JP6456816B2 - ナノ細孔の調製方法およびその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年3月14日出願の米国仮出願第61/781,353号;2012年6月20日出願の米国仮出願第61/662,330号;2012年6月20日出願の米国仮出願第61/662,329号;2012年6月20日出願の米国仮出願第61/662,334号;および2012年4月9日出願の米国仮出願第61/621,981号の利益を主張し、その出願を、その全体において参照により本明細書に組み込む。
この発明は、米国国立衛生研究所により授与された補助金番号HG005109の下で政府支援により行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH2であり、ZがO、SまたはBH3であり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルまたはこれら塩基のうちの1つの誘導体であり、nが1、2、3または4であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有する化合物を提供する。
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH2であり、ZがO、SまたはBH3であり、nが1、2、3または4であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第1の種類の化合物の塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第2の種類の化合物の塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第3の種類の化合物の塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第4の種類の化合物の塩基がチミンもしくはその誘導体またはウラシルもしくはその誘導体であり、各種類の化合物にあるタグが他の3種類の化合物の各々にあるタグと異なる、組成物を提供する。
構造
(a)一本鎖DNAを(i)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;(ii)障壁を越えて電界を印加するための手段と;(iii)電界の変化を測定するための手段と;(iv)細孔に付着している少なくとも1つのポリメラーゼと;(v)細孔に付着している2つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH2であり、ZがO、SまたはBH3であり、塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはこれらの塩基のうち1つの誘導体であり、nが1、2、3または4であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、一本鎖DNAが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、DNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側にある一本鎖DNAのヌクレオチド残基に対して相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖DNAがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との接触を反復して繰り返し、ただし(1)化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、(2)化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと;(b)障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物がプライマーに組み込まれてDNA伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖DNA中のヌクレオチド残基を同定することと;(c)配列決定される一本鎖DNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(a)および(b)を反復して実施することとを含み、それによって、一本鎖DNAのヌクレオチド配列を決定する、方法を提供する。
構造
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH2であり、ZがO、SまたはBH3であり、nが1、2、3または4であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第1の種類の化合物の塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第2の種類の化合物の塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第3の種類の化合物の塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第4の種類の化合物の塩基がウラシルまたはその誘導体であり、各種類の化合物にあるタグが他の3種類の化合物の各々にあるタグと異なり、一本鎖RNAが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、RNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖RNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の一本鎖RNAのヌクレオチド残基に対して化合物が相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物のうちの1つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖RNAがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと;(b)障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物がプライマーに組み込まれてRNA伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖RNA中のヌクレオチド残基を同定することと;(c)配列決定される一本鎖RNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(b)を繰り返し実施することとを含み、それによって、一本鎖RNAのヌクレオチド配列を決定する、方法を提供する。
構造
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH2であり、ZがO、SまたはBH3であり、塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはこれら塩基のうち1つの誘導体であり、nが1、2、3または4であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、一本鎖RNAが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、RNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側にある一本鎖RNAのヌクレオチド残基に対して相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖RNAがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との接触を反復して繰り返し、ただし(1)化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、(2)化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと;(b)障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物がプライマーに組み込まれてRNA伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖RNA中のヌクレオチド残基を同定することと;(c)配列決定される一本鎖RNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(a)および(b)を反復して実施することとを含み、それによって、一本鎖RNAのヌクレオチド配列を決定する、方法を提供する。
参照により組み込まれるべき各個々の出版物または特許出願が具体的および別々に示されるように、この明細書に記載の全ての出版物および特許出願を参照によりここに組み込む。
ナノ細孔を使用して核酸を配列決定する方法、デバイスおよびシステムについて、ここで記載する。本方法は、個々のヌクレオチド組み込み事象、例えば、鋳型に相補的な成長鎖へのヌクレオチドの組み込みによる、を正確に検出することができる。酵素(例えば、DNAポリメラーゼ)は、成長ポリヌクレオチド鎖にヌクレオチドを組み込むことができ、付加されたヌクレオチドは、対応する鋳型核酸鎖に相補的であり、鋳型核酸鎖は、成長鎖にハイブリダイズされている(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR))。これらのヌクレオチド組み込み事象は、ヌクレオチドからタグを遊離し、そのタグがナノ細孔を通り抜け、検出される。各種類のヌクレオチド(すなわち、A、C、G、TまたはU)から固有のタグが遊離するので、このようにして、組み込まれた塩基(すなわち、A、C、G、TまたはU)を同定することができる。
ナノ細孔を用いて核酸分子を配列決定するシステムおよび方法を、ここで提供する。ナノ細孔は、検知回路、例えば集積回路、の検知電極に隣接して配置された膜の中に形成されてもまたはそうでない場合、埋め込まれてもよい。集積回路は、特定用途向け集積回路(ASIC)であってもよい。いくつかの例において、集積回路は、電界効果トランジスタまたは相補型金属酸化膜半導体(CMOS)である。検知回路は、ナノ細孔を有するチップもしくは他のデバイス内に位置していても、またはチップもしくはデバイスと離れている、例えばオフチップ構成でもよい。半導体は任意の半導体であることができ、第IV族(例えば、シリコン)および第III〜V族半導体(例えば、ヒ化ガリウム)を含むが、これに制限されない。
ナノ細孔を使用して、任意に電気的検出を用いて、核酸分子を間接的に配列決定してもよい。間接的配列決定は、重合した核酸分子、例えば、DNAまたはRNAがナノ細孔を通り抜けない任意の方法であってもよい。核酸分子は、少なくとも部分的にはナノ細孔の前庭に位置してもよいが、ナノ細孔の細孔(すなわち、最も狭い部分)には位置しない。核酸分子は、ナノ細孔から任意の適当な距離および/またはそれに近接する範囲内、任意でヌクレオチド組み込み事象から遊離したタグがナノ細孔において検出されるような距離の範囲内、を通過してもよい。
核酸サンプルは、タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を使用して配列決定されてもよい。いくつかの例において、核酸分子を配列決定する方法は、(a)タグ付けされたヌクレオチドを重合させ、個々のヌクレオチドと関連付けられたタグが、重合すると遊離することと、(b)ナノ細孔を用いて、遊離したタグを検出することとを含む。
図5は、複数の核酸分子が、ナノ細孔検出器のアレイ上で配列決定されてもよいことを示している。ここで、各ナノ細孔位置(例えば、501)はナノ細孔を含み、任意でポリメラーゼ酵素および/またはホスファターゼ酵素に付着している。ここでの他の場所に記載される通り、各アレイ位置にセンサも一般にある。
ここで提供される方法は、個々のヌクレオチド組み込み事象(例えば、単一分子事象)を正確に区別することができる。本方法は、単一パスで、−すなわち、所与の核酸分子を再配列決定する必要無しに、個々のヌクレオチド組み込み事象を正確に区別できる。
本方法は、鋳型鎖に相補的な鎖にタグ付けされたヌクレオチドを付加することによって鋳型核酸鎖を配列決定することと、ナノ細孔において、遊離したタグ分子を検出することとを含んでもよい。
図11は、ここで記載の通り、核酸を配列決定するおよび/またはタグ分子を検出するために使用できるナノ細孔デバイス100(または、センサ)の概念図である。脂質二重層を含有するナノ細孔は、抵抗および静電容量によって特徴づけられてもよい。ナノ細孔デバイス100は、伝導性固形基板106の脂質二重層適合性表面104上に形成される脂質二重層102を含み、脂質二重層適合性表面104は、脂質二重層不適合性表面105によって絶縁されていてもよく、伝導性固形基板106は、絶縁材料107によって電気的に絶縁されていてもよく、脂質二重層102は、脂質二重層不適合性表面105上に形成される不定形脂質103に囲まれていてもよい。脂質二重層102に、特徴づけられるタグ分子および/または小さいイオン(例えば、Na+、K+、Ca2+、Cl-)が脂質二重層102の両側の間を通過するのに十分大きなナノ細孔110を有する単一のナノ細孔構造108が埋め込まれていてもよい。水分子の層114は、脂質二重層適合性表面104に吸着していても、脂質二重層102と脂質二重層適合性表面104の間にはさまれていてもよい。親水性脂質二重層適合性表面104に吸着している水性膜114は、脂質二重層適合性表面104上で脂質分子の秩序化を促しても、脂質二重層の形成を促進してもよい。核酸分子112およびタグ付けされたヌクレオチドの溶液を含有するサンプルチャンバ116は、脂質二重層102を覆って設置されてもよい。ナノ細孔110を開孔したままにするために、溶液は、電解質を含有し、最適イオン濃度に緩衝され、最適pHに維持されている水溶液でもよい。デバイスは、脂質二重層を超えて電気的刺激(例えば、電圧バイアス)を与え、脂質二重層の電気的特性(例えば、抵抗、静電容量およびイオン電流の流れ)を検知するために、可変電源120に接続されている一対の電極118(陰極ノード118aおよび陽極ノード118bを含む)を含む。陽極電極118bの表面は、脂質二重層適合性表面104である、またはその一部を形成する。伝導性固形基板106は、電極118のうちの一方と接続していてもその一部を形成していてもよい。デバイス100は、電気的刺激を制御するおよび検出した信号を処理するための電気回路122を含んでいてもよい。いくつかの態様において、可変電源120は、電気回路122の一部として含まれている。電気回路122は、増幅器、積分器、ノイズフィルタ、フィードバック制御論理および/または他の様々な構成要素を含んでいてもよい。電気回路122は、シリコン基板128に一体化された集積電気回路でもよく、メモリ126に接続しているコンピュータプロセッサ124にさらに接続されてもよい。
ナノ細孔検出器のアレイは、別々の部位を高密度で有してもよい。例えば、単位領域当たりの部位(すなわち、密度)が多いことにより、より小さなデバイスの構築が可能になり、そのデバイスは移動可能で、廉価で、または他の有利な特徴を有する。ナノ細孔と検知回路を含む多数の部位により、多数の核酸分子を一度に配列決定可能にすることができる。そのようなシステムにより、核酸サンプルを配列決定するためのスループットを高めおよび/または経費を低減することができる。
ナノ細孔を基礎にした配列決定チップは、アレイとして構成された多数の、独立して動作するまたは別々にアドレス可能なセルを組み込んでもよい。ナノ細孔デバイスは、別々にアドレス可能なナノ細孔のアレイを含むことができる。各別々にアドレス可能なナノ細孔は、別々にアドレス可能な電極を含むことができる。例えば、1,000,000セルのアレイは、1000行のセルx1000列のセルから構築され得る。例えば、ヌクレオチド組み込み事象により遊離したタグがナノ細孔を通過するときに伝導性の差異を測定することによって、このアレイは核酸分子の並列配列決定を可能にすることができる。さらに、この回路の実行により細孔−分子複合体の伝導性特性を決定することが可能になり、特定のタグを区別する際に極めて有益になり得る。
セル回路の一例が、図14Bに示される。印加電圧Vaは、MOSFET電流コンベアゲート1401の前にある演算増幅器1400に印加される。電極1402ならびにデバイスによって検出される核酸および/またはタグの抵抗1403も、ここで示される。
いくつかの例において、テストチップは、各66個のセンサセルからなる4つの別々のグループ(別名バンク)を並べた264個のセンサのアレイを含む。各グループは、各列に22個のセンサ「セル」を持つ3つの「列」に分けられている。「セル」の名は、理想的には二重脂質層から構成されている仮想セルに適切に付与され、挿入されたナノ細孔は、アレイ内の264個のセンサ各々の上に形成される(ただし、デバイスは、そのように設置されたセンサセルの一部しか正常に動作しなくてもよい)。
場合によっては、タグ付けされたヌクレオチドは、ヌクレオチド重合事象において切断され、ナノ細孔を用いて検出することができるタグを含む。タグは、ヌクレオチドの5’−リン酸に付着していてもよい。ある場合には、タグは、発蛍光団ではない。タグは、その電荷、形状、サイズまたはその任意の組合せによって検出可能でもよい。例示的なタグには、様々なポリマーがある。各種類のヌクレオチド(すなわち、A、C、G、T)は、一般に固有のタグを含む。
タグは、ナノ細孔において検出可能な任意の化学基または分子であってもよい。場合によっては、タグは、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含む。
タグを付着させるのに適した任意の方法を使用してもよい。一例として、(a)環状トリメタリン酸を産生できる条件下でヌクレオチド三リン酸をジシクロヘキシルカルボジイミド/ジメチルホルムアミドと接触させることと;(b)工程a)から得られた産物を求核原子と接触させて−OHまたは−NH2官能化化合物を形成することと;(c)タグが末端リン酸に間接的に結合できる条件下で、工程b)の産物を−COR基が付着しているタグと反応させることとによってタグを末端リン酸に付着させ、それによって、ヌクレオチド三リン酸類似体を形成してもよい。
タグは、任意の様式で遊離してもよい。場合によっては、タグは、ポリリン酸に付着しており(例えば、図6)、核酸分子へのヌクレオチドの組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離する。組み込みは、任意でナノ細孔に付着している少なくとも1つのポリメラーゼによって触媒されてもよい。ある場合には、少なくとも1つのホスファターゼ酵素も、細孔に付着している。ホスファターゼ酵素は、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離してもよい。場合によっては、ホスファターゼ酵素は、ポリメラーゼ反応においてポリメラーゼによって生じたピロリン酸が、細孔に入る前にホスファターゼ酵素と相互作用するように位置している。
タグは、ヌクレオチドから遊離した後、ナノ細孔を通り抜けて流れてもよい。ある場合には、電圧を印加して、ナノ細孔を通り抜けてタグを引き寄せる。遊離したタグの少なくとも約85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも99.9または少なくとも99.99%は、ナノ細孔を通り抜け移行してもよい。
本開示の別の側面は、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画とを含む伝導性測定システムを提供する。本システムは、障壁を越えて電界を印加するための手段と、電界の変化を測定するための手段と、細孔に付着している少なくとも1つのポリメラーゼと、細孔に付着している1つ以上のホスファターゼ酵素とをさらに含むことができる。
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH2であり、ZがO、SまたはBH3であり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルまたはこれら塩基のうちの1つの誘導体であり、nが1、2、3または4であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有する化合物。
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH2であり、ZがO、SまたはBH3であり、nが1、2、3または4であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第1の種類の化合物の塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第2の種類の化合物の塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第3の種類の化合物の塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第4の種類の化合物の塩基がチミンもしくはその誘導体またはウラシルもしくはその誘導体であり、各種類の化合物にあるタグが他の3種類の化合物の各々にあるタグと異なる、組成物。
(a)化合物を、(i)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;(ii)障壁を越えて電界を印加するための手段と;(iii)電界の変化を測定するための手段とを含む伝導性測定システムと接触させることと;
(b)化合物が細孔を通り抜けて移行するときに、電界の変化を記録し、電界の変化が、化合物と電解質と細孔との相互作用の結果であり、化合物のサイズ、電荷および組成を示すことと
を含み、それによって、変化と所定の値との相関から化合物のアイデンティティを決定することが可能になる、方法。
(a)化合物を(i)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;(ii)障壁を越えて電界を印加するための手段と;(iii)電界の変化を測定するための手段とを含む伝導性測定システムと接触させることと;
化合物が細孔を通り抜けて移行するときに、電界の変化を記録することと;
電界の変化を、タグおよびタグの前駆体に対応する所定の値と比較することと
を含み、それによって、化合物が、タグであるかまたはその前駆体であるかどうかを決定する、方法。
(a)一本鎖DNAを
(i)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;(ii)障壁を越えて電界を印加するための手段と;(iii)電界の変化を測定するための手段と;(iv)細孔に付着している少なくとも1つのポリメラーゼと;(v)細孔に付着している2つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
と接触させ、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH2であり、ZがO、SまたはBH3であり、nが1、2、3または4であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第1の種類の化合物の塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第2の種類の化合物の塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第3の種類の化合物の塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第4の種類の化合物の塩基がチミンまたはその誘導体であり、各種類の化合物にあるタグが他の3種類の化合物の各々にあるタグと異なり、
一本鎖DNAが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、DNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の一本鎖DNAのヌクレオチド残基に対して化合物が相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物のうちの1つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖DNAがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、
化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、
細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと;
(b)障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物がプライマーに組み込まれてDNA伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖DNA中のヌクレオチド残基を同定することと;
(c)配列決定される一本鎖DNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(b)を繰り返し実施することと
を含み、それによって、一本鎖DNAのヌクレオチド配列を決定する、方法。
(a)一本鎖DNAを
(i)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;(ii)障壁を越えて電界を印加するための手段と;(iii)電界の変化を測定するための手段と;(iv)細孔に付着している少なくとも1つのポリメラーゼと;(v)細孔に付着している2つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
と接触させ、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH2であり、ZがO、SまたはBH3であり、塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはこれらの塩基のうち1つの誘導体であり、nが1、2、3または4であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、
一本鎖DNAが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、DNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側にある一本鎖DNAのヌクレオチド残基に対して化合物が相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖DNAがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、
化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との接触を反復して繰り返し、ただし(1)化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、(2)化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、
化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、
細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと;
(b)障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物がプライマーに組み込まれてDNA伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖DNA中のヌクレオチド残基を同定することと;
(c)配列決定される一本鎖DNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(a)および(b)を反復して実施することと
を含み、それによって、一本鎖DNAのヌクレオチド配列を決定する、方法。
(a)一本鎖RNAを
(i)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;(ii)障壁を越えて電界を印加するための手段と;(iii)電界の変化を測定するための手段と;(iv)細孔に付着している少なくとも1つのポリメラーゼと;(v)細孔に付着している2つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
と接触させ、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH2であり、ZがO、SまたはBH3であり、nが1、2、3または4であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第1の種類の化合物の塩基が、アデニンまたはその誘導体であり、第2の種類の化合物の塩基が、グアニンまたはその誘導体であり、第3の種類の化合物の塩基が、シトシンまたはその誘導体であり、第4の種類の化合物の塩基が、ウラシルまたはその誘導体であり、各種類の化合物にあるタグが、他の3種類の化合物の各々にあるタグと異なり、
一本鎖RNAが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、RNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖RNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の一本鎖RNAのヌクレオチド残基に対して化合物が相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物のうちの1つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖RNAがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、
化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、
細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと;
(b)障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物がプライマーに組み込まれてRNA伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖RNA中のヌクレオチド残基を同定することと;
(c)配列決定される一本鎖RNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(b)を繰り返し実施することと
を含み、それによって、一本鎖RNAのヌクレオチド配列を決定する、方法。
(a)一本鎖RNAを
(i)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;(ii)障壁を越えて電界を印加するための手段と;(iii)電界の変化を測定するための手段と;(iv)細孔に付着している少なくとも1つのポリメラーゼと;(v)細孔に付着している2つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
と接触させ、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH2であり、ZがO、SまたはBH3であり、塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはこれら塩基のうちの1つの誘導体であり、nが1、2、3または4であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、
一本鎖RNAが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、RNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側にある一本鎖RNAのヌクレオチド残基に対して化合物が相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖RNAがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、
化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との接触を反復して繰り返し、ただし(1)化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、(2)化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、
化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、
細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと;
(b)障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物がプライマーに組み込まれてRNA伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖RNA中のヌクレオチド残基を同定することと;
(c)配列決定される一本鎖RNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(a)および(b)を反復して実施することと
を含み、それによって、一本鎖RNAのヌクレオチド配列を決定する、方法。
前記電気的抵抗がある障壁は、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を含み;
前記第1および第2の電解質溶液の少なくとも一方にある、タグを持つ少なくとも1つの化合物と;
前記少なくとも1つの細孔は、印加電位によって前記第1および第2の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており;
前記少なくとも1つの細孔は、化合物からタグを切断してタグを遊離するように構成された特徴部を含み;
イオン電流を測定する手段、ならびに少なくとも1つの細孔がタグによって遮られていない時間およびタグが伝導性の低下したパルスを引き起こす時間も含めて、時系列としてその時間経過を記録する手段と
を含む伝導性測定システム。
少なくとも第1および第2の電解質溶液を分離している電気的抵抗がある障壁と;
前記電気的抵抗がある障壁は、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を含み;
前記第1および第2の電解質溶液の少なくとも一方にある、タグを持つ少なくとも1つの化合物と;
前記少なくとも1つの細孔は、印加電位によって前記第1および第2の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており;
前記少なくとも1つの細孔は、化合物からタグを切断してタグを遊離するように構成された特徴部を含み;
イオン電流を測定する手段、ならびに少なくとも1つの細孔が前記タグによって遮られていない時間および前記タグが伝導性の低下したパルスを引き起こす時間も含めて、前記伝導性時系列を記録する手段と
を含む伝導性測定システムで生成され;
伝導性時系列のセグメントを正確に記述するための前記方法が、
(a)未加工伝導性時系列から推定した、ヒドンマルコフモデルの連続密度の最尤状態配列のビタビ復号と;
(b)開孔伝導性レベルからの逸脱に対する閾値との比較による伝導性の低下したパルスの領域の正確な記述と;
(c)各セグメントに対するイオン電流レベルの中心傾向を推定することによって、または中心傾向とセグメント継続時間を一緒に測定することによって、伝導性の低下したパルスを特徴づける手段とからなる群から選択され、セグメント中心傾向の測定が、
(i)連続密度ヒドンマルコフモデルの一部として伝導性時系列から推定した第1のGMMのガウス成分の平均パラメータと;
(ii)算術平均と;
(iii)トリム平均と;
(iv)中央値と;
(v)サンプル位置の最大事後推定量、またはサンプル位置の最尤推定量と
からなる群から選択される方法。
(b)伝導性時系列のセグメントの中心傾向の推定の経験的確率密度の補間および平滑化、ならびに補間する関数の導関数の平方根によるピーク検出と;
(c)多モード分布推定量のモードを位置指定する別の手段と
の少なくとも1つをさらに含む。
第1の貯蔵部に第1の流体を入れることと;
第2の貯蔵部に第2の流体を入れることと;
前記第1および前記第2の流体の少なくとも一方は、少なくとも1つの化合物を含み、化合物は、タグ付けされたヌクレオチドまたはタグ付けされたヌクレオチドから切断されたタグであり;
前記第1の貯蔵部内の前記第1の流体は、電気的抵抗がある障壁で前記第2の貯蔵部内の前記第2の流体と分離されており;
前記電気的抵抗がある障壁は、少なくとも1つの細孔を含み;
前記第1と前記第2の流体の間の電位により、前記第1の流体、前記少なくとも1つの細孔、および前記第2の流体にイオン電流を流すことと;
前記少なくとも1つの細孔を通って流れるイオン電流およびイオン電流の変化の継続時間を測定することと;
イオン電流の測定は、前記少なくとも1つの細孔と相互作用している化合物によって引き起こされるイオン電流の減少を測定するのに十分な一定の時間実行され;
イオン電流の変化および一定の時間を通じてのイオン電流の変化の継続時間を数理的に解析することによって、化合物の少なくとも1つのパラメータを決定することと
を含み、前記数理解析が、
(a)連続密度ヒドンマルコフモデルの一部として伝導性時系列から推定した第1のGMMのガウス成分の平均パラメータと;
(b)事象平均抽出と;
(c)最尤事象状態割り当てと;
(d)閾値検出および平均化と;
(e)スライディングウインドウ分析と;
(f)算術平均と;
(g)トリム平均と;
(h)中央値と;
(i)サンプル位置の最大事後推定量、またはサンプル位置の最尤推定量と
からなる群から選択される少なくとも1つの工程を含む、方法。
(a)DNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の一本鎖DNAのヌクレオチド残基に対してdNPP類似体が相補的である場合に、DNAポリメラーゼがプライマーへのdNPP類似体のうちの1つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖DNAを、DNAポリメラーゼおよび配列決定されるDNA中のA、T、GまたはCヌクレオチドの各々とそのうちの少なくとも1つがハイブリダイズできる4つのデオキシリボヌクレオチドポリリン酸(dNPP)類似体と接触させ、4つのdNPP類似体の各々は構造:
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンもしくはウラシル、またはこれら塩基のうちの1つ以上の誘導体であり、R1はOHであり、R2はHであり、XはO、NH、SまたはCH2であり、nは1、2、3または4であり、ZはO、SまたはBH3であり、
ただし、(i)各dNPP類似体にある塩基の種類は、他の3つのdNPP類似体の各々にある塩基の種類と異なり、(ii)各dNPP類似体のnの値が他の3つのdNPP類似体の各々のnの値と異なるか、または4つのdNPP類似体の各々のnの値が同じであり、各dNPP類似体にあるタグの種類が他の3つのdNPP類似体の各々にあるタグの種類と異なるかのいずれかであり、dNPP類似体の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離することと;
(b)膜を越えて電圧を印加し、工程(a)において生成したタグが付着しているポリリン酸がナノ細孔を通り抜けて移行することによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどのdNPP類似体がプライマーに組み込まれてDNA伸長産物を形成したかを同定し、電子的変化が、適用可能であるものはどれでも、nの各値に対して、またはタグの各異なる種類に対して異なり、それによって、組み込まれたdNPP類似体に相補的な一本鎖DNA中のヌクレオチド残基を同定できることと;
(c)配列決定される一本鎖DNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(b)を繰り返し実施し、工程(b)の各反復において、工程(a)においてどのdNPP類似体がDNA伸長産物に組み込まれたかを同定し、dNPP類似体が、DNA伸長産物の3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側に位置することと
を含み、それによって、一本鎖DNAのヌクレオチド配列を決定する、方法。
(a)DNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の一本鎖DNAのヌクレオチド残基に対してNPP類似体が相補的である場合に、DNAポリメラーゼがプライマーへのdNPP類似体の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖DNAを、DNAポリメラーゼおよび配列決定されるDNA中のA、T、GまたはCヌクレオチドとハイブリダイズできるデオキシリボヌクレオチドポリリン酸(dNPP)類似体と接触させ、dNPP類似体は構造:
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルもしくはチミン、またはこれら塩基のうちの1つの誘導体であり、R1は−OH、−O−CH2N3または−O−2−ニトロベンジルであり、R2はHであり、XはO、NH、SまたはCH2であり、nは1、2、3または4であり、ZはO、SまたはBH3であり、
dNPP類似体が組み込まれない場合は、dNPP類似体が組み込まれるまで、異なるdNPP類似体との接触を反復して繰り返し、ただし(i)各dNPP類似体にある塩基の種類は、他のdNPP類似体の各々にある塩基の種類と異なり、(ii)各dNPP類似体のnの値が他のdNPP類似体の各々のnの値と異なるか、またはdNPP類似体の各々のnの値が同じであり、各dNPP類似体にあるタグの種類が他のdNPP類似体の各々にあるタグの種類と異なるかのいずれかであり、dNPP類似体の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離することと;
(b)膜を越えて電圧を印加し、工程(a)において生成したタグが付着しているポリリン酸がナノ細孔を通り抜けて移行することによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどのdNPP類似体がプライマーに組み込まれてDNA伸長産物を形成したかを同定し、電子的変化が、適用可能であるものはどれでも、nの各値に対して、またはタグの各異なる種類に対して異なり、それによって、組み込まれたdNPP類似体に相補的な一本鎖DNA中のヌクレオチド残基を同定できることと;
(c)配列決定される一本鎖DNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(a)および(b)を繰り返し実施し、DNA伸長産物の3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の一本鎖DNAのヌクレオチド残基に対して、そのdNPP類似体が相補的である場合に、工程(a)の各反復において、dNPP類似体がDNA伸長産物に組み込まれることと
を含み、それによって、一本鎖DNAのヌクレオチド配列を決定する、方法。
(a)DNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の一本鎖DNAのヌクレオチド残基に対してdNPP類似体が相補的である場合に、DNAポリメラーゼがプライマーへのdNPP類似体のうちの1つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖DNAを、DNAポリメラーゼおよび配列決定されるDNA中のA、T、GまたはCヌクレオチドの各々とそのうちの少なくとも1つがハイブリダイズできる4つのデオキシリボヌクレオチドポリリン酸(dNPP)類似体と接触させ、4つのdNPP類似体の各々は、
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルもしくはチミン、またはこれら塩基のうちの1つ以上の誘導体であり、Yはタグであり、存在する場合、R1はOHであり、存在する場合、R2はHであり、Xは切断可能なリンカーであり、ZはO、SまたはBH3であり、nは1、2、3または4であり、AはO、S、CH2、CHF、CFFまたはNHであり、
ただし(i)各dNPP類似体にある塩基の種類は、他の3つのdNPP類似体の各々にある塩基の種類と異なり、(ii)各dNPP類似体にあるタグの種類が、他の3つのdNPP類似体の各々にあるタグの種類と異なることと;
(b)工程(a)において組み込まれたdNPP類似体からタグを切断することと;
(c)膜を越えて電圧を印加し、工程(b)において切り離されたタグがナノ細孔を通り抜けて移行することによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどのdNPP類似体がプライマーに組み込まれてDNA伸長産物を形成したかを同定し、電子的変化が、タグの各異なる種類について異なり、それによって、組み込まれたdNPP類似体に相補的な一本鎖DNA中のヌクレオチド残基を同定できることと;
(d)配列決定される一本鎖DNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(b)および(c)を繰り返し実施し、工程(c)の各反復において、工程(a)においてDNA伸長産物の3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側にどのdNPP類似体がDNA伸長産物に組み込まれたかを同定することと
を含み、それによって、一本鎖DNAのヌクレオチド配列を決定する、方法。
(a)DNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の一本鎖DNAのヌクレオチド残基に対してdNPP類似体が相補的である場合に、DNAポリメラーゼがプライマーへのdNPP類似体の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖DNAを、DNAポリメラーゼおよび配列決定されるDNA中のA、T、GまたはCヌクレオチドとハイブリダイズできるデオキシリボヌクレオチドポリリン酸(dNPP)類似体と接触させ、dNPP類似体は構造:
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルもしくはチミン、またはこれら塩基のうちの1つの誘導体であり、Yはタグであり、存在する場合、R1はOH、−OCH2N3または−O−2−ニトロベンジルであり、存在する場合、R2はHであり、Xは切断可能なリンカーであり、ZはO、SまたはBH3であり、nは1、2、3または4であり、Aは、O、S、CH2、CHF、CFFまたはNHであり、
dNPP類似体が組み込まれない場合は、dNPP類似体が組み込まれるまで、異なるdNPP類似体との接触を反復して繰り返し、
ただし(i)各dNPP類似体にある塩基の種類は、他のdNPP類似体の各々にある塩基の種類と異なり、(ii)各dNPP類似体にあるタグの種類が、他のdNPP類似体の各々にあるタグの種類と異なることと;
(b)工程(a)において組み込まれたdNPP類似体からタグを切断することと;
(c)膜を越えて電圧を印加し、工程(b)において切り離されたタグがナノ細孔を通り抜けて移行することによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどのdNPP類似体がプライマーに組み込まれてDNA伸長産物を形成したかを同定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれたdNPP類似体に相補的な一本鎖DNA中のヌクレオチド残基を同定できることと;
(d)配列決定される一本鎖DNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(a)から(c)を繰り返し実施し、DNA伸長産物の3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の一本鎖DNAのヌクレオチド残基に対して、そのdNPP類似体が相補的である場合に、工程(a)の各反復において、dNPP類似体がDNA伸長産物に組み込まれることと
を含み、それによって、一本鎖DNAのヌクレオチド配列を決定する、方法。
R1はOHであり、R2はHまたはOHであり、ZはO、SまたはBH3であり、
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンである。
各構造においてnはそれぞれ独立に、1、2、3、または4であり、mはそれぞれ独立に、0〜100の整数であり、mが0であるとき、dNPPの末端リン酸は、構造の左側に示されるヌクレオシドの3’O原子に直接結合されており、nの値は、各種類の塩基で異なる。
Rは置換されているまたは無置換のヒドロカルビルであり、3000ダルトンまでであり、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンである。
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンである。
ただし、mは1〜50の整数であり、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンである。
R1はOHであり、R2はHまたはOHであり、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンである。
タグが末端リン酸に間接的に結合できる条件下で、工程b)の産物を−COR基が付着しているタグと反応させることとを含み、それにより、構造:
R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンである方法。
(a)構造:
R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンであることと;
(b)ヌクレオチド四リン酸類似体を形成できる条件下で、工程a)から得られた産物をモノリン酸基が付着しているタグと接触させることとを含む方法。
(a)構造:
R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンであることと;
(b)ヌクレオチド四リン酸を形成できる条件下で、工程a)から得られた産物をリン酸と接触させることと;
(c)ヌクレオチド四リン酸を1)カルボニルジイミダゾール/ジメチルホルムアミド;2)求核原子、次いで3)NH4OHと接触させて、−OHまたは−NH2官能化化合物を形成することと;
(d)タグが末端リン酸に間接的に結合できる条件下で、工程c)の産物を−COR基が付着しているタグと接触させることとを含み、それによって、ヌクレオチド四リン酸類似体を形成する、方法。
2)構造:
タグが末端リン酸に間接的に結合できる条件下で、工程b)の産物を−COR基が付着しているタグと接触させることとを含み、それにより、構造:
R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンであることとを含む。
(a)構造:
(b)ヌクレオチド四リン酸を形成できる条件下で、工程a)から得られた産物をリン酸と接触させることと;
(c)ヌクレオチド四リン酸をカルボニルジイミダゾール/ジメチルホルムアミドおよびヒドロキシルまたはアミノ基が付着しているタグと接触させて、構造:
R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンである方法。
(a)構造:
R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンであることと;
(b)ヌクレオチド五リン酸類似体を形成できる条件下で、工程a)から得られた産物をピロリン酸基が付着しているタグと接触させることとを含む方法。
(a)構造:
R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンであることと;
(b)ヌクレオチド五リン酸を形成できる条件下で、工程a)から得られた産物をピロリン酸基と接触させることと;
(c)ヌクレオチド五リン酸をカルボニルジイミダゾール/ジメチルホルムアミドおよびヒドロキシルまたはアミノ基が付着しているタグと接触させて、ヌクレオチド五リン酸類似体を形成することとを含む方法。
(a)構造:
R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンであることと;
(b)ヌクレオチド六リン酸類似体を形成できる条件下で、工程a)から得られた産物を三リン酸基が付着しているタグと接触させることとを含む方法。
(a)構造:
R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンであることと;
(b)ヌクレオチド六リン酸を形成できる条件下で、工程a)から得られた産物を三リン酸基と接触させることと;
(c)ヌクレオチド六リン酸をカルボニルジイミダゾール/ジメチルホルムアミドおよびヒドロキシルまたはアミノ基が付着しているタグと接触させて、ヌクレオチド六リン酸類似体を形成することとを含む方法。
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、色素、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチドまたはヘキサヌクレオチドであり、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH2であり、ZがO、SまたはBH3であり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンであり、nが1、2、3または4である化合物。
各構造においてnはそれぞれ独立に、1、2、3、または4であり、mはそれぞれ独立に、0〜100の整数であり、mが0であるとき、dNTPの末端リン酸は、構造の左側に示されるヌクレオシドの3’O原子に直接結合されており、R1は−OHまたは−O−CH2N3であり、R2はHまたはOHである化合物。場合によっては、nの値は、各種類の塩基で異なる。
mが0〜100の整数であり、化合物が1種類の塩基を含み、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルもしくはチミンまたはこれら塩基のうちの1つの誘導体である化合物。
ただし、mは0〜100の整数である。
塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンである化合物。
塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンであり、Rが置換されているまたは無置換のヒドロカルビルであり、3000ダルトンまでである化合物。
nが1または2であり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンである化合物。
R1が−OHまたは−O−CH2N3であり、R2がHまたはOHである化合物。
(a)RNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖RNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の一本鎖RNAのヌクレオチド残基に対してrNPP類似体が相補的である場合に、RNAポリメラーゼがプライマーへのrNPP類似体のうちの1つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖RNAを、RNAポリメラーゼおよび配列決定されるRNA中のA、U、GまたはCヌクレオチドの各々とそのうちの少なくとも1つがハイブリダイズできる4つのリボヌクレオチドポリリン酸(rNPP)類似体と接触させ、4つのrNPP類似体の各々は構造:
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンもしくはウラシル、またはこれら塩基のうちの1つ以上の誘導体であり、R1はOHであり、R2はOHであり、XはO、NH、SまたはCH2であり、nは1、2、3または4であり、ZはO、SまたはBH3であり、ただし、(i)各rNPP類似体にある塩基の種類は、他の3つのrNPP類似体の各々にある塩基の種類と異なり、(ii)各rNPP類似体のnの値が他の3つのrNPP類似体の各々のnの値と異なるか、または4つのrNPP類似体の各々のnの値が同じであり、各rNPP類似体にあるタグの種類が他の3つのrNPP類似体の各々にあるタグの種類と異なるかのいずれかであり、rNPP類似体の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離することと;
(b)膜を越えて電圧を印加し、工程(a)において生成したタグが付着しているポリリン酸がナノ細孔を通り抜けて移行することによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどのrNPP類似体がプライマーに組み込まれてRNA伸長産物を形成したかを同定し、電子的変化が、適用可能であるものはどれでも、nの各値に対して、またはタグの各異なる種類に対して異なり、それによって、組み込まれたrNPP類似体に相補的な一本鎖RNA中のヌクレオチド残基を同定できることと;
(c)配列決定される一本鎖RNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(b)を繰り返し実施し、工程(b)の各反復において、工程(a)においてどのrNPP類似体がRNA伸長産物に組み込まれたかを同定し、rNPP類似体が、RNA伸長産物の3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖RNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側に位置することと
を含み、それによって、一本鎖RNAのヌクレオチド配列を決定する、方法。
(a)RNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖RNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の一本鎖RNAのヌクレオチド残基に対してrNPP類似体が相補的である場合に、RNAポリメラーゼがプライマーへのrNPP類似体の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖RNAを、RNAポリメラーゼおよび配列決定されるRNA中のA、U、GまたはCヌクレオチドとハイブリダイズできるリボヌクレオチドポリリン酸(rNPP)類似体と接触させ、rNPP類似体は構造:
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはこれら塩基のうちの1つの誘導体であり、R1は−OH、−O−CH2N3または−O−2−ニトロベンジルであり、R2は−OHであり、XはO、NH、SまたはCH2であり、nは1、2、3または4であり、ZはO、SまたはBH3であり、rNPP類似体が組み込まれない場合は、rNPP類似体が組み込まれるまで、異なるrNPP類似体との接触を反復して繰り返し、ただし(i)各rNPP類似体にある塩基の種類は、他のrNPP類似体の各々にある塩基の種類と異なり、(ii)各rNPP類似体のnの値が他のrNPP類似体の各々のnの値と異なるか、またはrNPP類似体の各々のnの値が同じであり、各rNPP類似体にあるタグの種類が3つのrNPP類似体の各々にあるタグの種類と異なるかのいずれかであり、rNPP類似体の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離することと;
(b)膜を越えて電圧を印加し、工程(a)において生成したタグが付着しているポリリン酸がナノ細孔を通り抜けて移行することによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどのrNPP類似体がプライマーに組み込まれてRNA伸長産物を形成したかを同定し、電子的変化が、適用可能であるものはどれでも、nの各値に対して異なる、またはタグの各種類に対して異なり、それによって、組み込まれたrNPP類似体に相補的な一本鎖RNA中のヌクレオチド残基を同定できることと;
(c)配列決定される一本鎖RNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(a)および(b)を繰り返し実施し、RNA伸長産物の3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖RNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の一本鎖RNAのヌクレオチド残基に対して、そのrNPP類似体が相補的である場合に、工程(a)の各反復において、rNPP類似体がRNA伸長産物に組み込まれることと
を含み、それによって、一本鎖RNAのヌクレオチド配列を決定する、方法。
nが1または2であり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザプリンまたは5−メチルピリミジンである。
ただし、Wは0〜100の整数である。任意の数のエチレングリコール単位(W)が使用されてもよい。ある場合には、Wは0〜100の整数である。場合によっては、エチレングリコール単位の数は、各種類のヌクレオチドで異なる。一態様において、4種類のヌクレオチドは、16、20、24、または36個のエチレングリコール単位を有するタグを含む。場合によっては、タグは、追加の識別可能な部分、例えばクマリン性色素をさらに含む。
(a)プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした配列決定される一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の配列決定されるDNAのヌクレオチド残基に対してデオキシリボヌクレオチド類似体が相補的である場合に、DNAポリメラーゼがプライマーの伸長産物の末端に類似体の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖DNAをDNAポリメラーゼと、続けて配列決定されるDNA中のA、T、GまたはCヌクレオチドとハイブリダイズできる4つのタグ付けされたデオキシリボヌクレオチド類似体の各々で処理し、類似体が組み込まれない場合は、類似体が組み込まれるまで、異なる類似体との接触を反復して繰り返し、ただし(i)各類似体にある塩基の種類は、他の類似体の各々にある塩基の種類と異なり、(ii)各類似体にあるタグの種類は、他の類似体の各々にあるタグの種類と異なり、類似体の組み込みによりタグが遊離することと;
(b)膜を越えて電圧を印加し、類似体に付着しているタグによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)において伸長産物に組み込まれた類似体を同定することと;
(c)工程(a)および(b)を繰り返し実施することと
を含み、それによって、一本鎖DNAのヌクレオチド配列を得る、方法。
(a)プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした配列決定される一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の配列決定されるDNAのヌクレオチド残基に対してデオキシリボヌクレオチド類似体が相補的である場合に、DNAポリメラーゼがプライマーの伸長産物の末端に類似体の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖DNAを、DNAポリメラーゼおよび配列決定されるDNA中のA、T、GまたはCヌクレオチドの各々とそのうち少なくとも1つがハイブリダイズできる4つの3’遮断デオキシリボヌクレオチド類似体で処理し、各類似体が、可逆性ターミネーターを含み、ただし、(i)各類似体にある塩基の種類は、他の3つの類似体の各々にある塩基の種類と異なり、(ii)各類似体にあるタグが、他の3つの類似体の各々にあるタグと異なり、類似体の組み込みによりタグが遊離することと;
(b)膜を越えて電圧を印加し、類似体に付着しているタグによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)において伸長産物に組み込まれた類似体を同定することと;
(c)工程(a)において伸長産物に組み込まれた類似体から可逆性ターミネーターを除去することと;
(d)工程(b)および(c)を繰り返し実施することと
を含み、それによって、一本鎖DNAのヌクレオチド配列を得る、方法。
ここで開示される本発明は、ナノ細孔を使用するDNA(またはRNA、必要な変更を加える)の単一分子分析のための修飾ヌクレオチドに関する。ヌクレオチドの様々な位置、すなわち末端リン酸、塩基、および/または2’もしくは3’−OHに修正を作って、ヌクレオチド類似体を形成することができる。鋳型−プライマー複合体におけるポリメラーゼ伸長反応の後に、遊離した、タグが付着しているピロリン酸はナノ細孔を通り抜け、得られた電流遮断をモニタリングして付加されたヌクレオチド塩基を決定する。修正もしくはタグが、ヌクレオチドの塩基部分、または糖部分の2’/3’−OHにある場合、そのときDNA/RNAポリメラーゼによる組み込みの後に、リンカー−タグは化学的または光化学的手段により塩基/糖から切断され、遊離したリンカー−タグがナノ細孔を通り抜けて、付加されたヌクレオチドが同定される。
核酸配列決定システムおよび開示の方法は、コンピュータシステムを用いて管理されてもよい。図18は、核酸配列決定システム1802に接続されたコンピュータシステム1801を含むシステム1800を示す。コンピュータシステム1801は、1つのサーバまたは複数のサーバであってもよい。コンピュータシステム1801は、サンプル調製および処理ならびに配列決定システム1802による核酸配列決定を調節するようにプログラムされてもよい。ここでの他の場所に記載されるように、配列決定システム1802は、ナノ細孔型シーケンサ(または、検出器)でもよい。
例1
I.改変ヌクレオチドの設計および合成
ナノ細孔により生成された電気的遮断信号に対するタグ付ポリリン酸のかさ高さの効果を、ヌクレオチドの末端リン酸に結合した異なるサイズのタグまたは基を有する様々なリン酸結合ヌクレオチドを用いて決定する。4つのリン酸タグ付ヌクレオシド−5’−ポリリン酸の構造を図23に示す。最初に、一連のヌクレオシド−5’−三、四、五および六リン酸を合成する。これらのヌクレオチドにおいて、末端リン酸は、異なるタグ、例えば、異なる長さおよびマスエチレングリコールまたは遊離したポリリン酸のかさ高さもしくは電荷を増加させる他の分子が結合されたリンカーと結合される。これらのヌクレオチドを、ナノ細孔を用いて試験して、末端リン酸に結合したどのタグまたはかさ高い基が異なる塩基間の電気的遮断信号におけるより劇的な差異と相関するのかを決定する。
a.末端リン酸タグ付ヌクレオシド−5’−三リン酸
図24に示されるように、末端リン酸タグ付ヌクレオシド−5’−三リン酸を、対応するdNTPをDCC/DMFと反応させて、環状トリメタリン酸を得ることにより合成し、これを適切な求核試薬で開環して、タグまたはリンカーに結合したヌクレオシド−5’−三リン酸を得ることができる。これを、鋳型−プライマー伸長反応において使用し、遊離したタグ結合ピロリン酸をナノ細孔を用いて読み取ることができる。あるいは、リン酸に結合したリンカーを、タグ−NHSエステルと反応させて、代替的なタグ結合ヌクレオシド−5’−三リン酸を提供することができる。
末端リン酸タグ付ヌクレオシド−5’−四リン酸の合成のために、対応する三リン酸を最初にDMF中のCDIと反応させて、末端リン酸基を活性化した後、リン酸またはタグ−モノリン酸と反応させて、四リン酸を得る(図25)。四リン酸上の末端リン酸をCDIでさらに活性化した後、好適な求核試薬と反応させて、リンカー結合四リン酸を提供し、これをさらに用いて、異なる質量、長さまたはかさ高さのタグ、例えば、図25にも示される、m−dPEG−NHSエステルに結合させることができる。
末端リン酸タグ付ヌクレオシド−5’−五および六リン酸の合成は、図26に示されるものと同じ原理に従う。それらを、リン酸、ピロリン酸またはタグ結合リン酸と反応させることにより活性化された三リン酸または四リン酸から調製することができる。あるいは、リンカーを、五または六リン酸に結合させた後、活性化されたNHSエステルと反応させることができる。
ナノ細孔配列決定に対する現在の手法に関しては、例えば、ナノ細孔を通過し、核酸塩基の認識を可能にする輸送の速度または比率が登録される時の塩基の認識などのいくつかの問題が存在する。DNAは1〜5μsの速度でα−溶血素のナノ細孔を通過し、これは単一分子配列決定実験を記録するには速すぎる。分子ブレーキの使用を含む様々なタンパク質工学戦略によりこれらの問題を克服するいくらかの進歩が為された(短い共有結合したオリゴヌクレオチド)(Bayley,H.2006)。
末端リン酸またはヌクレオシド塩基部分および反応することができる基上の反応基の特定例を、表1に提供する。それらが反応することができる反応基は、リンカー上またはタグ上のいずれかに存在してもよい。
合成によるDNA配列決定(SBS)のための様々なヌクレオチド可逆性ターミネーター(NRT)を合成し、蛍光染料をヌクレオチド塩基およびヌクレオチドの3’−OHに結合させる切断性リンカーを、小さい可逆性ターミネーター基で遮断する(Juら、2006、Guoら、2008および2010)。これらのNRTを用いて、DNA合成をそれぞれの位置で可逆的に停止させる。組込まれた塩基からの蛍光信号を記録した後、組込まれたヌクレオチドの切断可能部分を除去し、サイクルを反復する。
4つ全部の3’改変ヌクレオシド−5’−三リン酸の合成を実行することができる(Guoら、2008、Liら、2003、Seoら、2004)。3’−O−2−ニトロベンジルおよび3’−O−アジドメチル結合dNTP(それぞれ、図29Aおよび29B)は、DNAポリメラーゼのための良好な基質である。配列決定反応におけるDNA/RNAポリメラーゼによる組込み後、これらの3’−O−タグ付ヌクレオチドは、3’−OHでの遮断基のため、単一塩基伸長後に合成を終結する。さらなる伸長は、3’−O位置からの遮断基の切断後にのみ可能である。3’−O−2−ニトロベンジル基をUV光によって、2’−O−アジドメチルをTCEPを用いる処理によって効率的に切断して、さらなる伸長のための遊離OH基を生成することができる。反応に由来する切断産物(図29Cまたは29D)を、ナノ細孔を通過させ、信号を記録することにより電気的遮断についてモニタリングする。1つがDNAの4つの塩基のそれぞれのためのものである、4つの異なる置換ニトロベンジル保護dNTPおよび4つの異なるアジドメチル置換dNTPを合成する。
1)リン酸タグ付ヌクレオチド
上記の末端リン酸タグ付ヌクレオシドポリリン酸をポリメラーゼ反応において用いて、伸長産物を生成する。図30に示されるように、ポリメラーゼ反応後、リン酸タグ付ヌクレオチドの遊離した副産物、タグ−ポリリン酸が得られ、伸長したDNAはいかなる改変物も含まない。次いで、遊離したタグ−ポリリン酸を、配列決定分析のためのシングルチャンネル記録技術により操作されたナノ細孔において用いる。遊離したタグ−ポリリン酸をアルカリホスファターゼで処理して、検出することもできる遊離タグを提供することもできる。質量、電荷またはかさが異なる4つの異なるタグ付ポリリン酸を生成するために4つのヌクレオチド(A、T、GおよびC)のための4つの異なるタグを用いて、DNAの配列を決定することができる。
合成(SBS)によるDNA配列決定および単一分子配列決定のための塩基タグ付ヌクレオチド三リン酸を合成する(Guoら、2008および2010)。ピリミジン(CおよびT)の5位ならびに7−デアザプリン(GおよびA)の7位での大きいかさ高い基の付加は、DNAポリメラーゼ反応における2個以上のヌクレオチドの付加を遮断することができる。ヌクレオチド塩基に結合した切断可能リンカー、かさ高い基、および異なる電荷を有する改変ヌクレオチドを合成する。改変ヌクレオチドはまた、ヌクレオチドの3’−OHに小さい遮断基を有してもよい。これらの改変ヌクレオチドを、ポリメラーゼ伸長反応において用いる。図31に示されるように、適切なヌクレオチドを用いる伸長後に、ヌクレオチド塩基および糖の3’−Oに由来するリンカーおよびタグを、遮断される場合、化学的または光化学的手段によって切断し、遊離したリンカー−タグを、配列決定分析のためのシングルチャンネル記録技術によって操作されたナノ細孔中で用いる。
リンカーおよびタグを、ヌクレオチドの2’−または3’−OHに結合させることもできる。ポリメラーゼ伸長反応の後、リンカー−タグを、化学的、光化学的または酵素的反応によって伸長産物から切断し、さらなる伸長のために遊離3’−OHを遊離する。図32に示されるように、次いで、遊離したリンカー−タグを、配列決定分析のためのシングルチャンネル記録技術によって操作されたナノ細孔中で用いる。
ナノ細孔を用いるDNA配列決定における異なるヌクレオチドの識別は、図30〜32に示される戦略に従って評価される。DNA中の4つの異なるリンカー−タグを区別するナノ細孔の能力を検証するために、図33に示される一連の実験を実施する。DNA/RNAポリメラーゼをナノ細孔に結合させることができ、配列決定しようとする鋳型をプライマーに沿って付加する。DNA鋳型またはプライマーのいずれかを、ナノ細孔の頂部に固定することもでき、次いで、DNAポリメラーゼの付加の際に鋳型−プライマー複合体を形成する。この鋳型−プライマー複合体に、4つの異なるようにタグ付けられたヌクレオチドを一緒に、または連続的に付加する。正確なヌクレオチドのポリメラーゼにより触媒された組込みの後、付加されたヌクレオチドはタグに結合したポリリン酸(末端リン酸標識ヌクレオチドの場合)を遊離し、次いで、ナノ細孔を通過して、付加された塩基を同定するために記録および使用される電気信号を生成する。任意に、遊離したタグ−ポリリン酸をアルカリホスファターゼで処理して、遊離タグを提供し、これをナノ細孔を通過させることによって検出することもできる。それぞれのタグは、サイズ、質量または電荷の差異のため、異なる電気的遮断特徴を生成する。塩基改変または2’/3’−改変ヌクレオチドの場合、DNA/RNAポリメラーゼ伸長の後、伸長したプライマーに由来するタグを化学的、光化学的または酵素的手段によって切断し、遊離したタグの電気的特徴をモニタリングする。タグの形状、サイズ、質量、電荷または他の特性を、要件に従って調整することができる。
I.PEG標識デオキシグアノシン−5’−四リン酸(dG4P−PEG)の合成:
PEG標識デオキシグアノシン−5’−四リン酸(dG4P−PEG)を、図38に従って合成する。最初に、2’−デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)は、DMF中のCDIと反応して、末端リン酸基を活性化した後、ジブチルアンモニウムリン酸と反応して四リン酸を与える。この四リン酸上の末端リン酸を、0.1Mイミダゾールバッファー中のEDACでさらに活性化した後、ジアミノヘプタンと反応させて、アミノ結合四リン酸を提供し、これをmPEG−NHSエステルとさらに反応させて、必要な4つのPEG−dG4Pを提供する。ポリメラーゼ組込みの後、遊離したPEG上の正味の電荷は、−3である(PEG−NH−三リン酸)。
dG4P−PEGを、表IIに示されるようなMALDI−TOF質量分光法により特徴づける。
ヌクレオチドを標識するために用いられるPEGのナノ細孔による単一分子検出
ポリ(エチレングリコール)は、カチオンに弱く結合する非電解質ポリマーである(例えば、それは約2MのKdでK+イオンに結合する)。かくして、ポリマー上の正味の電荷は、移動性カチオン濃度およびそれに化学的に連結される他の部分の存在に依存する。単一α−溶血素ナノ細孔は、モノマー分解よりも良好に、すなわち、44g/molより良好に異なるサイズのPEGポリマー間を容易に区別することができることが示されている(Reinerら、2010;Robertsonら、2007)。ポリマーが体積排除に起因して、およびさもなければ細孔を自由に流動することができる移動性カチオンに結合することにより、細孔の伝導性を減少させる(細孔の伝導性はポリマーサイズの増加と共に減少する)ため、その識別レベルが可能となる(Reinerら、2010)。さらに、細孔中でのポリマーの滞留時間は、ポリマーの電荷に対して高感度であり、PEGについては、ポリマーの長さに比例して拡大する。ナノ細孔は、他の部分に化学的に連結されたサイズが異なるPEG間を区別することができるべきである。ヌクレオチドを標識するためのPEG(PEG16、24、37および49)は、ナノ細孔上で試験され、図40に示されるように単一分子レベルで異なる電気的遮断特徴を生成する。
最近、ポリエチレングリコール(PEG)分子が単一α−溶血素細孔に進入する時、それが特徴的な平均滞留時間で異なる質量依存的伝導状態を惹起することが示された(Robertsonら、2007)。図41Aは、伝導性に基づく質量スペクトルがエチレングリコールの反復単位を明確に分解し、滞留時間がPEGの質量と共に増大することを示す。
異なる長さおよび分子量のPEG(Quanta Biodesign Ltdまたは他の供給業者から市販されている)を選択し、例2に記載のようにナノ細孔遮断特徴をモニタリングする。図41Aに示されるように、28〜48個のエチレングリコール単位のPEGが、ナノ細孔によって明確に区別される。従って、非常に異なるナノ細孔遮断信号を示す広範囲のエチレングリコール単位を有するPEGをタグとして選択して、ヌクレオチドA、C、GおよびTを標識する。例を図41Bに示す。タグとしての分枝状PEGはより直接的な様式で正の電荷を用いて改変することができるため、それらも評価する。いくつかの直鎖状および分枝状PEGの構造を、図41の下部に示す。
ナノ細孔配列決定において、ナノ細孔中での電流遮断信号は、ポリメラーゼ反応中に遊離したPEG−リン酸により生成される。かくして、本発明者らは、正に帯電したリンカーを有するリン酸標識PEGを設計および合成し、有機(例えば、α−溶血素)および合成(固相)ナノ細孔を用いてこれらの分子を試験して、その電流遮断信号を評価する。選択されたPEGを、図42に示されるようにその三リン酸に変換する。例えば、Fmoc保護されたアミノ−ブタノールを、最初にオキシ塩化リンと反応させた後、1ポット反応においてトリブチルアンモニウムピロリン酸と反応させることにより、対応する三リン酸に変換することができる。精製後の三リン酸を、DCC/DMFまたはCDI/DMFで活性化して、活性化三リン酸を提供し、これをPEGのOH基と反応させて、PEG−三リン酸を生成する。同じスキームは、直鎖状ならびに分枝状PEGの両方に適用可能である。これらのPEGリン酸をナノ細孔中で試験して、異なる電流遮断信号を生成するための条件を最適化する。
末端リン酸タグ付ヌクレオシド−5’−三−、四−、および五リン酸を設計および合成する。これらの分子を、ポリメラーゼ反応において試験し、最適なものをナノ細孔検出のために選択する。小さいか、または大きいポリリシン、アミノ酸、様々な負または正に帯電した染料、例えば、エネルギー移動染料、およびエチレングリコール単位などの様々なタグを含む末端リン酸タグ付ヌクレオシド−5’−三−、四−、および五リン酸は、プライマー伸長のための優れた基質としてDNAポリメラーゼにより許容されることが示された(Kumarら、2006および2008;Soodら、2005;およびEidら、2009)。
図43に示されるように、末端リン酸タグ付ヌクレオシド−5’−三リン酸を、対応するdNTPをDCC/DMFと反応させて、環状トリメタリン酸を得て、これを求核試薬で開環して、タグまたはリンカーに結合したヌクレオシド−5’−三リン酸を生成することにより合成する。さらに、リン酸に結合したリンカーを、PEG−NHSエステルと反応させて、代替的なPEG結合ヌクレオシド−5’−三リン酸を提供することができる。得られる末端リン酸タグ付ヌクレオシド−5’−三リン酸を、鋳型−プライマー伸長反応において使用し、遊離したタグに結合したピロリン酸を検出し、その特異的ナノ細孔電流遮断パラメータにより区別する。
末端リン酸タグ付ヌクレオシド−5’−四リン酸の合成のために、対応する三リン酸を最初にDMF中のCDIと反応させて、末端リン酸基を活性化した後、リン酸またはタグ−モノリン酸と反応させて、図44に示されるように四リン酸を得る。四リン酸上の末端リン酸を、0.1Mイミダゾールバッファー中のEDACでさらに活性化した後、好適な求核試薬と反応させて、リンカーに結合した四リン酸を提供し、これを用いて異なる質量、長さまたは電荷のタグ、例えば、m−PEG−NHSエステルに結合させることができる。この場合、4つのトリメチルリシンを用いて、4つのリン酸の電荷を中和する。ポリメラーゼ組込みの後、遊離したPEG上の正味の電荷は+1であるか、またはアルカリホスファターゼで処理した場合、+4であり、これをナノ細孔により検出することができる。
末端リン酸タグ付ヌクレオシド−5’−五リン酸の合成は、図45に示されるものと同じ原理に従う。それらを、リン酸、ピロリン酸またはタグ結合リン酸と反応させることにより、活性化三リン酸または四リン酸のいずれかから調製することができる。あるいは、リンカーを五リン酸に結合させた後、活性化NHSエステルと反応させることができる。
本発明者らは、単一のα−溶血素ナノ細孔を用いて、多リン酸リンカーを介して結合したヌクレオチドに連結されたPEGを検出し、ヌクレオチド/リボース部分の後の同じポリマーをDNAポリメラーゼ反応によって切断した。4つの異なるDNA塩基のそれぞれを、ユニークな長さのPEGポリマーに連結する。かくして、ポリメラーゼによりPEGから除去されたそれぞれの塩基が同定される。未反応のヌクレオチドは、特にリアルタイムの状況では遊離したタグ付ポリリン酸から分離することができないため、本発明者らは、遊離した反応産物と出発材料とを識別する分子電荷に対する本発明の方法の極端な感度を利用する。本発明者らは、100kHZおよび約4pAのRMSノイズでのデータ収集を可能にする円錐ガラス支持体(Whiteら、2006および2007)を用いて単一α−溶血素伝導性を測定する。本発明者らは、ヌクレオチド識別のための最適条件を決定し、固定された電荷での分子とのPEG−ナノ細孔相互作用(Robertsonら、2007)の本発明者らの現在の理論的理解を拡張するために、様々な膜貫通能力にわたってタグ付ヌクレオチドとタグ付産物の両方の遮断深度および滞留時間分布を測定する。特徴づけおよび理論的理解は、ポリメラーゼによりポリヌクレオチド中に組込まれたヌクレオチドの明白な同定を可能にする。かくして、DNAの構成要素のこれらの合理的な化学的設計および改変について、本発明者らは、ナノ細孔の使用を最適化して、タンパク質または合成ナノ細孔において単一塩基分解能で単一分子レベルでDNAを解読する。
単一分子配列決定のための単一固体状態ナノ細孔の製造
タンパク質ナノ細孔から固体状態ナノ細孔への遷移は、高密度ナノ細孔アレイの製造を可能にし、これは高効率単一分子電気DNA配列決定装置を得るための重要な工程である。ここで、一体型単一固体状態ナノ細孔プラットフォームを開発して、タンパク質ナノ細孔から獲得された知識に基づいてポリメラーゼ反応におけるタグ付ヌクレオチドを特徴づける。
本発明者らは、固体状態ナノ細孔と一体化した場合、外部電気物理的増幅器、例えば、Axopatch 200Bを用いる「標準的な」測定技術と比較して有意な性能の利点を送達する特殊化された一体型低ノイズCMOS電子機器を開発した。これらの利点は、慣用的な一体化増幅器設計における容量性(抵抗性よりもむしろ)フィードバックの活用に由来する。この、およびその他のバイオエレクトロニクスインタフェースに特徴的であるDC電流を、DCサーボループ中で運転する低ノイズ電流源を用いて除去する。同時一体化と関連する増幅器入力容量の低下および寄生容量の低下は高周波数でのノイズ特性を改善し、固体状態の細孔に関する1MHzに達するバンド幅を可能にする。そのような高い一時的分解能は、開発されたタグと組合わせた場合、高感度およびリアルタイム性能のためにこのプラットフォームを調整するための高い可撓性を提供する。
ポリメラーゼのサイズは、約5nm x 5nmである。1個のポリメラーゼは、各ナノ細孔の入口の近くに配置される。固体状態ナノ細孔についてこれを達成するために、(1)表面上のユニークな位置を、ポリメラーゼに結合するようにCMOS製造中に官能基で改変する;(2)部位がただ1個のポリメラーゼ分子が結合することができる程度に十分小さい;(3)遊離したタグ付ポリリン酸の近隣のチャンネルへの拡散の可能性がほとんどないようにそれらが十分に離れている;および(4)架橋剤が、酵素が機能的に無傷であるように十分に可撓性であることが必要である。ポリメラーゼ係留は、多くても1個の酵素分子が結合されるように、インキュベーション中にパターン化された結合点を、適切な濃度のポリメラーゼ溶液の使用と組合わせることによって達成される。
前駆体ヌクレオチドおよびDNAを細孔により寄せ付けないようにしながら細孔に対する遊離したタグの迅速な拡散のためのシステムを生成する。DNA中への組込み後に、ヌクレオシドから遊離したタグが累積正電荷を有するが、無傷のタグ−ヌクレオチドが中性のままであるようにタグ付ヌクレオチドを操作する。これにより、チャンネルが方法に従って負に帯電する場合、検出チャンネルを通して特異的に遊離したタグを活発にゲート化することができる(Wanunuら、2007)。タグ以外の、反応混合物(プライマー、未反応のヌクレオチド、鋳型)中に存在する他の全ての遊離分子は負に帯電しているため、正電荷を担持する遊離したタグのみがチャンネル中に誘引され、検出の特異性を増加させ、ノイズを減少させる。異なる数の帯電基を、特異的ヌクレオチド塩基に応じて、異なるタグ上で用いることができる。かくして、タグの累積電荷は、そのサイズと共に、塩基識別のために用いることができる。タグの組込みおよび遊離の後、ポリリン酸が正電荷を隠すと考えられる場合、第2の反応(例えば、細孔中の第2の下流部位に固定されたアルカリホスファターゼ)を用いてそれを除去することができる。正帯電タグを、検出および認識のために負帯電チャンネル中にゲート化することができる。
この配列決定システムの重要な側面は、隣接したナノ細孔による各ヌクレオチドの遊離したタグの信頼性が高く、時宜を得た捕捉である。タグが正確な順序で迅速に捕捉されるように、条件を操作しなければならない。さらに、組込まれなかったタグの捕捉率を最小化し、隣接するチャンネルからの干渉を無視できるほどのものにするべきである。細孔の入口でのウェルの作出(図48に示される)はこのプロセスを補助し、これはナノ細孔開口部へのポリメラーゼの近接性にも依存する。ナノ細孔捕捉プロセスの分析は、細孔の周囲での放射対称性のプロセスを一般に考慮する。幾何学は、電界の非存在下では、静電気引力とは反対に、分子は細孔から遠くに拡散する傾向があると決定付ける。電圧勾配を用いた場合、拡散および電気泳動に起因する分子運動が等しい臨界距離Lが存在する(Gershowら、2007)。この臨界距離は、イオン電流(I)および電解質伝導性(σ)、ならびに分析物分子の拡散定数(D)および移動度(μ)の関数、
固体状態ナノ細孔のアレイの製造
改善された性能に加えて、一体型電子機器を用いた場合にのみ、大規模平行ナノ細孔アレイを製造することができる。これは、ナノ細孔がチップのいずれかの側で流動するCMOSダイス中に直接一体化された図46Cに示される1チップトポロジーを含む。複数の細孔を一体化するための手法も、図46Cに示されている。この場合、SU−8光耐性のウェルを用いて、互いに個々のナノ細孔を単離する。これは、Rothbergら、2011のものと同様の手法である。しかしながら、Rothbergらにおいては、ウェルはチップ上の溶液リザーバによって依然として「接続」されたままであり得る。本発明の場合、cisリザーバ間での電気的単離が必要であるため、図46Cに示されるようにPDMSキャップを用いて試薬の導入後に測定のためにウェルを密封する。64個の固体状態ナノ細孔を、同じ5mmx5mmのダイス上に一体化する。それぞれの細孔部位で複製される必要があり得る現在の一体型増幅器設計は、250μmx150μmのみであるが、細孔自体の製造のために追加の空間を残す必要がある。チップ面積を減少させるための製造技術がさらに開発されるので、これを16x16の電極のアレイに容易に拡大することができる。
リン酸タグ付ヌクレオチドおよびナノ細孔検出を用いるパイロシーケンシング
パイロシーケンシングは、ポリメラーゼ反応においてヌクレオチドが増殖中のDNA鎖中に組込まれた場合に遊離されるピロリン酸の検出に依拠する合成法による配列決定(SBS)である(Ronaghiら、1998)。この手法においては、4つのdNTPのそれぞれを、酵素、基質、および通常のポリメラーゼ反応成分のカクテルと共に連続的に添加する。添加されたヌクレオチドが鋳型上の第1の利用可能な塩基と相補的である場合、そのヌクレオチドは組込まれ、ピロリン酸が遊離される。酵素カスケードを通して、遊離したピロリン酸はATPに変換された後、蛍ルシフェラーゼにより可視光信号になる。他方、添加されたヌクレオチドが組込まれなかった場合、光は生成されず、ヌクレオチドは酵素アピラーゼによって単純に分解される。パイロシーケンシングは、単一ヌクレオチド多型(SNP)検出およびDNA配列決定に上手く適用されてきた。市販の配列決定プラットフォームは、高効率DNA配列決定のために個々のマイクロビーズ上でパイロシーケンシングとDNA鋳型増幅とを組合わせて開発されたものである(Marguliesら、2005)。しかしながら、鋳型のホモポリマー領域(例えば、行中の一続きのいくつかのT)中の組込まれたヌクレオチドの数を決定するためのパイロシーケンシングにおける固有の難しさがある。この他、依然として改善を要するパイロシーケンシングの他の側面もある。例えば、4つのヌクレオチドのそれぞれを別々に添加、検出しなければならない。未分解ヌクレオチドおよび他の成分の蓄積もまた、長いDNA鋳型を配列決定する場合に本発明の方法の精度を低下させ得る。
1)多くの異なる酵素の使用を回避する(費用および複雑性を節減する)。
正に帯電したTAG結合ヌクレオシド−ポリリン酸を、図44に示されるように合成する。最初に、正に帯電したトリメチル−(リシン)n−グリシンアミノ酸(K((Me)3)n−Gly)を、PEG−NHSエステルと反応させた後、活性化して、PEG−K((Me)3)n−Gly−NHSエステルを形成させる。この活性化エステルを、図38および44に示されるようにアミノ末端ヌクレオシド−ポリリン酸と反応させる。ヌクレオシド−四リン酸上の正味の電荷は中性であるが、ポリメラーゼ組込み後、遊離したPEGは+1の正電荷を有し、アルカリホスファターゼを反応カクテルに添加した場合、遊離したPEG上の正味の電荷は+4である。かくして、遊離したTAGを容易に分離し、ナノ細孔を通過させることにより同定することができる。
3’−遮断ヌクレオシド−ポリリン酸の合成は、出発ヌクレオシド−5’−三リン酸が3’−O−遮断−dNTPであることを除いて、TAG結合ヌクレオシド−ポリリン酸について示されたものと同じ経路に本質的に従う。図50に示されるように、3’−O−アジドメチル−dNTP(6)を最初にCDIまたはDCC/DMFと反応させた後、リン酸(四リン酸)またはピロリン酸(五リン酸)と反応させる。これを、精製後に適切な求核試薬と反応させて、アミノ末端リン酸を提供した後、適切なPEG−NHSエステル(中性、正帯電または負帯電)と反応させて、必要な3’−O−遮断−PEG結合ヌクレオシド−ポリリン酸を提供する。
図53に示されるように、大規模平行方法において、生化学的プロセスを実施するためのマイクロウェルの高密度アレイを構築することができる。それぞれのマイクロ/ナノ−ウェルは、異なるDNA鋳型およびナノ細孔デバイスを保持する。遊離したPEGは単一分子感度で検出される。
1)異なるサイズ、長さ、分子量、電荷の任意のTAGをヌクレオチドの末端リン酸に結合させ、これをポリメラーゼ組込み後にナノ細孔によって検出することができる。
ナノ細孔を用いる溶液中での単一分子質量/サイズ分光分析
方法
溶媒を含まない平面脂質二重膜を、2つの同一のテフロン(登録商標)チャンバを分離する25μmの厚さのテフロン(登録商標)パーティション中、約70μm直径の穴上で、ペンタン(J.T.Baker、Phillipsburg,N.J.)中のジフィタノイルホスファチジルコリン(1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン;Avanti Polar Lipids、Alabaster、Ala.)から形成させた。穴を、ペンタン中の1:400vol/volのヘキサデカン(Aldrich、St.Louis、Mo.)の溶液で予備処理した。両チャンバは、濃クエン酸(Fluka、Buchs、Switzerland)でpH7.5に調整された、4M KCl(Mallinckrodt、Paris、Ky.)、5mM 2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール(Tris;Schwarz/Mann Biotech、Cleveland、Ohio)を含有していた。
分析物の非存在下では、DC電位により引き起こされるイオン電流は明確に定義される。イオン電流中の固有ノイズは、ナノ細孔および抵抗障壁容量におけるイオンのブラウン運動により一部引き起こされ得る。分析物(例えば、ポリ(エチレングリコール))の添加は、伝導性の明確に定義された一過的低下を引き起こす。それぞれのパルスは、ナノ細孔中の単一のPEG分子の存在に対応してもよい。電流の減少は、多分散性PEG−1500試料(平均分子質量〜1500g/mol)についてはわずかに〜50ピコアンペアの範囲を包含する。
タグ付ポリリン酸ヌクレオチドおよびナノ細孔を用いる単一分子配列決定
個別化医療のために単一のDNAおよびRNA分子を正確に配列決定する有意な必要性が存在する。単一分子レベルで、初めは各ヌクレオチドの5’−リン酸に結合していた4つの異なるサイズのタグを正確に区別する、新規ナノ細孔に基づく合成による配列決定(SBS)戦略がここに記載される。各ヌクレオチドはポリメラーゼ反応中に増殖中のDNA鎖に組込まれるため、そのタグはタグ付ヌクレオチドのα−リン酸と、前のヌクレオチドの3’−OH基とのホスホジエステル結合形成により遊離される。遊離したタグは、それらが遊離した順序でナノ細孔に進入し、そのサイズ、形状および電荷のためユニークなイオン電流遮断特徴に影響し、それによって、単一塩基分解能で単一分子レベルで電気的にDNA配列を決定する。非限定例として、4つの異なる長さのPEG−クマリンタグを、2’−デオキシグアノシン−5’−四リン酸の末端リン酸に結合させる。ポリメラーゼ反応中にこれらの改変ヌクレオチドの効率的な組込みが観察され、これは異なるタグがナノ細孔イオン電流を減少させる程度に基づく4つのタグ間での6σより良好なタグ識別である。アレイ形式でナノ細孔に共有結合したポリメラーゼと共にここで記載される分子手法は、単一分子ナノ細孔に基づくSBSプラットフォームをもたらす。
クマリン−PEG−dG4Pヌクレオチド類似体の合成
全てのヌクレオチドを、150x4.6mmのカラム(Supelco)、移動相:A、8.6mM Et3N/100mM 1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール/水(pH8.1);B、メタノール上での逆相HPLCにより精製する。溶出を、10minかけて100%のAアイソクラチック、次いで、20minの0〜50%のBの線形勾配、および次いでさらに30minかけて50%のBアイソクラチックから実施する。
クマリン−PEGn−dG4Pの合成は、図15のスキームに示されるような3つの工程を含む。
最初に、2’−dG4Pの合成を、2’−dGTPから出発して実行する。300μモルの2’−dGTP(トリエチルアンモニウム塩)を、無水ピリジン(5ml)中の1.5mmol(5当量)のトリブチルアミンを用いることによりトルブチルアンモニウム塩に変換する。得られる溶液を濃縮乾固し、5mlの無水DMF(x2)で共蒸発させる。dGTP(トリブチルアンモニウム塩)を5mlの無水DMFに溶解し、1.5mmolの1,1−カルボニルジイミダゾールを添加する。反応物を6h撹拌した後、12μlのメタノールを添加し、撹拌を30min続ける。この溶液に、1.5mmolのリン酸(トリブチルアンモニウム塩、DMF中)を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌する。
2mlの水および3.5mlの0.2M 1−メチルイミダゾール−HCl(pH6)中の80μmolのdG4Pに、154mgのEDACおよび260mgのジアミノヘプタンを添加する。得られる溶液のpHを濃HClで6に調整し、室温で一晩撹拌する。この溶液を水で希釈し、Sephadex−A25イオン交換クロマトグラフィー、次いで、逆相HPLCにより精製して、約20μmolのdG4P−NH2を得る。これをESI−MSデータ(−veモード)により確認する:計算値699.1;実測値(698.1、M−1)。
市販のアミノ−dPEG−酸(アミノ−d(PEG)16、20、24、36−酸;Quanta Biodesign)を、6−メトキシクマリン−NHSエステルと反応させて、対応するクマリン−(PEG)n−酸を提供する。アミノ−PEG−酸(1当量)を炭酸−重炭酸バッファー(pH8.6)に溶解した後、DMF中のクマリン−NHS(1当量)を添加し、反応混合物を一晩撹拌する。クマリン−PEG−酸を、CH2Cl2−MeOH(5〜15%)混合物を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、適切な画分を合わせる。これらの化合物を、1H NMRおよびMALDI−TOF MS分析により分析する。
上記の工程AからのdG4P−ヘプチル−NH2を、0.1M炭酸−重炭酸バッファー(pH8.6)中に取り、この撹拌溶液に、クマリン−PEG−NHS化合物(DMF中)の1つを添加する。得られる混合物を室温で一晩撹拌した後、シリカゲルカートリッジ(未反応のクマリン−酸または−NHSを除去するためのCH2Cl2中の15〜25%MeOH、次いで、6:4:1のイソプロパノール/NH4OH/H2O)上で精製する。これを、逆相HPLCによりさらに2回精製して、純粋なクマリン−PEG−dG4Pを提供する。この構造をMALDI−TOF MS上での分析により確認する。クマリン−PEG16−dG4P:保持時間、31.7min;クマリン−PEG20−dG4P:保持時間、32.2min;クマリン−PEG24−dG4P:保持時間、33.0min;クマリン−PEG36−dG4P:保持時間、34.3min。
伸長反応を、ループした鋳型−プライマー(5’−GATCGCGCCGCGCCTTGGCGCGGCGC−3’、M.W.7966)を用いて実施し、ここで鋳型上の次の相補的塩基はCであり、単一のGによる伸長を可能にする(図56)。それぞれの伸長反応を、3μMのループした鋳型−プライマー、1X Therminatorγバッファー(50mM KCl、20mM Tris−HCl、5mM MgSO4、0.02%IGEPAL CA−630(pH9.2@25℃))、2ユニットのTherminatorγDNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、および15μMのクマリン−PEG−dG4Pヌクレオチドの1つからなる20μlの反応液中、65℃で25分間、GeneAmp PCR System 9700サーマルサイクラー(Applied Biosystems)中で実行する。DNA伸長産物をエタノールと共に沈降させ、C18 ZipTipカラム(Millipore)を通して精製し、ABI Voyager装置を用いるMALDI−TOF MSにより特徴づける。図58に示されるように、4つの同一の産物(予想分子量8,295)が得られる。
酢酸をクマリン−PEG−dG4Pヌクレオチドに添加して、10%の最終濃度にし、溶液を一晩激しく振とうして、δリン酸とヘプチルアミンとのN−P結合の加水分解を確実にする。CentriVapを用いて溶液を乾燥し、適切な容量の水に再懸濁する。1μlのアリコートをMALDI−TOF質量分光分析特徴づけのために収集し、第2のアリコートを、NanoDrop ND−1000分光計を用いて260nmおよび350nmで測定する。
膜およびチャンネル形成
単一のα−溶血素チャンネルを、以前に記載のように(Reinerら、2010)、2つの電解質溶液ウェルを分離する25μmの厚さのTeflonパーティション中、約80μm直径の穴にわたって製造された無溶媒平面脂質二重膜(BLM)(Montalら、1972)中に挿入する。クエン酸でpH7.2に滴定した4M KCl、10mM Trisを、実験を通して用いる。最初にパーティションを1%v/vのヘキサデカン/ペンタンで湿潤させることにより、膜を形成させる。ペンタン中の10mg/mLのジフィタノイルホスファチジルコリン(DPhyPC)を、Teflonパーティション中の穴の下の溶液レベルウェルとの両方の空気−電解質溶液境界面に拡散させる。10min後、溶液レベルを自発的に穴の上まで上昇させて、膜を形成させる。約0.5μLの0.5mg/mL α−溶血素を、膜にすぐ隣接する溶液中に注入し、シングルチャンネルが膜中に挿入されるまでイオン電流を観察する。次いで、cisチャンバの含量をタンパク質を含有しない電解質溶液と交換して、シングルチャンネルを維持する。
データを、以前に記載されたように(Rodriguesら、2008)、LabVIEW(National Instruments)で書かれた社内プログラムを用いてオフラインで分析する。簡単に述べると、オープン状態で5σの電流ノイズに設定された単純閾値アルゴリズムに基づいて事象検出器を用いて遮断を検索する。事象が検出された場合、上昇時間および崩壊時間における点を廃棄する(それぞれ、〜60μsおよび20μs)。平均遮断深度を、残りの点から算出し、オープンチャンネル電流を閾値から0.2ms離れた平均0.8msのオープンチャンネルデータから算出する。データを平均の比(<i>/<iopen>)として報告し、ナノ細孔スペクトルをこれらの値のヒストグラムとして算出する。
1996年に、Kasianowiczら(Kasianowiczら、1996)が、α−溶血素(αHL)チャンネルを用いて単一分子レベルで核酸を検出することができることを初めて示した。αHLチャンネルは、1.5nm直径の限界開口部を有し(Songら、1996;Bezrukovら、1996;Krasilnikov 2002;Kasianowicz 1995)、細孔が無期限に開いたままになるようにその電圧依存的ゲーティングを制御することができ(Kasianowicz 1995)、それをナノ細孔に基づく検出および識別のための理想的な候補にする。個々の一本鎖ポリアニオン核酸を、印加された電界によって細孔を通して誘導し、ポリヌクレオチドは細孔伝導性の明確に定義された、一過的減少を引き起こす(Kasianowiczら、1996;Vercoutereら、2001;Deamerら、2002;Kasianowicz 2004)。細孔中でのポリヌクレオチドの滞留時間はRNAまたはDNAの輪郭の長さに比例するため、4つの塩基を互いに識別することができる場合、ナノ細孔はティッカーテープ様式でDNAを配列決定することができることが示唆される(Kasianowiczら、1996)。その目標に向かって(Kasianowicz 1996;Kasianowiczら、2008;Kasianowiczら、2002)、細孔中で共有結合したアダプタを含むαHLチャンネルが、未標識のヌクレオシド−5’−モノリン酸を同定するために用いられている(Clarkeら、2009)。しかしながら、DNAを配列決定するためのこの概念に基づく完全なエキソヌクレアーゼ−ナノ細孔システムは、文書化されていない。
4つの5’−リン酸タグ付2’−デオキシグアノシン−5’−四リン酸(図54)を、図15に示される一般化された合成スキームに従って合成する(詳細については上記の方法を参照されたい)。最初に、2’−デオキシグアノシン−5’−三リン酸(dGTP)を、2’−デオキシグアノシン−5’−四リン酸(dG4P)に変換した後、ジアミノヘプタンリンカーを四リン酸の末端リン酸に付加して、異なる長さのPEGタグを結合させる。別のセットの反応において、6−メトキシ−クマリンN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを、16、20、24または36のエチレングリコール単位を有する4つのアミノ−PEG−COOH分子の1つと反応させて、クマリン−PEGn−COOH分子を作製した後、対応するNHS−エステルに変換する。これらのものをdG4P−ヘプチルアミン(dG4P−NH2)と反応させて、クマリン−PEGn−dG4Pと省略される4つの最終ヌクレオチド類似体を生成させる(図54)。クマリン部分を用いて、中間体および最終ヌクレオチド類似体の精製を追跡する。予想される分子の合成を、MALDI−TOF質量分光法により確認する(図55)。
MALDI−TOF MSによる遊離したタグの特徴づけ
予想されるクマリン−PEG−NH2分子を、HPLC精製の後、MALDI−TOF−MS分析により確認する(図16)。MALDI−TOF−MSの結果は、酸加水分解により生成されたクマリン−PEG−NH2タグがアルカリホスファターゼ処理後のポリメラーゼ反応中に生成された遊離したタグと同一であることを示している。
単一分子でのタンパク質ナノ細孔における遊離したタグの識別
図17を参照すれば、酸加水分解により4つの同等のヌクレオチドから誘導される4つのクマリン−PEGn−NH2化合物(n=16、20、24および36)をプールし、ナノ細孔測定のために4M KCl、10mM Tris、pH7.2中に希釈した。左側の時系列データは、これらのPEGタグが単一のα−溶血素イオンチャンネルに進入する時、それらがそのサイズに特徴的な電流遮断を引き起こすことを示す。右側のヒストグラムは、個々の分子により引き起こされる平均電流遮断が10kHzの測定バンド幅で基準分解能を示すことを示す。上側の色付きのバーは、データの6σ分布を表し(4つのDNAヌクレオチドのそれぞれを表すことができる4つのPEGタグのそれぞれに関するガウス分布と見なす)、これは、4つの異なる長さのPEGを含む4つの異なるヌクレオチドをDNA配列決定のために用いる場合に生じてもよいA、C、GおよびT指定を用いることによりこの図面中で表される、単一の塩基を1/300,000の事象より良好な精度で識別することができることを示唆する。
クマリン−PEG−dG4Pヌクレオチド類似体の合成
全てのヌクレオチドを、150x4.6mmのカラム(Supelco)、移動相:A、8.6mM Et3N/100mMの1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール/水(pH8.1);B、メタノール上での逆相HPLCにより精製する。溶出を、10minにわたる100%のAアイソクラチック、次いで、20minにわたる0〜50%のBの線形勾配、次いで、さらに30minにわたる50%のBアイソクラチックから実施する。
クマリン−PEGn−dG4Pの合成は、図15のスキームに示されるような3つの工程を含む。
最初に、2’−dG4Pの合成を、2’−dGTPから出発して実行する。300μモルの2’−dGTP(トリエチルアンモニウム塩)を、無水ピリジン(5ml)中の1.5mmol(5当量)のトリブチルアミンを用いることにより、トリブチルアンモニウム塩に変換する。得られる溶液を濃縮乾固し、5mlの無水DMF(x2)と共蒸発させる。dGTP(トリブチルアンモニウム塩)を5mlの無水DMFに溶解し、1.5mmolの1,1−カルボニルジイミダゾールを添加する。反応物を6h撹拌した後、12μlのメタノールを添加し、撹拌を30min継続する。この溶液に、1.5mmolのリン酸(トリブチルアンモニウム塩、DMF中)を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌する。
2mlの水および3.5mlの0.2M 1−メチルイミダゾール−HCl(pH6)中の80μmolのdG4Pに、154mgのEDACおよび260mgのジアミノヘプタンを添加する。得られる溶液のpHを、濃HClで6に調整し、室温で一晩撹拌する。この溶液を水で希釈し、Sephadex−A25イオン交換クロマトグラフィー、次いで、逆相HPLCにより精製して、約20μmolのdG4P−NH2を得る。これを、ESI−MSデータ(−veモード)により確認する:計算値699.1;実測値(698.1、M−1)。
市販のアミノ−dPEG−酸(アミノ−d(PEG)16、20、24、36−酸;Quanta Biodesign)を、6−メトキシクマリン−NHSエステルと反応させて、対応するクマリン−(PEG)n−酸を提供する。アミノ−PEG−酸(1当量)を炭酸−重炭酸バッファー(pH8.6)中に溶解した後、DMF中のクマリン−NHS(1当量)を添加し、反応混合物を一晩撹拌する。クマリン−PEG−酸を、CH2Cl2−MeOH(5〜15%)混合物を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、適切な画分を合わせる。これらの化合物を、1H NMRおよびMALDI−TOF MS分析により分析する。
上記の工程A)に由来するdG4P−ヘプチル−NH2を、0.1M炭酸−重炭酸バッファー(pH8.6)中に取り、この撹拌溶液に、クマリン−PEG−NHS化合物(DMF中)の1つを添加する。得られる混合物を室温で一晩撹拌した後、シリカゲルカートリッジ上で精製する(未反応のクマリン−酸または−NHSを除去するためのCH2Cl2中の15〜25%のMeOH、次いで、6:4:1のイソプロパノール/NH4OH/H2O)。これを逆相HPLCによりさらに2回精製して、純粋なクマリン−PEG−dG4Pを提供する。この構造を、MALDI−TOF MS上での分析により確認する。クマリン−PEG16−dG4P:保持時間、31.7min;クマリン−PEG20−dG4P:保持時間、32.2min;クマリン−PEG24−dG4P:保持時間、33.0min;クマリン−PEG36−dG4P:保持時間、34.3min。
MALDI−TOF MSによる遊離したタグの特徴づけ
予想されるクマリン−PEG−NH2分子を、HPLC精製後、MALDI−TOF−MS分析により確認する(図16)。MALDI−TOF−MSの結果は、酸加水分解により生成されたクマリン−PEG−NH2タグが、アルカリホスファターゼ処理後にポリメラーゼ反応中に生成された遊離したタグと同一であることを示している。
単一分子でのタンパク質ナノ細孔における遊離したタグの識別
図17を参照して、酸加水分解により4つの同等のヌクレオチドから誘導される、4つのクマリン−PEGn−NH2化合物(n=16、20、24、および36)をプールし、ナノ細孔測定のために4M KCl、10mM Tris、pH7.2中に希釈した。左側の時系列データは、これらのPEGが単一のα−溶血素イオンチャンネルに進入する時、それらがそのサイズに特徴的な電流遮断を引き起こすことを示す。右側のヒストグラムは、個々の分子により引き起こされる平均電流遮断が、10kHzの測定バンド幅で基準分解能を示すことを示す。上側の色付きのバーは、データの6σ分布を表し(4つのDNAヌクレオチドのそれぞれを表すことができる4つのPEGタグのそれぞれに関するガウス分布と見なす)、これは、A、C、GおよびT指定を用いることによりこの図面で表された、単一の塩基を、4つの異なる長さのPEGと共に4つの異なるヌクレオチドをDNA配列決定に用いる場合に生じてもよい1/300,000の事象より良好な精度で識別することができることを示唆する。
タグの検出
デバイスを用いて、4つの異なるタグ分子に関する4つの異なる電流レベルを検出する。図19に見られるように、それぞれのタグを、他の3つのいずれかから区別することができる(すなわち、ヒストグラムは対応するタグと共にグラフ中で標識される4つの異なるピークを示す)。
(a)配列;ストレプトアビジン−ビオチン−10T−xxx−3T−xxx−11Tを有するフェイクタグXXX−XXX
(b)配列;ストレプトアビジン−ビオチン−10T−TTT−3T−xxx−11Tを有するフェイクタグTTT−XXX
(c)配列;ストレプトアビジン−ビオチン−30Tを有する30Tタグ
(d)配列;ストレプトアビジン−ビオチン−10T−TTT−3T−T−IfluorT−T−11T(ここで、位置18のTは蛍光で標識される)を有するフェイクタグiFluorT
である。
また、以下に本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
[1] (a)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;
(b)前記障壁を越えて電界を印加するための手段と;
(c)前記電界の変化を測定するための手段と;
(d)前記細孔に付着している少なくとも1つのポリメラーゼと;
(e)前記細孔に付着している2つ以上のホスファターゼ酵素と
を含む伝導性測定システム。
[2] 前記細孔が、約1〜10nmの直径を有する、[1]に記載の伝導性測定システム。
[3] 前記ポリメラーゼと前記ホスファターゼ酵素が、前記細孔に共有結合している、[1]に記載の伝導性測定システム。
[4] ポリメラーゼより多くのホスファターゼ酵素が、前記細孔に付着している、[1]に記載の伝導性測定システム。
[5] ポリメラーゼ反応において前記ポリメラーゼによって生じたポリリン酸が、前記細孔に入る前に前記ホスファターゼ酵素と相互作用するように前記ホスファターゼ酵素が位置する、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
[6] 前記ホスファターゼ酵素と前記ポリリン酸との相互作用の速度が、前記ポリメラーゼが前記ポリリン酸を生じる速度と同じか、それを超える、[5]に記載の伝導性測定システム。
[7] 前記第1および前記第2の区画の各々が、電荷を有する、[1]〜[6]のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
[8] 前記細孔の内部が負電荷を有する、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
[9] 前記細孔が、生物学的なものまたは合成によるものである、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
[10] 前記細孔が、タンパク質性のものである、[9]に記載の伝導性測定システム。
[11] 前記細孔が、α溶血素タンパク質である、[10]に記載の伝導性測定システム。
[12] 前記細孔が、固体細孔である、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
[13] 前記細孔が、グラフェンからなる、[1]〜[12]のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
[14] 各々が実質的に同一の特徴を有する細孔のアレイをさらに含む、[1]〜[13]のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
[15] 異なる直径の細孔のアレイをさらに含む、[1]〜[13]のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
[16] 細孔のアレイをさらに含み、前記細孔が、前記障壁を越えて異なる電界を印加するように構成されている、[1]〜[13]のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
[17] 前記伝導性測定システムが、CMOS電子回路と一体化している、[1]〜[16]のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
[18] 図46に示すように、前記細孔または細孔のアレイが、CMOSダイに直接一体化している、[17]に記載の伝導性測定システム。
[19] 構造
[20] 前記タグの前記電荷の大きさが、前記化合物の残りの前記電荷の大きさと同じである、[19]に記載の化合物。
[21] 前記タグが、複数のエチレングリコール単位を含む、[19]または[20]に記載の化合物。
[22] 前記タグが、16、20、24、または36個のエチレングリコール単位を含む、[19]〜[21]のいずれか一項に記載の化合物。
[23] 前記タグが、追加の識別可能な部分を含む、[19]〜[22]のいずれか一項に記載の化合物。
[24] 前記追加の識別可能な部分が、クマリン性色素である、[23]に記載の化合物。
[25] 前記タグが、正電荷を有する、[19]〜[24]のいずれか一項に記載の化合物。
[26] 前記タグの除去により、前記化合物の前記電荷が変化する、[19]〜[25]のいずれか一項に記載の化合物。
[27] 前記タグが、適切な数のリシンまたはアルギニンをさらに含み、リン酸の数の均衡を保っている、[19]〜[26]のいずれか一項に記載の化合物。
[28] 構造
[29] 前記塩基および前記タグにおいて前記4種類の化合物の各々と異なる第5の種類の化合物をさらに含み、前記第4の種類の化合物の前記塩基がチミンまたはその誘導体である場合に、前記第5の種類の化合物の前記塩基がウラシルまたはその誘導体であり、または前記第4の種類の化合物の前記塩基がウラシルまたはその誘導体である場合に、前記第5の種類の化合物の前記塩基がチミンまたはその誘導体である、[28]に記載の組成物。
[30] 化合物のアイデンティティを決定する方法であって、
(a)前記化合物を、(i)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;(ii)前記障壁を越えて電界を印加するための手段と;(iii)前記電界の変化を測定するための手段とを含む伝導性測定システムと接触させることと;
(b)前記化合物が前記細孔を通り抜けて移行するときに、前記電界の前記変化を記録し、前記電界の前記変化が、前記化合物と前記電解質と前記細孔との相互作用の結果であり、前記化合物のサイズ、電荷および組成を示すことと
を含み、それによって、前記変化と所定の値との相関から前記化合物の前記アイデンティティを決定することが可能になる、方法。
[31] 工程(a)の前にホスファターゼ酵素で前記化合物を処理する工程をさらに含む、[30]に記載の方法。
[32] 化合物がタグであるかまたは前記タグの前駆体であるかどうかを決定する方法であって、
(a)前記化合物を(i)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;(ii)前記障壁を越えて電界を印加するための手段と;(iii)前記電界の変化を測定するための手段とを含む伝導性測定システムと接触させることと;
(b)前記化合物が前記細孔を通り抜けて移行するときに、前記電界の前記変化を記録することと;
(c)前記電界の前記変化を、前記タグおよび前記タグの前記前駆体に対応する所定の値と比較することと
を含み、それによって、前記化合物が、前記タグであるかまたは前記その前駆体であるかどうかを決定する、方法。
[33] 工程(a)において前記電界の電流バイアスを調節する工程をさらに含む、[30]〜[32]のいずれか一項に記載の方法。
[34] 一本鎖DNAのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)前記一本鎖DNAを
(i)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;(ii)前記障壁を越えて電界を印加するための手段と;(iii)前記電界の変化を測定するための手段と;(iv)前記細孔に付着している少なくとも1つのポリメラーゼと;(v)前記細孔に付着している2つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
前記タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R 1 がOHであり、R 2 がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH 2 であり、ZがO、SまたはBH 3 であり、nが1、2、3または4であり、前記タグが、前記化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第1の種類の化合物の前記塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第2の種類の化合物の前記塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第3の種類の化合物の前記塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第4の種類の化合物の前記塩基がチミンもしくはその誘導体であり、各種類の化合物にある前記タグが他の3種類の化合物の各々にある前記タグと異なり、
前記一本鎖DNAが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、DNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の前記一本鎖DNAのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物のうちの1つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖DNAがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離し、
前記細孔に付着している前記ホスファターゼ酵素が、前記ポリリン酸から前記タグを切断して前記タグを遊離することと;
(b)前記障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記DNA伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖DNA中の前記ヌクレオチド残基を同定することと;
(c)配列決定される前記一本鎖DNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(b)を繰り返し実施することと
を含み、それによって、前記一本鎖DNAの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。
[35] 一本鎖DNAのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)前記一本鎖DNAを
(i)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;(ii)前記障壁を越えて電界を印加するための手段と;(iii)前記電界の変化を測定するための手段と;(iv)前記細孔に付着している少なくとも1つのポリメラーゼと;(v)前記細孔に付着している2つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
前記タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R 1 がOHであり、R 2 がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH 2 であり、ZがO、SまたはBH 3 であり、前記塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはこれらの塩基のうち1つの誘導体であり、nが1、2、3または4であり、前記タグが、前記化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、
前記一本鎖DNAが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、DNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側にある前記一本鎖DNAのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖DNAがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との前記接触を反復して繰り返し、ただし(1)前記化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、(2)前記化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離し、
前記細孔に付着している前記ホスファターゼ酵素が、前記ポリリン酸から前記タグを切断して前記タグを遊離することと;
(b)前記障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記DNA伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖DNA中の前記ヌクレオチド残基を同定することと;
(c)配列決定される前記一本鎖DNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(a)および(b)を反復して実施することと
を含み、それによって、前記一本鎖DNAの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。
[36] 一本鎖RNAのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)前記一本鎖RNAを
(i)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;(ii)前記障壁を越えて電界を印加するための手段と;(iii)前記電界の変化を測定するための手段と;(iv)前記細孔に付着している少なくとも1つのポリメラーゼと;(v)前記細孔に付着している2つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
前記タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R 1 がOHであり、R 2 がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH 2 であり、ZがO、SまたはBH 3 であり、nが1、2、3または4であり、前記タグが、前記化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第1の種類の化合物の前記塩基が、アデニンまたはその誘導体であり、第2の種類の化合物の前記塩基が、グアニンまたはその誘導体であり、第3の種類の化合物の前記塩基が、シトシンまたはその誘導体であり、前記第4の種類の化合物の前記塩基が、ウラシルまたはその誘導体であり、各種類の化合物にある前記タグが、他の3種類の化合物の各々にある前記タグと異なり、
前記一本鎖RNAが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、RNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖RNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の前記一本鎖RNAのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物のうちの1つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖RNAがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離し、
前記細孔に付着している前記ホスファターゼ酵素が、前記ポリリン酸から前記タグを切断して前記タグを遊離することと;
(b)前記障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記RNA伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖RNA中の前記ヌクレオチド残基を同定することと;
(c)配列決定される前記一本鎖RNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(b)を繰り返し実施することと
を含み、それによって、前記一本鎖RNAの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。
[37] 一本鎖RNAのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)前記一本鎖RNAを
(i)ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第1および第2の電解質溶液が入った第1および第2の区画と;(ii)前記障壁を越えて電界を印加するための手段と;(iii)前記電界の変化を測定するための手段と;(iv)前記細孔に付着している少なくとも1つのポリメラーゼと;(v)前記細孔に付着している2つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
前記タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を含み、R 1 がOHであり、R 2 がHまたはOHであり、XがO、NH、SまたはCH 2 であり、ZがO、SまたはBH 3 であり、前記塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはこれら塩基のうちの1つの誘導体であり、nが1、2、3または4であり、前記タグが、前記化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、
前記一本鎖RNAが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、RNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側にある前記一本鎖RNAのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖RNAがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との前記接触を反復して繰り返し、ただし(1)前記化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、(2)前記化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離し、
前記細孔に付着している前記ホスファターゼ酵素が、前記ポリリン酸から前記タグを切断して前記タグを遊離することと;
(b)前記障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記RNA伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖RNA中の前記ヌクレオチド残基を同定することと;
(c)配列決定される前記一本鎖RNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(a)および(b)を反復して実施することと
を含み、それによって、前記一本鎖RNAの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。
[38] ポリメラーゼより多くのホスファターゼ酵素が、前記細孔に付着している、[34]〜[37]のいずれか一項に記載の方法。
[39] 前記一本鎖DNAまたはRNAが、どちらを適用するにしても、二本鎖DNAまたはRNAを変性させることによって得られる、[34]〜[37]のいずれか一項に記載の方法。
[40] 同じ一本鎖DNAまたはRNAの複数のコピーが、ビーズに固定化されている、[34]〜[37]のいずれか一項に記載の方法。
[41] 前記一本鎖DNAまたはRNAの前記ヌクレオチド配列が、同じ一本鎖DNAまたはRNAの複数のコピーを使用して決定される、[40]に記載の方法。
[42] 工程(b)の各反復後に、前記一本鎖DNAまたはRNAとの接触によって組み込まれていない化合物を除去する洗浄工程をさらに含む、[34]〜[41]のいずれか一項に記載の方法。
[43] 工程(b)の各反復後に、前記タグに付着している追加の識別可能な部分のアイデンティティを決定する工程をさらに含む 、[34]〜[42]のいずれか一項に記載の方法。
[44] 前記遊離したタグの少なくとも85〜99%が、前記細孔を通り抜けて移行する、[34]〜[43]のいずれか一項に記載の方法。
[45] 前記化合物が、可逆性ターミネーターをさらに含む、[34]〜[44]のいずれか一項に記載の方法。
[46] 工程(b)の各反復後に、前記可逆性ターミネーターを除去する工程をさらに含む、[45]に記載の方法。
[47] 前記可逆性ターミネーターが、生物学的手段、化学的手段、物理的手段によって、または光照射によって除去される、[46]に記載の方法。
[48] 前記細孔の内部が、前記タグのまたは前記タグが付着している前記ポリリン酸の電荷に対して反対の符号の電荷を有する、[34]〜[47]のいずれか一項に記載の方法。
[49] 前記伝導性測定システムの前記第1および前記第2の区画の各々が、電荷を有する、[34]〜[48]のいずれか一項に記載の方法。
[50] 前記第1および前記第2の区画の前記電荷の極性が、反対である、[49]に記載の方法。
[51] 前記第1および前記第2の区画の前記電荷が、調節可能である、[49]に記載の方法。
[52] 工程(b)において前記細孔を通り抜けて移行する前記タグの速度が、タグの前記電荷と前記第1および前記第2の区画の前記電荷とに基づいて決定される、[34]〜[51]のいずれか一項に記載の方法。
[53] 前記第1および前記第2の区画の各々が、工程(a)において前記タグまたは前記タグが付着している前記ポリリン酸が遊離する速度を超えるか、または同じ速度で、工程(b)において前記タグが前記細孔を通り抜けて移行するような電荷を有する、[34]〜[52]のいずれか一項に記載の方法。
[54] 少なくとも第1および第2の電解質溶液を分離している電気的抵抗がある障壁と;
前記電気的抵抗がある障壁は、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を含み;
前記第1および第2の電解質溶液の少なくとも一方にある、タグを持つ少なくとも1つの化合物と;
前記少なくとも1つの細孔は、印加電位によって前記第1および第2の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており;
前記少なくとも1つの細孔は、前記化合物から前記タグを切断して前記タグを遊離するように構成された特徴部を含み;
前記イオン電流を測定する手段、ならびに前記少なくとも1つの細孔が前記タグによって遮られていない時間および前記タグが伝導性の低下したパルスを引き起こす時間も含めて、時系列としてその時間経過を記録する手段と
を含む伝導性測定システム。
[55] 前記タグが、前記細孔においてイオン電流帯域幅の制限より長い滞留時間および前記イオン電流を測定する前記手段の電流ショットノイズを有する、[54]に記載の伝導性測定システム。
[56] 遮られていない細孔の伝導性レベルと統計的に一致する領域、および伝導性の低下したパルス、また伝導性の低下した個々のパルス内の統計的に定常なセグメントに伝導性時系列のセグメントを記述する方法であって、前記伝導性時系列が、
少なくとも第1および第2の電解質溶液を分離している電気的抵抗がある障壁と;
前記電気的抵抗がある障壁は、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を含み;
前記第1および第2の電解質溶液の少なくとも一方にある、タグを持つ少なくとも1つの化合物と;
前記少なくとも1つの細孔は、印加電位によって前記第1および第2の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており;
前記少なくとも1つの細孔は、前記化合物から前記タグを切断して前記タグを遊離するように構成された特徴部を含み;
前記イオン電流を測定する手段、ならびに前記少なくとも1つの細孔が前記タグによって遮られていない時間および前記タグが伝導性の低下したパルスを引き起こす時間も含めて、前記伝導性時系列を記録する手段と
を含む伝導性測定システムで生成され;
伝導性時系列のセグメントを記述するための前記方法が、
(a)前記未加工伝導性時系列から推定した、ヒドンマルコフモデルの連続密度の最尤状態配列のビタビ復号と;
(b)開孔伝導性レベルからの逸脱に対する閾値との比較による伝導性の低下したパルスの領域の記述と;
(c)各セグメントに対する前記イオン電流レベルの前記中心傾向を推定することによって、または中心傾向とセグメント継続時間を一緒に測定することによって、伝導性の低下したパルスを特徴づける手段とからなる群から選択され、セグメント中心傾向の前記測定が、
(i)連続密度ヒドンマルコフモデルの一部として前記伝導性時系列から推定した第1のGMMのガウス成分の平均パラメータと;
(ii)算術平均と;
(iii)トリム平均と;
(iv)中央値と;
(v)サンプル位置の最大事後推定量、またはサンプル位置の最尤推定量と
からなる群から選択される方法。
[57] (a)伝導性セグメントの中心傾向の前記測定に基づく第2の混合ガウスモデルの最尤法推定と;
(b)前記伝導性時系列のセグメントの中心傾向の前記推定の経験的確率密度の補間および平滑化、ならびに前記補間する関数の導関数の平方根によるピーク検出と;
(c)多モード分布推定量のモードを位置指定する別の手段との少なくとも1つをさらに含む、[56]に記載の方法。
[58] 溶液中の化合物の少なくとも1つのパラメータを決定する方法であって、
第1の貯蔵部に第1の流体を入れることと;
第2の貯蔵部に第2の流体を入れることと;
前記第1および前記第2の流体の少なくとも一方は、少なくとも1つの化合物を含み、前記化合物は、タグ付けされたヌクレオチドまたはタグ付けされたヌクレオチドから切断されたタグであり;
前記第1の貯蔵部内の前記第1の流体は、電気的抵抗がある障壁で前記第2の貯蔵部内の前記第2の流体と分離されており;
前記電気的抵抗がある障壁は、少なくとも1つの細孔を含み;
前記第1と前記第2の流体の間の電位により、前記第1の流体、前記少なくとも1つの細孔、および前記第2の流体にイオン電流を流すことと;
前記少なくとも1つの細孔を通って流れる前記イオン電流および前記イオン電流の変化の継続時間を測定することと;
前記イオン電流の前記測定は、前記少なくとも1つの細孔と相互作用している前記化合物によって引き起こされる前記イオン電流の減少を測定するのに十分な一定の時間実行され;
前記イオン電流の前記変化および前記一定の時間を通じての前記イオン電流の前記変化の前記継続時間を数理的に解析することによって、前記化合物の少なくとも1つのパラメータを決定することと
を含み、前記数理解析が、
i)連続密度ヒドンマルコフモデルの一部として前記伝導性時系列から推定した第1のGMMのガウス成分の平均パラメータと;
ii)事象平均抽出と;
iii)最尤事象状態割り当てと;
iv)閾値検出および平均化と;
v)スライディングウインドウ分析と;
vi)算術平均と;
vii)トリム平均と;
viii)中央値と;
ix)サンプル位置の最大事後推定量、またはサンプル位置の最尤推定量と
からなる群から選択される少なくとも1つの工程を含む、方法。
[59] 前記化合物が、前記イオン電流の前記減少を測定する前に、ホスファターゼで処理される、[56]〜[58]のいずれか一項に記載の方法。
[60] 前記化合物が、第1の正味電荷、および化学的、物理的または生物学的反応の後に、異なる第2の正味電荷を有する選択的に帯電した化合物である、[56]〜[59]のいずれか一項に記載の方法。
[61] 前記数理解析が、GMM、閾値検出および平均化、ならびにスライディングウインドウ分析からなる群から選択される、[56]〜[60]のいずれか一項に記載の方法。
[62] 前記少なくとも1つのパラメータが、前記化合物の濃度、サイズ、電荷および組成からなる群から選択される、[56]〜[61]のいずれか一項に記載の方法。
[63] 前記伝導性測定システムを較正する工程をさらに含む、[30]〜[53]および[56]〜[62]のいずれか一項に記載の方法。
[64] 精度が、4σより大きい、[30]〜[53]および[56]〜[63]のいずれか一項に記載の方法。
[65] 精度が、5σより大きい、[30]〜[53]および[56]〜[63]のいずれか一項に記載の方法。
[66] 精度が、6σより大きい、[30]〜[53]および[56]〜[63]のいずれか一項に記載の方法。
[67] ヌクレオチド重合事象において切断され、ナノ細孔を用いて検出することができるタグを含む、タグ付けされたヌクレオチド。
[68] 前記タグが、前記ヌクレオチドの5’−リン酸に付着している、[67]に記載のヌクレオチド。
[69] 前記タグが発蛍光団ではない、[67]に記載のヌクレオチド。
[70] 前記タグが、その電荷、形状、サイズまたはそれらの任意の組合せによって検出可能である、[67]に記載のヌクレオチド。
[71] 前記第1および第2の電解質溶液が同じである、[1]に記載の伝導性測定システム。
[72] 前記第1および前記第2の電解質溶液が同じである、[54]に記載の伝導性測定システム。
[73] 前記第1および前記第2の電解質溶液が同じである、[56]に記載の方法。
[74] 前記第1の流体および前記第2の流体が同じである、[58]に記載の方法。
[75] ヌクレオチド重合事象において切断され、ナノ細孔を用いて検出することができるタグを含む、タグ付けされたヌクレオチド。
[76] 前記タグが、前記ヌクレオチドの5’−リン酸に付着している、[75]に記載のヌクレオチド。
[77] 前記タグが発蛍光団ではない、[75]に記載のヌクレオチド。
[78] 前記タグが、その電荷、形状、サイズまたはその任意の組合せによって検出可能である、[75]に記載のヌクレオチド。
[79] 核酸配列を決定する方法であって、別々にアドレス可能な部位のアレイを用意し、各部位が、核酸ポリメラーゼが付着しているナノ細孔を有することと、前記アレイの所与の部位で、タグ付けされたヌクレオチドをポリメラーゼで重合させることとを含み、タグが遊離し、前記所与の部位でナノ細孔によって検出される、方法。
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Claims (15)
- 構造
- 前記タグは、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を更に含む、請求項1に記載の化合物。
- 前記タグは、前記化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、前記タグの電荷の大きさが、前記化合物の残りの電荷の大きさと同じである、請求項1または2に記載の化合物。
- 前記タグが正電荷を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記タグが、適切な数のリシンまたはアルギニンをさらに含み、リン酸の数の均衡を保つ、請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記タグが、その電荷、形状、サイズまたはその任意の組合せによって検出可能である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記タグの除去により、化合物の電荷が変化する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記リンカーが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、異なる長さおよび分子量のPEG、有機または無機染料、蛍光および蛍光性染料、薬物、オリゴヌクレオチド、マスタグ、化学発光化合物を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物。
- 請求項1に記載の異なる4種類の化合物を含む組成物であって、第1の種類の化合物の前記塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第2の種類の化合物の前記塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第3の種類の化合物の前記塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第4の種類の化合物の前記塩基がチミンもしくはその誘導体またはウラシルもしくはその誘導体であり、各種類の化合物にある前記タグが他の3種類の化合物の各々にある前記タグと異なる、組成物。
- 一本鎖DNAのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)前記一本鎖DNAを、
少なくとも第1の電解質溶液を含む第1の区画と、少なくとも第2の電解質溶液を含む第2の区画とを分離し、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を含む、電気的抵抗がある障壁、および
前記電気的抵抗がある障壁を越えて印加電位を生じるように構成された少なくとも1つの電極を含み、
前記少なくとも1つの細孔が、前記印加電位によって前記第1および第2の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており、且つ
前記少なくとも1つの細孔は、該細孔の入口に隣接して該細孔に結合するポリメラーゼ を有する、
伝導性測定システム;および
構造
前記タグが、天然の塩基を有するヌクレオチド、および(i)少なくとも1つの脱塩基部位、または(ii)修飾塩基を有する少なくとも1つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、前記タグは発蛍光団ではなく、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、Xがリンカーであって、O、NH、SまたはCH2を含んでよく、ZがO、SまたはBH3であり、nが1、2、3または4であり、第1の種類の化合物の前記塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第2の種類の化合物の前記塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第3の種類の化合物の前記塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第4の種類の化合物の前記塩基がチミンもしくはその誘導体であり;
前記一本鎖DNAが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、DNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の前記一本鎖DNAのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物のうちの1つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖DNAがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離することと;
(b)前記障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記DNA伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖DNA中の前記ヌクレオチド残基を同定することと;
(c)配列決定される前記一本鎖DNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(b)を繰り返し実施することと;
を含み、それによって、前記一本鎖DNAの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。 - 一本鎖DNAのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)前記一本鎖DNAを、
少なくとも第1の電解質溶液を含む第1の区画と、少なくとも第2の電解質溶液を含む第2の区画とを分離し、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を含む、電気的抵抗がある障壁、および
前記電気的抵抗がある障壁を越えて印加電位を生じるように構成された少なくとも1つの電極を含み、
前記少なくとも1つの細孔が、前記印加電位によって前記第1および第2の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており、且つ
前記少なくとも1つの細孔は、該細孔の入口に隣接して該細孔に結合するポリメラーゼ
を有する、
伝導性測定システム;および
構造
前記タグが、天然の塩基を有するヌクレオチド、および(i)少なくとも1つの脱塩基部位、または(ii)修飾塩基を有する少なくとも1つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、前記タグは発蛍光団ではなく、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、Xがリンカーであって、O、NH、SまたはCH2を含んでよく、ZがO、SまたはBH3であり、前記塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはこれらの塩基のうちの1つの誘導体であり、nが1、2、3または4であり;
前記一本鎖DNAが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、DNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側にある前記一本鎖DNAのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖DNAがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との前記接触を反復して繰り返し、ただし(1)前記化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、(2)前記化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり;
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離することと;
(b)前記障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記DNA伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖DNA中の前記ヌクレオチド残基を同定することと;
(c)配列決定される前記一本鎖DNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(a)および(b)を反復して実施することと;
を含み、それによって、前記一本鎖DNAの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。 - 一本鎖RNAのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)前記一本鎖RNAを、
少なくとも第1の電解質溶液を含む第1の区画と、少なくとも第2の電解質溶液を含む第2の区画とを分離し、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を含む、電気的抵抗がある障壁、および
前記電気的抵抗がある障壁を越えて印加電位を生じるように構成された少なくとも1つの電極を含み、
前記少なくとも1つの細孔が、前記印加電位によって前記第1および第2の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており、且つ
前記少なくとも1つの細孔は、該細孔の入口に隣接して該細孔に結合するポリメラーゼ
を有する、
伝導性測定システム;および
構造
前記タグが、天然の塩基を有するヌクレオチド、および(i)少なくとも1つの脱塩基部位、または(ii)修飾塩基を有する少なくとも1つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、前記タグは発蛍光団ではなく、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、Xがリンカーであって、O、NH、SまたはCH2を含んでよく、ZがO、SまたはBH3であり、nが1、2、3または4であり、第1の種類の化合物の前記塩基が、アデニンまたはその誘導体であり、第2の種類の化合物の前記塩基が、グアニンまたはその誘導体であり、第3の種類の化合物の前記塩基が、シトシンまたはその誘導体であり、第4の種類の化合物の前記塩基が、ウラシルまたはその誘導体であり、各種類の化合物にある前記タグが、他の3種類の化合物の各々にある前記タグと異なり;
前記一本鎖RNAが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、RNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖RNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側の前記一本鎖RNAのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物のうちの1つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖RNAがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離することと;
(b)前記障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記RNA伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖RNA中の前記ヌクレオチド残基を同定することと;
(c)配列決定される前記一本鎖RNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(b)を繰り返し実施することと;
を含み、それによって、前記一本鎖RNAの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。 - 一本鎖RNAのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)前記一本鎖RNAを、
少なくとも第1の電解質溶液を含む第1の区画と、少なくとも第2の電解質溶液を含む第2の区画とを分離し、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも1つの細孔を含む、電気的抵抗がある障壁、および
前記電気的抵抗がある障壁を越えて印加電位を生じるように構成された少なくとも1つの電極を含み、
前記少なくとも1つの細孔が、前記印加電位によって前記第1および第2の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており、且つ
前記少なくとも1つの細孔は、該細孔の入口に隣接して該細孔に結合するポリメラーゼ を有する、
伝導性測定システム;および
構造
前記タグが、天然の塩基を有するヌクレオチド、および(i)少なくとも1つの脱塩基部位、または(ii)修飾塩基を有する少なくとも1つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、前記タグは発蛍光団ではなく、R1がOHであり、R2がHまたはOHであり、Xがリンカーであって、O、NH、SまたはCH2を含んでよく、ZがO、SまたはBH3であり、前記塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはこれら塩基のうちの1つの誘導体であり、nが1、2、3または4であり;
前記一本鎖RNAが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、RNA伸長産物を形成するように、プライマーの3’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖DNAのヌクレオチド残基の直ぐ5’側にある前記一本鎖RNAのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖RNAがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との前記接触を反復して繰り返し、ただし(1)前記化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、(2)前記化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離することと;
(b)前記障壁を越えて電界を印加し、工程(a)において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程(a)においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記RNA伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖RNA中の前記ヌクレオチド残基を同定することと;
(c)配列決定される前記一本鎖RNAの各ヌクレオチド残基に対して工程(a)および(b)を反復して実施することと;
を含み、それによって、前記一本鎖RNAの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。 - 前記タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの1つ以上を更に含む、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リンカーは、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、異なる長さおよび分子量のPEG、有機または無機染料、蛍光および蛍光性染料、薬物、オリゴヌクレオチド、マスタグ、または化学発光化合物を含む、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
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