두께가 단지 몇 nm에 불과한 경우에도 물 및 이온의 확산을 막는 효과적인 장벽을 제공하기 때문에, 상기 목적을 위해서는 특히 바람직하다. (본원 실시예에서 사용되는 바와 같은) 이산화규소는 화학적으로 변형시키는 데 우수한 표면이기 때문에 이 또한 유용하다. 대안적으로, 특정 실시양태에서, 나노칩은 전체적으로 또는 부분적으로 단일 분자만큼 얇은 시트를 형성할 수 있는 물질(종종 단층 물질로서 지칭된다), 예를 들어, 그래핀, 예컨대, 문헌 [Heerema, SJ, et al, Graphene nanodevices for DNA sequencing, Nature Nanotechnology (2016) 11: 127-136]; [Garaj S et al., Graphene as a subnanometre trans-electrode membrane, Nature (2010) 467 (7312), 190-193](상기 문헌 각각의 내용은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있는 것과 같은 것, 또는 전이 금속 디칼코게나이드, 예컨대, 문헌 [Feng, et al., Identification of single nucleotides in MoS 2 nanopores, Nat Nanotechnol. (2015) 10(12):1070-1076](상기 문헌의 내용은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있는 것과 같은 이황화몰리브덴(MoS2), 또는 문헌 [Gilbert, et al. Fabrication of Atomically Precise Nanopores in Hexagonal Boron Nitride, eprint arXiv:1702.01220 (2017)]에 기술되어 있는 것과 같은 질화붕소로 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노칩은 비교적 강성이고, 불활성인, 예컨대, 적어도 그래핀만큼 불활성이고, 강성인 단층 물질, 예컨대, MoS2를 포함한다. 단층 물질은 예를 들어, 나노포어를 포함하는 막의 전부 또는 일부분으로서 사용될 수 있다. 나노칩은 금속으로 부분적으로 라이닝될 수 있고, 예를 들어, 벽은 적층될 수 있고(예컨대, 금속 - 질화규소 - 금속), 이어서, 금속은 나노포어 인근에 제어가능한 전극 쌍을 제공하기 위해 구성될 수 있고, 이로써, 핵산은 기전력에 의해 나노포어를 통하여 전후로 이동될 수 있고, 이는 또한 핵산이 나노포어를 통과함에 따른 전위 변화를 측정함으로써 서열분석될 수 있다.
DNA 서열분석용 나노칩 나노유체 장치는 예컨대, 나노포어를 포함하는 나노칩의 디자인 및 제조에 관한 그의 교시에 대하여, 예를 들어, 문헌 [Li, J., et al, Solid-state nanopore for detecting individual biopolymers, Methods Mol Biol. (2009)544:81-93]; [Smeets RM, et al. Noise in solid-state nanopores, PNAS (2008)105(2):417-21]; [Venta K, et al., Differentiation of short, single-stranded DNA homopolymers in solid-state nanopores, ACS Nano. (2013)7(5):4629-36]; [Briggs K, et al. Automated fabrication of 2-nm solid-state nanopores for nucleic acid analysis, Small (2014)10(10):2077-86]; 및 [Chen Z, DNA translocation through an array of kinked nanopores, Nat Mater. (2010)9(8):667-75](상기 문헌 각각은 그 내용 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있는 바와 같이, 일반적으로 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "나노포어"란 직경이 1 ㎛ 미만, 예컨대, 직경이 2-20 nm, 예를 들어, 대략 2-5 nm인 공극이다. 단일 가닥 DNA는 2 nm 나노포어를 통과할 수 있고; 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA는 4 nm 나노포어를 통과할 수 있다. 예컨대, 2-5 nm로 극도로 작은 나노포어를 가지면, DNA는 통과할 수 있지만, 더운 큰 단백질 효소는 통과하지 못하게 되고, 이로써, DNA(또는 다른 하전된 중합체) 합성이 제어될 수 있다. 더욱 큰 나노포어(또는 더욱 작은 단백질 효소)가 사용되는 경우, 단백질 효소는, 나노포어를 통과하지 못하게 막는 기질에, 예컨대, 더욱 큰 분자, 예컨대, 더욱 큰 단백질에, 비드에, 또는 챔버내 표면에 접합될 수 있다. 상이한 유형의 나노포어가 공지되어 있다. 예를 들어, 생물학적 나노포어는 막, 예컨대, 지질 이중층내 공극 형성 단백질의 어셈블리에 의해 형성된다. 예를 들어, α-헤몰리신 및 유사 단백질 공극은 자연적으로 세포막에서 발견되며, 여기서, 이는 세포 안으로 및 밖으로 수송되어야 하는 이온 또는 분자를 위한 채널로서 작용하고, 상기 단백질은 나노채널로서 용도에 맞게 변경될 수 있다. 고체 상태 나노포어는 예컨대, 예를 들어, 피드백 제어식 저에너지 이온 빔 스컬프팅(IBS: ion beam sculpting) 또는 고에너지 전자 빔 조사을 사용하여 합성 막에 홀을 형성함으로써 합성 물질, 예컨대, 질화규소 또는 그래핀에 형성된다. 하이브리드 나노포어는 합성 물질 중에 공극 형성 단백질을 포매시킴으로써 제조될 수 있다. 나노포어의 양단 또는 양쪽에 금속 표면 또는 전극이 존재할 경우, 전해질 매질을 통해 나노포어를 통과하는 나노포어를 가로지르는 전류 흐름이 확립될 수 있다. 전극은 임의의 전도성 물질, 예를 들어, 은, 금, 백금, 구리, 이산화티타늄, 예를 들어, 염화은으로 코팅된 은으로 제조될 수 있다.
예컨대, 질화규소 막과 같은 고체 상태의 나노포어를 형성하는 방법은 공지되어 있다. 한 접근법에서, 규소 기판을 막 물질, 예컨대, 질화규소로 코팅하고, 예컨대, 약 25x25 ㎛ 정도로, 나노칩 내로의 도입을 위해 원하는 크기를 가지는 질화규소 막을 제공하기 위해 포토리소그래피 및 습식 화학적 에칭을 사용하여 막의 전체적 구성을 생성한다. 집속 이온 빔(FIB: focused ion beam)을 사용하여 질화규소 막에 초기 직경이 0.1 ㎛인 홀 또는 캐비티를 펀칭한다. 이온 빔 스컬프팅은 예컨대, 막 표면 상에서의 이온 빔 유도 측면 물질 전달에 의해 더욱 큰 공극을 축소시킴으로써, 또는 대향 측면으로부터 캐비티를 함유하는 막의 평평한 면으로부터 층층마다 이온 빔 스퍼터링에 의해 막 물질을 제거함으로써 나노포어를 형성할 수 있고, 궁극적으로 캐비티를 달성하였을 때, 끝이 날카로운 나노포어가 존재하게 된다. 이온 빔 노출을 끝내고 나면, 이때 포어를 통해 전달되는 이온 전류는 원하는 포어 크기에 적절하다. 예컨대, 문헌 [Li, J., et al., Solid-state nanopore for detecting individual biopolymers, Methods Mol Biol. (2009)544:81-93]을 참조한다. 대안적으로, 나노포어는 TEM에서 고에너지(200-300 keV) 전자 빔 조사를 사용하여 형성될 수 있다. 반도체 프로세싱 기술, e-빔 리소그래피, SiO2 마스크 층의 반응성 이온 에칭, 및 Si의 이방성 KOH 에칭을 사용할 경우, 피라미드형의 20 Х 20 nm이고, 더욱 큰 포어가 두께가 40 nm인 막에 형성된다. TEM에서 전자 빔은 더욱 큰 20 nm 포어를 더 작은 포어로 축소시키는 데 사용된다. TEM을 통해 축소 프로세스는 실시간으로 관찰될 수 있다. 더욱 얇은 막(예컨대, 두께가 < 10 nm)을 사용할 경우, 나노포어는 TEM에서 고에너지 집속 전자 빔을 이용하여 드릴링될 수 있다. 일반적으로, 문헌 [Storm AJ, et al. Fabrication of solid-state nanopores with single- nanometre precision. Nature Materials (2003) 2:537-540]; [Storm AJ, et al. Translocation of double-stranded DNA through a silicon oxide nanopore. Phys. Rev. E (2005)71:051903]; [Heng JB, et al. Sizing DNA Using a Nanometer-Diameter Pore. Biophys. J (2004) 87(4):2905-11](상기 문헌 각각의 내용은 본원에서 참조로 포함된다)을 참조한다.
다른 실시양태에서, 예컨대, 문헌 [Kwok, et al., "Nanopore Fabrication by Controlled Dielectric Breakdown," PLOS ONE (2014) 9(3): e92880](상기 문헌의 내용은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있는 바와 같이, 나노포어는 막 간의 비교적 높은 전압 전위를 사용하여 절연 파괴를 사용함으로써 제조되며, 여기서, 전압은 전류가 검출될 때까지 상승된다.
상기 기술을 사용하며, 당연히 사용되는 정확한 기술, 막의 두께 및 정확한 조성에 의존하여, 질화규소와 같은 고체 물질 중의 나노포어의 전체적인 형상은 대략적으로는 정점이 가장 좁은 지점, 즉, 실제 나노포어에서 하나로 합쳐지는 2개의 깔때기와 유사할 수 있다. 상기 이중 원추 형상은 중합체가 나노포어를 통과하고, 다시 되돌리는 것을 조종하는 데 도움이 된다. 영상화 기술, 예를 들어, 원자력 현미경법(AFM: atomic force microscopy) 또는 투과 전자 현미경법(TEM: transmission electron microscopy), 특히, TEM은 나노막, FIB 홀 또는 캐비티, 및 최종 나노포어의 크기, 위치 및 구성을 확인하고, 측정하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체, 예컨대, DNA의 한쪽 말단은 나노포어 인근에 테더링되거나, 또는 깔때기 내벽 상에 테더링되어 나노포어로 유도된다. 중합체는 초기에는 확산에 의해 나노포어에 접근한 후, 이어서, 전기적 구배에 의해 구동되는 바, 구배 구동식 운동은 최대화되고, 확산 운동은 최소화되고, 이로써, 중합체의 한쪽 말단이 나노포어에 가깝게 테더링되어 있다면, 속도 및 효율은 증진된다. 예컨대, 문헌 [Wanunu M, Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient, Nat Nanotechnol. (2010) 5(2):160-5]; [Gershow M., Recapturing and trapping single molecules with a solid-state nanopore. Nat Nanotechnol. (2007) 2(12):775-9]; [Gershow, M., Recapturing and Trapping Single Molecules with a Solid State Nanopore. Nat Nanotechnol. (2007) 2(12): 775-779]를 참조한다.
한 실시양태에서, 중합체, 예컨대, DNA의 한쪽 말단은 비드에 부착되고, 중합체는 포어를 통과하도록 유도된다. 비드에의 부착이 중합체가 인접 챔버 중의 분리막의 대향면 상의 나노포어를 통해 모든 방향으로 이동하지 못하게 막을 것이다. 이어서, 전류는 차단되고, 중합체, 예컨대, DNA는 분리막의 나머지 다른 한쪽 상에 챔버 중 나노포어에 인접한 표면에 부착된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, ssDNA의 한쪽 말단은 50 nm 비드에 공유적으로 부착되고, 나머지 다른 한쪽 말단은 비오티닐화된다. 스트렙트아비딘은 분리막의 나머지 다른 한쪽 상에 챔버 중 원하는 부착 지점의 영역에 결합된다. DNA는 전위에 의해 나노포어를 통해 풀링되고, 비오틴은 스트렙트아비딘에 부착된다. 비드 및/또는 나노포어에 인접한 표면에의 부착은 공유 결합 또는 강한 비공유 결합(예컨대, 비오틴-스트렙트아비딘 결합)일 수 있다. 이어서, 비드는 효소로 절단되고, 플러싱된다. 일부 실시양태에서, 예컨대, 문헌 [K. Nishigaki, Type II restriction endonucleases cleave single-stranded DNAs in general. Nucleic Acids Res. (1985) 13(16): 5747-5760](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이, 단일 가닥 DNA는, 단일 가닥 DNA를 절단하는 제한 효소로 절단된다. 다른 실시양태에서, 상보적인 올리고뉴클레오티드는 이중 제한 부위를 제조하기 위해 제공되며, 이는 이어서, 상응하는 제한 효소로 절단될 수 있다.
중합체가 나노포어를 통과함에 따라, 중합체가 통과함에 따른 나노포어의 부분적인 차단에 의해 유발되는 나노포어를 가로지르는 전위 또는 전류의 변화가 검출될 수 있고, 상이한 단량체는 그의 상이한 크기 및 정전위에 의해 구별될 수 있는 바, 상기 변화를 사용하여 중합체 중의 단량체의 서열을 확인할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은, DNA 제조 방법에서 나노포어를 포함하는 나노칩 사용은 당업계에 개시되어 있지 않지만, 상기 칩은 널리 공지되어 있고, 신속한 DNA 서열분석을 위해 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, MinION(Oxford Nanopore Technologies: 영국 옥스포드 소재)은 작고, 랩톱 컴퓨터에 부착될 수 있다. DNA의 단일 가닥이 초당 30개 염기로 단백질 나노포어를 통과함에 따라, MinION은 전류를 측정한다. 포어 내의 DNA 가닥은 이온 흐름을 방해하여 서열 중 뉴클레오티드에 상응하는 전류를 변화시킨다. 문헌 [Mikheyev, AS, et al. A first look at the Oxford Nanopore MinION sequencer, Mol. Ecol. Resour. (2014)14, 1097-1102]. MinION의 정확도는 낮지만, 재서열분석의 반복을 요구하면서, 판독되는 DNA가 쉽게 구별될 수 있는 염기, 예컨대, A 및 C, 단 2개만을 함유한다면, 본 발명의 나노칩을 사용하여 수행되는 서열분석의 속도 및 정확도는 크게 개선될 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노포어를 포함하는 막은 예컨대, 질화규소 막과 같이, 절연 코어 물질의 양쪽에 금속 표면을 가지는, 삼층 구성을 가진다. 본 실시양태에서, 금속 표면은 각 나노포어 양 말단에 하나씩 쌍 형성한 전극을 마이크로회로에 제공하기 위해 예컨대, 리소그래피 수단에 의해 구성되고, 예컨대, 이로써, 나노포어를 가로지르는 전류 흐름이 전극 사이에 및 전해질 매질을 통한 나노포어를 통해 확립될 수 있고, 전류는 나노포어를 통해 중합체를 끌어들일 수 있고, 극성을 역전시킴으로써 중합체를 뒤로 이동시킬 수 있다. 중합체가 나노포어를 통과함에 따라, 전극은 중합체 중의 단량체의 서열을 확인하기 위해 나노포어를 가로지르는 전위 변화를 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체의 서열은 데이터를 저장하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 데이터는 이진 코드(1인 것 및 0인 것)로 코딩된다. 일부 실시양태에서, 각 염기는 1 또는 0에 상응한다. 다른 실시양태에서, 2개 이상의 염기 중 쉽게 인식되는 한 서열은 1에 상응하고, 2개 이상의 염기 중 쉽게 인식되는 또 다른 서열은 0에 상응한다. 다른 실시양태에서, 데이터는 삼진, 사진 또는 다른 코드로 저장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 중합체는 DNA, 예를 들어, 단일 가닥 DNA이고, 여기서, DNA는 단 2개의 염기 유형만을 함유하고, 자기 하이브리드화할 수 있는 염기는 함유하지 않으며, 예컨대, 여기서, DNA는 아데닌 및 구아닌, 아데닌 및 시토신, 티미딘 및 구아닌, 또는 티미딘 및 시토신을 함유한다. 일부 실시양태에서, 두 염기 사이에 하나 이상의 추가 염기가 배치될 수 있고, 예를 들어, A 및 C는 유의적인 자기 하이브리드화를 초래하지 않는 빈도로, 예컨대, 코딩 서열 중 브레이크를 나타냄으로써 서열을 "중단"시키기 위해 T를 함유할 수 있다. 다른 실시양태에서, 예컨대, 핵산이 이중 가닥인 경우, 이용가능한 염기 중 일부 또는 그들 모두가 사용될 수 있다.
뉴클레오티드 염기는 천연 염기일 수 있거나, 또는 일부 실시양태에서, 예컨대, 문헌 [Malyshev, D. et al. "A semi-synthetic organism with an expanded genetic alphabet", Nature (2014) 509: 385-388](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이, 비천연 염기로 구성될 수 있거나, 또는 그를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 데이터는 단일 단량체, 예컨대, DNA인 경우, 단일 뉴클레오티드의 중합체에의 부가에 의해 저장된다. 한 실시양태에서, 중합체는 DNA이고, 단량체는 아데닌(A) 및 시토신(C) 잔기이다. (i) A 및 C의 크기 차이는 크고, 따라서, 나노포어를 통한 차별화는 촉진되어져야 하고, (ii) A 및 C는 서로 쌍을 형성하지 못하는 바, 이에 나노포어 신호의 해석을 복잡하게 만들 수 있는 유의적인 2차 구조를 형성하지 못하고, (iii) 동일한 이유에서, G는 구아닌 4분자를 형성하는 것으로 알려져 있는 바, 이는 덜 바람직하기 때문에, A 및 C 잔기는 이점을 가진다. 뉴클레오티드는 말단 트랜스퍼라제(또는 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제)에 의해 부가되지만, 뉴클레오티드는 3' 블로킹되고, 이로써, 한 번에 단 하나의 단일 뉴클레오티드만이 부가된다. 블록은 다음 뉴클레오티드 부가 이전에 제거된다.
일부 실시양태에서, DNA는 나노칩에 남겨진다. 다른 실시양태에서, 이는 예컨대, 장기간의 안정성을 증진시키기 위해, 제거되고, 임의적으로, 이중 가닥 DNA로 전환되고/거나, 임의적으로, 결정질 형태로 전환된다. 추가의 다른 실시양태에서, DNA는 증폭될 수 있고, 증폭된 DNA는 장기간 저장을 위해 제거되는 반면, 원래의 주형 DNA, 예를 들어, 나노칩 내 챔버의 벽에 결합된 DNA는 나노칩에 남겨질 수 있고, 여기서, 판독되고/거나, 추가 DNA 제조를 위한 주형으로 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA 또는 다른 중합체는 합성 동안 나노포어 인근의 표면에 고정된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 분자는 각각 5' 말단에서 나노포어 인근의 표면에 부착되고, 여기서, 각 나노포어에서의 전류는 상기 나노포어에 대한 전극에 의해 독립적으로 조절될 수 있고, 이로써, DNA 분자의 3' 말단은 나노포어를 통해 유지 챔버로부터, 3' 보호된 dNTP를 부가하는 말단 트랜스퍼라제 효소 또는 폴리머라제와 함께 3' 보호된 dNTP의 플로우를 함유하는 유동 챔버 내로 정방향으로 풀링되거나, 또는 나노포어가 효소는 배제하고, 이로써, dNTP가 부가되지 않는 유지 챔버 중에 유지될 수 있다. 예컨대, 도 12-16, 및 도 18 및 19 또한 참조한다. 다른 실시양태에서, 단일 가닥 DNA는 하기에서 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 토포이소머라제를 사용하여 (3' 말단은 부착되어 있을 때) 5' 말단에의 부가에 의해 구축된다. 각 DNA 분자가 각 사이클에 참여하는지 여부를 제어함으로써, 각 DNA 분자의 서열을 예컨대, 하기와 같이 정밀하게 제어할 수 있다:
상기 도식에서 나노포어 1 및 나노포어 2는 상이한 DNA 가닥과 연관이 있으며, (유동 챔버 내부 또는 외부에서의) 그의 위치는 별개로 제어가능하다. DNA는 유지 챔버에서 특이적 효소에 의해, 또는 효소적, 화학적, 광 촉매화 수단, 또는 다른 수단에 의해 탈보호화하기 위해 유동 챔버에서 플로우를 변화시킴으로써 탈보호화될 수 있다. 한 실시양태에서, 탈블로킹제(들)는 플로우 A와 플로우 C 사이클 사이에서 유동하고, 이에, 예컨대, 유동 챔버를 완충제로 세척할 때, 탈블로킹제는 뉴클레오티드 빌딩 블록을 탈보호화하지 않는다. 다른 실시양태에서, 탈보호화제(들)는 너무 벌키하기 때문에 나노포어를 통해 유동 챔버로 건너가지 못한다.
상기 예에서 최종 결과는 나노포어 1에서는 A 및 C가 DNA에 부가되고, 나노포어 2에서는 C 및 C가 DNA에 부가되는 것이 될 것이다.
또 다른 실시양태에서, 챔버 구성은 유사하지만, 이중 가닥 DNA는 나노포어 인근의 표면에 고정되고, 올리고뉴클레오티드 단편, 예를 들어, 각각이 이진 코드에 상응하는 것인 2가지 이상의 유형의 올리고뉴클레오티드는 예컨대, 부위 특이적 리콤비나제, 즉, 부위 특이적 재조합 서열로서 공지된 서열 세그먼트 내의 핵산의 이중 가닥 중 1 이상의 가닥을 자발적으로 인식하고, 절단하는 효소를 사용하여, 예를 들어, 하기 기술되는 바와 같은 토포이소머라제 장입된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 순차적으로 부가된다.
특정 실시양태에서, 전기적으로 하전된 중합체, 예컨대, DNA는 합성 후 응축 상태로 유지시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기에 대해서는 하기와 같은 여러 이유가 있다:
· 중합체는 상기 형태에서 더욱 안정적이어야 하고,
· 중합체를 응축시키는 것이 과밀을 억제시킬 것이며, 소량의 더욱 긴 중합체가 사용될 수 있도록 허용할 것이며,
· 정돈된 응축은 중합체가 매듭 또는 얽힘을 형성할 수 있는 잠재성을 감소시킬 수 있고,
· 챔버 중 임의의 것이 서로 연결되어 있다면, 전류를 인가하였을 때 통과할 것으로 예정된 것과 다른 포어를 통과할 정도로 긴 중합체가 되지 않게 하는 데 도움을 줄 것이며,
· 전기화학법이 중합체를 손상시킬 수 있는 경우, 응축은 중합체를 전극으로부터 멀리 떨어진 곳에 유지시키는 데 도움을 줄 것이다.
인간 세포는 약 10 ㎛이지만, 80억 개의 DNA 염기쌍을 함유한다. 길게 펼치면, 그 길이는 1 미터를 초과할 것이다. DNA가 히스톤 단백질 둘레를 휘감고 있기 때문에 DNA는 세포 공간 내로 들어맞게 된다. 특정 실시양태에서, 히스톤 또는 유사 단백질은 본 발명의 나노칩에서 유사한 기능을 제공한다. 일부 실시양태에서, 나노칩의 내부 표면은 약하게 양으로 하전되어 있고, 이에 전기적으로 하전된 중합체, 예컨대, DNA는 그에 약하게 점착하는 경향이 있다.
특정 실시양태에서, 하전된 중합체, 예컨대, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA는 나노포어 인근의 표면에 결합하였다. 이는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 일반적으로, 중합체는, 중합체를 비교적 벌키한 구조(예컨대, 직경이 예컨대, > 10 nm, 예컨대, 약 20-50 nm 정도로 너무 커서 나노포어에 안맞는 것인, 비드, 단백질, 또는 (하기 기술되는) DNA 오리가미 구조)에 부착시키고, 전류를 사용하여 나노포어를 통해 하전된 중합체를 풀링하고, 벌키한 구조로부터 원위부에 위치하는 중합체의 말단을 나노포어에 인접한 표면에 고정시키고, 벌키한 구조를 절단함으로써 나노포어로 국재화된다.
벌키한 구조로부터 원위부에 위치하는 중합체의 말단을 나노포어에 인접한 표면에 고정시키는 단계는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 중합체는 단일 가닥 DNA이고, 단일 가닥 DNA의 부분과 상보적인, 미리 부착된 DNA 가닥(약 50 bp)이 존재하고, 이로써, 단일 가닥 DNA와 미리 부착된 DNA 가닥은 염기쌍 형성을 통해 결합될 수 있다. 쌍 형성이 충분히 강력하다면, DNA는 심지어 조작되는 경우에도 충분히 고정된 상태 그대로 유지될 것이다. 이러한 부착 방법의 이점은 원하는 경우, 장기간의 DNA 저장 기간 동안 DNA가 나노포어 칩으로부터 제거될 수 있도록 허용한다는 점이다. 대안적으로, 가닥은 접합 화학법, 예컨대, 하기 실시예 1에 기술된 바와 같은 스트렙트아비딘-비오틴 접합, 또는 '클릭' 화학법(문헌 [Kolb, et al. Angew. Chem. Int. Ed. (2001)40: 2004-2021](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다) 참조)을 사용하여, 및/또는 효소적 부착을 사용하여, 예를 들어, 원위부 표면에 공유적으로 올리고를 미리 부착시킨 후, DNA 리가제를 사용하여 그를 연결시킴으로써 표면에 공유적으로 부착된다.
일단 가닥의 원위 말단이 나노포어에 인접한 표면에 부착되고 나면, 벌키한 구조는 예컨대, 벌키한 구조 인근의 제한 부위에서 절단하는 엔도뉴클레아제를 사용하여 절단된다.
벌키한 구조는 비드, 벌키한 분자, 예컨대, DNA 가닥에 가역적으로 결합하는 단백질, 또는 DNA 오리가미 구조일 수 있다. DNA 오리가미는 염기쌍 형성을 사용하여 3차원 DNA 구조를 생성하는 것을 포함한다. DNA 오리가미 기술은 일반적으로 문헌 [Bell, et al, Nano Lett. (2012)12: 512-517](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 예를 들어, 본 발명에서, DNA 오리가미는 단일 DNA 분자를 나노포어에 인접한 표면에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 구조는 예컨대, 각 변이 약 20 nm인 '허니콤형 입방체'이다. 이는 (부착된 페이퍼에서와 같이) DNA의 상기 부분이 나노포어를 통과하지 못하게 막는다. 긴 DNA 가닥(단일 가닥 또는 이중 가닥)이 오리가미 구조에 부착되어 있다. 오리가미 입방체가 나노포어를 만나 추가 진행을 차단시킬 때까지, DNA 가닥는 나노포어를 통과하게 된다. 이어서, 전류가 차단되고, 가닥은 나노포어에 인접한 표면에 부착된다.
또 다른 실시양태에서, 오리가미 구조를 가지는 전기적으로 하전된 중합체, 예컨대, DNA는 3 챔버 구성 중 중간 챔버에 존재한다. 오리가미는 DNA가 다른 2개의 챔버(또는 2 챔버 예에서는 다른 한 챔버)에 완전히 진입하지 못하게 막을 것이다. 따라서, 본 예에서, 중합체는 표면에 고정될 필요가 없다. 이는 중합체가 매듭을 형성할 위험을 감소시키고, 중합체의 한쪽 말단을 표면에 결합시키고, 나머지 다른 한쪽 말단에서 벌키한 부분를 절단하는 단계의 필요성을 제거한다. 오리가미를 포함하는 챔버의 부피는, 중합체가 포어에 비교적 가까운 위치에 유지될 수 있도록 실행가능할 정도로 작게 유지되어야 하고, 이는 전류가 가해졌을 때, 중합체가 확실하게 빠르게 이동되도록 하는 데 도움을 줄 것이다. 중합체의 오리가미 부분을 함유하는 중간 챔버는 다른 중간 챔버와 서로 연결될 수 없는 반면(또는 그렇지 않으면 다른 중합체는 혼합될 것이다), 나머지 다른 챔버(또는 3 챔버 예에서 챔버 세트)는 서로 연결될 수 있다는 점에 주의하여야 한다. 이들 다른 챔버는, DNA가 상기 챔버로 이동할 때, 중합체는 반드시 포어에 가깝게 위치하여야 하는 바(사실상 그 중 일부가 포어에 존재할 것이다), 원하는 경우, 부피가 더 클 수 있다.
일부 실시양태에서, 장치는 3개의 인라인 챔버를 포함하며, 여기서, 추가 챔버는 유동을 허용할 수 있도록 인접해 있고, 공동 전극을 가지는 반면, '탈보호화' 챔버는 나노포어를 통한 유동을 제외하면, 유체적으로 분리되어 있고, 독자적인 전극을 가진다.
다른 실시양태에서, DNA 또는 다른 하전된 중합체는 고정되지 않지만, 챔버내 전극 제어하에서 합성 챔버(들)와 탈보호화 챔버(들) 사이를 이동할 수 있는 반면, 폴리머라제 및 탈보호화제는, 이들이 너무 벌키하여 챔버를 연결하는 나노포어를 통과하지 못하고/거나, 챔버내 표면에 고정되어 있기 때문에, 챔버 사이의 이동에 제한을 받는다. 예컨대, 도 1-9 및 16-17을 참조한다.
나노포어를 통해 하전된 중합체를 이동시키는 데 필요한 전류는 예컨대, 중합체의 성질, 나노포어의 크기, 나노포어를 함유하는 막의 물질, 염 농도에 의존하고, 이에 필요에 따라 특정 시스템에 맞게 최적화될 것이다. 본원 실시예에서 사용되는 바와 같은 DNA인 경우, 염 농도가 대략 100 mM 내지 1 M일 때, 전압 및 전류의 예는 예컨대, 50-500 mV, 전형적으로, 100-200 mV, 및 1-10 nA, 예컨대, 약 4 nA가 될 것이다.
하전된 중합체, 예컨대, DNA가 나노포어를 통한 이동은 예컨대, 염기당 1 내지 5 μs, 이에 초당 대략 100만 개의 염기 정도(1 MHz, 본 발명자들이 주파수 명명법을 채택할 경우)로 보통은 매우 빠르고, 이는 시스템에서 잡음과 별개의 정확한 판독값을 얻기 위한 도전과제를 제기한다. 현행 방법을 사용할 때, (i) 측정가능한 특징적인 변화를 일으키기 위해서는 뉴클레오티드는 서열 중에서 예컨대, 약 100회 연속해서 반복되어야 하거나, 또는 (ii) 단백질 포어, 예컨대, 알파 헤몰리신(αHL) 또는 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 포린 A(MspA)를 사용할 경우, 이는 비교적 긴 포어를 제공하며, 동시에 염기가 중합체를 통해 이동함에 따라 다회에 걸쳐 판독하게 될 잠재성도 제공하고, 일부 경우에서는 DNA가 한 번에 1개의 염기가 포어를 통해 조절된 방식으로 공급되도록, 일부 경우에서는, DNA가 통과시 각 염기를 절단하는 엑소뉴클레아제를 사용함으로써 적합화될 수 있다. 다양한 접근법, 예컨대, 하기와 같은 접근법이 가능하다:
· 예를 들어, 전압이 가해였을 때, 더욱 큰 점성을 가지게 되는 전기유변 유체를 포함하는 매질을 사용하여 중합체의 속도를 약 1 MHz 내지 약 100-200 Hz 정도로 저속화함으로써, 나노포어, 또는 플라즈몬성 유체 시스템을 통과하는 중합체의 속도를 저속화하는 접근법으로서, 여기서, 매질의 점성은 빛; 또는 분자 모터 또는 래칫에 의해 제어될 수 있는 것인 접근법;
· 중합체에, 예컨대, 단일 가닥 DNA에 서열을 제공하고, 이로써, 벌키한 2차 구조, 예컨대, "헤어핀", "해머헤드," 또는 "덤벨" 구성이 형성되며, 이는 나노포어에 맞도록 하기 위해서는 선형화되어야 하는 것이고, 이를 통해 정보는 덜 조밀화되고, 지속 기간이 더욱 긴 신호를 제공하게 되는 것인 접근법;
· 예컨대, 신속하게 교류를 사용함으로써 동일한 서열 프레임에 대하여 다회에 걸쳐 판독될 수 있게 하고, 잠깐 동안 직류와 조합시켜 분자가 다음 서열 프레임으로 풀링될 수 있게 함으로써, 전체 서열을 다회에 걸쳐 판독함으로써, 또는 다중의 동일한 서열을 동시에 판독함으로써, 각 경우에서는 판독값을 수집 분석하여 신호를 증폭시켜 일치된 판독값을 제공하는 것인 동일한 서열에 대하여 다회에 걸쳐 판독하는 접근법;
· 전류 흐름 또는 저항을 직접 측정하기보다는 단량체(예컨대, 뉴클레오티드)가 나노포어를 통과함에 따른 정전 용량의 변화에 의해 유도되는 고주파 신호의 임피던스 변화를 측정하는 접근법;
· 예컨대, 크기면에서 더욱 큰 차이가 나거나, 또는 다르게는 상이한 신호를 제공하도록 변형된 비천연 염기를 사용하거나, 또는 그의 크기가 더 크기 때문에 증가된 신호를 제공하는 더욱 큰 2차 구조, 예컨대, "헤어핀," "해머헤드," 또는 "덤벨" 구성을 DNA 내에서 형성함으로써 상이한 염기 사이의 전류, 저항 또는 정전 용량의 차를 증가시키는 접근법;
· 광학 판독 시스템을 사용하는, 예를 들어, 예컨대, 문헌 [Nam, et al., "Graphene Nanopore with a Self-Integrated Optical Antenna", Nano Lett. (2014)14: 5584-5589](상기 문헌의 내용은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이, 표준 이온 전류 측정을 보완하거나, 또는 대체하는 광 변환 소자(또는 광 신호 인핸서)로서 작용하는, 나노포어에 인접해 있는 통합형 광학 안테나를 사용하는 접근법. 일부 실시양태에서, 각각의 상이한 단량체가 나노포어와 그의 광학 안테나의 접합부를 통해 통과함에 따라, 각각의 상이한 단량체가 시그니처 강도에서 형광을 낼 수 있도록, 단량체, 예컨대, DNA 뉴클레오티드는 형광 염료로 표지화된다. 일부 실시양태에서, 예컨대, 문헌 [McNally et al., "Optical recognition of converted DNA nucleotides for single molecule DNA sequencing using nanopore arrays", Nano Lett. (2010)10(6): 2237-2244], 및 [Meller A., "Towards Optical DNA Sequencing Using Nanopore Arrays", J Biomol Tech. (2011) 22(Suppl): S8-S9](상기 문헌 각각의 내용은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이, 고체 상태 나노포어는 형광 표지를 제거하여, 중합체가 고속으로 나노포어를 통과함에 따라 검출가능한 광자 버스트 시리즈를 일으킨다.
한 실시양태에서, 하전된 중합체는 핵산, 예컨대, 단일 가닥 DNA이고, 여기서, 서열은 2차 구조를 제공한다. 문헌 [Bell, et al., Nat Nanotechnol.(2016)11(7):645-51](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에는 면역검정법에서 항원을 표지화하기 위해, 고체 상태 나노포어 포맷에서 검출가능한, 비교적 짧은 서열의 덤벨 구성을 사용하는 것이 기술되어 있다. 문헌 [Bell, et al.]에서 사용된 나노포어는 비교적 컸고, 이에 전체 덤벨 구조가 포어를 통해 통과할 수 있었지만, 덤벨 구성의 직경보다 더 작은 나노포어를 사용할 경우, DNA는 "언지핑(unzip)"되고, 선형화될 것이다. 예컨대, 각 비트가 tRNA와 유사한 서열에 상응하는 것인, 더욱 복잡한 구성이 사용될 수 있다(예컨대, 문헌 [Henley, et al. Nano Lett. (2016)16: 138-144](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 따라서, 본 발명은 2차 구조가 데이터(예컨대, 이진 데이터, 여기서, 한 2차 구조는 1이고, 두 번째 것은 0이다)를 코딩하는 것인, 적어도 2가지 유형의 2차 구조를 가지는 하전된 중합체, 예컨대, 단일 가닥 DNA를 제공한다. 다른 실시양태에서, 2차 구조는 DNA가 나노포어를 통과하는 속도를 저속화하여, 또는 서열 파단을 제공하여 서열 판독을 촉진시키기 위해 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 2 이상의 상이한 DNA 모티프 시리즈를 포함하는 DNA 분자를 이용하고, 여기서, 각 모티프는 특정 리간드, 예를 들어, 이중 가닥 DNA에 대한 유전자 조절 단백질, 또는 단일 가닥 DNA에 대한 tRNA에 특이적으로 결합하고, 여기서, 2 이상의 상이한 DNA 모티프는 정보를 예컨대, 이진 코드를 코딩하고, 여기서, 한 모티프는 1이고, 두 번째 것은 0이고, 예컨대, 리간드는 DNA가 나노포어를 통과함에 따라 나노포어를 가로지르는 신호 차이(예컨대, 전류 또는 정전 용량 변화)를 증가시킨다.
상기 논의된 바와 같이, 상이한 단량체가 나노포어를 통과할 때, 상기 단량체는 주로 나노포어를 물리적으로 차단하고, 나노포어를 가로지르는 전도도를 변화시킴으로써 나노포어를 통한 전류 흐름에 영향을 준다. 현존 나노포어 시스템에서는 상기와 같은 전류 변화는 직접 측정된다. 전류 판독 시스템의 문제는 시스템에서 잡음이 상당하고, DNA의 경우, 예를 들어, 상이한 뉴클레오티드 단위가 나노포어를 통과함에 따른 전류 변동을 측정할 때, 상이한 단량체 사이의, 예컨대, 상이한 염기 사이의 차이를 정확하게 검출하기 위해서는 약 1/100초 정도로 비교적 긴 통합 시간이 요구된다는 점이다. 최근, 염 및 생물학적 분자와 복잡한 상호작용을 할 수 있는 잠재성에도 불구하고, 임피던스 및 정전 용량 변화가 세포 및 생물학적 시스템을 연구하는 데 유용할 수 있다고 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌 [Laborde, et al. Nat Nano. (2015)10(9):791-5](본원에서 참조로 포함)에서는 고주파 임피던스 분광법을 사용하여 디바이(Debye) 한계를 넘어서서 생리적 염 조건하에서의 정전 용량의 작은 변화 및 영상 극미립자 및 살아있는 세포를 검출할 수 있다는 것이 입증되었다.
그러므로, 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명자들은 전류 변동량을 직접 측정하기보다는 정전 용량 변동량을 측정하고, 예를 들어, 여기서, 하전된 중합체의 서열은, 단량체(예컨대, 뉴클레오티드)가 나노포어를 통과함에 따른 정전 용량의 변화에 의해 유도되는 무선주파수 신호의 상 변화를 측정함으로써 확인된다.
간단히 말하자면, 정전 용량은 한 전기 전도체와 또 다른 전기 전도체 사이에 갭이 있는 회로 어디에나 존재한다. 전류는 정전 용량에 따라 직접으로 변하지만, 정전 용량과 함께 동시에 변하지는 않는다. 예를 들어, 교류를 사용하여 정전 용량성 회로에서 시간 경과에 따른 전류 및 전압을 플롯팅하였다면, 전류 및 전압 둘 모두는 각각 사인파를 형성하는 반면, 파는 이상(out of phase)이라는 것을 본 발명자들은 알았을 것이다. 전류 변화가 있을 때, 정전 용량에 변화가 일어나고, 이는 신호 상 변화에 반영된다. 무선주파수 교류는 주파수 및 진폭이 고정되 신호를 제공하는 반면, 신호 상은 회로의 정전 용량에 따라 달라질 것이다. 본 발명자들의 시스템, 본 발명자들은 교류보다는 맥동 직류를 이용하며(즉, 전압은 두 값 사이를 교류하지만, 전압은 "0" 라인을 넘어가지는 않고, 이로써, 극성은 유지되고, 한 전극은 양성 그대로, 나머지 다른 하나는 음성으로 유지된다), 이로써, 하전된 중합체는 나노포어를 통해 (DNA인 경우, 양의 전극 방향으로) 끌어들어질 수 있다. 나노포어에 아무것도 없을 때, 정전 용량은 한 가지 값을 가지며, 이는 중합체의 상이한 단량체가 나노포어를 통과함에 따라 변하게 된다. 적합한 주파수 범위는 무선주파수 범위, 예컨대, 1 MHz 내지 1 GHz, 예컨대, 50-200 MHz, 예를 들어, 약 100 MHz, 예컨대, 매질의 유의적인 유전 가열을 유발할 수 있는 더 높은 마이크로파 주파수 미만이다. 간섭 잠재성을 감소시키기 위해, 상이한 나노포어에 상이한 주파수를 적용시킬 수 있고, 이로써, 다중 나노포어는 단일 무선주파수 입력 라인과 동시에 측정될 수 있다.
고주파수에서 (예컨대, 정전 용량 변화에 기인하는) 임피던스 변화를 측정하는 것은, 1/f 잡음, 또는 전자식 측정 회로에 고유한 '핑크' 잡음의 효과를 감소시키기 때문에, 특정 기간 내에서 이용가능한 신호 대 잡음을 증가시킨다. 고주파 신호를 사용하는 것은 주어진 기간 이내에 다회에 걸쳐 측정이 이루어지는 바, 신호 대 잡음비를 증가시키며, 환경 또는 장치 변화 및 변동에 기인하는 임피던스 변화를 쉽게 구별하는 더욱 안정적인 신호를 제공한다.
본 발명에 상기 원리를 적용시킴으로써, 본 발명은 한 실시양태에서, 단량체(예컨대, 뉴클레오티드)가 나노포어를 통과함에 따른 정전 용량의 변화에 의해 유도되는 고주파 신호에서의 임피던스 변화를 측정하는 방법, 예를 들어, 나노포어를 가로질러 예컨대, 1 MHz 내지 1 GHz, 예컨대, 50-200 MHz, 예를 들어, 약 100 MHz의 주파수로 무선주파수 맥동 직류를 인가하는 단계를 포함하고, 여기서, 맥동 직류는 나노포어를 통해 하전된 중합체를 끌어들이고, 단량체 서열은, 하전된 중합체가 나노포어를 통과함에 따른 나노포어를 가로지르는 정전 용량 변동량 측정에 의해 판독되는 것인, 적어도 2가지 상이한 유형의 단량체, 예를 들어, DNA 분자를 포함하는 하전된 중합체의 단량체 서열을 판독하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 2 이상의 별개의 단량체를 포함하는, 전기적으로 하전된 중합체, 예컨대, DNA를 서열분석하기 위한 나노칩으로서, 나노칩은 적어도, 각각이 전해질 매질을 포함하고, 하나 이상의 나노포어를 포함하는 막에 의해 분리되어 있는 제1 및 제2 반응 챔버를 포함하고, 여기서, 회로에 연결되어 있는 한쌍의 전극(예를 들어, 대향 플레이트 형태로)은 하나 이상의 나노포어를 포함하는 막 양쪽에 배치되어 있고, 전극은 1-30 ㎛, 예컨대, 약 10 ㎛ 거리만큼 이격되어 있으며, 그 결과, 전극 사이의 갭은, 나노포어를 통해 예컨대, 한 챔버에서 다음 챔버로 전기적으로 하전된 중합체를 끌어들이기 위하여 예컨대, 1 MHz 내지 1 GHz의 무선주파수 맥동 직류를 전극에 인가하였을 때, 정전 용량을 가지게 되고, 및 그 결과, 무선주파수 맥동 직류 상이 전기적으로 하전된 중합체가 나노포어를 통과함에 따른 정정 용량 변화에 따라 변화하며, 이로써, 전기적으로 하전된 중합체의 단량체 서열을 검출할 수 있게 되는 것인 나노칩을 제공한다. 특정 실시양태에서, 나노칩은 다중 반응 챔버 세트를 포함하며, 세트 내의 반응 챔버는 하나 이상의 나노포어를 가지는 막에 의해 분리되어 있고, 반응 챔버 세트는 반응 챔버 세트 사이의 전기 간섭을 최소화하기 위해 및/또는 다중의 선형 중합체가 분리되고, 그들이 동시에 서열분석될 수 있도록 하기 위해 스크리닝 층에 의해 분리되어 있다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 전극은 공진 회로에 포함되어 있는 커패시터의 상단 및 하단 플레이트를 형성하고, 정전 용량 변화는 DNA가 플레이트 사이의 포어를 통해 통과함에 따라 측정된다.
특정 실시양태에서, 나노칩은 중합체, 예컨대, DNA, 예컨대, 하기 나노칩 1 중 임의의 것(이하 참조)에 따른 것을 합성하기 위한 시약을 추가로 포함한다.
그러므로, 한 실시양태에서, 본 발명은, 나노칩에서 2 이상의 별개의 단량체를 포함하는 하전된 중합체[예컨대, 핵산(예컨대, DNA 또는 RNA)]를 합성하는 방법(방법 1)으로서, 나노칩이
한 반응 사이클에서 오직 단일 단량체 또는 올리고머만이 부가될 수 있도록, 하나 이상의 단량체[예컨대, 뉴클레오티드] 또는 올리고머[예컨대, 올리고뉴클레오티드]를, 말단이 보호된 형태로 완충제 용액 중의 하전된 중합체에 부가하기 위한 시약을 함유하는 하나 이상의 부가 챔버; 및
완충제 용액은 함유하지만, 하나 이상의 단량체 또는 올리고머를 부가하는 데 필요한 시약 모두를 함유하지는 않는 하나 이상의 저장 챔버
를 포함하고, 챔버들은 하나 이상의 나노포어를 포함하는 하나 이상의 막에 의해 분리되어 있으며,
여기서, 하전된 중합체는 나노포어를 통과할 수 있고, 하나 이상의 단량체 또는 올리고머의 부가를 위한 시약 중 1 이상은 통과할 수 없으며,
상기 방법은,
a) 제1 말단 및 제2 말단을 가지는 하전된 중합체의 제1 말단을 전기적 인력에 의해 부가 챔버 내로 이동시켜 단량체 또는 올리고머가 블로킹된 형태로 상기 제1 말단에 부가되도록 하는 것인 단계,
b) 블로킹된 형태의 부가된 단량체 또는 올리고머를 갖는 하전된 중합체의 제1 말단을 저장 챔버 내로 이동시키는 단계,
c) 부가된 단량체 또는 올리고머를 탈블로킹시키는 단계, 및
d) 원하는 중합체 서열을 수득할 때까지 단계 a-c를 반복하는 단계로서, 단계 a)에서 부가되는 단량체 또는 올리고머는 동일하거나 상이한 것인 단계
를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
예를 들어, 본 발명은 하기를 제공한다:
1.1. 중합체가 핵산이고, 예컨대, 중합체가 DNA 또는 RNA이고, 예컨대, 중합체가 DNA, 예컨대, dsDNA 또는 ssDNA인 방법 1.
1.2. 중합체, 예컨대, 핵산의 제2 말단이 보호되어 있거나, 또는 나노포어에 인접한 기판에 결합되어 있는 것인 임의의 상기 방법.
1.3. 전기적 인력은 각 챔버 중의 전극 사이에 전위를 가함으로써 제공되고, 여기서, 극성 및 전극 사이의 전류 흐름은 제어될 수 있고, 예컨대, 이로써, 핵산이 양의 전극으로 끌어들여지는 것인 임의의 상기 방법.
1.4. 중합체가 핵산이고,
(i) 핵산의 상기 제1 말단은 3' 말단이고, 뉴클레오티드 부가는 5'에서 3' 방향으로 이루어지고, 폴리머라제에 의해 촉매화되고, 예컨대, 여기서, 폴리머라제는 (예컨대, 그의 크기에 기인하여, 또는 제1 챔버 중 기판에 테더링된 것에 기인하여) 나노포어를 통과하지 못하게 저지되고, 뉴클레오티드는 부가시 3' 보호된 것이고, 3' 보호된 뉴클레오티드의 핵산의 3' 말단로의 부가 후, 핵산 상의 3' 보호기는 예컨대, 저장 챔버에서 제거되거나; 또는
(ii) 핵산의 상기 제1 말단은 5' 말단이고, 뉴클레오티드 부가는 3'에서 5' 방향으로 이루어지고, 뉴클레오티드는 부가시 5' 보호된 것이고, 5' 보호된 뉴클레오티드의 핵산의 5' 말단로의 부가 후, 5' 보호기는 예컨대, 제2 챔버에서 제거되고; (예를 들어, 여기서, 5' 보호된 뉴클레오티드 상의 포스페이트는 나노포어를 통과할 수 없는, 5' 보호기를 통해 벌키한 기에 커플링된 뉴클레오시드 포스포라미다이트이고, 이로써, 핵산에의 커플링 후, 비반응 뉴클레오티드는 플러싱되고, 벌키한 5'-보호기는 핵산으로부터 제거되고, 플러싱되고, 핵산의 5' 말단은 저장 챔버 내로 이동될 수 있다);
뉴클레오티드의 핵산에의 부가는, 핵산의 제1 말단의 하나 이상의 부가 챔버 안으로 및 밖으로의 이동에 의해 제어되고, 원하는 서열을 수득할 때까지 사이클이 계속 진행되는 것인, 임의의 상기 방법.
1.5. 상기와 같이 합성된 중합체 중 단량체 또는 올리고머의 서열[예컨대, 핵산 중 뉴클레오티드의 서열)이 이진 코드에 상응하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.6. 상기와 같이 합성된 중합체가 단일 가닥 DNA인, 임의의 상기 방법.
1.7. 서열분석시 오류를 확인하기 위해, 나노포어를 통과함에 따라 단량체 또는 올리고머[예컨대, 뉴클레오티드 염기]를 서열분석하여 프로세스 또는 합성 동안 중합체[예컨대, 핵산]의 서열을 체크하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.8. 상기와 같이 합성된 중합체가 단일 가닥 DNA이고, 여기서, 서열 중 염기의 적어도 95%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 실질적으로는 상기 염기 모두가 가닥 중 다른 염기와 하이브리드화하지 않는 두 염기로부터 선택되고, 예컨대, 아데닌 및 시토신으로부터 선택된 염기인, 임의의 상기 방법.
1.9. 다수의 중합체[예컨대, 올리고뉴클레오티드]가 독립적으로 동시에 합성되고, 이로써, 하나 이상의 부가 챔버 또는 하나 이상의 저장 챔버에 존재하는지 여부를 별개로 제어함으로써 상이한 서열을 가지는 중합체[올리고뉴클레오티드]를 수득하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.10. 상이한 단량체 또는 올리고머, 예컨대, 상이한 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약을 함유하는 2 이상의 부가 챔버가 존재하고, 예컨대, 여기서, 제1 단량체 또는 올리고머를 부가하는 데 적합한 시약을 함유하는 하나 이상의 부가 챔버, 및 제2 상이한 단량체 또는 올리고머를 부가하는 데 적합한 시약을 함유하는 하나 이상의 부가 챔버가 존재하고, 예를 들어, 여기서, 아데닌 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약을 함유하는 하나 이상의 부가 챔버, 및 시토신 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약을 함유하는 하나 이상의 부가 챔버가 존재하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.11. 1 이상의 부가 챔버가, (i) 유동 챔버에 제1 단량체 또는 올리고머를 부가하는 데 적합한 시약을 제공하는 단계, (ii) 플러싱하는 단계, (iii) 유동 챔버에 제2 단량체 또는 올리고머를 부가하는 데 적합한 시약을 제공하는 단계, 및 (iv) 플러싱하는 단계를 포함하는 유동 사이클을 제공하고, 합성이 완료될 때까지 사이클을 반복하는 것인 유동 챔버이고, 여기서, 중합체 중의 단량체 또는 올리고머의 서열은 각 사이클에서 단계 (i) 또는 (iii) 동안 중합체의 제1 말단을 유동 챔버로부터 도입하거나, 또는 배제시킴으로써 제어되는 것인, 임의의 상기 방법;
1.12. 중합체가 DNA이고, 1 이상의 부가 챔버가, (i) 유동 챔버에 제1 유형의 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약을 제공하는 단계, (ii) 플러싱하는 단계, (iii) 유동 챔버에 제2 유형의 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약을 제공하는 단계, 및 (iv) 플러싱하는 단계를 포함하는 유동 사이클을 제공하고, 합성이 완료될 때까지 사이클을 반복하는 것인 유동 챔버이고, 여기서, 서열은 유동 챔버 중 DNA의 제1 말단(예컨대, 3' 말단)의 존재 또는 부재를 제어함으로써 제어되는 것인, 임의의 상기 방법.
1.13. 중합체가 DNA이고, 1 이상의 부가 챔버가, (i) 유동 챔버에 제1 유형의 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약을 제공하는 단계, (ii) 플러싱하는 단계, (iii) 유동 챔버에 제2 유형의 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약을 제공하는 단계, 및 (iv) 플러싱하는 단계, (i) 유동 챔버에 제3 유형의 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약을 제공하는 단계, (ii) 플러싱하는 단계, (iii) 유동 챔버에 제4 유형의 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약을 제공하는 단계, 및 (iv) 플러싱하는 단계를 포함하는 유동 사이클을 제공하고, 합성이 완료될 때까지 사이클을 반복하는 것인 유동 챔버이고, 여기서, 서열은, 상이한 유형의 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약이 존재할 때, 유동 챔버 중 DNA의 제1 말단(예컨대, 3' 말단)의 존재 또는 부재를 제어함으로써 제어되는 것인, 임의의 상기 방법.
1.14. 중합체가 DNA이고, 나노칩은 유동 챔버인 2개의 부가 챔버, (a) (i) 제1 유동 챔버에 제1 유형의 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약을 제공하는 단계, (ii) 플러싱하는 단계, (iii) 제1 유동 챔버에 제2 유형의 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약을 제공하는 단계, 및 (iv) 플러싱하는 단계를 포함하는 유동 사이클을 제공하고, 합성이 완료될 때까지 사이클을 반복하는 것인 제1 유동 챔버, 및 (b)(i) 제2 유동 챔버에 제3 유형의 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약을 제공하는 단계, (ii) 플러싱하는 단계, (iii) 제2 유동 챔버에 제4의 상이한 유형의 뉴클레오티드를 부가하는 데 적합한 시약을 제공하는 단계, 및 (iv) 플러싱하는 단계를 포함하는 유동 사이클을 제공하고, 합성이 완료될 때까지 사이클을 반복하는 것인 제2 유동 챔버를 포함하고, 여기서, 뉴클레오티드는 dATP, dTTP, dCTP, 및 dGTP로부터 선택되고, 여기서, 서열은 다음의 원하는 뉴클레오티드가 제공될 때 DNA의 제1 말단(예컨대, 3' 말단)를 유동 챔버 내로 유도함으로써 제어되는 것인, 임의의 상기 방법.
1.15. 중합체가 DNA이고, 나노포어 칩이 dATP를 부가하기 위한 하나 이상의 부가 챔버, dTTP를 부가하기 위한 하나 이상의 부가 챔버, dCTP를 부가하기 위한 하나 이상의 부가 챔버, 및 dGTP를 부가하기 위한 하나 이상의 부가 챔버를 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.16. 합성된 중합체[예컨대, 핵산]가 각각 그의 제2 말단을 통해 나노포어 인근의 표면에 결합되는 것인, 임의의 상기 방법.
1.17. 중합체[예컨대, 핵산]의 서열이 각 사이클 후, 중합체가 나노포어를 통과함에 따른 전위, 전류, 저항, 정전 용량, 및/또는 임피던스 변화를 검출함으로써 측정되는 것인, 임의의 상기 방법.
1.18. 중합체가 핵산이고, 핵산 합성은 완충제 용액, 예컨대, pH 7-8.5, 예컨대, 약 pH 8을 위한 완충제, 예컨대, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스), 적합한 산, 및 임의적으로 킬레이터, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 포함하는 완충제, 예를 들어, 트리스 염기, 아세트산 및 EDTA의 혼합물을 함유하는 TAE 완충제, 또는 트리스 염기, 붕산 및 EDTA의 혼합물을 함유하는 TBE 완충제를 포함하는 용액; 예를 들어, 10 mM 트리스 pH 8, 1 mM EDTA, 150 mM KCl, 또는 예를 들어, 50 mM 아세트산칼륨, 20 mM 트리스 아세테이트, 10 mM 아세트산마그네슘, pH 7.9(@ 25℃)를 포함하는 용액 중에서 이루어지는 것인, 임의의 상기 방법.
1.19. 중합체가 단일 가닥 DNA이고, 합성된 단일 가닥 DNA를 이중 가닥 DNA로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.20. 중합체 합성 완료 후, 중합체[예컨대, 핵산]를 나노칩으로부터 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.21. 중합체가 핵산이고, 적절한 프라이머 및 폴리머라제(예컨대, Phi29)를 사용하여 합성된 핵산을 증폭시키고, 그의 카피를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.22. 중합체가 핵산이고, 합성된 핵산을 제한 효소로 절단하고, 핵산을 나노칩으로부터 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.23. 중합체가 핵산이고, 상기와 같이 합성된 핵산을 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.24. 중합체[예컨대, 핵산]를 나노칩으로부터 제거하고, 중합체를 결정화하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.25. 중합체가 핵산이고, 예컨대, 예를 들어, US 8283165 B2(상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이, 완충제(예컨대, 보레이트 완충제), 항산화제, 습윤제, 예컨대, 폴리올, 및 임의적으로 킬레이터 중 하나 이상의 것과 함께 핵산을 포함하는 용액을 건조시키거나; 또는 핵산과 중합체 사이에 매트릭스, 예컨대, 폴리(에틸렌 글리콜)-폴리(l-리신)(PEG-PLL) AB 타입 블록 공중합체를 형성함으로써; 또는 상보적인 핵산 가닥 또는 DNA에 결합하는 단백질을 부가함으로써 핵산을 안정화하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.26. (i) 핵산의 3' 말단에의 3' 보호된 뉴클레오티드의 부가를 촉매화하는 폴리머라제의 존재하에서 부가 챔버 중 3' 보호된 뉴클레오티드와 핵산을 반응시키는 단계;
(ii) 적어도, 상기와 같이 수득된 3' 보호된 핵산의 3' 말단을 1 이상의 나노포어를 통해 부가 챔버 밖으로, 저장 챔버 내로 끌어들이는 단계로서, 여기서, 폴리머라제는 (예컨대, 그의 크기에 기인하여, 또는 제1 챔버 중 기판에 테더링된 것에 기인하여) 나노포어를 통과하지 못하게 저지되는 것인 단계;
(iii) 3' 보호된 핵산을 예컨대, 화학적으로 또는 효소적으로 탈보호화하는 단계; 및
(iv) 추가의 3' 보호된 dNTP를 올리고뉴클레오티드에 부가하는 것이 바람직할 경우, 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 동일한 또는 상이한 부가 챔버 내로 끌어들여, 이로써, 단계 (i) - (iii)을 반복하거나, 또는 상기와 같이 부가하는 것이 바람직하지 않을 경우, 원하는 3' 보호된 dNTP가 부가 챔버에 제공되는 추가 사이클까지, 핵산의 3' 말단이 저장 챔버에 그대로 유지될 수 있게 하는 단계; 및
(v) 원하는 핵산 서열을 수득할 때까지 단계 (i) - (iv)의 사이클을 반복하는 단계를 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.27. 중합체가 핵산 단일 가닥 DNA(ssDNA: single-stranded DNA)이고, 하나 이상의 나노포어의 직경은 ssDNA는 통과하지만, 이중 가닥 DNA(dsDNA: double stranded DNA)는 통과하지 못하게 하는 것, 예컨대, 직경이 약 2 nm인, 임의의 상기 방법.
1.28. 단량체가 3' 보호된 뉴클레오티드, 예컨대, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP: deoxynucleotide triphosphate), 예컨대, 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP: deoxyadenosine triphosphate), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP: deoxyguanosine triphosphate), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP: deoxycytidine triphosphate), 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP: deoxythymidine triphosphate), 예를 들어, dATP 또는 dCTP로부터 선택되는 것인, 임의의 상기 방법.
1.29. 중합체가 핵산이고, 뉴클레오티드의 핵산에의 부가가 폴리머라제, 예컨대, 주형 비의존성 폴리머라제, 예컨대, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase), 또는 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제에 의해 촉매화되고, 예컨대, 여기서, 폴리머라제는 DNA의 3' 하이드록실 말단에서 데옥시뉴클레오티드의 도입을 촉매화하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.30. 막이 다수의 나노포어, 및 각각이 나노포어 인근의 표면에 결합되어 있는 다수의 중합체, 예컨대, 각각이 그의 5' 말단을 통해 나노포어 인근의 표면에 결합되어 있는 것인 다수의 핵산을 함유하는 것인, 임의의 상기 방법.
1.31. 각각이 나노포어 인근의 표면에 결합되어 있는 다수의 중합체, 예컨대, 각각이 그의 5' 말단에서 나노포어 인근의 표면에 결합되어 있는 다수의 핵산이 독립적으로 합성되고, 여기서, 각각의 나노포어는 연관된 한 쌍의 전극을 가지고, 여기서, 쌍 중 하나의 전극은 나노포어의 한쪽 말단에 인접하게 위치하고, 나머지 다른 한 전극은 나노포어의 나머지 다른 한쪽 말단에 인접하게 위치하고, 이로써, 각 중합체는 상기 전극 쌍에 의해 제공되는 전류에 의해 제1 챔버와 제2 챔버 사이를 독립적으로 이동할 수 있게 되는 것인, 임의의 상기 방법.
1.32. 중합체가 5' 말단에서 나노포어 인근의 표면에 결합되어 있는 3' 보호된 핵산이고, 3' 보호된 핵산의 3' 말단은 전기력을 사용함으로써, 예컨대, 인접한 챔버 중의 전극으로부터 인가된 전기력을 사용함으로써 나노포어를 통해 끌어들여지는 것인, 임의의 상기 방법.
1.33. 새 3' 보호된 dNTP가 제1 3' 보호된 dNTP와 동일하거나 상이한 것인 방법 1.20.
1.34. 사이클 중 단계 (i)에서 사용된 3' 보호된 dNTP가 각 사이클마다 3' 보호된 dATP 및 3' 보호된 dCTP를 교대로 하는 것인 방법 1.20.
1.35. 중합체가 핵산이고, 핵산의 탈보호화는 3' 보호된 dNTP 상이 아닌, ssDNA 상의 3' 보호기를 제거하는 효소에 의해 수행되는 것인, 임의의 상기 방법.
예를 들어, 본 발명은 합성이 완충제 용액 중에서 제1 말단 및 제2 말단을 가지는 핵산의 제1 말단에 뉴클레오티드를 부가하는 사이클에 의해 수행되고, 여기서, 핵산의 제1 말단은 전기적 인력에 의해 (뉴클레오티드를 부가할 수 있는 시약을 함유하는) 하나 이상의 부가 챔버와 (뉴클레오티드를 부가하는 데 필요한 시약을 함유하지 않는) 하나 이상의 저장 챔버 사이를 이동하고, 챔버는 각각이 하나 이상의 나노포어를 포함하는 것인 하나 이상의 막에 의해 분리되어 있고, 여기서, 나노포어는 핵산의 통과를 허용할 정도로 충분히 크지만, 뉴클레오티드를 부가하는 데 필수적인 1 이상의 시약의 통과를 허용하기에는 너무 작으며, 예컨대, 여기서, 본 방법은 방법 1 중 임의의 것(이하 참조)에 상응하는 것인, 적어도, 1 이상의 나노포어를 포함하는 막에 의해 분리된 제1 챔버 및 제2 챔버를 포함하는 나노칩에서 핵산을 합성하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 중합체의 서열은 이진 코드에 상응하고, 예를 들어, 여기서, 중합체는 핵산이고, 서열은 이진 코드에 상응하고, 여기서, 각 비트(0 또는 1)는 염기, 예컨대, A 또는 C로 표시된다.
특정 실시양태에서, 중합체는 DNA이다.
특정의 다른 실시양태에서, 각 비트는 단일 단량체보다는 단량체의 짧은 서열로 표시된다. 예를 들어, 상기의 한 실시양태에서, DNA 블록이 합성되고, 여기서, 각 블록은 나노포어를 통해 독자적인 신호를 생성하고, 0 또는 1에 상응한다. 본 실시양태는 단일 뉴클레오티드는 나노포어, 특히, 고체 상태 나노포어에서 검출하기가 더 어려운 바, 이에, 비록 중합체 중의 정보 밀도는 그에 따라 감소되기는 하지만, 블록을 사용하는 것이 오류를 판독할 경향은 더 적다는 점에서 특정한 이점을 가진다.
예를 들어, (이중 가닥) 뉴클레오티드의 블록은 부위 특이적 리콤비나제, 즉, 부위 특이적 재조합 서열로서 공지된 서열 세그먼트 내의 핵산의 이중 가닥 중 1 이상의 가닥을 자발적으로 인식하고, 절단하는 효소를 사용함으로써 부가될 수 있다. 상기의 한 실시양태에서, 부위 특이적 리콤비나제는 토포 접합된 dsDNA 올리고뉴클레오티드 블록을 서열에 라이게이션시키는 데 사용되는 토포이소머라제이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 제한 효소로 절단될 때까지는 그 자체가 추가의 라이게이션과 상용성을 띠는 구조를 가지지 않을 것이다. 백시니아 바이러스 토포이소머라제 I은 DNA 서열 5'-(C/T)CCTT-3'을 특이적으로 인식한다. 토포이소머라제는 이중 가닥 DNA에 결합하고, 5'-(C/T)CCTT-3' 절단 부위에서 그를 절단한다. (비록 나머지 다른 한 가닥 상에 가까운 닉을 가지는 것이 일종의 이중 가닥 파단을 유발하기는 하지만) 토포이소머라제는 오직 한 가닥 상의 DNA를 절단하기 때문에 절단은 완전한 것은 아니며, 절단시, 토포이소머라제는 3' 뉴클레오티드의 3' 포스페이트에 공유적으로 부착된다는 점에 주의한다. 이어서, 효소는 DNA의 3' 말단에 공유적으로 결합된 상태 그대로 남아있고, 이는 (DNA 이완 동안 발생하는 것과 같이) 원래 절단된 것과 동일한 결합에서 공유적으로 고정된 가닥을 다시 라이게이션시킬 수 있거나, 또는 상용성 오버행을 가지는 이종성 수용자 DNA에 다시 라이게이션시켜 재조합 분자를 생성할 수 있다. 본 실시양태에서, 본 발명자들은, 토포이소머라제 라이게이션 부위를 생성하는 제한 부위 및 토포이소머라제 재조합 부위 측면에 위치하는 (예컨대, 2 이상의 상이한 서열, '0'에 대한 것 하나, 및 '1'에 대한 나머지 다른 하나 중 하나를 포함하는) dsDNA 공여자 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 카세트는 토포 장입된 것이고; 즉, 카세트는 토포이소머라제에 공유적으로 결합되어 있고, 이는 수용자 올리고뉴클레오티드 상의 토포이소머라제 라이게이션 부위에 그를 결합시킬 것이다. 수용자의 성장 DNA 쇄가 제한 효소로 절단될 때, 이는 토포 장입된 카세트에 라이게이션될 수 있다. 따라서, 제한 효소에서 토포 장입된 카세트로 성장하는 DNA를 연속하여 사이클링시켜야만 하며, 각 사이클은 또 다른 공여자 올리고뉴클레오티드를 부가한다. 관련된 접근법은 클로닝에 대하여 기술된 바 있으며, 예컨대, 문헌 [Shuman S., Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase . J Biol Chem. (1994); 269(51):32678-84](상기 문헌의 내용은 본원에서 참조로 포함된다)를 참조한다.
단일 염기는 유사한 전략법을 사용하여 부가될 수 있다. 적합한 단일 가닥 '탈보호화된' '수용자' DNA의 존재하에서, 토포 장입된 DNA는 토포이소머라제에 의해 수용자에 효소적으로 및 공유적으로 라이게이션('부가')되고, 토포이소머라제는 상기 프로세스에서 DNA로부터 제거된다. 이어서, 타입 IIS 제한 효소는 단일 염기('부가'되고 있는 염기)를 제외하고, 부가된 DNA 모두를 절단할 수 있다. 탈보호화-부가로 이루어진 본 프로세스를 반복하여 추가 염기(비트)를 부가할 수 있다. 본원 실시예에서 입증되는 바와 같이, 토포/타입 IIS 제한 효소 조합을 사용하여 단일 뉴클레오티드를 표적 단일 가닥 DNA의 5' 말단에 부가하는 것이 실행가능하다. 타입 IIS 제한 효소를 사용하면, 인식 서열의 것과 상이한 위치에서 DNA를 절단할 수 있다(다른 타입 IIS 제한 효소는 https://www.neb.com/tools-and-resources/selectioncharts/type-iis-restriction-enzymes에서 살펴볼 수 있다). 본 시스템에서 ('범용 염기'로서 작용하고, 임의의 다른 염기와 쌍을 형성하는) 이노신을 사용하면, 표적 DNA에서 어떤 특정한 서열 요건 없이도 상기 반응은 일어날 수 있다. 단일 가닥 표적 DNA에 부가되는 뉴클레오티드의 아이덴티티는 백시니아 토포이소머라제가 3' 포스페이트를 통해 접합되는 3' 뉴클레오티드이다. 백시니아 토포이소머라제의 인식 서열은 (C/T)CCTT이기 때문에, 본 발명자들은 본 시스템을 사용하여 'T'를 표적 DNA에 부가하였다. 인식 서열 CCCTG를 사용할 수 있는 관련된 토포이소머라제, SVF가 존재한다(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8661446). 따라서, SVF는 'T' 대신 'G'를 부가하는 데 사용될 수 있다. 백시니아 토포와 쌍을 형성한 경우, 이진 데이터는 T의 것 및 G의 것으로 코딩될 수 있다.
단일 염기 부가에 대한 또 다른 접근법에서, 5' 포스페이트는 블로킹 기를 제공하여 단일 염기 부가를 3'에서 5' 방향으로 진행시킨다. 장입 반응은 5' 포스페이트 기를 가지는 단일 T(또는 G, 또는 기술된 바와 같은 다른 뉴클레오티드)를 토포이소머라제에 장입한다. 장입된 토포이소머라제가 유리 5' 언블로킹된(인산화되지 않은) 단일 가닥 DNA 쇄를 '발견'하게 되었을 때, T를 상기 쇄에 부가하여 T가 5'에 부가된 DNA를 제공할 것이다. 이러한 부가는 토포이소머라제 및 단일 가닥 수용자 DNA가 결합할 수 있는 서열을 가지는 어댑터 DNA의 존재에 의해 촉진된다(어댑터 DNA는 촉매성이고 - 이는 반복된 반응에서 주형으로서 재사용될 수 있다는 점에 주의한다). 부가된 뉴클레오티드는 그 위에 5' 포스페이트를 가지며, 이에, 5' 포스페이트를 제거하는 포스파타제에 노출될 때까지는 추가의 부가를 위한 기질이 되지 못할 것이다. 백시니아 토포이소머라제를 사용하여 표적 단일 가닥 DNA의 5' 말단에 단일 "T"를 부가하고, SVF 토포이소머라제를 사용하여 단일 'G'를 부가하면서 본 프로세스를 반복함으로써, T 및 G를 이용하여 이진 정보를 코딩하는 서열을 구성할 수 있다. 비록 하기 반응이 덜 효율적이기는 하겠지만, 다른 토포이소머라제를 사용하여 A의 것 또는 C의 것을 부가할 수 있다.
토포이소머라제 매개 전략법을 사용하는 것의 한 가지 이점은 단량체가 토포이소머라제에 공유적으로 결합하는 바, 이에 "탈출"하여 다른 반응을 방해하지 못한다는 점이다. 폴리머라제가 사용될 때, 단량체는 확산될 수 있는 바, 이에, 폴리머라제 및/또는 탈블로킹제는 특이적이어야 하거나(예컨대, 예를 들어, A 대 C에 대해 선택적이어야 하거나), 또는 대안적으로, 단량체는 유동에 의해 제공되며, 이에 단량체는 혼합될 기회를 가지지 못한다.
한 측면에서, 본 발명은 단일 뉴클레오티드가 장입된 토포이소머라제, 즉, 단일 뉴클레오티드에 접합된 토포이소머라제로서, 예컨대, 여기서, 토포이소머라제는 뉴클레오티드의 3' 포스페이트를 통해 접합되어 있고, 뉴클레오티드는 5' 위치에서 보호화된, 예컨대, 인산화된 것인, 토포이소머라제를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) DNA 분자를, 원하는 뉴클레오티드 또는 올리고머가 장입된 토포이소머라제와 반응시키는 단계로서, 여기서, 뉴클레오티드 또는 올리고머는 5' 말단에서 추가의 부가가 일어나지 못하게 블로킹되어 있는 것인 단계, 이어서, (ii) 상기와 같이 형성된 DNA의 5' 말단을 탈블로킹시키는 단계, 및 원하는 뉴클레오티드 서열을 수득할 때까지 단계 (i) 및 (ii)를 반복하는 단계를 포함하는, 단일 뉴클레오티드 또는 올리고머를 DNA 가닥에 3'에서 5' 방향으로 부가함으로써 토포이소머라제 매개 라이게이션을 이용하여 DNA 분자를 합성하는 방법(방법 A), 예컨대, 하기의 방법을 제공한다:
A1.1. (i) DNA 분자를, 5' 보호 형태, 예컨대, 5' 인산화 형태의 원하는 뉴클레오티드가 장입된 토포이소머라제와 반응시켜 5' 보호 형태의 원하는 뉴클레오티드를 DNA의 5' 말단에 부가하는 것인 단계, 이어서, (ii) 상기와 같이 형성된 DNA의 5' 말단을 포스파타제 효소를 사용하여 탈보호화하는 단계, 및 원하는 뉴클레오티드 서열을 수득할 때까지 단계 (i) 및 (ii)를 반복하는 단계를 포함하는, 단일 뉴클레오티드를 3'에서 5' 방향으로 부가함으로써 DNA 분자를 합성하는 방법인 방법 A; 또는
A1.2. (i) DNA 분자를, 원하는 올리고머가 장입된 토포이소머라제와 반응시켜 올리고머를 DNA 분자에 라이게이션시키는 단계, 이어서, (ii) 제한 효소를 사용하여 또 다른 올리고머에 대한 토포이소머라제 매개 라이게이션을 위한 5' 부위를 제공하는 단계, 및 원하는 올리고머 서열을 수득할 때까지 단계 (i) 및 (ii)를 반복하는 단계를 포함하는, 올리고머를 3'에서 5' 방향으로 부가함으로써 DNA 분자를 합성하는 방법인 방법 A.
A1.3. 리가제 및 ATP를 제공하여 DNA 중의 닉을 실링하는 단계를 포함하는 임의의 상기 방법[NB: 토포이소머라제 라이게이션은 오직 한 가닥만을 라이게이션시킨다].
A1.4. 토포이소머라제 장입된 공여자 올리고뉴클레오티드가 토포이소머라제를 보유하는 가닥에 상보적이고, 폴리이노신 서열을 포함하는 가닥 상에 5' 오버행을 포함하는 것인, 임의의 상기 방법[NB: 이노신은 '범용 염기'로서 작용하고, 고, 임의의 다른 염기와 쌍을 형성한다].
A1.5. 제한 효소가 단일 염기('부가'되고 있는 염기)를 제외하고, 부가된 DNA 모두를 절단할 수 있는 타입 IIS 제한 효소인, 임의의 상기 방법.
A1.6. 토포이소머라제가 백시니아 토포이소머라제 및 SVF 토포이소머라제 I로부터 선택되는 것인, 임의의 상기 방법.
A1.7. ((C/T)CCTT를 인식하는) 백시니아 토포이소머라제를 사용하여 dTTP 뉴클레오티드를 부가하고, (CCCTG를 인식하는) SVF 토포이소머라제 I를 사용하여 dGTP 뉴클레오티드를 부가함으로써 예컨대, 이진 코드를 제공하는 것인, 임의의 상기 방법.
A1.8. DNA가 이중 가닥이고, 저장 챔버가 토포이소머라제에 의해 연결되지 않은 DNA 가닥을 수복시키기 위해 리가제 및 ATP를 추가로 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
A1.9. DNA 올리고머에의 유리 토포이소머라제의 결합 및 활성을 억제시키기 위하여 토포이소머라제 억제제를 사용하는 단계를 포함하고, 예컨대, 여기서, 억제제는 노보비오신 및 쿠메르마이신으로부터 선택되는 것인, 임의의 상기 방법.
A1.10. 상기와 같이 제공된 DNA 가닥이 티미딘(T) 뉴클레오시드 및 데옥시구아노신(G) 뉴클레오시드를 포함하는 서열을 가지는 것인, 임의의 상기 방법.
A1.11. 토포이소머라제가 단일 염기를 부가하지만, 제한 효소는 토포이소머라제에 의해 부가된 염기로부터 5' 방향으로 하나의 뉴클레오티드만큼인 위치에서 절단하는 것인, 임의의 상기 방법.
A1.12. 상기와 같이 제공된 DNA 가닥이 'TT' 및 'TG' 디뉴클레오티드의 서열을 포함하는 서열을 가지는 것인, 임의의 상기 방법.
A1.13. DNA가 단일 가닥인, 임의의 상기 방법.
A1.14. DNA가 이중 가닥인, 임의의 상기 방법.
A1.15. DNA가 기판 또는 자기 비드 상에 있고, 여기서, 원하는 서열을 제공하기 위해 필요에 따라 선택적으로 시약에 노출되거나, 또는 그로부터 제거될 수 있는 것인, 임의의 상기 방법.
A1.16. DNA를 부가하거나, 또는 그를 탈블로킹시키기 위한 시약 중 일부 또는 그들 모두가 유동에 의해 공급되거나, 또는 플러싱에 의해 제거되는 것인, 임의의 상기 방법.
A1.17. 단일 뉴클레오티드 또는 올리고머의 단일 가닥 DNA에의 부착이 토포이소머라제 및 단일 가닥 수용자 DNA가 결합할 수 있는 서열을 가지는 어댑터 DNA의 존재에 의해 촉진되는 것인, 임의의 상기 방법.
A1.18. 나노포어가 토포이소머라제를 포함하는 챔버를 포스파타제 또는 제한 효소를 포함하는 챔버로부터 분리시키는 시스템에서 수행되고, 여기서, 나노포어는 예컨대, 방법 2 중 임의의 것(이하 참조)에 기술된 바와 같이, 전기적 인력에 의해 효소가 아닌, DNA를 이동시킬 수 있는 것인, 임의의 상기 방법.
한 가지 가능한 우려 사항은 폴리G 서열이 G-사분체 2차 구조를 형성할 수 있다는 점이다. 제한 효소를 하나의 염기만큼 (토포 서열의 5'로) 뒤로 이동시킴으로써 및 유사한 토포/IIS 전략법에 따라, 각각이 상이한 비트를 나타낼 수 있는 것인 'TT' 또는 'TG'를 부가할 수 있다. 이는 비트를 코딩하기 위해 2개의 염기를 필요로 하겠지만, 폴리G 서열은 피할 수 있다는 이점을 가진다. 다른 실시양태에서, 비록 (C/T)CCTT보다는 덜 효율적이기는 하지만, 토포 인식 서열의 3' 말단 중의 다른 염기는 폭스바이러스 토포이소머라제를 사용하여 (C/T)CCTA, (C/T)CCTC 및 (C/T)CCTG와의 접합을 허용할 수 있다(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17462694). 또한, 단백질 조작/선택 기술을 사용하여 상기 반응의 효율을 개선시킬 수 있고, 유사한 접근법을 사용하여 비정규 염기를 부가할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 방법에 의해 DNA를 합성하는 방법은 DNA를 리가제 및 ATP로 처리하는 단계를 포함한다. 토포이소머라제는 오직 DNA의 한쪽만을 함께 연결한다(나머지 다른 한쪽은 실질적으로 니킹된다). 리가제는 닉을 수복시킬 것이며, 토포이소머라제 그 자체가 확실하게 반응 생성물을 재절단하지 못하게 하고, 그를 절단하지 못하게 할 것이다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 DNA 올리고머에의 유리 토포이소머라제의 결합 및 활성을 억제시키기 위하여 토포이소머라제 억제제를 사용하는 단계를 포함한다. 적합한 억제제로는 노보비오신 및 쿠메르마이신을 포함한다. 낮은 수준의 토포이소머라제 활성이 꼬인 DNA를 이완시키는 데 도움을 줄 수 있기 때문에(이는 특히 장쇄의 DNA 쇄를 합성할 때 유용하다), 완전한 억제가 바람직한 것은 아니라는 점에 주의한다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 나노칩에서 DNA를 합성하는 방법(방법 2)으로서, 상기 나노칩은 토포이소머라제 장입된 올리고뉴클레오티드(즉, 3' 말단에서 토포이소머라제에 결합된 올리고뉴클레오티드)를 함유하는 하나 이상의 부가 챔버, 및 제한 효소 또는 탈블로커, 예컨대, 포스파타제를 포함하는 하나 이상의 저장 챔버를 포함하고, 상기 챔버는 또한 상용성 완충제 용액을 함유하고, 1 이상의 나노포어를 포함하는 막에 의해 분리되어 있고, 여기서, 토포이소머라제 및 제한 효소는 (예컨대, 너무 크기 때문에, 및/또는 각각 제1 및 제2 챔버 중의 기판에 테더링되어 있기 때문에) 나노포어를 통과하지 못하게 저지되고, 합성은 단일 뉴클레오티드 또는 짧은 올리고뉴클레오티드 블록을, 제1 말단 및 제2 말단을 가지는 핵산의 제1 말단에 부가하는 사이클에 의해 수행되고, 여기서, 핵산의 제1 말단은 전기적 인력에 의해 부가 챔버와 저장 챔버 사이를 이동하게 되고, 예를 들어, 한 실시양태에서, 하기와 같이,
(i) 수용자 DNA(예컨대, 이중 가닥 DNA)의 5' 말단을 전기력에 의해 제1 부가 챔버 내로 이동시키는 단계,
(ii) 제1 부가 챔버에 토포이소머라제 장입된 공여자 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 여기서, 공여자 올리고뉴클레오티드는 토포이소머라제 결합 부위, 정보 서열(예컨대, 2 이상의 상이한 뉴클레오티드 또는 서열로부터 선택되는 것, 예컨대, 여기서, 이진 코드로 한 서열은 '0'에 상응하고, 나머지 다른 하나는 '1'에 상응한다), 및 제한 효소에 의해 절단될 때, 토포이소머라제 라이게이션 부위를 생성하는 제한 부위를 포함하는 것인 단계;
(iii) 공여자 올리고뉴클레오티드가 수용자 DNA에 라이게이션되어 그를 연장시킬 수 있게 충분한 시간을 허용하는 단계;
(iv) 상기와 같이 연장된 수용자 DNA의 5' 말단을 전기력에 의해 저장 챔버 내로 이동시켜, 예컨대, 제한 효소가 수용자 DNA를 절단하여 토포이소머라제 라이게이션 부위를 제공하도록, 또는 단일 뉴클레오티드 부가인 경우, 탈블로커, 예컨대, 포스파타제가 단일 가닥 DNA 상에 5' 언블로킹된 뉴클레오티드를 생성하는 것인 단계; 및
(v) 원하는 DNA 서열 또는 서열들을 수득할 때까지, 동일하거나 상이한 정보 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 부가하면서, 단계 (i) - (iv)의 사이클을 반복하는 단계에 의해 수행되는 것인 방법을 제공한다.
예를 들어, 본 발명은 하기 방법들을 제공한다:
2.1. 수용자 DNA의 3' 말단이 나노포어에 인접하게 부착되고, 수용자 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이 토포이소머라제 라이게이션 부위를 포함하고, 단계 (iv) 이후, 제1 부가 챔버를 플러싱하고, 새 토포이소머라제 장입된 공여자 올리고뉴클레오티드를 제1 부가 챔버에 제공함으로써 추가의 올리고뉴클레오티드를 수용자 DNA의 5' 말단에 부가하는 단계로서, 새 공여자 올리고뉴클레오티드는 이전 공여자 올리고뉴클레오티드와는 상이한 정보 서열을 가지고; 원하는 경우, 새 공여자 올리고뉴클레오티드가 수용체 DNA에 부가되고, 수용자 핵산의 5' 말단을 제1 챔버 내로 다시 끌어들이는 단계, 및 단계 (i) - (iii)을 반복하거나, 또는 원하지 않을 경우, 원하는 공여자 올리고뉴클레오티드가 제1 챔버에 제공될 때까지, 수용자 DNA가 제2 챔버에 그대로 유지될 수 있게 하는 단계를 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
2.2. 다수의 수용자 DNA 분자가 독립적으로 동시에 합성되고, 이로써, 제1 챔버에 존재하는지 여부를 별개로 제어함으로써 상이한 서열을 가지는 DNA 분자를 수득하는 것인, 임의의 상기 방법.
2.3. 각각이 3' 말단에서 나노포어 인근의 표면에 결합되어 있는 다수의 수용자 DNA 분자가 독립적으로 합성되고, 여기서, 각각의 나노포어는 연관된 한 쌍의 전극을 가지고, 여기서, 쌍 중 하나의 전극은 나노포어의 한쪽 말단에 인접하게 위치하고, 나머지 다른 한 전극은 나노포어의 나머지 다른 한쪽 말단에 인접하게 위치하고, 이로써, 각 수용자 DNA 분자는 상기 전극 쌍에 의해 제공되는 전류에 의해 제1 챔버와 제2 챔버 사이를 독립적으로 이동할 수 있게 되는 것인, 임의의 상기 방법.
2.4. 사이클 중 단계 (i)에서 사용된 공여자 올리고뉴클레오티드가 각 사이클마다 제1 정보 서열을 포함하는 공여자 올리고뉴클레오티드 및 제2 정보 서열을 포함하는 공여자 올리고뉴클레오티드를 교대로 하는 것인, 임의의 상기 방법.
2.5. 동일한 정보 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 부가하기 위해 수용자 DNA의 5' 말단을 제1 부가 챔버로 복귀시킴으로써, 또는 공여자 올리고뉴클레오티드를 3' 말단에서 토포이소머라제에 결합시키기 위해 수용자 DNA의 5' 말단을 제2 부가 챔버로 이동시킴으로써 추가의 올리고뉴클레오티드를 수용자 DNA의 5' 말단에 부가하는 단계로서, 여기서, 제2 부가 챔버 중의 공여자 올리고뉴클레오티드는 제1 부가 챔버 중의 공여자 올리고뉴클레오티드와 상이한 정보 서열을 가지는 것인 단계를 포함하는 것인 방법 2.
2.6. 공여자 올리고뉴클레오티드가 하기와 같은 구조를 포함하고:
여기서, N은 임의의 뉴클레오티드를 지칭하고, 제한 효소는 적절한 오버행을 제공하기 위해 DNA(예컨대, 상기 서열에서 GTCGAC)를 절단할 수 있는 Acc1인, 임의의 상기 방법.
2.7. 공여자 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 구조, 예컨대, 2.6에서 상단 가닥 및 하단 가닥 상의 NNNNN 기가 연결되어 있는 것과 같은 구조를 가지는 것인, 임의의 상기 방법.
2.8. 토포이소머라제 장입된 올리고뉴클레오티드 중 1 이상이 하기와 같은 구조를 가지는 것인, 임의의 상기 방법:
2.9. 토포이소머라제 장입된 올리고뉴클레오티드 중 1 이상이 하기와 같은 구조를 가지는 것인, 임의의 상기 방법:
2.10. 토포이소머라제 장입된 올리고뉴클레오티드인 상기 방법.
2.11. 합성된 DNA의 서열이 각 사이클 후, 올리고뉴클레오티드가 나노포어를 통과함에 따른 전위, 전류, 저항, 정전 용량 및/또는 임피던스 변화를 검출함으로써 측정되는 것인, 임의의 상기 방법.
2.12. DNA의 합성이 완충제 용액, 예컨대, pH 7-8.5, 예컨대, 약 pH 8을 위한 완충제, 예컨대, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스), 적합한 산, 및 임의적으로 킬레이터, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 포함하는 완충제, 예를 들어, 트리스 염기, 아세트산 및 EDTA의 혼합물을 함유하는 TAE 완충제, 또는 트리스 염기, 붕산 및 EDTA의 혼합물을 함유하는 TBE 완충제를 포함하는 용액; 예를 들어, 10 mM 트리스 pH 8, 1 mM EDTA, 150 mM KCl, 또는 예를 들어, 50 mM 아세트산칼륨, 20 mM 트리스 아세테이트, 10 mM 아세트산마그네슘, pH 7.9(@ 25℃)를 포함하는 용액 중에서 이루어지는 것인, 임의의 상기 방법.
2.13. DNA를 나노칩으로부터 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
2.14. 상기와 같이 합성된 DNA를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
2.15. DNA를 나노칩으로부터 제거하고, DNA를 결정화하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
2.16. 예컨대, 예를 들어, US 8283165 B2(상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이, 완충제(예컨대, 보레이트 완충제), 항산화제, 습윤제, 예컨대, 폴리올, 및 임의적으로 킬레이터 중 하나 이상의 것과 함께 DNA를 포함하는 용액을 건조시키거나; 또는 핵산과 중합체 사이에 매트릭스, 예컨대, 폴리(에틸렌 글리콜)-폴리(l-리신)(PEG-PLL) AB 타입 블록 공중합체를 형성함으로써 DNA를 안정화하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
2.17. 리가제 및 ATP를 제공하여 DNA 중의 닉을 실링하는 단계를 포함하는 임의의 상기 방법[NB: 토포이소머라제 라이게이션은 오직 한 가닥만을 라이게이션시킨다].
2.18. 토포이소머라제 장입된 공여자 올리고뉴클레오티드가 토포이소머라제를 보유하는 가닥에 상보적이고, 폴리이노신 서열을 포함하는 가닥 상에 5' 오버행을 포함하는 것인, 임의의 상기 방법[NB: 이노신은 '범용 염기'로서 작용하고, 고, 임의의 다른 염기와 쌍을 형성한다].
2.19. 제한 효소가 단일 염기('부가'되고 있는 염기)를 제외하고, 부가된 DNA 모두를 절단할 수 있는 타입 IIS 제한 효소인, 임의의 상기 방법.
2.20. 토포이소머라제가 백시니아 토포이소머라제 및 SVF 토포이소머라제 I로부터 선택되는 것인, 임의의 상기 방법.
2.21. ((C/T)CCTT를 인식하는) 백시니아 토포이소머라제를 사용하여 dTTP 뉴클레오티드를 부가하고, (CCCTG를 인식하는) SVF 토포이소머라제 I를 사용하여 dGTP 뉴클레오티드를 부가함으로써 예컨대, 이진 코드 정보를 제공하는 것인, 임의의 상기 방법.
2.22. 저장 챔버가 토포이소머라제에 의해 연결되지 않은 DNA 가닥을 수복시키기 위해 리가제 및 ATP를 추가로 포함하는 것인, 임의의 상기 방법.
2.23. DNA 올리고머에의 유리 토포이소머라제의 결합 및 활성을 억제시키기 위하여 토포이소머라제 억제제를 사용하는 단계를 포함하고, 예컨대, 여기서, 억제제는 노보비오신 및 쿠메르마이신으로부터 선택되는 것인, 임의의 상기 방법.
2.24. 상기와 같이 제공된 DNA 가닥이 티미딘(T) 뉴클레오시드 및 데옥시구아노신(G) 뉴클레오시드를 포함하는 서열을 가지는 것인, 임의의 상기 방법.
2.25. 토포이소머라제가 단일 염기를 부가하지만, 제한 효소는 토포이소머라제에 의해 부가된 염기로부터 5' 방향으로 하나의 뉴클레오티드만큼인 위치에서 절단하는 것인, 임의의 상기 방법.
2.26. 상기와 같이 제공된 DNA 가닥이 'TT' 및 'TG' 디뉴클레오티드의 서열을 포함하는 서열을 가지는 것인, 임의의 상기 방법.
2.27. (i) DNA 분자를, 5' 보호 형태, 예컨대, 5' 인산화 형태의 원하는 뉴클레오티드가 장입된 토포이소머라제와 반응시켜 5' 보호 형태의 원하는 뉴클레오티드를 DNA의 5' 말단에 부가하는 것인 단계, 이어서, (ii) 상기와 같이 형성된 DNA의 5' 말단을 포스파타제 효소를 사용하여 탈보호화하는 단계, 및 원하는 뉴클레오티드 서열을 수득할 때까지 단계 (i) 및 (ii)를 반복하는 단계를 포함하는, 단일 뉴클레오티드를 3'에서 5' 방향으로 부가함으로써 DNA 분자를 합성하는 방법인, 임의의 상기 방법.
2.28. (i) DNA 분자를, 원하는 올리고머가 장입된 토포이소머라제와 반응시켜 올리고머를 DNA 분자에 라이게이션시키는 단계, 이어서, (ii) 제한 효소를 사용하여 또 다른 올리고머에 대한 토포이소머라제 매개 라이게이션을 위한 5' 부위를 제공하는 단계, 및 원하는 올리고머 서열을 수득할 때까지 단계 (i) 및 (ii)를 반복하는 단계를 포함하는, 올리고머를 3'에서 5' 방향으로 부가함으로써 DNA 분자를 합성하는 방법인, 임의의 상기 방법.
2.29. 방법 A 중 임의의 것(이하 참조)에 따른 방법인, 임의의 상기 방법.
합성 반응의 생성물은 검출될 수 있고, 품질 관리 목적으로 검토될 수 있고, 중합체 상에 코딩된 데이터를 추출하기 위해 판독될 수 있다. 예를 들어, DNA는 나노포어 서열분석이 강건하지 확인하기 위해 종래 수단에 의해 증폭되고, 서열분석될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 토포이소머라제 결합 부위, 정보 서열(예컨대, 2 이상의 상이한 서열로부터 선택되는 것, 예컨대, 여기서, 이진 코드로 한 서열은 '0'에 상응하고, 나머지 다른 하나는 '1'에 상응한다), 및 제한 효소에 의해 절단될 때, 토포이소머라제 라이게이션 부위를 생성하는 제한 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 예컨대, 하기 서열을 포함하는 것을 제공한다:
여기서, 정보 서열 A 또는 B는 3-12개, 예컨대, 약 8개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드가 토포이소머라제 결합 부위, 정보 서열(예컨대, 2 이상의 상이한 서열로부터 선택되는 것, 예컨대, 여기서, 이진 코드로 한 서열은 '0'에 상응하고, 나머지 다른 하나는 '1'에 상응한다), 및 제한 효소에 의해 절단될 때, 토포이소머라제 라이게이션 부위를 생성하는 제한 부위를 포함하는 것인, 토포이소머라제 장입된 올리고뉴클레오티드로서; 예를 들어, 토포이소머라제 장입된 올리고뉴클레오티드는 하기 구조를 가지는 것인 토포이소머라제 장입된 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
여기서, 정보 서열 A 또는 B는 3-12개, 예컨대, 약 8개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이고, *는 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 결합된 토포이소머라제이고; 예컨대, 여기서, 토포이소머라제는 백시니아 바이러스 토포이소머라제 I이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 분자로서, 여기서, 단일 가닥 또는 코딩 서열은 실질적으로 비하이브리드화 염기, 예를 들어, 아데닌 및 시토신(A 및 C)으로 구성되고, 이는 이진 코드에 상응하는 서열로 배열되어 있는 것인, 예컨대, 데이터 저장 방법에서 사용하기 위한 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 분자를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 DNA가 단일 가닥 또는 이중 가닥이고, 길이가 적어도 1,000개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대, 1,000 - 1,000,000개의 뉴클레오티드, 또는 예를 들어, 5,000 내지 20,000개의 뉴클레오티드 길이이고, 뉴클레오티드의 서열은 이진 코드에 상응하는 것인 DNA(DNA 1), 예컨대, 하기와 같은 DNA를 제공한다:
1.1. DNA가 단일 가닥인 DNA 1.
1.2. DNA가 이중 가닥인 DNA 1.
1.3. 단일 가닥 중 또는 코딩 가닥 중의 뉴클레오티드가 아데닌, 티민 및 시토신 뉴클레오티드로부터 선택되고, 예컨대, 아데닌 및 시토신 뉴클레오티드 또는 티민 및 시토신 뉴클레오티드로부터 선택되는 것인, 임의의 상기 DNA.
1.4. 주로 비하이브리드화 뉴클레오티드로 구성되고, 이로써, 단일 가닥 형태일 때 유의적인 2차 구조를 형성하지 않는 것인, 임의의 상기 DNA.
1.5. 뉴클레오티드가 적어도 95%, 예컨대, 99%, 예컨대, 100% 아데닌 및 시토신 뉴클레오티드인, 임의의 상기 DNA.
1.6. 이진 코드를 포함하는 뉴클레오티드를 분리시키거나, 또는 중단시키기 위해, 예컨대, 1인 것 및 0인 것, 또는 1인 것 및 0인 것으로 구성된 군을 분리시키기 위해 부가된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 DNA로서, 이로써, 연속된 1인 것 또는 0인 것은 더욱 쉽게 판독될 수 있는 것인, 임의의 상기 DNA.
1.7. (a) 이진 코드의 각 비트가 단일 뉴클레오티드에 상응하고, 예컨대, 1 및 0은 각각 A 또는 C에 상응하거나; 또는 (b) 이진 코드의 각 비트가 1개 초과의 뉴클레오티드, 예컨대, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드 시리즈, 예컨대, AAA 또는 CCC에 상응하는 것인, 임의의 상기 DNA.
1.8. 결정화된 것인, 임의의 상기 DNA.
1.9. 예를 들어, US 8283165 B2(상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이, 완충제 염(예컨대, 보레이트 완충제), 항산화제, 습윤제, 예컨대, 폴리올, 및 임의적으로 킬레이터 중 하나 이상의 것과 함께 건조된 형태로; 및/또는 핵산과 중합체 사이에 매트릭스로, 예컨대, 폴리(에틸렌 글리콜)-폴리(l-리신)(PEG-PLL) AB 타입 블록 공중합체로; 및/또는 상보적인 핵산 가닥 또는 DNA에 결합하는 단백질과 함께 제공되는 것인 임의의 상기 DNA.
1.10. 방법 1 중 임의의 것(이하 참조), 또는 방법 2 중 임의의 것(이하 참조) 또는 방법 A 중 임의의 것(이하 참조)에 의해 제조된 임의의 상기 DNA.
나노칩은 예를 들어, 도 23-29에 도시되어 있는 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, 한 포맷에서, 각 중합체 가닥은 2 또는 4개의 부가 챔버와 결합되어 있고, 여기서, 2개의 부가 챔버 포맷은 중합체에 이진 코드를 코딩하는 데 유용하고, 4개의 부가 챔버 포맷은 특히 맞춤형 DNA 서열을 제조하는 데 유용하다. 각각의 부가 챔버는 별개로 제어가능한 전극을 함유한다. 부가 챔버는 단량체를 완충제 중에서 중합체에 부가하는 시약을 함유한다. 부가 챔버는 하나 이상의 나노포어를 포함하는 막에 의해 저장 챔버로부터 분리되고, 이는 다중의 부가 챔버에 공통된 것일 수 있고, 부가 챔버에서 부가된 보호된 단량체 또는 올리고머를 탈보호화하기 위해 탈보호화 시약 및 시약을 함유한다. 나노칩은 다수의 중합체가 동시에 합성될 수 있도록 다수의 부가 챔버 세트를 포함한다.
고대역 및 저잡음 나노포어 센서 및 검출 전자장치는 단일-DNA 염기 분석을 달성하는 데 중요하다. 특정 실시양태에서, 나노칩은 상보성 금속 산화물 반도체(CMOS: Complementary Metal-Oxide Semiconductor) 칩에 전기적으로 연결된다. 고체 상태 나노포어는 예컨대, 문헌 [Uddin, et al., "Integration of solid-state nanopores in a 0.5 ㎛ cmos foundry process", Nanotechnology (2013) 24(15): 155501](상기 문헌의 내용은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이, CMOS 플랫폼 내에서 바이어싱 전극 및 맞춤형 디자인 증폭기 전자장치에 매우 인접하게 집적될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 2 이상의 별개의 단량체를 포함하는 전기적으로 하전된 중합체, 예컨대, DNA를 합성 및/또는 서열분석하기 위한 나노칩(나노칩 1)으로서, 상기 나노칩은 적어도, 하나 이상의 나노포어를 포함하는 막에 의해 분리되어 있는 제1 및 제2 반응 챔버를 포함하고, 여기서, 각각의 반응 챔버는 전기적으로 하전된 중합체를 챔버 내로 끌어들이기 위한 하나 이상의 전극을 포함하고, 전해질 매질, 및 임의적으로 단량체를 중합체에 부가하기 위한 시약을 추가로 포함하는 것인 나노칩(나노칩 1), 예를 들어, 하기와 같은 나노칩을 제공한다:
1.1. 나노포어 직경이 2-20 nm, 예컨대, 2-10 nm, 예를 들어, 2-5 nm인 나노칩 1.
1.2. 나노칩의 반응 챔버의 벽 중 일부, 또는 그들 모두가 규소 물질, 예컨대, 규소, 이산화규소, 질화규소, 또는 그의 조합, 예를 들어, 질화규소를 포함하는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.3. 나노칩의 반응 챔버의 벽 중 일부, 또는 그들 모두가 규소 물질, 예컨대, 규소, 이산화규소, 질화규소, 또는 그의 조합, 예를 들어, 질화규소를 포함하고, 나노포어 중 일부, 또는 그들 모두가 이온 충격에 의해 제조된 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.4. 나노포어 중 일부, 또는 그들 모두가 막, 예컨대, 지질 이중층 중의 포어 형성 단백질, α-헤몰리신으로 구성된 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.5. 반응 챔버의 벽 중 일부, 또는 그들 모두가 시약과의 상호작용을 최소화하기 위해 코팅되고, 예컨대, 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜로, 또는 단백질, 예컨대, 우혈청 알부민으로 코팅된 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.6. 전해질 매질을 포함하는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.7. 완충제, 예컨대, pH 7-8.5, 예컨대, 약 pH 8을 위한 완충제, 예컨대, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스), 적합한 산, 및 임의적으로 킬레이터, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 포함하는 완충제, 예를 들어, 트리스 염기, 아세트산 및 EDTA의 혼합물을 함유하는 TAE 완충제, 또는 트리스 염기, 붕산 및 EDTA의 혼합물을 함유하는 TBE 완충제; 예를 들어, 10 mM 트리스 pH 8, 1 mM EDTA, 150 mM KCl, 또는 예를 들어, 50 mM 아세트산칼륨, 20 mM 트리스 아세테이트, 10 mM 아세트산마그네슘, pH 7.9(@ 25℃)를 포함하는 용액을 포함하는 전해질 매질을 포함하는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.8. 단량체를 중합체에 부가하기 위한 시약을 포함하는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.9. 중합체를 합성할 수 있고(예컨대, 단량체 또는 단량체 군을 순차적으로 중합체에 부가함으로써 "기록할 수 있고"), 중합체를 서열분석할 수 있는(예컨대, 단량체가 나노포어를 통과함에 따른 전류 및/또는 인덕턴스의 변화를 측정함으로써 "판독할 수 있는"), 이 둘 모두를 수행할 수 있는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.10. 하나 이상의 나노포어를 포함하는 막이 양쪽 모두에 금속 표면을 포함하고, 금속 표면은 절연체, 예컨대, 질화규소 막에 의해 분리되어 있고, 금속 표면은 각 나노포어의 양단에 전극을 제공하도록 예컨대, 리소그래피 수단에 의해 구성되고, 예컨대, 이로써, 전해질 매질을 통해 나노포어를 통과하는 나노포어를 가로지르는 전류 흐름이 확립될 수 있고, 예컨대, 전류는 나노포어를 통해 중합체를 끌어들일 수 있고, 중합체가 나노포어를 통과함에 따라, 나노포어를 가로지르는 전위 변화를 측정할 수 있고, 이를 사용하여 중합체의 서열 중의 단량체를 확인할 수 있는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.11. DNA인 전기적으로 하전된 중합체를 포함하는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.12. 단일 가닥 DNA(ssDNA)인 전기적으로 하전된 중합체를 포함하는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.13. 미리 결정된 제한 부위를 포함하는 DNA인 전기적으로 하전된 중합체를 포함하는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.14. DNA가 상기 DNA 1 중 임의의 것(이하 참조)에 기술된 것과 같은 DNA인, DNA인 전기적으로 하전된 중합체를 포함하는 임의의 상기 나노칩.
1.15. DNA가 적어도 95%, 예컨대, 99%, 예컨대, 100% 아데닌 및 시토신을 포함하는 것인, DNA인 전기적으로 하전된 중합체를 포함하는 임의의 상기 나노칩.
1.16. DNA가 오직 아데닌 및 시토신만을 포함하는 것인, DNA인 전기적으로 하전된 중합체를 포함하는 임의의 상기 나노칩.
1.17. 완충제 및 시약을 도입할 수 있고, 그를 밖으로 플러싱할 수 있게 허용하는 하나 이상의 포트를 포함하는 임의의 상기 나노칩.
1.18. 완충제 용액, 예컨대, pH 7-8.5, 예컨대, 약 pH 8을 위한 완충제, 예컨대, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris), 적합한 산, 및 임의적으로 킬레이터, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 포함하는 완충제, 예를 들어, 트리스 염기, 아세트산 및 EDTA의 혼합물을 함유하는 TAE 완충제, 또는 트리스 염기, 붕산 및 EDTA의 혼합물을 함유하는 TBE 완충제를 포함하는 용액; 예를 들어, 10 mM 트리스 pH 8, 1 mM EDTA, 150 mM KCl, 또는 예를 들어, 50 mM 아세트산칼륨, 20 mM 트리스 아세테이트, 10 mM 아세트산마그네슘, pH 7.9(@ 25℃)를 포함하는 용액을 포함하는 임의의 상기 나노칩.
1.19. 보관을 위해 동결건조되거나, 또는 동결건조될 수 있고, 이어서, 재수화되거나, 또는 재수화될 수 있고, 예컨대, 여기서, 나노칩의 구조는 수화가능한 또는 투수성 중합체를 포함하는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.20. 건조된 형태로 합성되고, 예컨대, 여기서, 나노칩의 구조는 수화가능한 또는 투수성 중합체를 포함하고, 합성 후, 이어서, 사용 전에 수화되고, 이어서, 임의적으로, 일단 기록 프로세스가 완료되고 나면, 장기간 보관을 위해 동결건조되는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.21. 전기적으로 하전된 중합체, 예컨대, DNA가 히스톤으로 안정화된 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.22. 내부 표면이 양으로 하전된 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.23. 전극이 나노포어를 가로질러 무선주파수 맥동 직류를 예컨대, 1 MHz 내지 1 GHz, 예컨대, 50-200 MHz, 예를 들어, 약 100 MHz의 주파수로 제공할 수 있는 정전 용량성 회로에 작동가능하게 연결되어 있고, 예컨대, 여기서, 맥동 직류는 나노포어를 통해 하전된 중합체를 끌어들일 수 있고, 단량체 서열은 하전된 중합체가 나노포어를 통과함에 따른 나노포어를 가로지르는 정전 용량 변동량을 측정함으로써 측정될 수 있는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.24. 부가 챔버 중 하나에서 단량체 또는 올리고머를 부가한 후, 중합체의 탈보호화를 위한 시약을 함유하는, 저장 또는 탈블로커 챔버를 포함하는 임의의 상기 나노칩.
1.25. 다수의 부가 챔버 쌍을 포함하는 임의의 상기 나노칩.
1.26. 예컨대, 도 24에 도시된 바와 같이, 웨이퍼 본딩에 의해 연결된, 전기 제어 층, 유체 층 및 전기 접지 층을 포함하는 임의의 상기 나노칩.
1.27. 나노포어가 FIB, TEM, 습식 또는 건식 에칭에 의해 제조된 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.28. 나노포어를 포함하는 막의 두께가 1 원자 층 내지 30 nm인, 임의의 상기 나노칩.
1.29. 나노포어를 포함하는 막이 SiN, BN, SiOx, 그래핀, 전이 금속 디칼코게나이드 예컨대, WS2 또는 MoS2로 제조된 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.30. 금속 또는 폴리실리콘으로 제조된 배선을 포함하는 임의의 상기 나노칩.
1.31. 배선 밀도가 3D 적층에 의해 증가되고, 전기적 절연은 (예컨대, PECVD, 스퍼터링, ALD 등을 통해) 유전체 증착에 의해 제공되는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.32. 부가 챔버 중 전극에의 접촉이 심도 반응성 이온 에칭(DRIE)에 의해 실리콘 관통 전극(TSV)을 사용하여, 예컨대, 극저온 또는 BOSCH 프로세스를 사용하여, 또는 습식 규소 에칭을 통해 이루어지는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.33. 각각의 부가 챔버 중의 전극에 대한 개별 전압 제어를 통해 각각의 부가 챔버 중의 전극이 개별적으로 제어되고, 모니터링될 수 있는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.34. 각각의 중합체가 제1 부가 챔버, 제2 부가 챔버, 및 탈블로킹 챔버와 결합되어 있는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.35. 하나 이상의 챔버가 유체 유동을 가지는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.36. 하나 이상의 챔버가 유체적으로 분리되어 있는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.37. 탈블로킹 챔버가 유체 유동을 가지는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.38. 부가 챔버가 공동 유체 유동을 가지는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.39. 챔버 사이의 배선이 유사한 유형의 챔버 사이에서(예컨대, 제1 부가 챔버 사이에서, 제2 부가 챔버 사이에서, 및 탈블로킹 챔버 사이에서) 공통되는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.40. 부가 챔버가 개별 전압 제어를 가지고, 탈블로킹 챔버가 공동 전기 접지를 가지는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.41. 탈블로킹 챔버가 개별 전압 제어를 가지고, 제1 부가 챔버가 공동 전기 접지를 가지고, 제2 부가 챔버가 공동 전기 접지를 가지는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.42. 나노칩이 웨이퍼 본딩에 의해 제조되고, 챔버가 본딩 이전에 원하는 시약로 미리 충전되는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.43. 하나 이상의 내부 표면이 실란화된 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.44. 유체 도입 또는 제거를 위한 하나 이상의 포트를 가지는 임의의 상기 나노칩.
1.45. 챔버 중 전극이 하전된 중합체와의 직접적인 접촉으로부터 제한을 받고, 예컨대, 여기서, 전극은 나노포어로부터 너무 먼 거리에 배치되어 있어 나노포어에 인접한 표면에 결합된 하전된 중합체가 그에 도달할 수 없거나, 또는 여기서, 전극이 물 및 단일 원자 이온(예컨대, Na+, K+ 및 Cl- 이온)의 통과는 허용하지만, 중합체 또는 중합체에 연결되는 단량체 또는 올리고머 시약의 통과는 허용하지 않는 물질에 의해 보호되는 것인, 임의의 상기 나노칩.
1.46. 상보성 금속 산화물 반도체(CMOS) 칩에 전기적으로 연결되어 있는 임의의 상기 나노칩.
예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 2 이상의 별개의 단량체를 포함하는 전기적으로 하전된 중합체, 예컨대, DNA를 서열분석하기 위한 나노칩, 예컨대, 나노칩 1 중 임의의 것(이하 참조)에 따른 나노칩으로서, 나노칩은 적어도, 전해질 매질을 포함하고, 하나 이상의 나노포어를 포함하는 막에 의해 분리되어 있는 제1 및 제2 반응 챔버를 포함하고, 여기서, 각각의 반응 챔버는 막의 대향면에 배치된 적어도 한 쌍의 전극을 포함하고, 여기서, 전극은 나노포어를 가로질러 무선주파수 맥동 직류를 예컨대, 1 MHz 내지 1 GHz, 예컨대, 50-200 MHz, 예를 들어, 약 100 MHz의 주파수로 제공할 수 있는 정전 용량성 회로에 작동가능하게 연결되어 있고, 예컨대, 여기서, 맥동 직류는 나노포어를 통해 하전된 중합체를 끌어들일 수 있고, 단량체 서열은 하전된 중합체가 나노포어를 통과함에 따른 나노포어를 가로지르는 정전 용량 변동량을 측정함으로써 측정될 수 있는 것인 나노칩을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 나노포어를 가로질러 무선주파수 맥동 직류를 예컨대, 1 MHz 내지 1GHz, 예컨대, 50-200 MHz, 예를 들어, 약 100 MHz의 주파수로 인가하는 단계를 포함하고, 여기서, 맥동 직류는 나노포어를 통해 하전된 중합체를 끌어들이고, 단량체 서열은 하전된 중합체가 나노포어를 통과함에 따른 나노포어를 가로지르는 정전 용량 변동량을 측정함으로써 판독되는 것인, 적어도 2가지 상이한 유형의 단량체를 포함하는 하전된 중합체, 예를 들어, DNA 분자의 단량체 서열을 판독하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 정보를 저장하는 방법에서의 DNA 1 중 임의의 것(이하 참조)의 용도를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 정보를 저장하는 방법에서의 단일 가닥 DNA의 용도로서, 예컨대, 여기서, 서열은 실질적으로 자기 하이브리드화하지 않는 것인 용도를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 예컨대, 상기 방법 1 및/또는 2 중 임의의 것(이하 참조)에 따라 단량체 또는 올리고머가 이진 코드에 상응하는 서열로 배열되어 있는 것인, 2 이상의 별개의 단량체 또는 올리고머를 포함하는 전기적으로 하전된 중합체, 예컨대, DNA를 제조하기 위하여 나노칩, 예컨대, 나노칩 1 중 임의의 것(이하 참조)을 사용하는 데이터 저장 방법 및 장치를 제공한다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 상기와 같이 합성된 중합체를 포함하는 나노칩은, 나노칩이 활성화될 수 있고, 중합체의 서열은 수시로 나노포어를 통과함으로써 검출될 수 있는 바, 데이터 저장 장치를 제공한다. 다른 실시양태에서, 중합체는 나노칩으로부터 제거되거나, 또는 증폭되고, 증폭된 중합체는 나노칩으로부터 제거되고, 필요할 때까지, 보관된 후, 종래 서열분석기, 예컨대, 종래 나노포어 서열분석 장치를 사용하여 판독된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 예컨대, 방법 1 중 임의의 것(이하 참조)및/또는 방법 2 중 임의의 것(이하 참조)에 따라 DNA 1 중 임의의 것(이하 참조)을 합성하는 단계를 포함하는, 정보를 저장하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이, 나노포어 서열분석기를 사용하여, 예를 들어, 나노칩 1(이하 참조)을 사용하여 이진 코드, 예컨대, DNA 1 중 임의의 것(이하 참조)에 코딩된 것과 같은 이진 코드를 판독하는 방법을 제공한다.
하전된 중합체를 용해시키는 효소, 예컨대, DNA를 가수분해하는 데옥시리보뉴클레아제(DN아제)를 사용하여 나노칩을 소거하는 것인, 임의의 상기 방법.
실시예
실시예
1 - DNA의 한쪽
말단의
나노포어
인접부에의
고정화 및 전류를 통한 DNA의 제어된 방식의 전후 이동
실험 방법은 관련 단백질이 챔버 사이를 이동하지 않는 조건하에서 DNA가 전류를 통해 나노포어에 의해 분리된 두 챔버 사이를 전후로 이동한다는 것을 입증하기 위해 개발된 것이다.
질화규소로부터 두 챔버를 포함하는 나노칩을 제조한다. <4 nm(dsDNA 또는 ssDNA인 경우) 및 2 nm(오직 ssDNA인 경우에만)인 나노포어를 문헌 [Briggs K, et al. Automated fabrication of 2-nm solid-state nanopores for nucleic acid analysis, Small (2014)10(10):2077-86]에 기술된 바와 같이 제조한다. 두 챔버는 '근위' 및 '원위' 챔버로서 지칭되고, 원위 챔버는 DNA의 3' 말단이 접합되는 챔버이다.
ssDNA(2 nm 포어) 및 ssDNA+dsDNA(4 nm 포어)는 나노포어를 통과하지만, 단백질은 통과하지 못하는 것으로 나타났다. 나노포어를 통한 통과는 전류 단절에 의해 검출된다.
DNA의 포어 표면에의 접합: 5' 아미노 변형된 DNA를 카보디이미드 매개 부착을 통해 카복시 코팅된 폴리스티렌 비드(Polysciences, Inc.로부터 입수한 Fluoresbrite® BB Carboxylate Microspheres 0.05 ㎛)에 부착시킨다. DNA의 3' 말단을 비오틴으로 표지화한다. DNA는 앞서 명시된 길이를 가진다.
스트렙트아비딘 접합: 문헌 [Arafat, A. Covalent Biofunctionalization of Silicon Nitride Surfaces. Langmuir (2007) 23 (11): 6233-6244]에 기술된 바와 같이, 질화규소 나노포어 접합 스트렙트아비딘의 '원위' 측에서 표면에의 접합을 수행하였다.
나노포어 인근에의 DNA의 고정화: 완충제 중 폴리스티렌 비드에 접합된 DNA를 '근위' 챔버에 첨가하고, 완충제를 '원위' 챔버에 첨가한다(표준 완충제: 10 mM 트리스 pH 8, 1 mM EDTA, 150 mM KCl). 전류 단절이 관찰될 때까지 (Axon Nanopatch200B 패치 클램프 증폭기 사용) 전압(~100 mV)을 가한다. 50 nm 비드는 나노포어를 통과할 수 없는 바, 이에, DNA 가닥이 통과하고, 비드가 나노포어의 말단로 밀릴 때, 전류는 고도로 단절된다. DNA가 비오틴 결합을 통해 원위 측 상의 고정화된 스트렙트아비딘에 비가역적으로 결합할 때까지, 전류는 1-2 min 동안 유지된다. DNA가 고정화되었는지를 확인하기 위해, 전류를 역전시킨다. DNA가 포어의 안에, 또는 밖에 존재한다면, 상이한 전류가 관찰된다. DNA가 고정화되지 않은 것으로 보인다면, 프로세스를 반복한다.
엔도뉴클레아제를 통한 비드의 유리: DNA가 부착되어 있는 챔버에 제한 효소 완충제 중 제한 효소를 챔버에 첨가한다. 한 실시양태에서, DNA는 단일 가닥이고, 단일 가닥 DNA를 절단하는 효소에 의해 절단가능한 제한 부위를 함유한다. 예컨대, 문헌 [Nishigaki, K., Type II restriction endonucleases cleave single-stranded DNAs in general. Nucleic Acids Res. (1985) 13(16): 5747-5760]을 참조한다. 대안적 실시양태에서, DNA가 부착되어 있는 챔버에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 첨가하고, 여기서, DNA는 부착되고, 30분 동안 하이브리드할 수 있도록 하여 dsDNA를 형성한 후, 이어서, 제한 효소를 첨가한다. 일단 비드가 유리되고 나면, 이를 세척해낸다. 전류를 정방향 및 역방향으로 변환시킴으로써 DNA가 포어 안으로/포어를 통해 밖으로 이동하였는지를 확인한다.
제어된 방식의 전후 이동 입증: 표준 완충제를 사용하여, 신호 단절이 관찰될 때까지 정방향으로 전류를 가한 후, DNA 통과 후, '순방향'으로 복귀시킨다. 신호 단절이 관찰될 때까지 역방향 전류를 가한다. DNA가 포어에 잔존함에 따라, 신호는 순방향으로 복귀하지 못하는 것이 관찰된다. DNA가 나노포어를 통해 전후 이동하는지 여부를 확인하기 위하여 수회의 사이클 동안 정방향 및 역방향으로 전류를 인가하는 것을 반복한다.
실시예
1a: 이산화규소 칩에서
나노포어
인접부에의
DNA 가닥 고정화
이산화규소로부터 나노칩 내벽을 제조한다. 양면 모두 실란화되지만, 올리고뉴클레오티드는 칩 벽의 단 한쪽 면에만 접합되고, 이어서, 나노포어가 생성된다.
실란화 : 칩 벽의 표면을 30℃에서 피라나 용액(상업적으로 이용가능한 각종 브랜드의 것, 이는 일반적으로 황산(H2SO4) 및 과산화수소(H2O2)의 혼합물을 포함하고, 표면으로부터 유기 잔류물을 제거한다)으로 세정하고, 재증류수로 세척한다. 50% 메탄올(MeOH), 47.5% APTES, 2.5% 나노퓨어 H2O로 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES) 스톡 용액을 제조하고, 4℃에서 >1시간 동안 숙성시킨다. 이어서, APTES 스톡을 MeOH 중에 1:500으로 희석시키고, 칩 벽에 가하고, 그와 함께 실온에서 인큐베이션시킨다. 이어서, 칩 벽을 MeOH로 세정하고, 110℃에서 30분 동안 건조시킨다.
접합: 이어서, 칩 벽을 디메틸 술폭시드(DMSO) 중 0.5% w/v의 1,,4-페닐렌 디이소티오시아네이트(PDC) 용액 중에서 실온에서 5시간 동안 인큐베이션시킨다. DMSO로 2회에 걸쳐 짧게 세척하고, 재증류수로 2회에 걸쳐 짧게 세척한다. 이어서, 칩 벽을 재증류수(pH 8) 중 100 nM 아민 변형된 단일 가닥 DNA 올리고머(약 50-mer)와 함께 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨다. 이어서, 칩 벽을 28% 암모니아 용액으로 2회에 걸쳐 세척하여 임의의 비반응 물질을 비활성화하고, 재증류수로 2회에 걸쳐 세척한다. 이어서, 하나 이상의 나노포어가 벽에 생성된다.
일단 나노칩 제조가 완료되고 나면, 약 50 bp 길이의 DNA 올리고머로 내벽을 코팅한다. 이는, ssDNA를 비교적 벌키한 구조(예컨대, 직경이 너무 커서 나노포어에 안맞는 것인, 비드, 단백질, 또는 DNA 오리가미 구조)에 부착시키고(여기서, 표면 결합된 DNA에 상보적인 서열은 벌키한 구조로부터 원위부에 위치한다), 전류를 사용하여 나노포어를 통해 하전된 중합체를 풀링하고, ssDNA가 나노포어에 인접한 상보적인 표면 결합된 DNA 올리고머에 결합할 수 있도록 하고, 벌키한 구조를 절단함으로써 표면 결합된 DNA에 상보적인 말단 말단 서열을 가지는 단일 가닥 DNA가 나노포어로 국재화될 수 있게 한다.
실시예
2: DNA
합성 - 단일 뉴클레오티드 부가
적합한 전류를 인가하고, DNA 이동을 검출함으로써 DNA를 '저장' 챔버로 이동시킨다.
가역적으로 블로킹된 dATP*와 함께, 적절한 완충제 (50 mM 아세트산칼륨, 20 mM 트리스 아세테이트, 10 mM 아세트산마그네슘, pH 7.9(@ 25℃)) 중 말단 트랜스퍼라제 효소(TdT, New England Biolabs)를 '부가' 챔버에 첨가한다. 완충제 또한 '저장' 챔버에 첨가한다.
3' OH 상에 가역성 블록을 가지는 dNTP는 뉴클레오티드를 DNA에 부가하는 데 사용된다. DNA 쇄에 부가되었을 때, 다음 dNTP는, 블로킹된 dNTP가 언블로킹될 때까지는 부가될 수 없다.
탈블로킹은 화학적 또는 효소적인 것일 수 있다. 상이한 접근법이 사용된다:
a. 3' O-알릴: 문헌 [Ju J, Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators. Proc Natl Acad Sci U S A. (2006);103(52):19635-40]에 기술된 바와 같이, 완충제 수용액 중에서 Pd 촉매화된 탈알릴화에 의해; 또는 문헌 [Shankaraiah G., et al., Rapid and selective deallylation of allyl ethers and esters using iodine in polyethylene glycol-400. Green Chem. (2011)13: 2354-2358]에 기술된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜-400 중 아이오딘(10 mol%)을 사용하여 알릴을 제거한다.
b. 3' O-NH2: US 8034923에 기술된 바와 같이, 완충처리된 NaNO2 중에서 아민을 제거한다.
c. 3' 포스페이트. 엔도뉴클레아제 IV(New England Biolabs)로 포스페이트를 가수분해시킨다. 엔도뉴클레아제 IV로 또한 제거될 수 있는 다른 가능한 3' 변형으로는 포스포글리코알데히드 및 데옥시리보스-5-포스페이트를 포함한다.
d. 3' O-Ac: 문헌 [Ud-Dean, A theoretical model for template-free synthesis of long DNA sequence. Syst Synth Biol (2008) 2:67-73]에 기술된 바와 같이, 효소적 가수분해에 의해 아세테이트를 제거한다.
이어서, 적절한 전류를 인가하고, DNA 이동을 검출함으로써 DNA를 '원위' 챔버로 이동시킨다. 완충제를 교체하고, 상기 a. - d.에 기술된 바와 같은 탈블로킹 완충제/용액을 첨가함으로써 DNA를 탈보호화한다.
관심 서열을 제조하기 위해, 원하는 경우, 프로세스를 반복한다.
실시예
3: DNA
합성: 블록 올리고뉴클레오티드 부가
이중 가닥 DNA의 3' 말단은 4 nm 구멍이 있는 나노포어에 인접하게 부착된다. DNA의 5' 말단은 CG(5'에서 3'으로 판독)로 이루어진 오버행을 가진다.
올리고 카세트 A 및 B가 하기와 같이 제조된다:
코드 A 및 코드 B는 각각 정보 서열을 나타낸다. N은 임의의 뉴클레오티드를 지칭한다. 5' 서열은 토포이소머라제 인식 부위를 포함하고, 3' 서열은 Acc1 제한 부위를 포함한다. 올리고는 토포이소머라제에 노출되고, 토포이소머라제는 3' 티미딘에 결합한다:
적절한 전류를 인가하고, DNA 이동을 검출함으로써 DNA를 '근위' 챔버로 이동시킨다. 완충제를 교체하고, 상기 a. - d.에 기술된 바와 같은 탈블로킹 완충제/용액을 첨가함으로써 DNA를 탈보호화한다. 토포이소머라제 장입된 '코드 A' 올리고는 '부가' 챔버에 제공된다. 적절한 전류를 인가하고, DNA 이동을 검출함으로써 DNA를 부가 챔버 내로 이동시키고, 그 결과, 코드 A 올리고는 DNA에 결합되고, Acc1을 '저장' 챔버에 첨가하고, 여기서, Acc1은 제한 부위에서 절단하여 토포이소머라제 라이게이션 부위를 제공한다.
다른 '코드 A' 또는 '코드 B'를 부가하면서, 원하는 서열에 도달할 때까지 프로세스를 반복한다. 새 Acc1을 계속해서 '저장' 챔버에 첨가할 필요는 없고; 코드 A 또는 코드 B로부터 변환시킬 때, '부가' 챔버에서 코드 A 또는 코드 B를 플러싱하여야 한다는 점에만 주의한다.
오직 ssDNA만이 통과할 수 있는 포어를 서열분석하기 위해서는 상기 프로토콜을 일부 변형시켜야 한다. dsDNA가 작은 포어(2 nm)와 조우하게 되면, 오직 ssDNA만이 통과하게 되고, 상보체는 '스트리핑'된다는 것은 이미 공지되어 있다. 따라서, 2 nm 포어를 이용하여 상기 합성을 수행한다면, 적절한 dsDNA가 확실하게 나머지 다른 한쪽에서는 있도록 '리폼'되어야 한다. 이를 수행하기 위해, (확실하게 제한 부위가 생성되도록 하기 위해) "CGAAGGG <코드 A 또는 B> GTCGACNNNNN"(서열 번호 1)을 근위 챔버에 첨가하고, (확실하게 토포 상용성 부위가 생성되도록 하기 위해) "CGAAGGG <코드 A 또는 B> GT"(서열 번호 3)를 원위 챔버에 첨가할 것이다.
상기 방법을 상세하게 설명하면서, 본 발명자들은 각각이 '부가' 및 '탈보호' 단계를 포함하는, (2 비트의 데이터를 나타내는) ≥2 순차적인 부가를 이용하여 DNA 코딩된 정보의 성장하는 DNA 쇄로의 순차적인 '부가'를 입증한다. 최적화 및 개념 입증에 관한 초기 실험은 마이크로튜브에서 수행된다.
본 실시예에 기술된 접근법에서, 1 비트의 정보는 한 스트링의 뉴클레오티드에 코딩된다. '부가되는' DNA 비트는 백시니아 토포이소머라제 I(토포)에 접합된 짧은 dsDNA 서열이다. 적합한 '탈보호화된' '수용자' DNA의 존재하에서, 토포 장입된 DNA '비트'는 토포이소머라제에 의해 수용자에 효소적으로 및 공유적으로 연결되고('부가되고'), 본 프로세스에서 토포이소머라제는 DNA로부터 제거된다. 이어서, 제한 효소는 부가된 비트를 절단하여 그를 '탈보호화'하고, 다음 비트 부가를 위해 적합한 '수용자' 서열을 생성할 수 있다.
토포 장입: 도 22 및 하기에 개략적으로 도시되어 있는 일반적인 장입 방식은 하기와 같고, 여기서, N은 임의의 뉴클레오티드를 나타내고, A, T, G, 및 C는 각각 아데닌, 티민, 구아닌 및 시토신 염기를 가지는 뉴클레오티드를 나타낸다. 서로의 상단에 있는 N은 상보적인 것이다. 본 실시예에서는 제한 효소 HpyCH4III을 사용하였지만, 예컨대, 실시예 4에서 입증된 바와 같이, 기본 전략법은 다른 제한 효소를 이용함으로써 진행될 것이다.
하기 올리고뉴클레오티드는 인터그레이티드 DNA 테크놀러지즈(IDT: Integrated DNA Technologies)로부터 주문받은 것이다. 올리고뉴클레오티드 중 일부의 말단에 있는 "b"는 비오틴을 나타낸다):
올리고뉴클레오티드를 TE 완충제 중에 100 uM로 용해시키고, -20℃에서 보관한다.
하기 기술되는 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 혼합하고, 5분 동안 95℃로 가열한 후, 온도가 20℃에 도달할 때까지 매 3분마다 5℃씩 온도를 하강시킴으로써 하이브리드화된 올리고뉴클레오티드를 제조한다. 하이브리드화된 올리고뉴클레오티드를 4℃ 또는 -20℃에서 보관한다. 올리고뉴클레오티드 조합은 하기와 같다:
B1/2
48 uL B1
48 uL B2
4 uL 5 M NaCl
A5
20 uL TA1
20 uL TA2
5 uL TA3b
4 uL 5 M NaCl
51 uL TE
B5
20 uL TB1
20 uL TB2
5 uL TB3b
4 uL 5 M NaCl
51 uL TE
하기 완충제 및 효소가 본 실시예에서 사용된다:
TE: 10 M 트리스 pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0
WB: 1 M NaCl, 10 mM 트리스 pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0
1x 토포: 20 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 5 mM MgCl2
1x RE: 50 mM K-아세테이트, 20 mM 트리스 아세테이트, 10 mM Mg-아세테이트, 100 ug/ml BSA pH 7.9(@ 25℃).
백시니아 DNA 토포이소머라제 I(토포)는 몬세레이트 바이오테크(Monserate Biotech)(10,000 U/mL)로부터 구입한 것이다.
HypCH4III은 NEB로부터 구입한 것이다.
스트렙트아비딘 코팅된 자기 비드(s- MagBead: Streptavidin-coated magnetic bead)는 써모피셔(ThermoFisher)로부터 구입한 것이다.
수용자는 하기와 같이 제조된다: 5 uL의 s-magbead를 200 uL WB 중에서 1회에 걸쳐 세척한다(결합 시간 1분). 5 uL B1/2 + 195 uL WB를 비드에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킨 후, 200 uL WB로 1회에 걸쳐 세척한 후, 200 uL 1x 토포로 1회에 걸쳐 세척하고, 150 uL의 1x 토포 중에 재현탁시킨다.
토포 장입된 A5(도 20 참조)는 하기와 같이 제조된다: 4 uL 10x 토포 완충제 + 23 uL 물 + 8 uL A5 + 5 uL 토포를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, (200 uL WB로 1x, 200 uL 1x 토포로 1x 세척되고, 150 uL 1x 토포 중에 재현탁된) 5 uL s-magbead에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 결합될 수 있게 한다.
장입된 A5의 수용자에의 '부가': s-magbead를 토포 장입된 A5로부터 제거하고, 수용자에 부가하고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨다. 분취량을 제거하고, TE 중에서 1/200으로 희석시키고, -20℃에서 보관한다.
탈보호화: 물질을 200 uL의 1x RE로 1회 세척하였을 때, 200 uL의 WB로 1회 세척하고, 15 uL 10x RE 및 120 uL 물 중에 재현탁시킨다). 15 uL HypCH4III을 첨가한다. 혼합물을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨 후, 200 uL WB로 1회 세척하고, 200 uL 1x 토포로 1회 세척하여, 본 발명자들이 '수용자-A5'라고 명명하는 생성물을 수득한다.
토포 장입된 B5(도 21 참조)는 하기와 같이 제조된다: 4 uL 10x 토포 완충제. 23 uL 물 및 8 uL B5 + 5 uL 토포를 조합하고, 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시킨다. 생성물을 (200 uL WB로 1회, 200 uL 1x 토포로 1회 세척되고, 150 uL 1x 토포 중에 재현탁된) 5 uL s-magbead에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 결합될 수 있게 한다.
장입된 B5의 수용자-A5에의 '부가': s-magbead를 토포 장입된 B5로부터 제거하고, 수용자-A5에 부가하고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 분취량을 제거하고, TE 중에서 1/200으로 희석시키고, -20℃에서 보관한다.
탈보호화: 물질을 200 uL의 WB로 1회 세척한 후, 200 uL의 1x RE로 1회 세척하고, 15 uL 10x RE 및 120 uL 물 중에 재현탁시킨다. 15 uL HypCH4III을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨다.
진행된 상기 반응이 A5(부가된 A5를 포함하는 수용자: 도식에서 단계 iii, '부가된 A5') 및 B5(부가된 B5를 포함하는 수용자-A5: 도식에서 단계 vi, '부가된 B5)로부터의 분취물의 PCR에 의해 제공된다는 것에 관한 확인. '주형 없음'은 A5에 대한 음성 대조군으로서 사용되고, A5는 B5에 대한 음성 대조군으로서 사용되고, 올리고 BAB는 B5에 대한 양성 대조군으로서 사용된다. A5 PCR에 대한 생성물의 예상 크기는 68 bp이고, B5 PCR에 대한 생성물의 예상 크기는 57 bp이다(B1/2 또한 겔 상에서 전개되었고, 예상 크기는 ~47 bp이지만, 오버행이 존재하고, 비오티닐화된 것이기 때문에, 그의 크기는 근사치일 수 있다). PCR 반응(95/55/68(각 1분씩)로 30 사이클)을 하기와 같이 수행한다:
4-20% 트리스-글리신 겔을 이용하는 SDS-PAGE를 사용하여 예상 크기의 올리고뉴클레오티드가 제조되었는지 여부를 확인한다. 하기 기술된 바와 같이 장입를 수행하되, 단, 장입(37℃에서의 인큐베이션 단계) 직후, 로딩 완충제를 혼합하고, 샘플을 2분 동안 70℃로 가열하고, 겔을 전개시키기 이전에 냉각시킬 수 있다. 겔을 쿠마시로 염색한다. 음성 대조군의 경우, 토포 대신 물을 반응에 첨가한다. 도 30은 A5 PCR 및 B5 PCR에 대한 예상된 생성물 크기에 상응하는 밴드를 명확하게 보여주는 결과를 도시한 것이다.
이로써, 토포이소머라제 장입된 DNA 카세트를 통한 DNA 비트 부가 및 제한 효소를 통해 수행되는 탈보호화는 실현가능한 것으로 밝혀졌다. 본 개념 입증 실험에서, DNA는 스트렙트아비딘 접합된 자기 비드를 통해 고정화되고, 순차적으로 상이한 반응 믹스로 이동하지만, 나노포어 칩 포맷에서는, 본 발명자들은 별개의 반응 챔버를 생성하고, 전류를 사용하여 DNA를 상기 상이한 반응 챔버로 이동시킨다.
마지막으로, PCR은 정보의 '비트'에 상응하는 DNA 서열의 순차적인 부가를 수행하였을 때, 예상 DNA 서열이 생성된다는 것을 입증한다. 본 반응은 디자인된 바와 같이 작동하였고, 심지어 최소로 최적화된 경우에도 그러하였다.
실시예 2 및 3에 기술된 바와 같이 제조된 DNA를 회수하고, 시판용 나노포어 서열분석기(Oxford Nanopore로부터의 MinION)를 사용하여 서열분석함으로써 원하는 서열이 수득되었는지 여부를 확인한다.
실시예
4 - DNA 합성:
상이한
제한 효소를 이용한, 블록 올리고뉴클레오티드 부가
실시예 3과 유사한 방식으로, 단, 'ACGCGT'에서 절단하는 제한 효소 MluI를 사용하여 하기 합성을 수행함으로써 하기를 형성한다:
본 실시예에서, 토포를 장입하여 장입된 토포가 DNA를, MluI로 절단된 DNA로 전달할 수 있는 서열 상보성을 가지는 복합체를 형성한다:
이어서, 선행 실시예와 유사한 프로세스에 의해, 장입된 토포를 사용하여 올리고머를, 합성 중이고, 상보적인 수용자 서열을 가지는 가닥의 5' 말단에 부가함으로써 토포를 유리시키고, 이어서, MluI를 사용하여 가닥을 "탈보호화"하고, 올리고머의 원하는 서열을 수득할 때까지, 사이클을 반복한다.
실시예
5 -
토포이소머라제
전략법을 이용한 단일 염기 부가
본 발명자들은 ('카세트'를 부가하는 것을 기술하는 실시예 3과 비교하여) 단일 염기를 단일 가닥 DNA 쇄에 부가하는 토포이소머라제 시스템 또한 디자인할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. '부가되는' DNA 비트는 백시니아 토포이소머라제 I(토포)에 접합된 짧은 DNA 서열에 함유되어 있다. 적합한 단일 가닥 '탈보호화된' '수용자' DNA의 존재하에서, 토포 장입된 DNA는 토포이소머라제에 의해 수용자에 효소적으로 및 공유적으로 연결되고('부가되고'), 본 프로세스에서 토포이소머라제는 DNA로부터 제거된다. 이어서, 타입 IIS 제한 효소는 단일 염기('부가'되고 있는 염기)를 제외하고, 부가된 DNA 모두를 절단할 수 있다. 탈보호-부가로 이루어진 본 프로세스를 반복하여 추가 염기(비트)를 부가한다.
토포 장입: 실시예 3와 유사한, 일반적인 장입 프로토콜은 하기와 같다:
실시예 3에서와 같이, 서로의 상단에 있는 N은 상보적인 것이다. I는 이노신이다. 비오틴을 사용하여 비반응 생성물 및 부산물을 제거한다. 단일 염기 부가를 하기와 같이 수행한다:
BciVI 제한 효소(굵은체로 표시된 부위)를 사용하여 수행되는 탈보호화는 하기와 같이 도시된다:
하기 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 합성된 것이다(B=비오틴, P-포스페이트, I = 이노신):
올리고뉴클레오티드를 TE 완충제 중에 100 μM로 용해시키고, -20℃에서 보관한다.
하이브리드화: 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 혼합하고, 5분 동안 95℃로 가열한 후, 온도가 20℃에 도달할 때까지 매 3분마다 5℃씩 온도를 하강시킴으로써 하기 하이브리드화된 올리고뉴클레오티드를 제조한다. 하이브리드화된 올리고뉴클레오티드를 4℃ 또는 -20℃에서 보관한다.
NAT1b
/
NAT9cI
/
NAT9x
8 ㎕ NAT1B
10 ㎕ NAT9cI
10 ㎕ NAT9x
48 ㎕ TE
4 ㎕ 5 M NaCl
NAT1/NAT9cI
10 ㎕ NAT1
10 ㎕ NAT9cI
80 uL PBS
NAT1/NAT9
10 ㎕ NAT1
10 ㎕ NAT9
80 uL PBS
완충제 & 효소: 하기 완충제가 사용된다:
TE: 10 M 트리스 pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0
PBS: 포스페이트 완충처리된 염수(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4)(pH 7.4)
10x 컷스마트 ( Cutsmart ): 500 mM KAc, 200 mM 트리스-Ac, 100 mM Mg-Ac, 1 mg/mL BSA pH 7.9
BciVI는 NEB로부터 구입한 것이고, 스트렙트아비딘 코팅된 자기 비드(s-MagBeads)는 써모피셔로부터 구입한 것이다.
부가 반응을 하기와 같이 수행한다.
1. 토포 장입: 시약을 하기 표에 따라 어셈블리한다:
이어서, 시약을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨다. 실온에서 10분 동안 결합할 수 있도록 한 후, 1x 토포 완충제 중 스트렙트아비딘 자기 비드(5 uL)를 사용하여 부산물을 제거한다.
2. 반응: 시약을 하기 표에 따라 어셈블리한다:
이어서, 시약을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨다. 부가 반응은 하기와 같이 진행될 것으로 예상된다:
별표 표시(*)는 토포이소머라제를 나타낸다. NAT9cI는 인산화된 것이지만, 이는 예시 목적으로는 제시되지 않았다는 점에 주의한다.
장입된 토포가 수용자 서열의 존재하에 있을 때, 장입된 토포에서는 하기 반응이 이루어진다:
생성물의 PCR 증폭 및 아가로스 겔 상의 분자량 측정을 통해 예상 생성물이 제조되었음을 확인한다. 밴드가 없는 음성 대조군과 함께, 레인 1(실험)의 올바른 크기의 밴드를 도시한 도 30을 참조한다.
B. 탈보호화 반응: 시약을 하기 표에 따라 어셈블리한다:
이어서, 시약을 37℃에서 90분 동안 인큐베이션시킨다. 탈보호화 반응을 위해, 구입한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 부가 반응의 대표 생성물을 생성하고, BciVI 제한 효소를 이용한 분해에 대하여 시험한다:
절단 부위의 3'이 '정규' 염기와 달리 이노신 시리즈라는 것을 고려하면, 제한 효소가 의도된 바와 같이 DNA를 절단하였는지 여부는 알려지지 않았다. 양성 대조군으로서, '적절하게' 염기쌍을 형성한, NAT1/NAT9cI의 등가물(NAT1/NAT9c)을 제조한다:
생성물의 PCR 증폭 후, 아가로스 겔 상의 분자량 측정을 통해 (도 31) 효소가 의도된 바와 같이 작동한 것으로 나타났다. 양성 대조군의 경우, 분해되지 않았을 때, 더욱 큰 밴드가 관찰되었지만(레인 1), 분해되었을 때에는 더욱 작은 밴드/밴드들이 관찰된다. NAT1/NAT9cI 경우에도 동일한 패턴이 관찰되는데, 이는 이노신의 존재가 분해를 무효화 또는 방해하지 못한다는 것을 나타낸다. NAT1/NAT9cI의 경우에 소량의 분해되지 않은 생성물이 잔존하는 것으로 보이는데, 이는 절단이 적어도 상기 조건하에서는 NAT1/NAT9c 경우에서와 같이 효과가 없다는 것을 제안한다. 완충제 조건을 변경시키고/거나, NAT9cI의 5' 말단에 더 많은 이노신을 부가함으로써 절단 효율을 개선시킬 수 있다.
상기 실시예는 토포/타입 IIS 제한 효소 조합을 사용하여 단일 뉴클레오티드를 표적 단일 가닥 DNA의 5' 말단에 부가하는 것이 실행가능하다는 것을 입증한다. 유사한 프로세스를 사용함으로써 서열 CCCTG를 인식하는 관련된 토포이소머라제, SVF(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8661446)를 이용하여 'T' 대신 'G'를 부가함으로써 T 및 G를 사용하여 이진 정보를 코딩하는 서열을 구성할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 토포이소머라제 전략법을 이용하여 dsDNA를 생성하는 경우, 대향면 가닥 상의 DNA 중의 닉은 ATP와 함께 리가제를 사용하여 수복될 수 있다. 그러나, 본 실시예에서와 같이, 단일 뉴클레오티드 부가를 수행할 때, 본 발명자들은 단일 가닥 DNA를 구축하고 있으며, 이에, 수복되어야 하는 닉은 존재하지 않고, 리가제 사용도 필요로 하지 않는다.
실시예
6 - 5'
포스페이트
커플링과
결합된
,
토포이소머라제
전략법을 이용하는 단일 염기의 부가
단일 염기 부가에 대한 또 다른 접근법에서, 본 발명자들은 3'에서 5' 방향으로의 단일 염기쌍 부가를 제공하기 위해 블로킹 기로서 5' 포스페이트를 이용한다. 장입 반응은 5' 포스페이트 기를 가지는 단일 T(또는 G, 또는 원하는 바와 같은 다른 뉴클레오티드)를 토포이소머라제에 장입한다. 장입된 토포이소머라제가 유리 5' 언블로킹된(인산화되지 않은) 단일 가닥 DNA 쇄를 '발견'하게 되었을 때, T를 상기 쇄에 부가하여 T가 5'에 부가된 DNA를 제공할 것이다. 이러한 부가는 토포이소머라제 및 단일 가닥 수용자 DNA가 결합할 수 있는 서열을 가지는 어댑터 DNA의 존재에 의해 촉진된다(어댑터 DNA는 촉매성이고 - 이는 반복된 반응에서 주형으로서 재사용될 수 있다는 점에 주의한다). 부가된 뉴클레오티드는 그 위에 5' 포스페이트를 가지며, 이에, 5' 포스페이트를 제거하는 포스파타제에 노출될 때까지는 추가의 부가를 위한 기질이 되지 못할 것이다. 토포를 사용하여 표적 단일 가닥 DNA의 5' 말단에 단일 "T"를 부가하고, SVF 토포이소머라제를 사용하여 단일 'G'를 부가하면서 본 프로세스를 반복함으로써, T 및 G를 이용하여 이진 정보를 코딩하는 서열을 구성할 수 있다. 본 프로세스는 하기와 같이 개략적으로 도시된다:
일반적으로:
*****대안적 전달 기전*************
실시예
7 -
나노포어
인접부에의
DNA 부착을 지원하기 위한 DNA
오리가미
사용
한쪽 말단 상에 큰 오리가미 구조를 가지는 DNA 가닥은 나노포어에서 포획되고, DNA 상의 말단 비오틴 모이어티를 통해 표면 접합된 스트렙트아비딘에 고정화된다. 오리가미 구조의 제한 효소 절단 후, 고정화된 DNA는 전류 단절에 의해 확인되는 바와 같이, 포어를 통해 전후로 이동될 수 있다. 고정화함에 따라 단일 DNA 분자를 제어된 방식으로 포어를 통해 이동시킬 수 있고, 최종적으로는 정보의 DNA로의 '판독' 및 '기록,' 둘 모두를 수행할 수 있다.
도 35에 도시된 바와 같이, 합성에서 부가되는 DNA를 고정시키는 역할을 하는 것을 가지는, 2개의 짧은 이중 가닥 영역에 의해 벌키한 부분에 연결된 단일 가닥 영역과 함께, 너무 커서 나노포어에 안맞는 벌키한 이중 가닥 DNA 유니트가 형성된다. 이어서, 단일 가닥 영역은 분리되고, 나노포어에 인접한 표면에 고정될 수 있고, 오리가미 구조는 유리될 수 있다. 도 33을 참조한다.
나노포어는 20 nm SiO2로 된 3 mm 칩에 형성되고, 범위는 50 * 50 ㎛이다. 칩은 나노포어 용액에 의해 제공된다. 나노포어 카세트 홀더 및 유동 셀은 나노포어 용액에 의해 제공된다. 증폭기는 테셀라 피코 2(Tecella Pico 2) 증폭기이다. 이는 제어를 위해 usb-컴퓨터 인터페이스를 이용하는, usb로 전원이 공급되는 증폭기이다. 테셀라는 상기 증폭기를 제어하는 (윈도우스) 소프트웨어를 공급한다. 멀티미터는 0.1 uA 정도로 낮은 전류도 검출할 수 있는, 플루크 17B+ 디지털 멀티미터(FLUKE 17B+ Digital Multimeter)이다. 무선주파수 잡음 스크리닝을 위해, 본 발명자들은 USB 인터페이스가 장착된 콘센트릭 테크놀러지 솔루션즈 TC-5916A 쉴드 박스(Concentric Technology Solutions TC-5916A Shield Box)(패러데이 케이지)를 이용한다. 올리고뉴클레오티드는 IDT.com으로부터 입수한 것이다. "PS"는 http://www.gelest.com/product/o-propargyl-n-triethoxysilylpropylcarbamate-90/로부터의 프로파릴 실란 - O-(프로파르길)-N-(트리에톡시실릴프로필) 카바메이트이다.
오리가미 구조는 각 변이 약 20 nm인 '허니콤형' 입방체 오리가미 구조와 함께 단일 가닥 m13에 기초한다. 각각이 독자적인 제한 부위를 함유하는, 허니콤에 인접한 이중 가닥 영역이 존재한다. 상기 부위 중 하나는 변형된 DNA를 부착시켜 나노포어 인근에 부착시키는 데 사용될 수 있고, 나머지 다른 하나는, 일단 DNA가 부착되고 나면, 오리가미 구조를 절단시키는 데 사용된다.
나노포어 형성: 하기와 같이, 절연 파괴를 사용하여 칩에 나노포어를 형성한다:
1. 칩을 주의하여 카세트에 탑재시킨다.
2. 습윤화: 100% 에탄올을 주의하여 칩 상에서 피펫팅한다. 기포를 제거하여야 한다. 그러나, 칩 상에서 용액을 직접 피펫팅하는 것으로 피해야 하거나, 칩은 균열될 수 있다(SiO2는 단지 20 nm에 불과하다).
3. 표면 처리: 에탄올을 제거하고, 새로 제조된 피라나 용액(75% 황산, 25% 과산화수소(30%))을 칩 상에서 피펫팅한다. (피라나 용액이 실온이 되게 만든다). 30분 동안 방치한다.
4. 증류수로 4회에 걸쳐 세정한다.
5. HK 완충제(10 mM HEPES pH 8, 1 M KCl)로 2회에 걸쳐 세정한다.
6. 카세트를 유동 셀로 어셈블리한다.
7. 700 ㎕ HK 완충제를 유동 셀의 각 챔버에 첨가한다.
8. 증폭기에 부착된 은 전극을 삽입하고, 패러데이 케이지를 닫는다.
9. 300 mV에서 저항을 시험하였다. 어떤 전류도 검출되지 않아야 한다. 검출될 경우, 칩은 균열되었을 수 있으며, 다시 시작하여야 한다.
10. 전극을 6 V의 DC 전류에 연결하고, 멀티미터를 이용하여 전류를 시험한다. 전류는 낮아야 하고, 변하지 않아야 한다. 1.5 V만큼 전압을 증가시키고, 저항이 증가할 때까지, 전압을 유지시킨다. 5-10분 저항이 증가하지 않는다면, 추가로 1.5 V만큼 전압을 증가시키고, 다시 시도한다. 저항이 증가할 때까지 반복하고, 저항이 증가한 지점에서는 즉시 인가된 전압을 중단하여야 한다(전압이 충분할 경우, 절연 파괴가 발생하고, SiO2 막에 '홀'이 생성된다. 홀이 처음 생성되었을 때에는 작지만, 전압이 유지됨에 따라, 그 크기는 증가하게 될 것이다).
11. 증폭기를 사용하여 포어를 시험한다. 300 mV에서, 소수(a few) 내지 몇(several) nm 정도의 전류를 관찰하여야 한다. 전류가 클수록, 포어가 커진다.
도 34는 기본 기능성 나노포어를 도시한 것이다. 각 패널에서, y축은 전류(nA)이고, x축은 시간(s)이다. 좌측 패널 "RF 잡음 스크리닝"은 패러데이 케이지의 유용성을 나타낸 것이다. 나노포어가 없는 칩을 유동 셀에 배치하고, 300 mV를 가한다. 패러데이 케이지의 리드를 닫았을 때(첫 번째 화살표 표시), 잡음이 감소되었음을 관찰할 수 있다. 래치를 닫았을 때(두 번째 화살표 표시), 작은 스파이크가 발생한다. 전류는 ~0 nA인 것에 주의한다. 포어 제조 후(가운데 패널), 300 mV를 인가하면(화살표 표시) ~3.5 nA의 전류가 일어난다. DNA를 접지 챔버에 적용시키고, +300 mV를 인가하였을 때, 전류가 일시적으로 감소함에 따른 DNA 이동(우측 패널)을 관찰할 수 있다(주의, 이 경우, TS 완충제: 50 mM 트리스, pH 8, 1 M NaCl이 사용된다). 본 DNA 이동 실험을 위해 람다 DNA가 사용된다.
염화은
전극:
1. 은 와이어를 절연된 구리 와이어에 납땜한다.
2. 구리 와이어를 접지시키고, 은을 30분 동안 새 30% 하이포아염소산나트륨에 침비시킨다.
3. 은은 암회색 코팅(염화은) 획득하여야 한다.
4. 은 와이어를 증류수를 충분히 세정하고, 건조시킨다.
5. 이제 사용할 준비가 된 상태이다.
비드의 실란화 : 실란화 방법은 SiO2 코팅된 자기 비드(GBioscience) 상에서 최초로 개발되고/시험된 것이다. 하기 프로토콜을 차용한다:
1. 비드를 새 피라나 용액 중에서 30분 동안 전처리한다.
2. 증류수로 3회에 걸쳐 세척한다.
3. 메탄올 중에서 2x 세척한다.
4. APTES 스톡을 메탄올 중에서 1:500으로 희석시킨다.
5. 희석된 APTES를 비드에 첨가하고, RT에서 45분 동안 인큐베이션시킨다.
6. 메탄올로 세정한다.
7. 100℃에서 30분.
8. 진공하에서 보관한다.
실리콘 칩의
실란화
1. 나노포어가 있는 칩을 카세트에 탑재한다.
2. 주의하여 임의의 기포를 제거하면서, 메탄올로 세정한다.
3. (실온으로 평형화된) 새 피라나 용액을 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션시킨다.
4. 증류수로 4x로 세척한다.
5. 메탄올로 3x으로 세척한다.
6. APTES 스톡을 메탄올 중에서 1:500으로 희석시키고, 이를 사용하여 칩을 2x로 세척한다. RT에서 45분 동안 인큐베이션시킨다.
7. 메탄올로 2x로 세정한다.
8. 기류하에서 건조시킨다.
9. 진공하에서 밤새도록 보관한다.
비드의 스트렙트아비딘 접합: 스트렙트아비딘 접합은 상기 제조된 실란화된 비드 상에서 최초로 개발되고/시험된 것이다.
1. 실란화된 비드를 개질된 포스페이트 완충처리된 염수(MPBS: Modified Phosphate-Buffered Saline)로 세척한다.
2. MPBS 중 1.25% 글루타르알데히드의 새 용액을 제조한다(50% 글루타르알데히드 스톡 사용, 냉동 보관).
3. 1.25% 글루타르알데히드를 비드에 첨가하고, 매 15분마다 가볍게 위 아래로 피펫팅하면서, 60' 동안 그대로 놓아둔다.
4. MPBS로 2x로 세척한다.
5. 물로 2x로 세척한다.
6. 진공하에서 건조시킨다.
7. 스트렙트아비딘(MPBS 중 500 ㎍/mL)을 비드에 첨가하고, 60분 동안 인큐베이션시킨다(음성 대조군 비드의 경우, 스트렙트아비딘 대신 우혈청 알부민(BSA: bovine serum albumin)(MPBS 중 2 mg/mL)을 사용한다).
8. 스트렙트아비딘을 제거하고, BSA(MPBS 중 2 mg/mL)를 첨가한다. 60분 동안 인큐베이션시킨다.
9. MPBS 중에서 2x로 세척한다.
10. 4℃에서 보관한다.
실리콘 칩의
스트렙트아비딘
접합
1. 실란화된 칩을 에탄올로 2x로 세정한다.
2. 실란화된 칩을 MPBS로 2x로 세정한다.
3. MPBS 중 1.25% 글루타르알데히드의 새 용액을 제조한다(50% 글루타르알데히드 스톡 사용, 냉동 보관).
4. 칩을 1.25% 글루타르알데히드로 2x로 세정하고, 매 15분마다 가볍게 위 아래로 피펫팅하면서, 60' 동안 그대로 놓아둔다.
5. MPBS로 2x로 세척한다.
6. 물로 2x로 세척한다.
7. 기류하에서 건조시킨다.
8. 칩의 절반부에는 BSA(MPBS 중 2 mg/mL)를 첨가하고, 그 나머지 절반부에는 스트렙트아비딘(MPBS 중 500 ㎍/mL)을 첨가한다. 60분 동안 인큐베이션시킨다. 칩의 어느쪽 절반부가 스트렙트아비딘 변형된 것인지를 표시하기 위해 카세트 상에 마킹한다.
9. 칩의 양쪽 절반부 모두를 BSA(MPBS 중 2 mg/mL)로 세정한다. 60분 동안 인큐베이션시킨다.
10. MPBS 중에서 세척한다.
본원에서 사용된 완충제는 하기와 같다:
MPBS: 8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L 인산나트륨, 0.240 g/L 인산칼륨, 0.2 g/L 폴리소르베이트-20(pH 7.2)
PBS: 8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L 인산나트륨, 0.240 g/L 인산칼륨
TS: 50 mM 트리스 pH 8.0, 1 M NaCl
HK: 10 mM HEPES pH 8.0, 1 M KCl
TE: 10 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 8.0
피라나 용액: 75% 과산화수소(30%) + 25% 황산
APTES 스톡: 50% 메탄올, 47.5% APTES, 2.5% 나노퓨어 물. 4℃에서 적어도 1시간 동안 숙성시킨다. 4℃에서 보관한다.
PDC 스톡: DMSO 중 0.5% w/v 1,4-페닐렌 디이소티오시아네이트.
하기 올리고뉴클레오티드(5' → 3')는 주문된 것이다:
올리고뉴클레오티드 쌍 하이브리드화를 하기와 같이 수행한다:
1. TE 완충제 중에서 올리고의 스톡 용액을 100 uM 농도로 제조한다.
2. 올리고를 PBS 중에서 10 μM으로 희석시킨다.
3. 열순환기에서 5' 동안 85℃로 가열한다.
4. 25℃까지 매 3'마다 5℃씩 열을 감소시킨다.
5. 4℃ 또는 -20℃에서 보관한다.
스트렙트아비딘 접합: SiO2에의 스트렙트아비딘 접합은 SiO2 코팅된 자기 비드를 사용하여 개발되고, 시험된 것이고, 이어서, 상기 프로토콜은 SiO2 칩에 맞게 적합화하였다. 비오티닐화된 올리고의 스트렙트아비딘에의, 및 BSA 접합된 비드에의 결합, 둘 모두를 시험한다. 예상대로, BSA 접합된 비드의 경우, 무시할 수 있는 정도의 결합이 관찰되는 반면, 스트렙트아비딘 접합된 비드의 경우에는 강력한 결합이 관찰된다. 도 38을 참조한다. 고염에서 접합을 수행하는 것이 더욱 편리한 바(DNA 이동은 고염에서 수행된다), HK 완충제 중에서의 비드의 결합 능력 또한 시험한다. HK 완충제 중에서의 결합은 MPBS 완충제 중에서의 결합과 유사하다(도 39).
오리가미 구성물은 도 35-37에서 상기 기술된 바와 같이 제조되고, 작동가능한 것으로 확인된다. 올리고뉴클레오티드를 사용하여 오리가미 구조의 비오티닐화를 시험한다. 본 발명자들은 도 37에 대하여 상기 기술된 '오리가미' 결과로부터 AlwNI 부위가 활성을 띤다는 것을 이미 알고 있다. 오리가미 DNA에서 정확한 서열의 세그먼트를 다시 생성하는 올리고뉴클레오티드 쌍(o1/o3)이 하기에서 사용된다. 오리가미 분자는 하기와 같이 도시된다:
올리고 쌍 o1/o3은 하기와 같다:
DNA는 하기 반응에 따라 T4 DNA 리가제, 및 오리가미 서열의 3'측 상의 오버행에 상보적인 비오티닐화된 올리고(이 자체는, 그 자체가 오리가미의 나머지 다른 한쪽에 부착되는 것인 긴 ssDNA 서열에 부착된다)의 존재하에서 AlwNI로 분해된다:
본 전략법에서, AlwN1은 표적 DNA를 절단한다. 리가제가 첨가될 때, 상기 DNA는 다시 라이게이션될 수 있지만, 제한 효소가 다시 그를 절단할 것이다. 그러나, (o1/o3의) (우측) 단편이 BN1/N2에 결합한다면/결합할 때, 제한 부위는 다시 생성되지 않고, 따라서, 상기 생성물은 절단되지 않을 것이다. 제한 효소의 존재 및 부재하에서 시험함으로써 특이적인 부착을 확인한다:
리가제를 제외한 모든 시약을 첨가하고, 용액을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨다. 리가제를 첨가하고, 용액을 16℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨다. 10x lig buff는 NEB 10x T4 DNA 리가제 완충제를 지칭한다. 리가제는 NEB T4 DNA 리가제이다. o1/o3 및 n1/n2는 상기 도시된 바와 같은, 어닐링된 올리고 쌍을 지칭한다. 단위 ㎕이다. 아가로스 겔 분석을 통해 AlwNI의 존재하에서 긴 ssDNA 아암에 부착되고, 오리가미 구조에 부착되는 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드에 상응하는, 더욱 큰 생성물이 형성되었다는 것을 확인한다. 원하는 경우, 3' 비오티닐화를 위해 유사한 전략법을 사용한다.
상기에서 본 발명자들은 나노포어를 형성할 수 있고, 그를 사용하여 전압 유도성의, 포어 간의 DNA 통과, 그의 원위 말단에서 비오틴에 부착된 긴 ss 영역을 가지는 오리가미 분자의 생성, 및 스트렙트아비딘의 이산화규소에의 접합을 검출할 수 있고, 그를 사용하여 비오티닐화된 DNA를 포획할 수 있는 능력을 입증하였다. 이러한 도구를 사용하여 나노포어 옆의 단일 DNA 분자를 부착시키고, 그의 이동을 제어한다.
제1 단계는 스트렙트아비딘을 SiO2 나노포어의 한쪽 표면에 접합시키는 것이다(그리고, 나머지 다른 한쪽에는 BSA를 접합시키는 것이다). 이는 상기 프로토콜에 따라 달성된다. 생성된 포어는 그가 초기에 가진 것보다 더 낮은 전류를 가지는 경향이 있다. 잠깐의 6 v 펄스 후, 전류는 그의 원래의 전류에 가까운 값으로 복귀하게 된다. 이 지점에서의 기능성 나노포어가 도 40에 제시되어 있다.
이어서, 오리가미 DNA를 삽입한다. 오리가미 DNA가 적절한 챔버에 첨가되고, 전류 전원이 온 상태가 되었을 때, 오리가미는 챔버 내로 삽입될 것이다. 이에 대한 대표도는 도 41에 제시되어 있다. 오리가미가 50 pM의 최종 농도로 도입되었을 때의 실험 결과를 통해 오리가미를 포함하는 DNA가 비교적 빨리(전형적으로, 수초 이내) 포어 내로 삽입된다는 것을 확인할 수 있으며, 이는 그 결과로 나노포어를 가로지르는 전류 흐름이 감소된 것에 의해 검출가능하다(예컨대, 본 실험에서, 오리가미 삽입 이전의 전류는 ~3 nA이고, 삽입 이후에는 ~2.5 nA이다). 전류가 더욱 장시간 흐르도록 허용된다면, 이중 삽입을 관찰할 수 있다. 더 높은 고농도가 사용된다면, 삽입이 너무 빠르게 진행됨에 따라 관찰할 수 없게 된다.
삽입된 DNA의 칩에의 결합. 오리가미가 나노포어 내로 삽입된 후, 전압을 다시 인가하기 전, 15분 동안의 경과 시간을 허용한다. 오리가미의 ssDNA 영역의 말단은 비오틴을 함유하고, 스트렙트아비딘은 나노포어의 표면에 접합된다. 스트렙트아비딘은 공유 결합의 것에 근접한 친화 상수로 아비딘에 결합한다. 15분이라는 시간은 DNA가 확산될 수 있고, 비오틴 말단이 스트렙트아비딘을 찾아 그에 결합할 수 있도록 하는 시간이다. 사실상, DNA가 표면에 부착된다면, 전압이 역전되었을 때, 관찰되는 전류는 앞서 관찰된 것보다 약간 더 작아야 한다. 또한, 전류를 전후로 변환시키면, 그 결과로 전류는 양방향으로 유리 포어의 경우에 관찰된 것보다 더 낮은 전류로 감소되어야 한다. 본원에 제시된 본 실시예에서, 유리 포어는 ~3 nA의 전류를 나타낸다. 도 42는 부착된 DNA의 대표도를 보여주는 것이고, 도 43은 부착된 오리가미 DNA를 변환시키는 전압에 관한 실험 결과를 보여주는 것이다. 양방향으로 관찰된 전류는 ~+/-2.5 nA인데, 이는 유리 포어 경우에서 관찰된 ~+/-3 nA보다 더 낮은 값이라는 점에 주의한다. DNA가 표면에 결합하지 않았다면, 원래의 전류는 전압이 변환되었을 때, 복귀하게 될 것이다(도 44).
오리가미 구조를 제조하기 위해, 오리가미 구조를 함유하는 유동 셀 챔버 중의 완충제를 제거하고, 1 uL Swa1/20°L를 포함하는 1x Swa1 완충제로 교체하였다. 다른 유동 셀 챔버 중의 완충제는 Swa1을 포함하지 않는 1x Swa1 완충제로 교체한다. 이를 실온에서 60분 동안 인큐베이션시킨 후, HK 완충제로 세척하고, 전압을 가한다. 도 45에 제시된 바와 같은 DNA 전후 이동은 도 46의 실험 데이터에 의해 확인할 수 있으며, 이는 고정화된 DNA가 SiO2 나노포어를 통해 제어된 방식으로 이동한다는 것을 보여주는 것이다.
실시예
8 - 중합체를
나노포어에
인접한 표면에 부착시키는 대안적 수단
상기 실시예는 DNA를 비오티닐화하고, 부착 표면을 스트렙트아비딘으로 코팅함으로써 DNA를 나노포어에 인접한 표면에 부착시키는 것을 기술한다. 중합체를 부착시키는 것에 관한 일부 대안적 수단은 도 47에 도시되어 있다.
a) DNA 하이브리드화: 한 방법에서, 본 발명의 방법에서 연장된 DNA는 나노포어 인근에 부착된 짧은 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화된다. 일단 합성이 완료되고 나면, 합성된 DNA는 제한 효소를 필요로 하지 않으면서, 쉽게 제거될 수 있거나, 또는 대안적으로, 결합된 올리고뉴클레오티드 및 합성된 DNA에 의해 형성된 이중 가닥은 제한 효소에 대한 기질을 제공할 수 있다. 본 실시예에서, 짧은 올리고머는 하기와 같이 비오틴-스트렙트아비딘을 사용하여 표면에 접합되거나, 또는 1,4-페닐렌 디이소티오시아네이트를 사용하여 라이게이션된다:
비오티닐화된 DNA의 SiO2에의 접합:
A. 실란화:
1. 전처리: 30분 동안 피라나 용액, 재증류 H2O(ddH2O: double distilled H2O)로 세척한다.
2. APTES 스톡: 50% MeOH, 47.5% APTES, 2.5% 나노퓨어 H2O를 제조한다: 4℃에서 >1hr 동안 숙성시킨다.
3. APTES 스톡을 MeOH 중에서 1:500으로 희석시킨다.
4. 칩을 실온에서 인큐베이션시킨다.
5. MeOH를 세정한다.
6. 건조시킨다.
7. 110℃에서 30분 동안 가열시킨다.
접합:
1. 칩을 5h 동안(실온에서) PDC 스톡으로 처리한다(PDC 스톡: DMSO 중 0.5% w/v 1,4-페닐렌 디이소티오시아네이트).
2. DMSO 중에서 2회에 걸쳐 세척한다(단시간!).
3. ddH2O 중에서 2회에 걸쳐 세척한다(단시간!).
4. O/N 37℃에서 ddH2O(pH 8) 중 100 nM 아미노 변형된 DNA
5. 28% 암모니아 용액 중에서 2회에 걸쳐 세척한다(비활성화)
6. ddH2O로 2회에 걸쳐 세척한다.
부착된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 말단 서열을 가지는 단일 가닥은 상기 기술된 바와 같이 도입되고, 부착된 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화할 수 있도록 허용된다.
b) 클릭 화학법: 클릭 화학법은 간단하고, 열역학적으로 효율적이며, 독성이거나, 또는 고도로 반응성인 부산물을 생성하지 않고, 물 또는 생체적합성 용매 중에서 작동하지 않고, 대개는 선택된 기질을 특이적인 생체분자와 결합시키는 데 사용되는 반응에 대한 일반 용어이다. 이러한 경우, 클릭 접합은 올리고뉴클레오티드를 부착시키는 데 a)에서 사용된 것과 유사한 화학법을 사용하며, 단지 여기서는 본 발명이 방법 중 합성 과정에서 연장되는 중합체를 부착시키는 데 사용된다. 본 실시예에서는 DNA가 중합체이지만, 본 화학법은 상용성 아지드 기의 부가에 의해 관능화되는 다른 중합체를 부착시키는 작업도 할 것이다.
실란화:
1. 전처리: 30' 동안 피라나 용액, ddH2O로 세척한다.
2. PS(프로파르길 실란: propargyl silane) 스톡: 50% MeOH, 47.5% PS, 2.5% 나노퓨어 H2O를 제조한다: 4℃에서 >1hr 동안 숙성시킨다.
3. APTES 스톡을 MeOH 중에서 1:500으로 희석시킨다.
4. 칩을 실온에서 인큐베이션시킨다.
5. MeOH를 세정한다.
6. 건조시킨다.
7. 110℃에서 30분 동안 가열시킨다.
(도 47에 제시된 바와 같이) 아지드 작용기로 종결되는 DNA는 상기 표면에 공유적으로 결합하게 될 것이다. 앞서 DNA에의 비오틴 부가에 대하여 기술된 바와 같이, 아지드 종결 올리고는 정돈되고, 더욱 긴 오리가미 DNA에 부착된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Iridia, Inc.
<120> METHODS, COMPOSITIONS, AND DEVICES FOR INFORMATION STORAGE
<130> DNA-01-PCT
<150> PCT/US2017/020044
<151> 2017-02-28
<150> 62/415,430
<151> 2016-10-31
<150> 62/301,538
<151> 2016-02-29
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Donor Oligonucleotide (synthesized sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(15)
<223> n (located from base position 8 to 15 as 8 'n' and as any
nucleotides) refers to Informational Sequence A or B, which can
be from 3 to 12 nucleotides
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
cgaagggnnn nnnnngtcga cnnnnn 26
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Topoisomerase Ligation Site (synthesized sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(15)
<223> n (located from base position 8 to 15 as 8 'n' and as any
nucleotides) refers to Informational Sequence A or B, which can
be from 3 to 12 nucleotides
<400> 2
cgaagggnnn nnnnngtcga c 21
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide (synthesized sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(15)
<223> n (located from base position 8 to 15 as 8 'n' and as any
nucleotides) refers to Informational Sequence A or B, which can
be from 3 to 12 nucleotides
<400> 3
cgaagggnnn nnnnngt 17
<210> 4
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BAB (synthesized sequence)
<400> 4
cgatagtcta ggcactgttt gctgcgccct tgtccgtgtc gcccttatct acttaagaga 60
tcatacagca ttgcgagtac g 81
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B2 (synthesized sequence)
<400> 5
atctacttaa gagatcatac agcattgcga gtacg 35
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TA2 (synthesized sequence)
<400> 6
agggcgacac ggacagtttg aatcataccg 30
<210> 7
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TA3b (synthesized sequence)
<400> 7
aacttagtat gacggtatga ttcaaactgt ccgtgtcgcc cttattccga tagtgactac 60
agcggcatga g 71
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TB2 (synthesized sequence)
<400> 8
agggcgcagc aaacagtgcc tagactatcg 30
<210> 9
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TB3b (synthesized sequence)
<400> 9
aacttagtat gacgatagtc taggcactgt ttgctgcgcc cttattccga tagtgactac 60
agcggcatga g 71
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FP1 (synthesized sequence)
<400> 10
cacgtactcg caatgct 17
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FP2 (synthesized sequence)
<400> 11
cggtatgatt caaactgtcc g 21
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FP3 (synthesized sequence)
<400> 12
gcccttgtcc gtgtc 15
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NAT1 (synthesized sequence)
<400> 13
cacgtcaggc gtatccatcc cttcacgtac tcgcaatgct gtatggcgat 50
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NAT9x (synthesized sequence)
<400> 14
atcgccatac agcattgcga g 21
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NAT9 (synthesized sequence)
<400> 15
acgtgaaggg atggatacgc ctgacgtg 28
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nat9Acc (synthesized sequence)
<400> 16
cacgtagcag caaacagtgc ctagactatc g 31
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nat1P (synthesized sequence)
<400> 17
cacgtcaggc gtatccatcc 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FP4 (synthesized sequence)
<400> 18
cgatagtcta ggcactgttt g 21
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NAT9c (synthesized sequence)
<400> 19
gtgcagtccg cataggtagg gaagtgca 28
<210> 20
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> o1 (synthesized sequence)
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<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> o3 (synthesized sequence)
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ggaaagcgca gtctctgaat ttac 24
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<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N1 (synthesized sequence)
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cttactggaa cggctatcga tatcgcagca ggacaga 37
<210> 23
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<213> Artificial Sequence
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gtcctgctgc gatatcgata gccgttccag taag 34
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide (synthesized sequence)
<400> 24
ctggaacggt aaattcagag actgcgcttt ccattctggc tttaatg 47
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide (synthesized sequence)
<400> 25
catttaagtc tctgacgcga aagg 24
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<212> DNA
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<223> NAT9cI (synthesized sequence)
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<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> I (located before base position 1) refers to inosine, which
consists of 5 inosine bases, which pair with base position 1
<400> 26
aagggatgga tacgcctgac gtg 23
Claims (20)
- 나노칩에서 2 이상의 별개의 단량체를 포함하는 하전된 중합체를 합성하는 방법으로서, 상기 나노칩은
한 반응 사이클에서 오직 단일 단량체 또는 올리고머만이 부가될 수 있도록, 하나 이상의 단량체 또는 올리고머를 말단이 보호된 형태로 완충제 용액 중의 하전된 중합체에 부가하기 위한 시약을 함유하는 하나 이상의 부가 챔버; 및
완충제 용액은 함유하지만, 하나 이상의 단량체 또는 올리고머를 부가하는 데 필요한 시약 모두를 함유하지는 않는 하나 이상의 저장 챔버
를 포함하고, 챔버들은 하나 이상의 나노포어를 포함하는 하나 이상의 막에 의해 분리되어 있으며,
하전된 중합체는 나노포어를 통과할 수 있고, 하나 이상의 단량체 또는 올리고머의 부가를 위한 시약 중 1 이상은 통과할 수 없으며,
상기 방법은,
a) 제1 말단 및 제2 말단을 가지는 하전된 중합체의 제1 말단을 전기적 인력에 의해 부가 챔버 내로 이동시켜, 단량체 또는 올리고머가 블로킹된 형태로 상기 제1 말단에 부가되도록 하는 것인 단계,
b) 블로킹된 형태의 부가된 단량체 또는 올리고머를 갖는 하전된 중합체의 제1 말단을 저장 챔버 내로 이동시키는 단계,
c) 부가된 단량체 또는 올리고머를 탈블로킹시키는 단계, 및
d) 원하는 중합체 서열을 수득할 때까지 단계 a-c를 반복하는 단계로서, 단계 a)에서 부가되는 단량체 또는 올리고머는 동일하거나 상이한 것인 단계
를 포함하는 것인, 하전된 중합체를 합성하는 방법. - 제1항에 있어서, 하전된 중합체가 DNA인 방법.
- 1 이상의 나노포어를 포함하는 막에 의해 분리된 제1 챔버 및 제2 챔버를 적어도 포함하는 나노칩에서 핵산을 합성하는 방법으로서,
합성은 완충제 용액 중에서 제1 말단 및 제2 말단을 가지는 핵산의 제1 말단에 뉴클레오티드를 부가하는 사이클에 의해 수행되고, 핵산의 제1 말단은 전기적 인력에 의해 (뉴클레오티드 또는 올리고머를 부가할 수 있는 시약을 함유하는) 하나 이상의 부가 챔버와 (뉴클레오티드 또는 올리고머를 부가하는 데 필요한 시약을 함유하지 않는) 하나 이상의 저장 챔버 사이를 이동하며, 챔버들은 각각이 하나 이상의 나노포어를 포함하는 하나 이상의 막에 의해 분리되어 있고, 나노포어는 핵산의 통과를 허용할 정도로 충분히 크지만, 뉴클레오티드를 부가하는 데 필수적인 1 이상의 시약의 통과를 허용하기에는 너무 작은 것인, 핵산을 합성하는 방법. - 제3항에 있어서, 뉴클레오티드를 핵산에 부가하기 위한 시약이 폴리머라제를 포함하는 것인 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 뉴클레오티드가 3' 보호 형태로 부가되고, 저장 챔버는 부가된 뉴클레오티드를 탈보호화할 수 있는 시약을 함유하는 것인 방법.
- 토포이소머라제 장입된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 하나 이상의 부가 챔버, 및 제한 효소 또는 포스파타제를 함유하는 하나 이상의 저장 챔버를 포함하는 나노칩에서 DNA를 합성하는 방법으로서,
상기 챔버들은 상용성 완충제 용액을 또한 함유하고, 1 이상의 나노포어를 포함하는 막에 의해 분리되어 있으며, 나노포어는 토포이소머라제 및 제한 효소 또는 포스파타제가 나노포어를 통과할 수 없을 정도로 충분히 작은 것이고,
상기 합성은 제1 말단 및 제2 말단을 가지는 핵산의 제1 말단에 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 블록을 부가하는 사이클에 의해 수행되며, 핵산의 제1 말단은 전기적 인력에 의해 하나 이상의 부가 챔버와 하나 이상의 저장 챔버 사이를 이동하는 것인, 나노칩에서 DNA를 합성하는 방법. - 제6항에 있어서, 매 사이클에서 단일 뉴클레오티드가 부가되는 것인 방법.
- 단일 뉴클레오티드 또는 올리고머를 DNA 가닥에 3'에서 5' 방향으로 부가함으로써 토포이소머라제 매개 라이게이션을 이용하여 DNA 분자를 합성하는 방법으로서,
(i) DNA 분자를, 원하는 뉴클레오티드 또는 올리고머가 장입된 토포이소머라제와 반응시키는 단계로서, 상기 뉴클레오티드 또는 올리고머는 5' 말단에서 추가의 부가가 일어나지 못하게 블로킹되어 있는 것인 단계, 이어서
(ii) 이렇게 형성된 DNA의 5' 말단을 탈블로킹시키는 단계, 및
원하는 뉴클레오티드 서열을 수득할 때까지 단계 (i) 및 (ii)를 반복하는 단계
를 포함하는, DNA 분자를 합성하는 방법. - 제8항에 있어서, 단일 뉴클레오티드를 3'에서 5' 방향으로 부가하는 단계를 포함하고,
단계 i)에서, 5' 보호 형태의 원하는 뉴클레오티드가 DNA의 5' 말단에 부가되도록, 토포이소머라제에 5' 인산화 형태의 원하는 뉴클레오티드를 장입하고, 단계 ii)에서, 이렇게 형성된 DNA의 5' 말단을, 부가된 뉴클레오티드를 탈인산화함으로써 탈블로킹하는 것인 방법. - 토포이소머라제 결합 부위, 정보 서열, 및 제한 효소에 의해 절단될 때 토포이소머라제 라이게이션 부위를 생성하는 제한 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
- 단일 뉴클레오티드에 접합된 토포이소머라제로서, 토포이소머라제는 뉴클레오티드의 3' 포스페이트를 통해 접합되어 있고, 뉴클레오티드는 5' 위치에서 인산화되는 것인, 단일 뉴클레오티드에 접합된 토포이소머라제.
- 단일 가닥 또는 코딩 서열이 실질적으로 비하이브리드화 염기로 구성된, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 분자.
- 정보를 저장하는 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 2 이상의 별개의 단량체 또는 올리고머를 포함하는 하전된 중합체(핵산 또는 DNA 포함)를 합성하는 단계를 포함하고, 단량체의 서열은 기계 판독 가능한 코드에 상응하는 것인, 정보를 저장하는 방법.
- 제13항에 있어서, 하전된 중합체 또는 하전된 중합체의 카피가, 합성 완료 후 나노칩으로부터 제거되는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 하전된 중합체가, 합성 완료 후 나노칩에 잔존하는 것인 방법.
- 2 이상의 별개의 단량체를 포함하는, 전기적으로 하전된 중합체, 예컨대 DNA를 합성하기 위한 나노칩으로서, 나노칩은 하나 이상의 나노포어를 포함하는 막에 의해 분리되어 있는 제1 및 제2 반응 챔버를 적어도 포함하고, 각각의 반응 챔버는 전기적으로 하전된 중합체를 챔버 내로 끌어들이기 위한 하나 이상의 전극을 포함하며, 상기 제1 반응 챔버는 전해질 매질, 및 단량체 또는 올리고머를 중합체에 부가하기 위한 시약을 추가로 포함하고, 상기 단량체 또는 올리고머는 한 번에 단 하나만이 부가될 수 있도록 보호되어 있으며, 상기 제2 반응 챔버는 전해질 매질, 및 그렇게 부가된 단량체 또는 올리고머를 탈보호화하기 위한 시약을 추가로 포함하고, 나노포어는 중합체의 통과를 허용할 정도로 충분히 크지만, 단량체 또는 올리고머를 중합체에 부가하기 위한 시약 중 1 이상, 및 그렇게 부가된 단량체 또는 올리고머를 탈보호화하기 위한 시약 중 1 이상의 통과를 허용하기에는 너무 작은 것인 나노칩.
- 2 이상의 별개의 단량체를 포함하는, 전기적으로 하전된 중합체, 예컨대 DNA를 서열분석하기 위한 나노칩으로서, 나노칩은 전해질 매질을 포함하고 하나 이상의 나노포어를 포함하는 막에 의해 분리되어 있는 제1 및 제2 반응 챔버를 적어도 포함하고, 각각의 반응 챔버는 막의 대향면에 배치된 적어도 한 쌍의 전극을 포함하며, 전극은 나노포어를 가로질러 무선주파수 맥동 직류를 예컨대 1 MHz 내지 1 GHz, 예컨대 50-200 MHz, 예를 들어 약 100 MHz의 주파수로 제공할 수 있는 정전 용량성 회로에 작동가능하게 연결되어 있고, 예컨대 맥동 직류는 나노포어를 통해 하전된 중합체를 끌어들일 수 있으며, 단량체 서열은 하전된 중합체가 나노포어를 통과함에 따라 나노포어를 가로지르는 정전 용량 변동량을 측정함으로써 결정될 수 있는 것인 나노칩.
- 적어도 2가지 상이한 유형의 단량체를 포함하는 하전된 중합체, 예를 들어 DNA 분자의 단량체 서열을 판독하는 방법으로서,
나노포어를 가로질러 무선주파수 맥동 직류를, 예컨대 1 MHz 내지 1 GHz, 예컨대 50-200 MHz, 예를 들어 약 100 MHz의 주파수로 인가하는 단계를 포함하고, 맥동 직류는 나노포어를 통해 하전된 중합체를 끌어들이며, 단량체 서열은 하전된 중합체가 나노포어를 통과함에 따라 나노포어를 가로지르는 정전 용량 변동량을 측정함으로써 결정되는 것인, 단량체 서열을 판독하는 방법. - 제18항에 있어서, 정전 용량 변동량은 중합체가 나노포어를 통과함에 따라 정전 용량의 변화에 의해 유도되는 무선주파수 신호의 임피던스 변화를 측정함으로써 측정하는 것인 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 2 이상의 별개의 단량체를 포함하는 하전된 중합체의 서열에 코딩된 이진 코드를 판독하는 방법인 방법.
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