CN108949944A - 产生用于纳米孔传感器的双层的方法 - Google Patents

产生用于纳米孔传感器的双层的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108949944A
CN108949944A CN201810865708.1A CN201810865708A CN108949944A CN 108949944 A CN108949944 A CN 108949944A CN 201810865708 A CN201810865708 A CN 201810865708A CN 108949944 A CN108949944 A CN 108949944A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nano
pore
nucleic acid
molecule
acid molecules
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810865708.1A
Other languages
English (en)
Inventor
兰德尔·戴维斯
R·陈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Sequencing Solutions Inc
Original Assignee
Genia Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genia Technologies Inc filed Critical Genia Technologies Inc
Publication of CN108949944A publication Critical patent/CN108949944A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/5432—Liposomes or microcapsules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00306—Reactor vessels in a multiple arrangement
    • B01J2219/00313—Reactor vessels in a multiple arrangement the reactor vessels being formed by arrays of wells in blocks
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00653—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to electrodes embedded in or on the solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00734—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3517—Marker; Tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/607—Detection means characterised by use of a special device being a sensor, e.g. electrode
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/631—Detection means characterised by use of a special device being a biochannel or pore

Abstract

本申请提供了产生用于纳米孔传感器的双层的方法。本申请还提供了生物芯片以及用于制造生物芯片的方法。生物芯片可在邻近或靠近电极的膜(例如，脂双层)中包含纳米孔。还描述了用于形成膜和向膜中插入纳米孔的方法。该生物芯片和方法可用于核酸(例如，DNA)测序。本文还描述了使用生物芯片对分子(例如蛋白质)进行检测、分选和分箱的方法。

Description

产生用于纳米孔传感器的双层的方法
本申请是申请日为2013年2月15日，申请号为201380015148.6，发明名称为“产生用于纳米孔传感器的双层的方法”的申请的分案申请。
交叉引用
本申请要求2012年2月16日提交的美国临时专利申请号61/599,871及2012年2月17日提交的美国临时专利申请号61/600,398的权益，这些临时申请各自通过引用整体并入本文。
发明背景
核酸测序是一个可用于提供核酸样品的序列信息的过程。这样的序列信息在对受试者进行诊断和/或治疗中可能是有帮助的。例如，受试者的核酸序列可用于鉴别、诊断遗传疾病，并且可能开发针对该遗传疾病的治疗。作为另一个例子，对病原体的研究可导致针对接触性传染病的治疗。分子检测(例如，对蛋白质的检测)在对受试者进行诊断和/或治疗中同样可能是有帮助的。
有可获得的方法可用于对核酸进行测序和/或对分子进行检测。然而，这样的方法是昂贵的，而且可能无法在一个时间段内精确地提供对诊断和/或治疗受试者而言可能是必要的序列信息。
发明内容
纳米孔可用于对包括核酸分子在内的聚合物进行测序，和/或检测诸如蛋白质等分子。聚合物的例子包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。本文认识到对改进的核酸分子鉴别、核酸测序及分子检测的方法的需求。本文所描述的是用于形成脂双层(本文中也称为“双层”)并将纳米孔插入靠近传感器的双层中的方法。
在一些情况下，聚合物(例如，核酸)穿过纳米孔，而该聚合物的各种亚单位(例如，核酸的腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和/或尿嘧啶(U)碱基)可影响流过纳米孔的电流。如本文所述，可通过在跨纳米孔和/或跨膜施加的多个电压下测量电流来鉴别各种亚单位。
在一个方面，形成用于纳米孔传感器的膜(例如，脂双层)的方法包括(a)将缓冲溶液引入流动通道中，该流动通道包含其上具有材料层的电极，其中该缓冲溶液是导电的，并且其中该材料层包含膜的一种或多种组分(例如，脂质)；(b)使所述缓冲溶液与所述材料层接触；(c)测量通过所述电极的电流，以确定材料层的至少一部分是否已在电极的全部或一部分上形成膜(例如，脂双层)；以及(d)基于(c)的确定，向电极施加刺激，以诱导材料层的至少一部分形成邻近该电极的膜。
在一些实施方案中，在(c)中向所述电极施加一个或多个电压。
在一些实施方案中，所述电压高到足以破坏电极上的双层。
在一些实施方案中，所述刺激同时施加于所有电极上。
在一些实施方案中，所述刺激包括以下中的至少一个：在电极表面上流过的液体流、在电极表面上流过的一种或多种不同液体的连续流、在电极表面上流过的一个或多个气泡的流、电脉冲、超声脉冲、压力脉冲或声脉冲。
在一些实施方案中，包含一个或多个孔蛋白(porin)蛋白质的材料层包含一种或多种表面活性剂，该表面活性剂的浓度低于该表面活性剂的临界胶束浓度。
在一些实施方案中，所述流动通道包括多个电极。
在一些实施方案中，所述材料层包含脂质。在某些情况下，所述材料层包含至少2种、3种、4种、5种或10种类型的脂质。
在一些实施方案中，所述材料层包含孔蛋白。
在一些实施方案中，所述孔蛋白质是耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)孔蛋白A(MspA)，α-溶血素，与耻垢孔蛋白A(MspA)或α-溶血素中的至少一个具有至少70％同源性的任何蛋白质，或它们的任意组合。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在(d)之后，通过所述电极施加电刺激，以便于孔蛋白质在膜(例如，脂双层)中的插入。
在一些实施方案中，所述膜和所述孔蛋白质共同表现出约1GΩ或更小的电阻。
在一些实施方案中，不含孔蛋白质的膜表现出大于约1GΩ的电阻。
在一些实施方案中，缓冲溶液的压力被选择为使得所述材料层在没有刺激的情况下形成膜。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在(a)之前，生成邻近电极的材料层。
在一些实施方案中，所述生成操作包括：引导包含一种或多种脂质的脂质溶液通过流动通道；并且将材料层沉积在电极上。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含有机溶剂。
在一些实施方案中，所述有机溶剂包含癸烷。
在一些实施方案中，所述缓冲溶液包含离子溶液。
在一些实施方案中，所述离子溶液包含氯阴离子。
在一些实施方案中，所述离子溶液包含醋酸钠。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在(a)之后，引导气泡通过流动通道；并且使所述气泡与所述材料层接触，以使得所述材料层变光滑和/或变薄。
在一些实施方案中，所述气泡是蒸汽泡。
在一些实施方案中，所述方法还包括：使孔蛋白质溶液邻近所述材料层流动，以将孔蛋白质沉积于所述材料层中；以及在流动通道中用离子溶液和/或另一种气泡使所述材料层变薄。
在一些实施方案中，脂质可选自由二植酰磷脂酰胆碱(DPhPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、二油酰磷脂酰甲酯(DOPME)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和鞘磷脂组成的组。
在一些实施方案中，暴露于流动通道的所述电极的表面是亲水性的。
在一些实施方案中，所述电极被设置成邻近流动通道的一个或多个疏水性表面。
在一些实施方案中，所述一个或多个疏水性表面被硅烷化。
在一些实施方案中，所述流动通道在芯片中形成。
在一些实施方案中，所述电极在流动通道的表面中形成。
在一些实施方案中，所述流动通道是密封的。
在一些实施方案中，所述一个或多个流动通道包括多个流动通道。
在一些实施方案中，借助于沿所述多个流动通道的导轨，所述多个流动通道彼此流体地隔开。
在一些实施方案中，所述电极为可单独寻址的电极。
在一个方面，形成用于纳米孔感测装置的膜(例如，脂双层)的方法包括：(a)提供包含多个电极和与所述多个电极相邻的材料层的芯片，其中所述材料层中的每一个包含所述膜的一种或多种成分(例如脂质)；(b)使所述材料层与缓冲溶液接触，其中该缓冲溶液是导电的；(c)向所述多个电极的至少一个子集施加刺激，以诱导所述材料层形成邻近所述多个电极的膜；及(d)根据需要重复步骤(b)和(c)，直到所述多个电极中的至少约20％在施加到所述多个电极上的约-100毫伏(mV)到-1000mV的电压脉冲下钝化(deactivate)。
在一些实施方案中，所述多个电极各自为可单独寻址的。
在一些实施方案中，根据需要重复步骤(b)和(c)，直到所述多个电极的至少约60％在施加的电压脉冲下钝化。
在一些实施方案中，所施加的电压脉冲为约-400mV至-700mV。
在一些实施方案中，所述刺激包括以下中的至少一个：在电极表面上流过的液体流、在电极表面上流过的一种或多种不同液体的连续流、在电极表面上流过的一个或多个气泡的流、电脉冲、超声脉冲、压力脉冲或声脉冲。
在一些实施方案中，所述材料层中的每一个包含孔蛋白质。
在一些实施方案中，所述孔蛋白质是耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)，α-溶血素，与耻垢孔蛋白A(MspA)或α-溶血素中的至少一个具有至少70％同源性的任何蛋白质，或它们的任意组合。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在(c)后，通过所述电极的至少一个子集施加电刺激，以便于孔蛋白质在每个脂双层中的插入。
在一些实施方案中，所述方法还包括：使所述多个电极与脂质溶液接触，以形成材料层，其中该脂质溶液包含脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含有机溶剂。
在一些实施方案中，所述有机溶剂包含癸烷。
在一些实施方案中，所述缓冲溶液包含离子溶液。
在一些实施方案中，所述离子溶液包含氯阴离子。
在一些实施方案中，所述离子溶液包含醋酸钠。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在步骤(a)与(b)之间，引导气泡邻近每个材料层。
在一些实施方案中，所述电极被密封在所述芯片的一个或多个流动通道中。
在一个方面，用于检测靶分子的方法包括：(a)提供在邻近或靠近感测电极设置的膜中包含纳米孔的芯片；(b)引导核酸分子穿过纳米孔，其中该核酸分子与报道分子相关联，其中该核酸分子包含地址区域和探针区域，其中该报道分子与核酸分子在探针区域相关联，并且其中该报道分子与靶分子偶联；(c)在引导所述核酸分子穿过纳米孔的同时对地址区域进行测序，以确定该地址区域的核酸序列；及(d)在计算机处理器的辅助下，基于在(c)中确定的地址区域的核酸序列，鉴别靶分子。
在一些实施方案中，在(b)中，通过报道分子与所述核酸分子的探针区域的结合，将(b)中的探针分子保持在孔中。
在一些实施方案中，当核酸分子通过纳米孔的前进速率降低时，该核酸分子的最多三个碱基得到鉴别。
在一些实施方案中，当核酸分子通过纳米孔的前进速率降低时，该核酸分子的最多五个碱基得到鉴别。
在一些实施方案中，在报道分子与纳米孔相互作用时，核酸分子通过纳米孔的前进速率降低。
在一些实施方案中，在(b)中，核酸分子通过纳米孔的前进速率停止或停顿。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在(d)之前，确定核酸分子通过纳米孔的前进速率是否已经降低。
在一些实施方案中，在(d)中，若核酸分子通过纳米孔的前进速率已经降低，则靶分子得到鉴别。
在一些实施方案中，在(d)中，基于(i)地址区域的核酸序列和关联与(ii)核酸分子通过纳米孔的前进速率之间的相关性，来鉴别靶分子。
在一些实施方案中，所述纳米孔是可单独寻址的。
在一些实施方案中，所述核酸分子是单链的。
在一些实施方案中，所述方法还包括将核酸分子捕获于纳米孔中。
在一些实施方案中，在形成于核酸分子的一个或多个端部的大体积结构(bulkystructure)的辅助下，该核酸分子被捕获于纳米孔中。
在一些实施方案中，在附着于核酸分子的一个或多个端部的大体积结构的辅助下，该核酸分子被捕获于纳米孔中。
在一些实施方案中，所述方法还包括逆转核酸分子穿过纳米孔的流动方向。
在一些实施方案中，所述方法还包括，当逆转核酸分子的流动方向时，对地址区域的至少一部分进行重新测序。
在一些实施方案中，所述报道分子在所述报道分子的端部包含抗体或适体，并且其中所述抗体或适体与靶分子相关联。
在一些实施方案中，地址区域和探针区域具有已知的核酸序列。
在一些实施方案中，所述报道分子包含与探针区域的核酸序列互补的核酸序列。
在一些实施方案中，在被引导穿过纳米孔之前，所述核酸分子与报道分子相关联。
在一些实施方案中，在(b)之前，所述核酸分子穿过纳米孔，并且其中，在(b)中，所述报道分子与已穿过纳米孔的所述核酸分子相关联。
具体地，本申请提供了以下项目的内容：
1.一种形成用于纳米孔传感器的脂双层的方法，其包括：
(a)将缓冲溶液引入流动通道中，该流动通道包含其上具有材料层的电极，其中所述缓冲溶液是导电的，并且其中所述材料层包含一种或多种脂质；
(b)使所述缓冲溶液与所述材料层接触；
(c)测量通过所述电极的电流，以确定所述材料层的至少一部分是否已形成邻近所述电极的脂双层；以及
(d)基于(c)的确定，向所述电极施加刺激，以诱导所述材料层的至少一部分形成邻近所述电极的所述脂双层。
2.如项目1所述的方法，其中，在(c)中，向所述电极施加一个或多个电压。
3.如项目2所述的方法，其中所述电压被选择为断裂或破坏所述电极上的双层。
4.如项目1所述的方法，其中所述刺激包括以下中的至少一个：在电极表面上流过的液体流、在电极表面上流过的一种或多种不同液体的连续流、在电极表面上流过的一个或多个气泡的流、电脉冲、超声脉冲、压力脉冲或声脉冲。
5.如项目1所述的方法，其中所述材料层包含一个或多个孔蛋白和一种或多种表面活性剂，该表面活性剂的浓度低于该表面活性剂的临界胶束浓度。
6.如项目1所述的方法，其中所述流动通道包括多个电极，其中所述多个电极包括所述电极。
7.如项目6所述的方法，其中所述刺激同时施加于所述多个电极。
8.如项目1所述的方法，其中所述材料层包含至少两种类型的脂质。
9.如项目1所述的方法，其中所述材料层包含孔蛋白质。
10.如项目9所述的方法，其中所述孔蛋白质是耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)，α-溶血素，与耻垢孔蛋白A(MspA)或α-溶血素中的至少一个具有至少70％同源性的任何蛋白质，或它们的任意组合。
11.如项目9所述的方法，其还包括，在(d)之后，通过所述电极施加电刺激，以便于所述孔蛋白质在所述脂双层中的插入。
12.如项目11所述的方法，其中所述脂双层和所述孔蛋白质共同表现出约1GΩ或更小的电阻。
13.如项目1所述的方法，其中所述不含孔蛋白质的脂双层表现出大于约1GΩ的电阻。
14.如项目1所述的方法，其中所述缓冲溶液的压力被选择为使得所述材料层在没有所述刺激的情况下形成所述脂双层。
15.如项目1所述的方法，其还包括，在(a)之前，生成邻近所述电极的所述材料层。
16.如项目15所述的方法，其中所述生成包括：
引导包含所述一种或多种脂质的脂质溶液通过所述流动通道；和
将所述材料层沉积在所述电极上。
17.如项目16所述的方法，其中所述脂质溶液包含有机溶剂。
18.如项目17所述的方法，其中所述有机溶剂包含癸烷。
19.如项目1所述的方法，其中所述缓冲溶液包含离子溶液。
20.如项目19所述的方法，其中所述离子溶液包含氯阴离子。
21.如项目20所述的方法，其中所述离子溶液包含醋酸钠。
22.如项目1所述的方法，其还包括，在(a)之后，
引导气泡通过所述流动通道；和
使所述气泡与所述材料层接触，以使所述材料层变光滑和/或变薄。
23.如项目22所述的方法，其中所述气泡是蒸汽泡。
24.如项目18所述的方法，其还包括：
使孔蛋白质溶液邻近所述材料层流动，以将孔蛋白质沉积于所述材料层中；和
在所述流动通道中用离子溶液和/或另一种气泡使所述材料层变薄。
25.如项目1所述的方法，其中所述一种或多种脂质选自由二植酰磷脂酰胆碱(DPhPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、二油酰磷脂酰甲酯(DOPME)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和鞘磷脂组成的组。
26.如项目1所述的方法，其中暴露于所述流动通道的所述电极的表面是亲水性的。
27.如项目1所述的方法，其中所述电极被设置成邻近所述流动通道的一个或多个疏水性表面。
28.如项目27所述的方法，其中所述一个或多个疏水性表面被硅烷化。
29.如项目1所述的方法，其中所述流动通道在芯片中形成。
30.如项目1所述的方法，其中所述电极在所述流动通道的表面中形成。
31.如项目1所述的方法，其中所述流动通道是密封的。
32.如项目1所述的方法，其中所述一个或多个流动通道包括多个流动通道。
33.如项目32所述的方法，其中借助于沿所述多个流动通道的导轨，所述多个流动通道彼此流体地隔开。
34.如项目1所述的方法，其中所述电极为可单独寻址的电极。
35.如项目1所述的方法，其中(c)还包括确定所述材料层的至少一部分是否已经在所述电极的全部或一部分上形成脂双层。
36.一种形成用于纳米孔感测装置的脂双层的方法，其包括：
(a)提供包含多个电极和与所述多个电极相邻的材料层的芯片，其中所述材料层中的每一个包含脂质；
(b)使所述材料层与缓冲溶液接触，其中所述缓冲溶液是导电的；
(c)向所述多个电极的至少一个子集施加刺激，以诱导所述材料层形成邻近所述多个电极的脂双层；及
(d)根据需要重复步骤(b)和(c)，直到所述多个电极中的至少约20％在施加到所述多个电极上的约-100毫伏(mV)至-1000mV的电压脉冲下钝化。
37.如项目36所述的方法，其中所述多个电极各自为可单独寻址的。
38.如项目36所述的方法，其中根据需要重复步骤(b)和(c)，直到所述多个电极中的至少约60％在所述施加的电压脉冲下钝化。
39.如项目36所述的方法，其中所述施加的电压脉冲为约-400mV至-700mV。
40.如项目36所述的方法，其中所述刺激包括以下中的至少一个：在电极表面上流过的液体流、在电极表面上流过的一种或多种不同液体的连续流、在电极表面上流过的一个或多个气泡的流、电脉冲、超声脉冲、压力脉冲或声脉冲。
41.如项目36所述的方法，其中所述材料层中的每一个包含孔蛋白质。
42.如项目41所述的方法，其中所述孔蛋白质是耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)，α-溶血素，与耻垢孔蛋白A(MspA)或α-溶血素中的至少一个具有至少70％同源性的任何蛋白质，或它们的任意组合。
43.如项目41所述的方法，其还包括，在(c)后，通过所述电极的至少一个子集施加电刺激，以便于所述孔蛋白质在每个所述脂双层中的插入。
44.如项目36所述的方法，其中(a)还包括：
使所述多个电极与脂质溶液接触，以形成所述材料层，其中所述脂质溶液包含所述脂质。
45.如项目44所述的方法，其中所述脂质溶液包含有机溶剂。
46.如项目45所述的方法，其中所述有机溶剂包含癸烷。
47.如项目36所述的方法，其中所述缓冲溶液包含离子溶液。
48.如项目47所述的方法，其中所述离子溶液包含氯阴离子。
49.如项目48所述的方法，其中所述离子溶液包含醋酸钠。
50.如项目36所述的方法，其还包括，在步骤(a)与(b)之间，引导气泡邻近所述材料层中的每一个。
51.如项目36所述的方法，其中所述电极被密封在所述芯片的一个或多个流动通道中。
52.一种用于检测靶分子的方法，其包括：
(a)提供在邻近或靠近感测电极设置的膜中包含纳米孔的芯片；
(b)引导核酸分子穿过所述纳米孔，其中所述核酸分子与报道分子相关联，其中所述核酸分子包含地址区域和探针区域，其中所述报道分子与所述核酸分子在所述探针区域相关联，并且其中所述报道分子与靶分子偶联；
(c)在引导所述核酸分子穿过所述纳米孔的同时对所述地址区域进行测序，以确定所述地址区域的核酸序列；及
(d)在计算机处理器的辅助下，基于在(c)中确定的所述地址区域的核酸序列，鉴别所述靶分子。
53.如项目52所述的方法，其中通过报道分子与所述核酸分子的探针区域的结合，将(b)中的探针分子保持在所述孔中。
54.如项目53所述的方法，其中当所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率降低时，所述核酸分子的最多三个碱基得到鉴别。
55.如项目53所述的方法，其中当所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率降低时，所述核酸分子的最多五个碱基得到鉴别。
56.如项目53所述的方法，其中在所述报道分子与所述纳米孔相互作用时，所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率降低。
57.如项目52所述的方法，其中在(b)中，所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率停止或停顿。
58.如项目52所述的方法，其还包括，在(d)之前，确定所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率是否已经降低。
59.如项目52所述的方法，其中，在(d)中，若确定所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率已经降低，则所述靶分子得到鉴别。
60.如项目52所述的方法，其中，在(d)中，基于(i)所述地址区域的核酸序列和关联与(ii)所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率之间的相关性，鉴别所述靶分子。
61.如项目52所述的方法，其中所述纳米孔为可单独寻址的。
62.如项目52所述的方法，其中所述核酸分子是单链的。
63.如项目52所述的方法，其还包括将所述核酸分子捕获于所述纳米孔中。
64.如项目63所述的方法，其中在形成于所述核酸分子的一个或多个端部的大体积结构的辅助下，所述核酸分子被捕获于所述纳米孔中。
65.如项目63所述的方法，其中在附着于所述核酸分子的一个或多个端部的大体积结构的辅助下，所述核酸分子被捕获于所述纳米孔中。
66.如项目52所述的方法，其还包括逆转所述核酸分子穿过所述纳米孔的流动方向。
67.如项目66所述的方法，其还包括当逆转所述核酸分子的流动方向时，对所述地址区域的至少一部分进行重新测序。
68.如项目52所述的方法，其中所述报道分子在所述报道分子的端部包含抗体或适体，并且其中所述抗体或适体与所述靶分子相关联。
69.如项目52所述的方法，其中地址区域和探针区域具有已知的核酸序列。
70.如项目52所述的方法，其中所述报道分子包含与所述探针区域的核酸序列互补的核酸序列。
71.如项目52所述的方法，其中在被引导穿过所述纳米孔之前，所述核酸分子与所述报道分子相关联。
72.如项目52所述的方法，其中，在(b)之前，所述核酸分子穿过所述纳米孔，并且其中，在(b)中，所述报道分子与已穿过所述纳米孔的所述核酸分子相关联。
通过以下的详细描述(其中仅示出并描述了说明性的实施方案)，本发明的其他方面和优势对本领域技术人员而言将变得显而易见。正如将会认识到的，本发明能够有其他不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开内容。因此，附图和说明将被视为说明性的，而非限制性的。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利和专利申请通过引用而并入。
附图说明
本发明的新特征在随附的权利要求中具体阐述。通过参考以下对在其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：
图1A、1B和1C示出了纳米孔检测器的实例。在图1A中，纳米孔被设置在电极上；在图1B中，纳米孔被插入位于孔上的膜中；而在图1C中，纳米孔被设置在突出的电极上；
图2A、2B、2C和2D示出了能用纳米孔检测的分子的实例。图2A示出了对分子的检测；图2B示出了对聚合物分子的部分的检测；图2C示出了对用于核酸测序的标签分子的检测；而图2D示出了在核苷酸掺入的同时对标签的检测；
图3示出了包含纳米孔而非加样孔(well)的芯片设置的一个实例；
图4示出了超小型测量电路的一个实例；
图5示出了纳米孔检测器的阵列；
图6示出了配置为用于控制测序仪的计算机系统；
图7示出了用于在位于传感器芯片的一个或多个流动通道上的电极上形成脂质层的方法的一个实例；
图8示出了半导体传感器芯片的一个实例；
图9示出了捕获于纳米孔中的探针分子的一个实例；
图10示出了捕获于纳米孔中的探针分子的一个实例；
图11示出了探针分子的线性序列的一个实例；
图12示出了反义链能够结合形成双链帽(cap)，该双链帽具有足够大的体积，以至于被纳米孔阻挡在外；
图13示出了使用纳米孔捕获和表征探针分子的工序流程；
图14示出了使用纳米孔捕获的探针捕获和鉴别、计数、分选和/或收集靶分子的工序流程；
图15示出了使用纳米孔捕获的探针分子计数、分箱(binning)、收集靶分子的工序流程；
图16示出了使用纳米孔捕获的探针分子检测、鉴别、计数、分箱和/或收集靶蛋白质分子的工序流程；
图17示出了使用纳米孔捕获的探针分子检测、鉴别、计数、分箱和/或收集靶蛋白质分子的工序流程；
图18示出了与报道分子标记的抗体结合的蛋白质分子的结构；
图19示出了使用纳米孔捕获的探针分子表征报道分子及抗体结合的靶分子(例如，蛋白质)的流程；
图20示出了使用纳米孔捕获的探针分子表征来自不同样品的靶分子的流程；
图21示出了减速物(speed bump)与被捕获于纳米孔中的探针分子的地址区域的结合；
图22示出了纳米孔检测器的一个实例；
图23示出了探针多核苷酸结构；
图24示出了流动池构造的一个实例；
图25示出了包装好的芯片的一个实例；
图26示出了注射泵设置的一个实例；
图27示出了手动注射器设置的一个实例；
图28示出了用泵自动化的双层形成及弹出(pop)的一个实例；
图29示出了施加的波形的一个实例；
图30示出了对于开放通道，电流对时间的一个实例；
图31示出了对于开放通道，电流对时间的一个实例；
图32示出了对于开放通道，电流对时间的一个实例；
图33示出了对于DNA捕获，电流对时间的一个实例；
图34示出了对于DNA捕获，电流对时间的一个实例；
图35示出了对于DNA捕获，电流对时间的一个实例；
图36示出了对于DNA捕获，电流对时间的一个实例；
图37示出了对于DNA捕获，电流对时间的一个实例；且
图38示出了对于双层形成后的孔，电流对时间的一个实例。
发明详述
虽然本文已经显示并描述了本发明的各种实施方案，但是对本领域技术人员显而易见的是，这些具体实施方案仅以实例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将会想到许多变化、改变和替代。应当理解，可以使用本文所述发明的实施方案的各种替代方案。
本文所用的术语“纳米孔”一般是指在膜中形成的或以其他方式提供的孔、通道或通路。膜可以是有机膜，如脂双层，或合成膜，如由聚合材料形成的膜。膜可以是聚合材料。纳米孔可被设置成邻近或接近感测电路或与感测电路耦合的电极，该感测电路例如为互补金属氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路。在一些实例中，纳米孔具有0.1纳米(nm)至约1000nm级别的特征性宽度或直径。一些纳米孔是蛋白质。α-溶血素是蛋白质纳米孔的一个实例。
本文所用的术语“聚合酶”一般是指能够催化聚合反应的任何酶或其他分子催化剂。聚合酶的实例包括但不限于核酸聚合酶或连接酶。聚合酶可以是聚合作用的酶。
本文所用的术语“核酸”一般是指包含一个或多个核酸亚单位的分子。核酸可包括选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体的一个或多个亚单位。核苷酸可包括A、C、G、T或U，或其变体。核苷酸可包括任何可被掺入生长中的核酸链的亚单位。这样的亚单位可以是A、C、G、T或U，或者是对一个或多个互补A、C、G、T或U具有特异性的，或与嘌呤(即A或G，或其变体)或嘧啶(即C、T或U，或其变体)互补的任何其他亚单位。亚单位可使得单个核酸碱基或成组的碱基(例如，AA、TA、AT、GC、CG、CT、TC、GT、TG、AC、CA或其尿嘧啶对应物)能够被分辨。在一些实例中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或其变体或衍生物。核酸可以是单链的或双链的。
本文所用的术语“多核苷酸”或“寡核苷酸”一般是指包含一个或多个核苷酸的聚合物或寡聚物。多核苷酸或寡核苷酸可包含DNA多核苷酸或寡核苷酸、RNA多核苷酸或寡核苷酸，或DNA多核苷酸或寡核苷酸和/或RNA多核苷酸或寡核苷酸的一个或多个部分。
如本文一般所用的，“核苷酸”或“碱基”可以是基本核苷酸或核苷酸类似物。基本核苷酸是脱氧腺苷单磷酸(dAMP)、脱氧胞苷单磷酸(dCMP)、脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)、脱氧胸苷单磷酸(dTMP)、腺苷单磷酸(AMP)、胞苷单磷酸(CMP)、鸟苷单磷酸(GMP)或尿苷单磷酸(UMP)。核苷酸类似物是在基本核碱基(A、C、G、T和U)、脱氧核糖/核糖结构、基本核苷酸的磷酸基团或其任意组合上具有修饰的基本核苷酸的类似物或模拟物。例如，核苷酸类似物可具有经修饰的碱基，无论是天然存在的还是人造的。经修饰的碱基的实例包括但不限于甲基化的核碱基、经修饰的嘌呤碱基(例如，次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、isodG)、经修饰的嘧啶碱基(例如，5,6-二氢尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶、isodC)、通用碱基(例如，3-硝基吡咯和5-硝基吲哚)、非结合性碱基模拟物(例如，4-甲基苯并咪唑和2,4-二氟甲苯或苯)以及无碱基(无碱基核苷酸，其中核苷酸类似物不含碱基)。具有经修饰的脱氧核糖(例如，双脱氧核苷，如双脱氧鸟苷、双脱氧腺苷、双脱氧胸苷和双脱氧胞苷)和/或磷酸结构(统称为骨架结构)的核苷酸类似物的实例包括但不限于乙二醇核苷酸、吗啉代和锁定核苷酸。
本文所用的术语“测试聚合物”一般是指出于检测目的而穿过或邻近纳米孔的聚合物分子。测试聚合物可包含多个具有相似化学结构的构件。测试聚合物的实例包括但不限于测试多核苷酸、测试肽/蛋白质和测试碳水化合物。测试多核苷酸可以是单链测试多核苷酸(即ss测试多核苷酸)或双链测试多核苷酸(即ds测试多核苷酸)。构件的实例包括但不限于核苷酸、氨基酸和单糖。
本文所用的术语“样品多核苷酸”一般是指可包含感兴趣的多核苷酸例如单链(“ss”)样品多核苷酸(ss样品多核苷酸)或双链(“ds”)样品多核苷酸(即ds样品多核苷酸，例如，ds样品DNA、ds样品RNA和ds样品DNA-RNA杂合体)的核酸分子。样品多核苷酸可以是从生物样品中获得的天然多核苷酸或合成多核苷酸。合成多核苷酸可以是通过对天然多核苷酸进行修饰而获得的多核苷酸，例如，旨在用于多核苷酸鉴别和/或测序的预加工的多核苷酸。这类预加工的实例包括但不限于：针对期望的片段对样品多核苷酸的富集、配对末端加工、配对读取加工、包括二硫化物处理在内的外遗传预加工、经由PCR的聚焦片段分析、PCR片段测序和短多核苷酸片段分析。
本文所用的术语“测试多核苷酸”一般是指出于检测目的而穿过或邻近纳米孔的多核苷酸分子。测试多核苷酸可以是单链测试多核苷酸(即ss测试多核苷酸)和双链测试多核苷酸(即ds测试多核苷酸，例如，ds测试DNA、ds测试RNA和ds测试DNA-RNA杂合体)。本文所用的单链测试多核苷酸包含在本文所述的方法中将被减速物结合的单链多核苷酸的一部分。单链测试多核苷酸可进一步包含样品多核苷酸和其他功能部分(例如，前大体积结构(pre-bulky structure)、标识符和分离标签)。
本文所用的术语“前大体积结构”一般是指在特定条件下(例如，在特定温度下，在存在/不存在特定化合物的情况下)可形成大体积结构的多核苷酸分子中的分子结构。前大体积结构的实例包括寡核苷酸结构。前大体积结构可以是单链多核苷酸或双链多核苷酸。
本文所用的术语“大体积结构”一般是指由单链测试多核苷酸分子中的前大体积结构形成的结构(例如，核苷酸)。大体积结构在工作条件下可使纳米孔中的测试多核苷酸分子减慢或停顿，直至工作条件变为另一种条件，在这种条件下大体积结构转变为前大体积结构，或者是其他可以使测试多核苷酸分子停顿的结构。大体积结构的实例包括但不限于2-D和3-D结构，如多核苷酸双链体结构(RNA双链体、DNA双链体或RNA-DNA杂合体)、多核苷酸发夹结构、多发夹结构和多臂结构。在另一个实施方案中，前大体积结构通过与对前大体积结构具有特异性的配体的相互作用而形成大体积结构。这样的前大体积结构/配体对的实例包括但不限于生物素/链霉亲和素、抗原/抗体和碳水化合物/抗体。
在一个实施方案中，大体积结构由寡核苷酸前大体积结构(例如，由单链测试多核苷酸分子中的前大体积结构形成的寡核苷酸结构)形成。多核苷酸或寡核苷酸大体积结构的实例包括但不限于发夹核酸链、杂交的反义核酸链、多臂结构和自杂交的三维DNA或RNA分子。在另一个实施方案中，大体积结构通过如本文所述的前大体积结构/配体对的相互作用而形成。
本文所用的术语“双链体”一般是指双链体结构、部分、区域或区段。双链体可包括RNA双链体、DNA双链体或DNA-RNA双链体结构、部分、区域或区段。
本文所用的术语“减速物”一般是指与测试多核苷酸分子的结合区段形成复合物的分子，如寡核苷酸。在一个实例中，当测试多核苷酸分子在施加的电势下穿过或邻近纳米孔时，在减速物与结合区段间形成的复合物使位于或邻近纳米孔的测试多核苷酸分子减慢或停顿足够长的停留时间，该停留时间足以使纳米孔检测器从测试多核苷酸分子获得信号，该信号可提供关于测试多核苷酸分子的结构或序列信息。停留时间之后，该复合物解离，测试多核苷酸分子向前移动通过纳米孔。
本文所用的术语“已知的减速物”一般是指与单链测试多核苷酸中的已知序列特异性结合的减速物。由于单链测试多核苷酸上的结合区段(已知序列)是已知的，因此减速物结构也可能是已知的(例如，与单链测试多核苷酸上的已知序列互补)。
本文所用的术语“随机减速物池”一般是指可与测试多核苷酸分子或其片段的所有或基本上所有部分结合的减速物的集合。随机减速物池的一个实例包含具有通用核碱基的寡核苷酸，该通用核碱基能与所有基本核碱基(A、T、C、G和U)碱基配对。随机减速物池的另一个实例包含具有基本核碱基的所有可能组合的给定长度的寡核苷酸。随机减速物池的另一个实例包含具有基本核碱基和通用核碱基的每种可能组合的给定长度的寡核苷酸。随机减速物池的另一个实例包含在指定位置具有通用核碱基而在其他位置具有基本核碱基的所有组合的减速物。随机减速物的另一个实例是单链减速物的组合，其与单链测试多核苷酸形成双链体部分，并且该双链体部分具有大致相同的解链温度。这些单链减速物可具有相同或不同的长度，和/或相同或不同的核苷酸。
本文所用的术语“制止物(stopper)”一般是指可与测试多核苷酸形成制止物-测试多核苷酸复合物，并且使该制止物-测试多核苷酸复合物的流动在纳米孔的缩窄区域之前停止一段停留时间的结构。该制止物可以是测试多核苷酸的一部分，或是单独的结构(例如，本文所述的减速物，和在核苷酸聚合酶的存在下形成的测试多核苷酸的反义链)，或是可与测试多核苷酸结合，并且在某些情况下使测试多核苷酸移动通过纳米孔的酶。
本文所用的术语“标识符”一般是指测试多核苷酸中可通过本文所述的方法检测或识别的已知序列或结构。标识符的实例包括但不限于方向标识符、参照信号标识符、样品来源标识符和样品标识符。标识符可包含提供可识别的独特电信号的一种或多种核苷酸或结构。这样的核苷酸和结构的实例包括但不限于isodG、isodC、甲基化核苷酸、锁定核酸、通用核苷酸和无碱基核苷酸。在一些实施方案中，无碱基核苷酸提供比基本核苷酸更强的信号。因此，通过纳米孔针对同时包含无碱基核苷酸和基本核苷酸的序列检测的电信号可提供比从仅含基本核苷酸的序列获得的电信号更强的信号。例如，相对于仅包含基本核苷酸的4至5个碱基的序列，包含约25％无碱基核苷酸的4至5个碱基的序列可提供强达两倍以上的信号。序列具有的无碱基核苷酸越多，该序列的电信号越强。因此，通过改变标识符序列中无碱基核苷酸的量，标识符可提供期望强度(例如，比具有相同长度的基本寡核苷酸强约两倍、约3、4、5、6、7、8、9或约10倍)的电信号。
本文所用的术语“方向标识符”一般是指定位在距由前大体积结构形成的大体积结构至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或50个碱基的已知序列(如图17中所示的单链测试多核苷酸分子中的阴影部分)。在一些实例中，当大体积结构形成时，其可阻止单链测试多核苷酸分子流动通过其内引入单链测试多核苷酸分子的纳米孔。在一个实例中，当大体积结构在纳米孔内部或附近停顿、减慢或停止时，可获得一组电信号，该电信号可以提供在单链测试多核苷酸分子的流动方向上位于大体积结构之前的序列以及该大体积结构的第一个碱基对的序列信息。当序列已知时，这样的电信号可以(但不限于)：(1)证实前大体积结构已经适当地形成大体积结构，以使得该大体积结构阻止单链测试多核苷酸分子流动通过纳米孔；(2)指示单链测试多核苷酸分子已经到达单链测试多核苷酸的单链部分的一个末端，和/或(3)作为参照或校准读数来基线化(base line)在同一纳米孔中获得的其他电信号。在一些实施方案中，方向标识符包含提供容易识别的独特电信号的一个或多个核苷酸或结构。这样的核苷酸和结构的实例包括但不限于isodG、isodC和无碱基核苷酸。
本文所用的术语“参照信号标识符”一般是指测试多核苷酸中的已知序列，当通过本文所述的方法检测或识别时，其可作为参照或校准读数来基线化在同一纳米孔中获得的其他电信号。
本文所用的术语“样品来源标识符”一般是指测试多核苷酸中的已知序列，当通过本文所述的方法检测或识别时，其可用于鉴别样品多核苷酸的来源。
本文所用的术语“样品标识符”一般是指测试多核苷酸中的已知序列，当通过本文所述的方法检测或识别时，其可用于鉴别个体样品多核苷酸。
本文所用的术语“接头标识符”一般是指测试多核苷酸中的已知序列，当通过本文所述的方法检测或识别时，其可用于指示样品多核苷酸部分与反义多核苷酸部分之间的过渡。在一个实例中，当检测或识别接头标识符时，样品/反义多核苷酸部分已经穿过纳米孔。
本文所用的“探针来源标识符”是探针多核苷酸中的已知序列，当通过本文所述的方法检测或识别时，其用于鉴别探针多核苷酸的来源。
本文所用的“探针标识符”是探针多核苷酸中的已知序列，当通过本文所述的方法检测或识别时，其用于鉴别单个样品多核苷酸。
“报道分子的结合位点”部分与本文所述的报道分子结合。在一些实施方案中，报道分子包括DNA、RNA或其任意组合。
本文所用的“报道分子标识符”是探针多核苷酸中的已知序列，当通过本文所述的方法检测或识别时，其用于指示报道分子与探针多核苷酸的结合。
纳米孔检测
本文提供了用纳米孔鉴别分子或其部分的系统和方法。用纳米孔鉴别诸如分子或其部分的物质的方法可包括，提供在邻近或接近电极设置的膜中包含至少一个纳米孔的生物芯片(本文中也称作“芯片”)。该电极可被适配为检测通过纳米孔的电流。该方法可进一步包括将分子或其部分插入纳米孔，并改变跨纳米孔和/或跨膜施加的电压。在一些情况下，该方法包括测量多个电压下的电流以鉴别分子或其部分。在一些实施方案中，多个电压下的电流包括电子签名，并且进一步包括将该电子签名与多个参照电子签名进行比较以鉴别分子或其部分。
纳米孔可形成于或以其他方式嵌入邻近感测电路如集成电路的感测电极设置的膜中。该集成电路可以是专用集成电路(ASIC)。在一些实例中，该集成电路是场效应晶体管或互补金属氧化物半导体(CMOS)。该感测电路可位于芯片或其他具有纳米孔的装置中，或者在芯片或装置之外，诸如芯片外(off-chip)配置。该半导体可以是任何半导体，包括但不限于IV族(例如，硅)和III-V族半导体(例如，砷化镓)。
图1示出了具有温度控制的纳米孔检测器(或传感器)的一个实例，如可以按照美国专利申请公开号2011/0193570中所述的方法制备的，该申请通过引用整体并入本文。参见图1A，纳米孔检测器包含与导电溶液(例如，盐溶液)107接触的顶部电极101。底部导电电极102靠近、邻近或接近插入膜105中的纳米孔106。在一些情况下，底部导电电极102嵌入半导体103中，其中在半导体衬底104中嵌有电路。半导体103的表面可被处理成疏水性的。所检测的样品穿过纳米孔106中的孔。半导体芯片传感器被置于包装208中，而包装208又在温度控制元件109附近。温度控制元件109可以是热电加热和/或冷却装置(例如，珀尔帖装置)。在某些情况下，所述双层跨越并覆盖电极202。
多个纳米孔检测器可形成纳米孔阵列。纳米孔阵列可包括一个或多个纳米孔检测器。在一些情况下，纳米孔阵列包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、1000、10000或100,000个纳米孔检测器。单个纳米孔检测器可包括一个或多个邻近感测电极(例如，底部导电电极102)的纳米孔。在一些情况下，单个纳米孔检测器包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或100个邻近感测电极的纳米孔。
参见图1B，其中相同的数字表示相同的元件，膜105可被放置在加样孔110之上，其中传感器102形成加样孔表面的一部分。图1C示出了一个实例，其中电极102从处理过的半导体表面103突出。
在一些实例中，膜105在底部导电电极102上形成，而非在半导体103上形成。在这样的一种情况下，膜105可与底部导电电极102形成耦合相互作用。然而，在一些情况下，膜105在底部导电电极102和半导体103上形成。作为备选，膜105可在半导体103上形成，而非在底部导电电极102上形成，但是可以延伸超过底部导电电极102。
许多不同类型的分子或其部分可以通过本文所述的方法和/或装置进行检测。图2示出了可被检测的分子以及用于对包括核酸在内的聚合物进行测序的方法的一些实例。在一些情况下，分子201从膜205的顺侧203(远离电极)向反侧204(朝向电极)穿过纳米孔202。
如图2B中所见，分子可以是聚合物分子206，并且当聚合物分子穿过纳米孔时，可以鉴别该聚合物分子的部分207。该聚合物分子可以是生物分子，如核酸或蛋白质。在一些实施方案中，该聚合物分子是核酸，并且该聚合物分子的部分是核酸或成组核酸(例如，2、3、4、5、6、7或8个核酸)。在一些实施方案中，该聚合物分子是多肽，并且该多肽的部分是氨基酸或成组氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)。
在一些情况下，当核酸或标签流动通过或邻近纳米孔时，感测电路检测到与该核酸或标签相关的电信号。该核酸可以是较大链的亚单位。该标签可以是核苷酸掺入事件或标记的核酸与纳米孔或邻近纳米孔的物质(如将标签从核酸上切下的酶)之间的其他相互作用的副产物。该标签可保持连接至核苷酸。可采集检测到的信号，并将其存储在存储单元中，然后用于构建核酸的序列。可对采集的信号进行处理，以解释检测到的信号中的任何异常，例如错误。
如图2C中所见，在一些实施方案中，分子208(例如，“标签分子”)与核苷酸209结合。可在该核苷酸被掺入生长中的核酸链210(例如，通过聚合酶211)的同时鉴别该分子。核苷酸可根据与模板核酸212的碱基配对而掺入。若不同标签与不同核苷酸(例如，A、C、T和G)中的每一个结合，则可通过用纳米孔检测标签分子来确定模板核酸的序列(例如，无需模板核酸穿过纳米孔)。在一些实施方案中，一旦核苷酸掺入生长中的核酸链，该分子即从核苷酸中释放213。如图2D中所示，可在核苷酸被掺入生长中的链的同时和/或从核苷酸释放214之前检测该分子。在某些情况下，所述探针的地址区域或报道区域通过采用标签进行测序。
装置设置
图3示意性地图示说明了纳米孔装置300(或传感器)，其可如本文所述用于检测分子(和/或对核酸进行测序)。含有脂双层的纳米孔可用电阻和电容进行表征。纳米孔装置300包括在导电性固体衬底306的脂双层相容性表面304上形成的脂双层302，其中脂双层相容性表面304可被脂双层不相容表面305隔离，而导电性固体衬底306可被绝缘材料307电隔离，并且其中脂双层302可被在脂双层不相容表面305上形成的无定形脂质303所包围。脂双层302可嵌有单个纳米孔结构308，该纳米孔结构308具有大到足以使被检测的分子和/或小离子(例如，Na+、K+、Ca2+、Cl-)在脂双层302的两侧之间穿行的纳米孔310。一层水分子314可被吸附在脂双层相容性表面304上，并夹在脂双层302与脂双层相容性表面304之间。吸附在亲水性脂双层相容性表面304上的水膜314可促进脂质分子的排序，并有助于脂双层相容性表面304上脂双层的形成。含有待测分子(例如，根据需要在一些情况下具有标记的核苷酸或其他组分的核酸分子)312的溶液的样品腔室316可设置在脂双层302之上。该溶液可以是含有电解质的水溶液，其被缓冲至最佳离子浓度，并保持在最佳pH，以使纳米孔310保持开启。该装置包括一对与可变电压源320耦合的电极318(包括负极318a和正极318b)，用于跨脂双层提供电刺激(例如，偏压)以及用于感测脂双层的电特性(例如，电阻、电容和离子电流)。正极318b的表面是或者形成脂双层相容性表面304的一部分。导电性固体衬底306可与电极318之一耦合，或形成其一部分。装置300还可以包括用于控制电刺激和用于处理所检测到的信号的电路322。在一些实施方案中，包括(例如，可变的)电压源320作为电路322的一部分。电路322可包括放大器、积分器、噪音滤波器、反馈控制逻辑和/或各种其他组件。电路322可以是集成在硅衬底328内的集成电路，并且可以进一步耦合至与存储器326耦合的计算机处理器324。
脂双层相容性表面304可以由各种适合于离子传导和气体形成从而有助于脂双层形成的材料形成。在一些实施方案中，可使用导电性或半导电性亲水材料，因为它们可允许更好地检测脂双层电特性的变化。示例性材料包括Ag-AgCl、Au、Pt或掺杂硅或其他半导体材料。在一些情况下，该电极不是牺牲电极。
脂双层不相容表面305可由不适合于脂双层形成的各种材料形成，并且这些材料一般是疏水性的。在一些实施方案中，优选非导电性疏水材料，因为它除了使脂双层区域彼此隔开之外，还使脂双层区域电绝缘。示例性脂双层不相容材料包括例如氮化硅(例如，Si3N4)和特氟龙、用疏水分子硅烷化的氧化硅(例如，SiO2)。
在一个实例中，图3的纳米孔装置300是具有一个α-溶血素(aHL)蛋白308的α-溶血素(aHL)纳米孔装置，该α-溶血素蛋白108嵌入在涂覆于铝材料306上的脂双层相容性银(Ag)表面304之上形成的二植酰磷脂酰胆碱(DPhPC)脂双层302中。脂双层相容性Ag表面304被脂双层不相容氮化硅表面305隔离，并且铝材料306被氮化硅材料307电绝缘。铝306耦合至集成在硅衬底328中的电路322。置于芯片上或从盖板328向下延伸的银-氯化银电极接触含有(例如，核酸)分子的水溶液。
aHL纳米孔是7个单独肽的装配体。aHL纳米孔的入口或前室的直径为大约26埃，这个宽度足以容纳dsDNA分子的一部分。从前室开始，aHL纳米孔先变宽再变窄，变成直径大约为15埃的桶，这个宽度足以允许单个ssDNA分子(或更小的标签分子)穿过，但不足以允许dsDNA分子(或更大的标签分子)穿过。
除了DPhPC，纳米孔装置的脂双层还可由各种其他合适的两亲性材料装配而成，该材料基于各种考虑来选择，例如所用纳米孔的类型，所表征的分子的种类，以及所形成的脂双层的各种物理、化学和/或电学特性，诸如所形成的脂双层的稳定性和通透性、电阻和电容。示例性的两亲性材料包括各种磷脂，如棕榈酰-油酰-磷脂酰-胆碱(POPC)和二油酰-磷脂酰-甲酯(DOPME)、二植酰磷脂酰胆碱(DPhPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和鞘磷脂。
除了如上所示的aHL纳米孔，纳米孔还可以是各种其他类型的纳米孔。实例包括γ-溶血素、杀白细胞素、蜂毒肽、耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)和各种其他天然存在的、经修饰的天然的及合成的纳米孔。可基于分析物分子的各种特性(诸如分析物分子相对于纳米孔孔径的大小)来选择合适的纳米孔。例如，aHL纳米孔具有大约15埃的限制性孔径。
电流测量
在一些情况下，可以在不同的施加电压下测量电流。为了实现此目的，可向电极施加期望的电势，并且随后可在整个测量中保持所施加的电势。在一个实施方式中，如本文所述，可以为此目的而使用运算放大器积分器拓扑结构。该积分器依靠电容性反馈来保持电极处的电压电势。积分器电路可提供出色的线性、单元间匹配以及偏移特性。运算放大器积分器通常需要大尺寸，以便达到所需的性能。本文描述了更紧凑的积分器拓扑结构。
在一些情况下，可向腔室施加电压电势“V液体”，它为芯片上的所有单元提供公共电势(例如，350mV)。积分器电路可将电极(其电气地为积分电容器的顶板)初始化为比公共液体电势更高的电势。例如，450mV的偏压可在电极与液体之间产生正100mV的电势。该正电压电势可使电流从电极流向液体腔室接触件。在这种情况下，载流子是：(a)K+离子，其从双层的电极一侧(反侧)通过该孔向双层的贮液器一侧(顺侧)流动；和(b)反侧上的氯(Cl-)离子，其根据以下电化学反应与银电极反应：Ag+Cl-→AgCl+e-。
在一些情况下，当Cl-被转化成氯化银时，K+流出封闭单元(从双层的反侧到顺侧)。作为电流流动的结果，双层的电极侧可变为脱盐的。在一些情况下，银/氯化银液体海绵状材料或基体可作为储存器，以在电腔室接触件处发生的逆反应中提供Cl-离子，以使电路完整。
在一些情况下，电子最终流到积分电容器的顶侧上，这创造出所测量的电流。电化学反应将银转化为氯化银，并且只要有银可供转化，电流就会继续流动。在一些情况下，银的有限供应导致依赖于电流的电极寿命。在一些实施方案中，使用非损耗的电极材料(例如，铂)。
在图4中示出了单元电路的实例。将施加电压Va施加于MOSFET电流传送器门401之前的运算放大器1200。此处还示出了电极402以及由器件403检测到的核酸和/或标签的电阻。
施加电压Va可驱动电流传送器门401。由此在电极上产生的电压是Va-Vt，其中Vt是MOSFET的阈值电压。在一些情况下，这导致向电极施加的实际电压的有限控制，这是由于MOSFET阈值电压可随工艺、电压、温度而显著变化，并且甚至在一个芯片中的器件之间都有显著变化。这种Vt变化在亚阈值泄露效应可能开始起作用的低电流水平上可能更大。因此，为了提供对施加电压的更好的控制，可以在具有电流传送器器件的跟随器反馈配置中使用运算放大器。这确保了向电极施加的电压为Va，而不依赖于MOSFET阈值电压的变化。
纳米孔阵列
本发明提供了用于检测分子和/或对核酸进行测序的纳米孔检测器(或传感器)的阵列。参见图5，多个(例如，核酸)分子可在纳米孔检测器阵列上被检测和/或测序。此处，每个纳米孔位置(例如，501)包含纳米孔，在某些情况下该纳米孔可附接于聚合酶和/或磷酸酶。在每个如本文所述的阵列位置上一般还有传感器。在一些实例中，提供了附接于核酸聚合酶的纳米孔阵列，并且标记的核苷酸用聚合酶掺入。在聚合期间，标签被纳米孔检测到(例如，通过释放并穿入或穿过纳米孔，或通过向纳米孔呈现)。
纳米孔阵列可具有任何合适数目的纳米孔。在一些情况下，阵列包含约200、约400、约600、约800、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约10000、约15000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000、约200000、约400000、约600000、约800000、约1000000个纳米孔，等等。在一些情况下，阵列包含至少200、至少400、至少600、至少800、至少1000、至少1500、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000、至少10000、至少15000、至少20000、至少40000、至少60000、至少80000、至少100000、至少200000、至少400000、至少600000、至少800000或至少1000000个纳米孔。
纳米孔检测器阵列可具有高密度的离散位点。例如，每单位面积相对较大数目的位点(即，密度)允许构建较小的装置，该装置是便携的、廉价的或具有其他有利特征。阵列中的单个位点可以是可单独寻址的位点。包含纳米孔和感测电路的大量位点可允许一次同时对相对大量的核酸分子进行测序，例如，通过并行测序。这样的系统可以提高通量和/或降低对核酸样品进行测序的成本。
表面包含任何合适密度的离散位点(例如，适用于在给定的时间长度内或以给定的成本对核酸样品进行测序的密度)。每个离散位点可包括传感器。表面可具有大于或等于每1mm2约500个位点的离散位点密度。在一些实施方案中，表面具有的离散位点密度为每1mm2约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或约500000个位点。在一些情况下，表面具有的离散位点密度为每1mm2至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000、至少6000、至少7000、至少8000、至少9000、至少10000、至少20000、至少40000、至少60000、至少80000、至少100000或至少500000个位点。
在一些实例中，测试芯片包括264个传感器的阵列，该264个传感器布置成各含66个传感器单元的4个单独组(也称为库)。每组又分为三“列”，每列有22个传感器“单元”。考虑到理想情况下在阵列中的264个传感器中的每一个上形成包含脂双层和所插入的纳米孔的虚拟单元(但是在仅有一部分传感器单元被如此填充的情况下，装置仍可成功运行)，“单元”名称是适当的。
存在单个模拟I/O板，其向安装到管芯(die)表面的导电圆筒内所含的液体施加电压电势。该“液体”电势被施加到孔的顶侧，并且对于检测器阵列中的所有单元是公共的。孔的底侧具有暴露电极，并且每个传感器单元可向其电极施加不同的底侧电势。继而测量顶部液体连接与孔底侧上的每个单元的电极连接之间的电流。传感器单元测量受在孔内穿行的标签分子所调制的穿过孔的电流。
计算机系统
借助于计算机系统，可对本发明的装置、系统和方法进行调控。图6示出了系统600，其包含计算机系统601，该计算机系统601耦合至纳米孔检测和/或核酸测序系统602。计算机系统601可以是一个服务器或多个服务器。计算机系统601可被编程为用于调控样品制备和处理，以及由测序系统602进行的核酸测序。如本文所述，纳米孔检测和/或测序系统602可以是基于纳米孔的测序仪(或检测器)。
计算机系统可被编程为用于实施本发明的方法。计算机系统601包括中央处理器(CPU，本文中也称为“处理器”)605，该中央处理器605可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。处理器605可以是诸如集成电路的电路的一部分。在一些实例中，处理器605可集成在专用集成电路(ASIC)中。计算机系统601还包括存储器610(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元615(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口620(例如，网络适配器)，以及外围设备625，诸如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器610、存储单元615、接口620和外围设备625通过诸如主板的通信总线(实线)而与CPU 605通信。存储单元615可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统601可以借助于通信接口620而可操作地耦合至计算机网络(“网络”)。该网络可以是因特网、内联网和/或外联网，或者是与因特网通信的内联网和/或外联网。网络可包括一个或多个计算机服务器，所述计算机服务器可实现分布式计算。
在一些实例中，计算机系统601包括现场可编程门阵列(FPGA)。在这样的情况下可不包括处理器605。
本发明的方法可通过储存在计算机系统601的电子存储位置上(例如，储存在存储器610或电子存储单元615上)的机器(或计算机处理器)可执行代码(或软件)的方式来实现。在使用期间，代码可由处理器605执行。在一些情况下，可从存储单元615中检索代码并将其存储在存储器610上以供处理器605随时访问。在一些情况下，可排除电子存储单元615，并在存储器610上存储机器可执行指令。
代码可被预编译和配置为随同具有适于执行代码的处理器的机器一起使用，或者可在运行期间进行编译。代码能够以编程语言来提供，可以选择编程语言以使代码能够以预编译或当场编译(as-compiled)的方式执行。
计算机系统601可适于存储用户概要信息，例如，姓名、物理地址、电子邮件地址、电话号码、即时消息(IM)处理、教育信息、工作信息、社交喜好和/或厌恶，以及与用户或其他用户潜在相关的其他信息。这样的概要信息可以存储在计算机系统601的存储单元615上。纳米孔检测和/或核酸测序系统602可以直接耦合至计算机系统601或通过云(例如，因特网)630耦合。
本文所提供的系统和方法的各个方面，诸如计算机系统601，可以通过编程来体现。该技术的各个方面可以被认为是通常以携载或体现于某种类型的机器可读介质上的机器(或处理器)可执行代码和/或关联数据的形式存在的“产品”或“制品”。机器可执行代码可存储在诸如存储器(例如，ROM、RAM)或硬盘等电子存储单元上。“存储”型介质可包括计算机、处理器等的任何或所有的有形存储器或其关联模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。整个软件或其各部分可不时通过因特网或各种其他电信网络来通信。例如，这样的通信可实现软件从一个计算机或处理器向另一计算机或处理器中(例如，从管理服务器或主机向应用服务器的计算机平台中)的加载。因此，可承载软件元素的另一类型的介质包括经由有线或光学陆线网络或者通过各种空中链路的光波、电波和电磁波，诸如跨本地设备之间的物理接口使用的光波、电波和电磁波。携载此类波的物理元素，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可被认为是承载软件的介质。如本文所使用，除非局限于非暂时性的有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”等术语是指任何参与向处理器提供用于执行的指令的介质。
因此，机器可读介质，诸如计算机可执行代码，可以采取许多形式，包括但不限于：有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如光盘或磁盘，诸如任何一个或多个计算机中的任何存储设备等，诸如可用于实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的线缆。载波传输介质可采用电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外线(IR)数据通讯中生成的电信号或电磁信号或者声波或光波。计算机可读介质的常见形式因此包括，例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、任何其他具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣、传送数据或指令的载波、传送这样的载波的电缆或链路，或者计算机可从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质形式中的许多形式可涉及向处理器传送一个或多个指令的一个或多个序列以供执行。
双层的形成
此处描述了在构成半导体纳米孔传感器芯片的电极阵列(例如，单独控制的)上产生脂双层及纳米孔的方法。该芯片可以用于测定聚合物的序列，如核酸序列。
此处描述了在半导体传感器芯片上的电极阵列上形成脂双层的方法。在一个实施方案中，将包含脂质分子的液体插入到该芯片的表面。该液体被气泡隔开。脂质分子可以分布在表面上，并且气泡使得脂质变薄，从而在每个电极上自发形成脂双层。可以向电极施加额外的电刺激，以促进双层的形成。可以进一步向沉积的脂质的顶部施加含有纳米孔蛋白质的溶液。更多的气泡可以在芯片上翻滚，以促进纳米孔向脂双层内的插入。这些技术可以在流动池的辅助下或不在其辅助下进行。在某些情况下，可以施加额外的刺激以诱导双层或孔的生成，包括压力、超声处理和/或声脉冲。
在一个方面，形成用于纳米孔传感器的脂双层的方法包括：(a)将缓冲溶液导入流动通道，该流动通道包含其上具有材料层的电极。该缓冲溶液可以是导电的，并且该材料层可以包含一种或多种脂质。该方法可以包括使缓冲溶液与材料层接触，并且向电极施加一个或多个电压，并测量通过该电极的电流，以确定材料层的至少一部分是否已覆盖并密封该电极和/或在该电极的全部或一部分上形成双层。施加的电压可能足以破坏电极上的双层密封，并且引起短路电流。基于关于材料层的至少一部分是否已覆盖并封闭电极和/或已在电极的全部或一部分上形成双层的确定，可以同时向所有电极、电极组或独立电极施加刺激，以诱导材料层的至少一部分形成邻近该电极的脂双层。
在一些实施方案中，所述刺激包括以下中的至少一个：在电极阵列表面上流过的液体流、在阵列表面上流过的一种或多种不同液体的连续流、在阵列表面上流过的一种或多种不同液体和气泡的任意组合的连续流、电脉冲、超声脉冲、压力脉冲或声脉冲。在一些情况下，材料层包含至少两种类型的脂质。
在某些情况下，材料层包含孔蛋白质。在某些情况下，该孔蛋白质是耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)和/或α-溶血素，或与它们的氨基酸序列具有至少70％同源性的它们的衍生物。在一些情况下，包含一种或多种孔蛋白的材料层包含一种或多种表面活性剂，该表面活性剂的浓度低于该表面活性剂的临界胶束浓度。
在某些情况下，所述刺激包括以下中的至少一个：在电极阵列表面上流过的液体流、在阵列表面上流过的一种或多种不同液体的连续流、在阵列表面上流过的一种或多种不同液体和气泡的任意组合的连续流、电脉冲、超声脉冲、压力脉冲或声脉冲。
在一个方面，本文描述了用于在构成单独控制的电极的阵列的多个电极中每个电极的顶部生成脂双层的自动化方法，以及向半导体传感器上单独控制的电极的阵列中每个电极顶部的每个双层内插入单个孔的方法。通过向靠近基本平整的表面上的电极的脂质层施加适当的外部刺激(例如，电刺激、压力刺激、超声刺激或声刺激)，可以诱导在电极阵列中的电极上形成双层。此外，通过向在一个或多个电极上具有脂双层并且由含有纳米孔蛋白质的溶液覆盖的整个传感器芯片的单个电极上施加适当的外部刺激(例如，包括电刺激、压力刺激、超声刺激或声刺激)，可以诱导向双层内插入孔。结果是，响应于刺激并且以确定的方式，在单独控制的电极的阵列中的多个电极上自动生成双层，而无需手动干预。在某些情况下，单个纳米孔能够响应于刺激并且以确定的方式插入多个电极/双层中，并因此生成单独控制的电纳米孔传感器的高度平行的阵列。这些单独控制的纳米孔传感器的阵列可以在基本平整的半导体表面上生成，并且在该半导体材料内部，产生操作和控制单个电极所需的电路的一部分或全部。
除了上述生成双层和孔的方式，本申请中还公开了在单独控制的电/纳米孔传感器的阵列上生成双层和孔的经济、简单的方法，该方法包括：1)活化已经存在于(预先施加于)传感器上的脂质或脂质-孔蛋白混合物，并且导致自发的双层形成或双层-孔蛋白形成；2)活化已经存在于(预先施加于)传感器上的脂质或脂质-孔蛋白混合物，并且通过在电极处的电刺激而直接生成双层和/或孔，或通过对系统的刺激而生成双层和/或孔；3)活化已经存在于(预先施加于)传感器上的脂质或脂质-孔蛋白混合物，并且通过使气泡与传感器芯片表面接触或使气泡穿过传感器芯片表面而直接生成双层和/或孔；4)活化已经存在于(预先施加于)传感器上的脂质或脂质-孔蛋白混合物，并且使用气泡在传感器阵列表面上分布混合物或使之变薄，该处理为后续的在电极处的电刺激或对系统的刺激准备好表面，以生成双层和/或孔；5)一种气泡法，其将脂质混合物施加、分布于传感器阵列的表面上并使之变薄，以使得在阵列中的多个独立电极上生成双层；6)一种气泡法，其施加、分布脂质混合物并使之变薄，因而为后续的在电极处的电刺激或对系统的刺激准备好表面，以在多个电极上生成双层；7)一种气泡法，其将孔蛋白混合物施加、分布于经脂质混合物处理的传感器阵列的表面上并使之变薄，使得在阵列中的多个独立电极上插入孔；8)一种气泡法，其施加、分布孔蛋白混合物并使之变薄，因而为后续的在电极处的电刺激或对系统的刺激准备好表面，以在阵列的多个电极上生成单个孔；9)一种方法，其描述了使用电刺激在电极的表面上生成双层，而不需要在电极的表面上生成气泡；10)描述了上述“对系统的刺激”的方法，其包括使用施加于一个或多个电极或整个传感器芯片上的超声或压力刺激，以在一个电极或多个电极的表面上生成双层和/或孔；11)一种提高用于纳米孔电感测的电极半导体阵列上的电极密度的方法，该方法与上述建立双层及孔的方法相匹配；12)如下方法：其显示，在包含多个电极-纳米孔传感器的阵列的开放式单一传感器芯片上不存在流动池能够支持所确定的方法，或者，在包含多个电极-纳米孔传感器的阵列的单一传感器芯片上存在一个流动池能够支持以上所确定的方法，或者，在包含多个电极-纳米孔传感器的阵列的单一传感器芯片上存在多个流动池能够支持所确定的方法；13)液体或气泡的压力可以变化，以改善成功的双层或孔的生成；及14)传感器芯片和液体的温度可以变化，以改善双层或孔的生成。
存在多种生成脂双层以及向双层中插入孔的方法。在一个实施方案中，提出了一种具有多个电极的半导体芯片。将一种液态的脂质溶液施加于经硅烷化处理的芯片表面。该液态脂质溶液可以是癸烷和诸如二植酰磷脂酰胆碱(DPhPC)的脂质分子的溶液。该溶液可通过倾倒、喷涂、涂刷的方式施加于表面上。该溶液在表面上干燥。该溶液可以完全干燥，使得只有粉末形式的DPhPC分子得以保留。或者，该溶液可以干燥至粘性状态。因此，芯片的表面被粉末形式或粘性溶液形式的预施加的脂质分子官能化。该芯片被密封，并且可以被处理和运输。
所述半导体芯片可以含有盖，并且所述盖使得使用者可以将液体泵入和泵出该芯片。使用者向芯片内施加缓冲液，如盐水，以激活脂质分子。一旦干燥的脂质分子与缓冲溶液接触，脂质分子即被水合。进入的缓冲液的压力可以促进在每个电极表面的顶部自发形成脂双层。
在本文所述的所有技术中，半导体芯片可以不包含盖，而使用者使用移液管或其他仪器将缓冲液，如盐水，施加到芯片表面上，从而激活脂质分子。一旦干燥的脂质分子与缓冲溶液接触，脂质分子即被水合。进入的缓冲液的压力可以促进在每个电极表面的顶部自发形成脂双层。
在半导体芯片包含盖的另一个相关的实施方案中，在缓冲液施加于芯片内后，泵入气泡，并且在气泡后施加更多的缓冲溶液。气泡扫过芯片，使得新水合的预沉积的脂质混合物变光滑并变薄，并且使脂质分子扫过表面。在气泡流过后，在每个电极表面的顶部可以形成脂双层。
在另一个相关实施方案中，当施加气泡并且气泡扫过芯片后，向电极施加电信号，并且该电刺激可以导致在电极上形成双层。带有电压电势的电刺激可能会破坏电极表面与电极周围的脂质材料之间的界面，从而导致双层的突然快速形成。
在另一个实施方案中，所述液态脂质溶液可进一步含有孔蛋白质，如耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)或α-溶血素。使含有脂质分子和孔蛋白质的溶液干燥。芯片的表面用硅烷分子进行处理，以使表面成为疏水性的。脂质分子和孔蛋白质以粉末形式或以粘性状态沉积。使用者可通过向芯片施加缓冲溶液而激活芯片。脂质分子和孔蛋白质被水合。已插入纳米孔的脂质层可以自发地形成于每个电极表面的顶部。
在另一个相关实施方案中，在将缓冲液施加于芯片内后，泵入气泡，并且在气泡后施加更多的缓冲溶液。气泡扫过芯片，使得新水合的预沉积的脂质和孔混合物变光滑且变薄，并且使脂质和/或孔分子扫过表面。在气泡流过后，在每个电极表面的顶部可以形成脂双层，并且孔蛋白质也插入双层中作为纳米孔。
在又一个相关实施方案中，当施加气泡并且气泡扫过芯片后，向电极施加电信号，并且该电刺激可以导致在电极上形成双层以及纳米孔插入双层中。带有电压电势的电刺激可能会破坏电极的表面并影响电极周围的脂质材料，从而导致双层以及双层中的纳米孔的突然快速形成。
在另一个实施方案中，半导体芯片只是硅烷化的，而没有任何预先施加的分子如脂质分子或孔蛋白质使芯片的表面得以官能化。使用者首先用盐水冲洗芯片表面。然后向芯片上插入脂质和癸烷的等分试样。随后用气泡来涂抹脂质材料，将其分布到芯片表面上并使之变薄。脂双层通过气泡的接触和分布而在多个电极上自发地产生。
在另一个相关实施方案中，脂双层在经气泡处理后可能不会自发地产生。向电极施加后续的电刺激。电脉冲导致在电极上形成双层。
在又一个相关实施方案中，当气泡扫过芯片并且脂质材料得到分布后，接着使用盐水流。在盐水后，将孔蛋白质溶液插入到芯片中。随后用另一气泡将孔蛋白质混合物涂抹于芯片表面上并使之变薄，从而通过与气泡接触或来自气泡的压力的形式在阵列中的多个独立电极上插入孔。
在又一个相关实施方案中，当插入孔蛋白质溶液和第二气泡后，在电极上施加后续的电刺激，以在阵列中的多个电极上的脂双层中产生纳米孔。
在另一个实施方案中，将脂质和癸烷的等分试样插入被离子溶液(如盐水)填充或覆盖的芯片中。向电极施加后续的电刺激。电脉冲导致在电极上形成双层。在此实施方案中，没有插入气泡来促进双层的形成。脂质良好地分布于芯片表面上的电极周围。施加于电极上的电压引起位于电极边缘的脂质材料的破坏，并诱导脂双层的形成。
半导体纳米孔传感器芯片可以包含一个或多个通道，液体和试剂可以通过该通道流动。在一个实施方案中，每个通道具有两条轨道，在通道的每一侧各有一条。电极可以位于通道的底面上。电极还可以位于通道的侧壁表面上(位于轨道上)。这样，可以通过在底部和侧壁表面上创建电极而提高每个通道的电极密度。
在一个实施方案中，可以在半导体芯片上使用一个或多个流动池。每个流动池可用于为芯片上的一个通道插入溶液和气泡。流动池是液体、气泡和试剂可以通过的路径。芯片上充当流动池的整体或部分的通道可以是独立的，使得该芯片可以独立地同时处理多个不同的样品。
在一个实施方案中，在芯片上不存在通道或流动池。向芯片预先施加液态脂质溶液，或液态的脂质-孔混合物溶液。使该溶液干燥成粉末形式或粘性状态。将液态缓冲溶液施加于芯片，以激活脂质或脂质-孔混合物。向电极施加电信号，该电刺激可导致在电极上形成双层。具有电压电势的电刺激可以破坏电极的表面，并影响电极周围的脂质材料，从而导致双层的突然快速形成。此外，如果存在已激活的孔蛋白质，则电刺激可进一步促进孔分子向脂双层内的插入。
在一些实施方案中，所述液体或气泡的压力可以变化，以改善双层或纳米孔的形成。在一些实施方案中，芯片和液体的温度可以变化，以改善双层或孔的形成。例如，在形成双层时，可应用比室温稍低的温度；在纳米孔插入脂双层中时，可应用比室温稍高的温度。
在一个实施方案中，可以使密封芯片的四个侧边中的一个侧边保持开放并可以进入。其相对的侧边也可以开有一个孔洞，管可以与该孔洞接触和连接。如果将芯片竖立以使其垂直于位于底部的孔洞和管以及位于顶部的芯片的开口端，则缓冲液和试剂可以通过顶部添加，于是气泡可以受控的速度从底部释放并向上流过密封的腔室，并流过芯片。该系统可能不具有将滚过芯片的液体组分分隔的气泡列。它使通过封装芯片的开放顶部添加的任何物质变光滑，并在内部向下流过芯片的表面。相反地，可以通过位于该设备底部的单一管而引入液体和试剂，当可能需要按照自动化的时间顺序添加试剂时，这可能是有利的。
在本文描述的所有技术中，可以将传感器芯片耦合至一种设备，或将传感器芯片置于该设备内，该设备将会以自动化的方式向传感器芯片施加液体、试剂、气泡、电刺激脉冲、压力或压力脉冲、温度或温度脉冲、超声脉冲和/或声脉冲的任意组合，从而导致双层的自动化生成、孔的生成、双层和孔的维持(包括其再生成)、施加于纳米孔传感器芯片的生物分子的捕获及读取，以及提供关于全部传感器的状态及仪器性能的全部特性的实时和/或终点细节。该设备可以允许任何水平的操作者人工干预或允许创建自定义测试。该设备可以响应于先前的测试信号的结果或试剂添加而施加不同的信号和/或试剂，或作用于样品或芯片，从而允许该设备完全自动化地运行。这样的系统可以允许时间进程实验在无操作者的情况下运行，或允许纳米孔系统的更新，以将传感器芯片的表面重新官能化，从而继续测试。
在本文所描述的所有技术中，施加刺激以引发双层的生成或孔的生成也可以包括向芯片施加压力、温度、超声或声音，以激发所需的双层/孔生成事件。
在本文所描述的所有技术中，半导体芯片可以不包含盖，而使用者通过使用移液管或其他仪器手动施加任何和全部缓冲液、试剂及气泡。这些技术的手动施加可以与本文概述的任何施加的刺激相结合，以引发所需的双层和/或孔形成。
流动池或简单气泡系统还能够通过将孔蛋白质溶液均匀地施加到传感器芯片表面周围，并且引起自发的孔插入或设置表面以使得电刺激促进孔向双层中的快速插入，而极大地有助于孔的插入。流动池或简单气泡系统还可以有助于干燥的脂质-孔-蛋白质混合物的水合，该混合物可在存在或不存在气泡的情况下在合适的缓冲液中变光滑或混合后，形成自发的双层和孔。
图7示出了在传感器芯片的一个或多个流动通道上的电极上形成脂质层的示例性方法。该传感器芯片可以是平面芯片，其包含多个嵌入非导电的或半导体表面并且基本上呈平面的电极，该表面位于流动通道的表面上。该方法包括以下步骤：701：使包含至少一种类型的脂质的脂质溶液流动通过每个流动通道；702：将脂质沉积在电极表面上；703：在每个流动通道中用后继气泡使沉积的脂质变光滑并变薄；704：用缓冲溶液填充每个流动通道，该缓冲溶液是导电的；705：测量通过电极的电流，以确定是否在每个电极上形成脂双层；以及706：如果在任何电极上尚未形成脂双层，则施加刺激(例如，电刺激)，以诱导表面上的脂质在电极上形成脂双层。在某些情况下，向测试双层施加电压，而后插入孔。然而，在某些情况下，不施加电压即生成双层。
在一些实施方案中，所述脂质溶液可包含至少两种类型的脂质。脂质溶液可进一步包含至少一种类型的孔蛋白质。该孔蛋白质可包含耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)或α-溶血素。所述方法可进一步包括以下步骤：使含有孔蛋白质的非脂质溶液流过每个流动通道内沉积的脂质；在每个流动通道中使用第二气泡使孔蛋白质和沉积的脂质变薄。所述方法可进一步包括使孔蛋白质溶液、额外的气泡和额外的液态溶液流动通过流动通道，该孔蛋白质溶液和该液态溶液被该气泡所隔开；通过至少一部分电极施加电刺激，以促进孔蛋白质向脂双层中的插入。所有使溶液和气泡流动的步骤均可以任何顺序及组合重复进行，从而实现脂双层的形成和纳米孔向双层中的插入。所述脂质可以是二植酰磷脂酰胆碱(DPhPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、二油酰磷脂酰甲酯(DOPME)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油或鞘磷脂。所述液态脂质溶液可进一步含有有机溶剂，如癸烷。
在一些实施方案中，所述缓冲溶液可以含有离子溶液，如氯化钠溶液或氯化钾溶液。所述缓冲溶液还可以含有亚铁氰化物或抗坏血酸。在一些实施方案中，将气泡的压力调节为基本上处于大气压或稍高于大气压，以改善双层的形成或纳米孔的插入。
图8示出了根据本发明的一个实施方案的示例性半导体传感器芯片。传感器芯片800包括多个流动通道810。每个流动通道具有多个电极840，电极840嵌入非导电的或半导体表面并且基本上呈平面，该表面位于流动通道810的表面上。电极的表面被硅烷化为亲水性的。电极以外的流动通道的表面为疏水性的。流动通道810被沿流动通道的导轨820隔开。通道的宽度可以足够宽，以容纳两行或更多行电极。如图8所示，电极可被制作于流动通道的底面上，以及导轨的侧壁上。在一些实施方案中，流动通道的顶侧可以是密封的。
在一个方面，用于在传感器芯片的一个或多个流动通道上的电极上形成脂双层的方法包括：(a)使包含至少一种类型的脂质的脂质溶液流动通过每个流动通道；(b)将脂质沉积于电极表面上；(c)在每个流动通道中用后继气泡使沉积的脂质变光滑并变薄；(d)用缓冲溶液填充每个流动通道，该缓冲溶液是导电的；(e)测量通过电极的电流，以确定在每个电极上是否形成脂双层；以及(f)如果尚未在任何电极上形成脂双层，则向至少一个电极施加刺激，以诱导表面上的脂质在电极上形成脂双层。所述刺激可以包括电脉冲、超声脉冲、压力脉冲或声脉冲中的至少一个。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含至少两种类型的脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液进一步包含至少一种类型的孔蛋白质。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括，在(c)后：(c1)使包含孔蛋白质的非脂质溶液流过每个流动通道中沉积的脂质；和(c2)在每个流动通道中使用第二气泡使孔蛋白质和沉积的脂质变薄。在一些实施方案中，所述方法在(c2)之后进一步包括：(c3)以任何顺序或组合重复步骤(b)、(c)、(c1)或(c2)。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(g)使孔蛋白质溶液、额外的气泡和额外的液态溶液流动通过流动通道，该孔蛋白质溶液和该液态溶液被该气泡隔开。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(h)通过至少一部分电极施加电刺激，以促进孔蛋白质在脂双层中的插入。
在一些实施方案中，所述脂质是二植酰磷脂酰胆碱(DPhPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、二油酰磷脂酰甲酯(DOPME)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油或鞘磷脂。
在一些情况下，至少一些液态脂质溶液含有有机溶剂(例如癸烷)。所述孔蛋白质可包含耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)或α-溶血素。在一些情况下，所述缓冲溶液含有离子溶液(例如氯化钠或氯化钾)。在一些实例中，至少一些缓冲溶液含有亚铁氰化物或抗坏血酸。
在一些实施方案中，气泡的压力基本上等于或略高于大气压。在一些情况下，电极的表面是亲水性的。在一些情况下，电极以外的流动通道的表面是疏水性的。
在一些实施方案中，所述方法在(a)之前还包括以下任何一个或多个步骤：(a1)通过对电极以外的流动通道的表面进行硅烷化处理，使电极以外的流动通道的表面为疏水性的；(a2)在芯片的表面上形成多个流动通道；(a3)在每个流动通道的表面上制作电极；(a4)通过沿流动通道建立导轨将流动通道隔开；(a5)在每个导轨的侧表面上制作电极；以及(a6)将每个流动通道的顶侧密封。
一种产生具有双层的芯片的方法是使离子溶液流过芯片。在某些情况下，该流为“一列(train)”散布的脂质溶液和离子溶液的等分试样(例如，交替的脂质溶液和离子溶液)。该流可以通过供液管并穿过芯片。该“列”可以具有大约5μl的脂质，然后是5μl的离子溶液，并且可以重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。溶液列可以被来回泵送通过生物芯片的表面约2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。然后可以电气检查覆盖和/或密封。
在某些情况下，在溶液列后面是装配步骤。在某些情况下，装配步骤包括使气泡流动穿过芯片。在某些情况下，可以电气检查单元(电极)的覆盖、每个电极处的泄漏或密封电阻以及在密封和/或双层处施加的电压。
在某些情况下，重复装配操作，直到大致获得以下的试验结果：(1)约190个或更多的电极被覆盖；(2)至少约120个膜(例如，脂质层)在小于-1V的施加电压下被弹出；(3)在(2)中弹出的脂质层中，69个或更多个在约-300mV到-700mV弹出；(4)密封电阻小于约50千兆欧姆的电极的数目少于15个；以及(5)如果显示任何记录到的泄漏电流的单元的数目超过50个，那么密封电阻的中值大于150千兆欧姆。
如果这些标准的一部分或全部都已满足，那么可使大约10μl的气泡流过芯片，并且可以进行(1)、(4)和(5)的最终测试。如果通过测试，则该程序移至孔插入方案。该程序可在计算机系统(例如，由处理器执行)，例如图6的计算机系统601的辅助下执行。
在某些情况下，孔插入方案包括向芯片施加5μl的孔蛋白质溶液，并进行电穿孔以向双层中插入孔。在电穿孔操作结束时，检查芯片的孔产率，如果通过该标准，则施加样品和测试试剂。
在某些情况下，双层和孔插入的总时间平均为，15分钟的双层生成和20分钟的孔插入，总共35分钟。
任何数目的加样孔可以被具有插入的孔(例如，孔产率)的膜(例如，脂双层)覆盖。在某些情况下，孔产率为约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％等。在某些情况下，孔产率为至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％等。
在一些实施方案中，施加于电极芯片以及测试设置的参数为1M KCl，pH7.5，电流流体流速，海平面大气压，及室温。
捕获的探针
在一个方面，本发明提供了从非均相或均相混合物中捕获、检测、计数、分选、分箱及富集单个分子(例如，蛋白质)的方法。
公开了以逐个分子的方式进行单分子的捕获、检测、分选、计数、分离、收集和/或分箱的方法。在一些实施方案中，被捕获于纳米孔中的探针分子用于此目的。在一些实施方案中，包括探针分子的纳米孔可读复合物(NRC)用于此目的。在一些实施方案中，NRC包括可以被纳米孔捕捉、捕获、读取和/或穿过纳米孔的探针分子。在一些实施方案中，探针分子(“探针”)包括一个或多个如下部分：(1)探针部分或序列，其可以与靶分子直接结合，或与结合至靶分子上的报道分子结合；(2)附着于探针分子的一个或多个末端的可变温度帽(VTC)，该可变温度帽是温度敏感的，并且能够在特定温度范围内采取大体积的二维和/或三维结构，而在另一温度范围内采取线性结构；(4)一个或多个验证部分，该验证部分能够被纳米孔读取，以鉴别NRC、掺入NRC中的探针分子、直接附着于或通过报道分子附着于探针分子的靶分子，和/或NRC的状态(例如，在存在报道分子和/或附着于NRC的靶分子的情况下)；(5)用于与报道分子结合的报道分子结合部分；(6)用于后续分离或纯化的纯化标签；(7)独特的寻址ID部分；和/或(8)一个或多个“读取开关”部分，其在穿过孔时改变状态/特性，以指示出探针已经被纳米孔读取(例如，穿过用于电信号检测的纳米孔)。
在一个方面，一种用于检测靶分子的方法包括：(a)提供在邻近或靠近感测电极设置的膜中包含纳米孔的芯片；(b)引导核酸分子穿过纳米孔。该核酸分子可以与报道分子相关联。该核酸分子可以包含地址区域和探针区域。该报道分子可以与该核酸分子在探针区域相关联。该报道分子可以与靶分子偶联。在某些情况下，所述方法还包括(c)在核酸分子被引导通过纳米孔的同时对地址区域进行测序，以确定地址区域的核酸序列；以及(d)在计算机处理器的辅助下，基于在(c)中确定的地址区域的核酸序列，鉴别靶分子。
在一些实施方案中，(b)中的探针分子由于报道分子与(b)中的分子的探针区域结合而在孔中停止并保持(并且基于报道分子与核酸分子的缔合，探针通过纳米孔的前进速率可能降低)。
在某些情况下，当核酸分子通过纳米孔的前进速率降低时，该核酸分子中的最多3个、4个或5个碱基得到鉴别。在某些情况下，结合的报道分子完全停止了处于孔中的分子。杂交的复合物可以包含处于孔中的探针分子以及附着于该探针分子的报道分子。可通过添加减速物来完成读取。
在某些情况下，无需在探针的两端形成大体积结构，该探针在一端形成大体积结构，以使得该探针停留在孔中。
在一些实施方案中，NRC还包括与探针分子结合的报道分子(“Reporter”)。该报道分子可以是(a)任何可与包括肽、蛋白质、核酸、核酸类似物、DNA、RNA、siRNA、shRNA、肽核酸、乙二醇核酸、甲基化和/或非甲基化核酸等单一聚合物结合的分子，和/或(b)任何可以与包括肽链、蛋白质、核酸及其他生物和化学聚合物在内的多链聚合物结合的分子。在一些实施方案中，报道分子对靶分子的特定来源(例如，来自特定的样品)而言可以是独特的，并且对报道分子的鉴别可用于鉴别靶分子的来源。在一些实施方案中，报道分子可以被捕获并结合至探针分子，并采用本文所公开的技术进行计数、分选、收集和/或分箱。
在一些实施方案中，纳米孔可读复合物(NRC)允许探针或探针-NRC以单向方式插入孔中。在一些实施方案中，在特定条件下，NRC在一端形成大体积结构而在另一端则保持其线性形式。由于形成的大体积结构太大，以至无法穿过纳米孔检测器的纳米孔(例如，温度范围)，NRC只能被捕获，并且从NRC的线性端穿过纳米孔，从而导致纳米孔对NRC的定向读取。在一些实施方案中，定向穿过及读取(例如，从NRC的5'端)可以提供纳米孔中NRC的更清晰的读取信号。
在一些实施方案中，NRC被捕获在纳米孔检测器的纳米孔中，从而将包含在NRC中的探针捕获于纳米孔中。在一些实施方案中，将探针分子捕获在纳米孔中允许重复使用相同的探针分子对样品分子进行捕获、检测、表征、分选、收集和/或分箱。
在一些实施方案中，可以验证NRC和包含在NRC中的探针是否已正确插入纳米孔中。在一些实施方案中，NRC可包括能够识别正确的前端的前端标识符(例如，存在于前端的独特序列，其在NRC穿行至前端时能够被读取，从而产生可辨别的信号水平)和/或能够识别正确的尾端的尾端标识符(例如，存在于尾端的独特序列，其在NRC穿行至尾端时能够被读取，从而产生可辨别的信号水平)。当NRC插入纳米孔检测器的纳米孔内时，该NRC能够穿行至其尾端，并且位于尾端的序列被纳米孔检测器读取。如果序列读取值与正确的尾端信号相匹配，则确认该NRC已正确插入(例如，从5'末端插入)，并且尾端帽(例如，尾端发夹结构)已正确地形成。当捕获于纳米孔中的NRC穿行至其前端并且位于前端的序列被纳米孔检测器读取时，如果序列读取值与正确的前端信号相匹配，则确认该NRC已正确插入，并且前端帽(例如，前端发夹结构)已正确地形成。如果表明NRC已经正确插入并且末端帽已正确形成，则捕获于纳米孔中的探针(包含在NRC中)处于备用状态。
在一些实施方案中，NRC可包括“读取开关”部分，该部分可以用于确定探针分子是否已被读取一次。在一些实施方案中，一旦探针已被读取一次，则读取开关的特性和/或性质即发生改变。在一些实施方案中，一种或多种分子或分子片段附着到探针分子上，以作为分子读取开关。一旦探针穿过纳米孔，则该分子或分子片段即从探针分子上脱落。因此，分子读取开关的存在表明探针尚未读取(因为探针分子尚未穿过纳米孔以使读取开关改变状态)，而分子开关的不存在则表明探针分子已被读取(因为探针分子已穿过纳米孔以使读取开关改变状态)。读取开关允许对探针分子的定量分析，因此也允许对样品中的报道分子和/或附着于探针分子的样品分子的定量分析。在一些实施方案中，一种或多种类型的探针分子与样品分子一起温育，以形成探针-样品分子复合物。可以将该探针-样品分子复合物置于一个纳米孔检测器阵列中以供分析。每个纳米孔可以抓住一个探针-样品分子复合物，并对其进行读取，以确定何种类型的探针-样品分子/探针/样品已被捕获。一旦探针-样品分子复合物已被读取，读取开关即改变其状态(例如，开关分子从探针上脱落)。已读取的探针-样品分子复合物被释放回纳米孔周围的缓冲液内。纳米孔然后抓住另一个探针-样品分子，并再次对其进行读取。如果探针-样品分子之前已被读取，则将不会检测到读取开关。如果探针-样品分子之前尚未读取，则将检测到读取开关。之前已经读取的探针-样品分子可以得到鉴别，并且不被计数，所以不会发生探针-样品的重复计数。以这种方式，特定类型的探针-样品分子及样品分子可以得到精确计数。
在一些实施方案中，能够确定正确的分子(例如，正确的样品分子或报道分子)是否已经正确地连接到探针上。在一些实施方案中，由于给定的分子将与探针分子上的特定区域结合。当探针-分子被纳米孔检测器读取时，其将在该分子附着于探针上的位置处发生停顿。当该分子停顿时的电信号读取值对应于在探针上的分子结合位点之前的探针部分的结构/序列。其可以用于鉴别在探针上的分子结合位点之前的探针部分的结构/序列。如果在分子的结合位点之前的探针结构/序列是独特的，并且产生可辨别的电信号，则该电信号可以用来鉴别分子，并确定正确的分子是否已经与探针结合。
在一些实施方案中，能够确定分子来源于哪个样品，即使该分子是在含有来自不同样品的分子的样品中。在一些实施方案中，样品分子通过中间分子(例如，报道分子)与探针分子结合，每一种类型的分子与独特类型的中间分子结合，每种类型的中间分子与探针分子上的独特位置结合。如果来自第一样品的样品分子被允许与第一类型的中间分子结合，来自第二样品的样品分子被允许与第二类型的中间分子结合，则能够通过确定与该分子结合的中间分子的身份来确定在含有来自第一和第二样品的分子的混合物中的分子来源。在一些实施方案中，可以由当中间分子与探针分子结合并且探针上的中间分子结合位置之前的序列被读取时所产生的信号来确定中间分子(例如，报道分子)的身份。
在一些实施方案中，可以精确地确定来自不同样品的特定类型的分子的相对计数或浓度。例如，如果第一类型的脱氢酶结合中间分子与健康组织样品一起温育，则第二类型的脱氢酶结合中间分子与病变组织样品一起温育。这两种样品随后混合在一起，并用一个纳米孔检测器阵列进行分析。在一些实施方案中，来自于特定样品的脱氢酶分子可以在不破坏探针分子和/或纳米孔检测器的情况下被选择性地计数、释放和收集。在一些实施方案中，通过在纳米孔阵列上比较与探针分子结合的来自于健康样品和病变样品的中间分子，可以精确地确定来自于健康样品和病变样品的脱氢酶分子的相对浓度。
在一些实施方案中，NRC分子包括一个或多个分离标签，该分离标签有助于分离NRC分子与附着于NRC分子的其他分子(例如，报道分子和样品分子)。在一些实施方案中，分离标签被吸引至磁源，并且可以用于将NRC分子与附着于NRC分子的其他分子固定至磁源，以用于分离NRC分子与附着于NRC分子的其他分子。
在一些实施方案中，探针分子可以从报道分子/样品分子上解离，而不破坏探针分子。在一些实施方案中，可以提高温度以解离报道分子/样品分子，而不破坏探针分子和纳米孔。
图9示出了被捕获于纳米孔中的探针分子的一个实例。该探针分子包括用于与结合至靶分子上的报道分子结合的探针序列。该靶分子可以是任何合适的分子，例如蛋白质和肽等。使用大体积结构作为端帽，该探针分子被捕获在纳米孔内。该大体积结构可以是温度敏感的，并且可以取决于温度而形成和解离。
图10示出了被捕获于纳米孔中的探针分子的一个实例。在所示的例子中，探针分子包括用于与报道分子结合的探针序列，该报道分子与配体结合，该配体与靶分子结合。该配体是能结合靶分子的抗体。靶分子可以是任何合适的分子，如蛋白质、肽、细菌或化学衍生物等。报道分子为单链的聚合物序列。使用有大体积结构作为端帽，探针分子被捕获在纳米孔内。该大体积结构可以是温度敏感的，并且取决于温度而形成和解离。虽然未示出，靶DNA、RNA或其他核苷酸分子可以在探针序列处直接与探针分子结合。基于当使用纳米孔读取位于探针分子之前的序列——地址序列——时所产生的信号，可以确定靶核苷酸的身份。
图11示出了探针分子的示例性线性序列。该探针分子包括前端(位于5'端)和尾端(位于3'端)。尾端包括IJ。如图12所示，反义链可以与J结合，以形成双链帽，该双链帽的体积足够大，从而被纳米孔阻挡在外。或者，J可以以二维或三维构象折叠并且与其自身结合，以形成尾端帽。前端包括ONML。O发生回折，以与M结合，从而形成具有发夹结构的帽。较之于前端帽，双链帽在更高的温度下形成。聚合物的前端和尾端的取向可以通过调整该帽的解链温度而改变。高解链温度的帽成为尾端，而低解链温度的帽成为前端。前端还包括末端标识符序列L，当前端的低温帽被推向纳米孔从而由纳米孔进行读取时，该末端标识符序列L可用于识别前端。尾端包括末端标识符序列I，当尾端的高温帽被推向纳米孔从而由纳米孔进行读取时，该末端标识符序列I可用于识别尾端。
图13示出了使用纳米孔捕获并表征探针分子的工序流程。在502，制备具有适当的序列的探针分子。在504，例如通过将温度降低到低于高温帽结构的解链温度，在探针的一端形成高温帽。在506，使探针分子从前端(低温帽端)穿过纳米孔。在508，将温度降低至低于低温帽结构的解链温度，以使低温帽在前端形成。在508，将探针拉至一端(前端或尾端)，读取末端标识符。在510，将探针拉至另一端，并读取末端标识符。在512，确定正确的末端标识符是否已被读取，如果是，则探针已被捕获于纳米孔中。在514，将减速物连接至探针的地址区域。在516，使探针穿过纳米孔，因此连接至探针地址区域的引物被推向纳米孔。当每个引物均使探针分子的前进停顿时，读取位于地址区域的探针序列。在518，基于所读取的探针分子的地址序列，确定探针分子的身份。
图14是利用纳米孔捕获的探针捕获并鉴别、计数、分选和/或收集靶分子的工序流程。在602，使靶分子结合至在纳米孔中捕获的已知探针。所述结合可以是直接结合或通过一个或多个中间分子的间接结合。在604，拉/推探针分子穿过纳米孔，以使得探针-报道分子结合位点被推向纳米孔。在606，读取位于结合位点之前的序列。在608，已读取的序列用于确定报道分子-靶分子复合物已被捕获，并且在某些情况下，这种读取可以用于在多样品实验中确定报道分子-靶分子来源于何种样品。靶分子可与探针分子上的特定位点结合，并给出独特的序列。由于靶分子的身份是已知的。靶分子能够被选择性地释放、收集、计数并分箱，以供进一步处理和/或使用。在某些情况下，通过使用标签的合成测序来读取位于结合位点之前的探针的序列(参见，例如，图2C和2D)606。
图15是使用纳米孔捕获的探针分子对靶分子进行计数、分箱、收集的工序流程。在702，使靶分子与被捕获于纳米孔中的已知探针分子结合。在704，基于探针上报道分子-靶分子结合位点之前的探针序列来确定靶分子的身份。在708，从探针上释放报道分子-靶分子，以便收集、分箱和/或计数，以供进一步处理和/或使用。
图16是使用纳米孔捕获的探针分子检测、鉴别、计数、分箱和/或收集靶蛋白质分子的工序流程。在802，从样品中分离蛋白质。在804，用亚氨基生物素、生物素或抗亲和素RNA适体标记分离的蛋白质。在806，向蛋白质添加报道分子标记的抗体，并使其温育和结合。在808，通过在混合物中加入涂覆有链霉亲和素的磁珠或涂覆有抗生物素RNA适体的磁珠，洗掉所有未结合的抗体和报道DNA分子。在810，可以使用磁源将所有蛋白质拉至反应管的一侧。在812，移除上清液，用新的缓冲溶液漂洗磁珠/蛋白质/抗体报道DNA多次。在814，通过磁引力释放样品蛋白质分子，并重悬浮。在816，可以通过降低溶液的pH而破坏链霉亲和素/亚氨基生物素连接，或加入RNAase酶来破坏抗生物素或抗亲和素RNA适体。在某些情况下，816为captavidin，其在pH改变时能够释放分子。结果是用抗体和报道分子标记的样品蛋白质池，并且在溶液中没有独立的、没有未与蛋白质结合的抗体/报道分子复合物。
图17是使用纳米孔捕获的探针分子对靶蛋白质分子进行检测、鉴别、计数、分箱和/或收集的工序流程。在902，从样品中分离蛋白质。在904，用亚氨基生物素、生物素或抗亲和素RNA适体标记分离的蛋白质。在906，向蛋白质添加报道分子标记的抗体，并使其温育和结合。在908，通过在混合物中加入涂覆有链霉亲和素的磁珠或涂覆有抗生物素RNA适体的磁珠，洗掉所有未结合的抗体和报道DNA分子。在910，可以使用磁源将所有蛋白质拉至反应管的一侧。在912，移除上清液，用新的缓冲溶液漂洗磁珠/蛋白质/抗体报道DNA多次。在914，通过磁引力释放样品蛋白质分子，并重悬浮。在916，添加蛋白酶K以溶解所有蛋白质。在918，升高温度以使蛋白酶K变性。在920，将样品冷却，以在纳米孔阵列上使用，或储存以用于可能的进一步表征或使用。
图18示出了与报道分子标记的抗体结合的蛋白质分子的结构。报道分子可以是任何能与探针序列结合的分子。示例性的报道分子包括DNA、RNA、cDNA、siRNA、shRNA、PNA、GNA、吗啉代(morpholinos)或任何其他能够与聚合物探针链结合的聚合物或部分。
图19是使用纳米孔捕获的探针分子表征报道分子和抗体结合的靶分子(例如，蛋白质)的工序流程。在1002，向纳米孔阵列添加与报道分子标记的抗体结合的蛋白质分子。一系列探针分子被捕获在纳米孔阵列的纳米孔中。可以使用上述技术来确定所捕获的探针分子的身份和位置。开始操作纳米孔阵列，将探针分子拉至纳米孔，以进行捕获和验证。在1004，在例如电场下拉/推探针分子，以使得报道分子的结合位点被推向纳米孔。在1006，读取位于报道分子结合位点之前的序列。在1008，可基于所读取的探针序列确定报道分子的身份，从而确定与报道分子结合的抗体以及与抗体结合的蛋白质分子的身份。
图20是使用纳米孔捕获的探针分子从不同样品中表征靶分子的工序流程。由于报道分子的探针结合位点对报道分子是独特的。如果针对用于不同样品的相同抗体的报道分子彼此不同，则可以通过观察特定报道分子结合时产生的信号来鉴别靶分子来源于何种样品。例如，用于结合样品A中的过氧化氢酶的抗体用报道分子M标记，用于结合样品B中的过氧化氢酶的抗体用报道分子N标记。除了N比M长3个核苷酸之外，M和N是相同的。当M和N与探针分子结合时，以及当报道分子结合位点被推向纳米孔而读取探针序列时，M和N会产生不同的信号。与探针结合的蛋白质的来源可以基于这样的信号来确定。在1102，分离来自不同样品的蛋白质，并使其分别与独特的报道分子标记的抗体结合。与特定类型的抗体结合的报道分子是不同的，并且对于不同的样品，其结合至探针分子上的不同位置。在1104，混合来自不同样品的抗体-报道分子-蛋白质分子。在1106，使用同一纳米孔阵列同时表征来自不同样品的抗体-报道分子-蛋白质分子。在1108，当探针分子被定位为使得报道分子结合位点被推向纳米孔并且读取位于报道分子之前的序列时，由该探针分子的电信号来确定与被捕获于纳米孔中的探针分子结合的蛋白质的身份。使用同一纳米孔阵列同时表征不同样品允许对两种样品进行良好的定量比较，因为它们经历相同的表征条件。例如，可以对来自样品A和样品B的过氧化氢酶的数量进行计数，并且确定其比值。在1108中，在表征结束时，探针捕获的分子可以被选择性地释放、分箱、计数、收集和/或分选，以供进一步分析和/或使用。例如，从样品A捕获的过氧化氢酶可以从纳米孔阵列中同时释放，并且收集并计数，因为纳米孔是单独且电学可寻址的。
在表征结束时可以收集并回收靶分子以供进一步处理和/或使用。因此，本文所公开的技术允许进行实时的单分子表征，因为被表征的靶分子在该分子被表征时可以被收集、计数、分离。
对于定量分析，靶分子和靶标报道分子(均与探针序列结合)可以用一次性读取的标记物(例如，当靶分子第一次被读取时能够剥离并产生信号的化学标记物)连接。该一次性读取标记物不能重新连接到靶分子上。当一次性读取标记物剥离时产生的信号的存在或不存在能够用来确定该分子是否已经被计数或之前已被表征。
本文描述的技术可用于检测、计数、分选、分箱和/或富集低浓度的样品，例如一次对若干分子进行上述操作。
本发明提供了用于检测分子的各种实例。在某些情况下，ssDNA报道分子可以连接至具有未知组成的溶液中的每个蛋白质。该报道分子然后可以被拉进孔中，并停止。可以进行单一读取来鉴别蛋白质。由于只有一个停止位置用于读取，该方法在能够鉴别的不同蛋白质的数目上可能是有限的。
在另一个例子中，ssDNA报道分子可以连接至具有未知组成的溶液中的每个蛋白质上。该报道分子可以连接至被捕获于孔中的探针分子上。探针分子可以具有地址区域，该地址区域通过使用减速物在与报道分子杂交之前或之后被读取。在该方法中，有更多的探针可以因此用于孔阵列。该地址可以允许鉴别诸多不同的链。作为一个例子，探针对于每个减速物停止可以具有4个水平，以及6个减速物停止，从而给出4096个不同的地址。使用该方法，选择的分子可以从纳米孔阵列释放，并进行分选、分箱和存档。
在另一个例子中，ssDNA报道分子可以连接至具有未知组成的溶液中的每个蛋白质上。在某些情况下，许多或所有的蛋白质可以从大量上清液中分离出来。在某些情况下，洗掉游离的、未结合的报道分子。随后可以破坏和/或降解蛋白质(例如，用蛋白酶)。在某些情况下，这仅将报道分子ssDNA留在反应混合物中，代表处于原始溶液中的原始蛋白质。然后将这些ssDNA报道分子置于阵列上，该阵列在孔中结合有探针ssDNA。在一些实例中，报道分子与探针结合，并且得到的停止信号表示蛋白质的捕获或读取。在一些实施方案中，不再存在蛋白质，因此它们不能随后从纳米孔阵列中释放、分选、分箱并存档。
在另一个例子中，溶液中的分子不是蛋白质。例如，该分子可以是ssDNA。在溶液中的游离DNA与孔中捕获的ssDNA探针的结合可以允许对特定DNA链的检测以及对这些所选链的分选、分箱和归档。在一些情况下，阵列探针从阵列排出并收集。
用于检测分子的方法可以采用减速物。减速物的实例及其应用在美国专利公开号2012/0160681和2012/0160688中描述，其通过引用整体并入本文。
图21示出了减速物与纳米孔中捕获的探针分子的地址区域的结合。地址区域特异性的减速物可以与该区域结合，以允许用纳米孔检测器对其进行快速鉴别和读取。通过使探针分子穿过纳米孔，直到减速物在纳米孔的入口处停止，并且当探针在孔中停顿时测量电信号，可以快速鉴别该区域。地址区域可被设计成使之与特定类型的减速物结合。例如，由isodG和多聚isodC以独特模式构成的多核苷酸可被设计成地址区域。与地址区域中的isodG和isodC特异性结合的减速物(例如，由isodG和/或isodC构成的减速物)可以被定位，以允许容易地读取地址信息。
图22示出了一个示例性的纳米孔检测器，其包括电极A、亲水性表面B，该表面B将两个有意构建的独立的孔分开，在两个孔之间具有一个小孔洞，在该孔洞上生成脂质材料的双层C。通过导电的盐溶液E插入纳米孔D(例如，通过扩散)。图22的纳米孔检测器可以是纳米孔检测器阵列中的多个纳米孔检测器中的一个。
在另一个实施方案中，探针多核苷酸包含在图23中示出的结构。探针分子包含位于一端的第一前大体积结构、位于另一端的第二前大体积结构、第一方向标识符(DI1)、第二方向标识符(DI2)、报道DNA结合位点以及报道分子标识符。
第一前大体积结构在第一条件下形成第一大体积结构。第二前大体积结构在第二条件下形成第二大体积结构。
如本文中所使用的前大体积结构是在特定条件下(例如，在特定温度下，在存在/不存在特定化合物的情况下)能够形成大体积结构的结构。
如本文中所使用的大体积结构是这样的结构：其在工作条件下使测试多核苷酸分子在纳米孔中停顿，直到工作条件改变为另一条件，在后一条件下大体积结构转变为前大体积结构或其他不再能使测试多核苷酸分子停顿的结构。
在一个实施方案中，前大体积结构是多核苷酸分子中的寡核苷酸结构，其在特定条件下能够形成大体积结构。前大体积结构可以是单链多核苷酸或双链多核苷酸。大体积结构的例子包括但不限于2-D和3-D结构，如多核苷酸双链体结构(RNA双链体、DNA双链体或RNA-DNA杂合体)、多核苷酸发夹结构、多发夹结构及多臂结构。
在另一个实施方案中，前大体积结构通过与前大体积结构特异性配体的相互作用而形成大体积结构。这样的前大体积结构/配体对的例子包括但不限于生物素/链霉亲和素、抗原/抗体和碳水化合物/抗体。
在一个实施方案中，大体积结构由寡核苷酸前大体积结构(例如，由单链测试多核苷酸分子中的前大体积结构形成的寡核苷酸结构)形成。多核苷酸或寡核苷酸大体积结构的实例包括但不限于发夹核酸链、杂交的反义核酸链、多臂结构和自杂交的三维DNA或RNA分子。
在另一个实施方案中，大体积结构通过如本文所述的前大体积结构/配体对的相互作用而形成。
在一个实例中，第一和第二前大体积结构均为多核苷酸/寡核苷酸前大体积结构。第一前大体积结构在第一温度下形成相应的第一大体积结构。第二前大体积结构在第二温度下形成相应的第二大体积结构。第一温度比第二温度高。
在另一实例中，第一前大体积结构是多核苷酸/寡核苷酸前大体积结构，其通过与第一前大体积结构特异性配体的相互作用而形成第一大体积结构。在一个优选的实例中，第一大体积结构的形成不依赖于温度。第二前大体积结构优选为，使得前大体积结构与相应的大体积结构之间的转换是温度依赖性的。
如图23所示，探针分子还包含方向标识符：靠近第一前大体积结构的第一方向标识符，和靠近第二前大体积结构的第二方向标识符。
DI1和DI2部分可进一步包含一个或多个其他标识符，例如参照信号标识符、探针来源标识符和探针标识符。
图23中的I1和I2部分可包含一个或多个如本文所述的标识符。
在一个实施方案中，固定与报道分子形成复合物/化合物(报道分子/靶标)的靶标的方法包括：
(A1)制备探针多核苷酸，其中该多核苷酸包含如本文所述的图23所示的结构，并且报道分子可结合到报道分子结合位点；
(B1)在第一条件下由第一前大体积结构形成第一大体积结构(BS1)，
(B2)施加电势，以使单链探针多核苷酸流动通过纳米孔检测器的纳米孔，
(B3)在第二条件下由第二前大体积结构形成第二大体积结构(BS2)，
(B4)在某些情况下，施加另一个电势，以逆转单链测试多核苷酸的流动，直到BS2使单链测试多核苷酸在纳米孔的缩窄区域之前停止，
(B5)在某些情况下，识别探针多核苷酸的标识符(例如第一方向标识符、第二方向标识符、探针标识符、参照信号标识符和探针来源标识符)，以确认大体积结构的正确形成，并且鉴别探针多核苷酸，在以下情况下后者是重要的：在纳米孔阵列中有一个以上的纳米孔，其中每个纳米孔是可寻址的，通过鉴别探针多核苷酸，可寻址的纳米孔和靶标之间的联系得以建立，
(B6)使单链探针多核苷酸与报道分子/靶标接触，以形成包含报道分子-探针多核苷酸区段的单链探针多核苷酸复合物；
(B7)施加另一个电势，以使探针多核苷酸复合物流动通过纳米孔，直到报道分子-探针多核苷酸区段在纳米孔的缩窄区域前停止，
(B8)当报道分子-探针多核苷酸区段在纳米孔内停顿一段停留时间时，获得第一组电信号，
(B9)当报道分子与靶标形成化合物/复合物时，通过鉴别在探针多核苷酸的流动方向上位于报道分子-探针多核苷酸区段之前的结构，来确定报道分子是否被固定，当报道分子被固定时，该靶标也被固定，以及
(B10)在某些情况下，识别I2和LI中的一个或多个标识符(例如，探针标识符、参照信号标识符和探针来源标识符)。
本文描述的方法可以用于在分子水平上检测和/或定量报道分子和连接至报道分子的靶标。
在一些实施方案中，报道分子为靶标。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步适用于使用纳米孔阵列固定多个报道分子/靶分子，其中本文所述的方法适用于单独的探针多核苷酸、单独的报道分子/靶分子以及每个可单独寻址的纳米孔。在报道分子/靶分子被固定和鉴别后，在分子水平上检测/定量该报道分子/靶分子。此外，通过控制其中探针多核苷酸被捕获的单个纳米孔的条件(例如，其电势)，可以进一步浓缩/分选/纯化固定的报道分子/靶分子。
本发明可以在大规模并行的、单独可控的电极/纳米孔传感器上使用。包含多于1,000、10,000、100,000个或数百万个电极/纳米孔传感器的这些电极/纳米孔传感器的阵列可以在基本上为平面的半导体表面上制造。控制电路可被引入半导体中，以创建单独可控的和单独可读取的电极/纳米孔传感器，并且这些传感器可以用来读取任何适合于该纳米孔的聚合物；包括所有形式的DNA和RNA，包括但不限于甲基化DNA。
在某些情况下，用于检测分子的方法可以采用蛋白质解折叠和流通纳米孔。例如，参见J.Nivala,D.B.Marks和M.Akeson,“Unfoldase-mediated protein translocationthrough an α-hemolysin nanopore,”Nature Biotechnology,2013,DOI:10.1038/nbt.2503，其通过引用整体并入本文。解折叠的蛋白质可以穿过本发明的纳米孔。在蛋白质流动通过纳米孔时，可以生成解折叠的蛋白质的氨基酸序列。
实施例
下面的实施例是本发明的各种实施方案的示例，而非限制性的。
实施例1.形成双层并插入孔
使用手动注射器设置和注射泵设置在流动池上形成双层并插入孔导致双层和单溶血素孔的高产率。通过使1M或0.3M KCl溶液和气泡流过脂质覆盖的芯片表面并施加电刺激，在两种设置上均形成双层。两种溶血素施加方法均导致高单孔产率。一种方法包括以下步骤：(1)在癸烷中预混合溶血素与脂质，(2)使溶血素-脂质混合物流过芯片表面，并温育数分钟，(3)形成双层，及(4)施加电刺激以在双层内进行电穿孔而形成孔。第二种方法包括以下步骤：(1)使癸烷中的脂质流过芯片表面，(2)形成双层，(3)使溶血素流过芯片表面，(4)立即流过KCl洗液，以及(5)施加电刺激以在双层内进行电穿孔而形成孔。在这两种应用方法的电穿孔步骤中，可以加热芯片，以使双层对于溶血素的插入而言具有更好的流动性。在电穿孔步骤期间或之后，将温度降至室温或更低，以延长孔的寿命。
实施例2.流动池的构造
参见图24及图25，通过在半导体芯片的顶部直接放置衬垫，将流动池装配在芯片包装上。衬垫厚度从50μm到500μm不等。衬垫可由下列材料组成：在一侧或两侧具有压敏粘合剂的塑料、硅氧烷膜或柔性弹性体，如EPDM。衬垫可以制成任何形状。刚性塑料顶部(例如，由PMMA制成)被放置在衬垫(例如，由PSA层压的PMMA制成)的顶部，并且可以通过压敏粘合剂或通过对衬垫施加压力的锁紧机构而与衬垫密封。顶部具有一个或多个入口和出口孔，用于使试剂和空气流动通过流动池。
在一些情况下，衬垫的总尺寸为4mm×4mm正方形。在某些情况下，对于500μm厚的衬垫构造，流动池的容积为约1.5μL。在一些实施方案中，在衬垫下覆盖约15至20个电极。
实施例3.流体注射泵
参见图26和图27，空气和液体流过芯片的速率通过流体泵和注射阀来控制。由泵产生的流速在0.01μL/s至大于100μL/s不等。流体控制器具有多端口选择阀，该多端口选择阀具有缓冲液入口、出口和脂质/溶血素注射口。
一个实验室流体泵的实例是Kloehn Versapump 6(V6)注射泵。该泵具有安装有5口注射阀的面。在实验过程中，不同的样品被抽吸入注射器并通过出口推出，流进流动池。流速由泵中的步进马达控制。
实施例4.注射泵上的流动方案
该实施例实现了超过90％的脂质覆盖面和30％的溶血素孔插入。DPhPC和溶血素的混合物通过芯片表面的注射也实现了超过50％的孔插入产率。
双层的制备
(a)抽取100μl的1M KCl并使之以10μl/s的流速流过流动池系统。
(b)通过使用Ag/AgCl参比电极施加电势阶跃而调整芯片电极。
(c)以1μl/s的流速注入40μl于癸烷中的7.5mg/ml DPhPC流过芯片。
(d)注入200μl气泡流过芯片。
(e)以1μl/s的流速注入100μl KCl流过芯片。
溶血素孔插入
(a)以1μl/s的流速注入50μl溶血素溶液流过芯片表面。
(b)使100μl KCl溶液流过芯片表面。
(c)在步骤(a)之后、步骤(b)之前或者在步骤(b)之后，立即调整用于孔插入的电极电势。
实施例5.使用手动注射器的流动方案
双层的制备
(a)抽取100μl的1M KCl，并使之流过流动池系统。
(b)通过使用Ag/AgCl参比电极施加电势阶跃而调整芯片电极。
(c)流过含有于癸烷中的7.2mg/ml DPhPC及5μg/ml溶血素的溶血素-脂质混合物，之后是120μl KCl。
(d)施加一系列负电脉冲，以除去脂质覆盖。
(e)流过20μl KCl和20μl气泡两次，随后是120μl KCl。重复步骤(d)和(e)约4次，或者直到至少80％的电极在施加电脉冲时显示高于300pA的电流。
(f)流过20μl KCl和20μl气泡两次，随后是120μl KCl，以恢复具有双层的电极。
溶血素孔插入
(a)提高芯片温度至接近55摄氏度。
(b)施加电脉冲以在双层中进行电穿孔而形成孔。
上述实验步骤导致151-50个单孔产率(分别为约60％至20％的溶血素孔插入)。
在实验过程中可以调节芯片的温度。也可以调整参比电极设置，以潜在地包括涂于流动池上的Ag/AgCl墨水。
实施例6.材料与设置
试剂：0.3M KCl 20mM Hepes pH 7
溶血素：
5μg/ml溶血素，在癸烷中的7.2mg/ml DPhPC和2.5％甘油中
20μg/ml溶血素，在癸烷中的7.2mg/ml DPhPC和2.5％甘油中
DNA：
30μM 30T DNA，含有7.5μM链霉亲和素
30μM 30T DNA，含有7.5μM链霉亲和素和0.83％甘油
芯片：
Rev 2深孔大帽(deep well large cap)
Rev 1深孔大帽
实施例7.双层形成方案
1.流过20μl于癸烷中的7.5mg/ml DPhPC，随后是120μl KCl
2.运行bilayerpop3b，其施加一系列从-250mV到-1V的负电脉冲，具有300pA的钝化电流
3.使用2×(20μL KCl，20μL气泡)和120μl KCl清洗芯片
4.bilayerpop3b
5.重复步骤3和4，直到至少80％的流动池在-400mV至-700mV脉冲时钝化
a.大约4-8次重复
6.使用2×(20μL KCl，20μL气泡)和120μl KCl恢复流动池
实施例8.孔插入方案
方法1：在实验开始时将溶血素与脂质混合
1.形成双层后，在流动池的上方设置暖手器(hand warmer)
2.在双层中进行电穿孔以形成孔(getpore12b)
方法2：使溶血素流过双层，随后为首次清洗电穿孔
1.形成双层后，使20μl在0.3M KCl和5％甘油中的100μg/ml溶血素流过流动池
2.使用20μl气泡和80μL KCl清洗
3.用流动池上方的暖手器在双层中进行电穿孔以形成孔(getpore12b)
实施例9.用泵自动化的双层形成及弹出
图28示出了在重复的双层生成清洗条件下，双层弹出电压对细胞定位。自动化的气泡和KCl清洗方案允许一致的双层形成。表1示出了在不同条件(例如，含有溶血素和脂质或不含溶血素)下的双层形成和弹出产率。
表1.双层的形成和弹出
芯片ID 覆盖％ 弹出％
120830_CC 01-1 99％ 76％
120824_CC 06-1 94％ 59％
120801_CC 01-1 92％ 81％
120803_MT 01-1 73％ 51％
120802_CC-01-1 87％ 93％
120731_MT 01-1 100％ 89％
120803_MT 01-1 73％ 51％
实施例10.施加的波形
图29示出了开放通道所施加的波形和DNA捕获数据的实例。波形被命名为芯片代码042b(chipcode042b)，并且在纵轴上施加从-0.1至0.2伏的电压。时间显示在横轴上，范围为0到6秒。捕获波形之后是-50mV再充电33秒。
实施例11.开放通道数据
实施例8的方法1用于进行不同的方案。这些方案的结果在图30-32中提供。
图30示出了纵轴上从0到160pA的电流和横轴上从0到4秒的时间的曲线图。在7.02211和73.6021pA之间有151条线。该方案为实施例8的方法1。
图31示出了纵轴上从0到300pA的电流和横轴上从0到4.5秒的时间的曲线图。在12.0879和100pA之间有80条线。该图描绘了使用注射泵时收集到的数据。该方案为实施例8的方法1。
图32示出了纵轴上从0到160pA的电流和横轴上从0到4秒的时间的曲线图。在26.2679和75.6827pA之间有117条线。该方案为实施例8的方法2。
表2示出了开放通道数据的汇总
表2.开放通道数据
实验 溶血素插入方法 孔计数
01-1_120830 混合溶血素与脂质 151
02-1_120830 混合溶血素与脂质 67
01-1_120829 混合溶血素与脂质 135
02-1_120829 混合溶血素与脂质 80
01-1_120828 混合溶血素与脂质 50
01-1_120823 混合溶血素与脂质 70
02-1_120823 混合溶血素与脂质 56
04-1_120824 使溶血素在双层上流过 46
06-1_120824 使溶血素在双层上流过 117
07-1_120824 使溶血素在双层上流过 85
实施例12.DNA捕获
实施例8的方法1用于进行不同的方案。这些方案的结果在图33-37中提供。
图33示出了纵轴上从0到300pA的电流和横轴上从0到4秒的时间的曲线图。该方案为实施例8的方法1和160mV。
图34示出了纵轴上从0到300pA的电流和横轴上从0到4秒的时间的曲线图。该方案为实施例8的方法1和80mV。
图35示出了纵轴上从0到300pA的电流和横轴上从0到4秒的时间的曲线图。该方案为实施例8的方法1和220mV。在一些实施方案中，增加电压提高了捕获率。增加电压并不必然提高DNA捕获数。在某些情况下(例如，约50％的例子)，添加DNA会破坏双层和/或将孔从双层中敲出。
图36示出了纵轴上从0到100pA的电流和横轴上从0到4秒的时间的曲线图。该方案为实施例8的方法2。采用160mV捕获电压，在流动池上，在0.3M KCl时，捕获率为30T DNA。
图37示出了纵轴上从0到100pA的电流和横轴上从0到4秒的时间的曲线图。该方案为实施例8的方法2，采用0.3M KCl和30μM的30T DNA与7.5μM的链霉亲和素。
实施例13.DNA捕获
图38示出了对于双层形成(例如，按照自动化方案)后的孔，电流对时间或单元计数的曲线图。孔形成条件为1M KCl，pH 7.5，室温，于癸烷中的15mg/mL DPhPC脂质和于pH7.5水中的20μg/mL溶血素。
从上述记载中应当理解，虽然已经说明和描述了具体实施方案，但可以对其进行各种修改，并且在此也考虑了这些修改。也并不意味着本发明受说明书中提供的具体实施例的限制。虽然已经参照上述说明书对本发明进行了描述，但是对本文优选实施方案的描述和说明并不意味着以限制性的意义来解释。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的具体描述、构造或相对比例，它们取决于多种条件和变量。对本领域技术人员而言，本发明实施方案在形式和细节上的不同修改将是显而易见的。因此，可以预期，本发明还应当包括任何这样的修改、变化和等同方案。意图以下列权利要求限定本发明的范围，从而覆盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (21)

1.一种用于检测靶分子的方法，其包括：
(a)提供在邻近或靠近感测电极设置的膜中包含纳米孔的芯片；
(b)引导核酸分子穿过所述纳米孔，其中所述核酸分子与报道分子相关联，其中所述核酸分子包含地址区域和探针区域，其中所述报道分子与所述核酸分子在所述探针区域相关联，并且其中所述报道分子与靶分子偶联；
(c)在引导所述核酸分子穿过所述纳米孔的同时对所述地址区域进行测序，以确定所述地址区域的核酸序列；及
(d)在计算机处理器的辅助下，基于在(c)中确定的所述地址区域的核酸序列，鉴别所述靶分子。
2.如权利要求1所述的方法，其中通过报道分子与所述核酸分子的探针区域的结合，将(b)中的探针分子保持在所述孔中。
3.如权利要求2所述的方法，其中当所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率降低时，所述核酸分子的最多三个碱基得到鉴别。
4.如权利要求2所述的方法，其中当所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率降低时，所述核酸分子的最多五个碱基得到鉴别。
5.如权利要求2所述的方法，其中在所述报道分子与所述纳米孔相互作用时，所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率降低。
6.如权利要求1所述的方法，其中在(b)中，所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率停止或停顿。
7.如权利要求1所述的方法，其还包括，在(d)之前，确定所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率是否已经降低。
8.如权利要求1所述的方法，其中，在(d)中，若确定所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率已经降低，则所述靶分子得到鉴别。
9.如权利要求1所述的方法，其中，在(d)中，基于(i)所述地址区域的核酸序列和关联与(ii)所述核酸分子通过所述纳米孔的前进速率之间的相关性，鉴别所述靶分子。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米孔为可单独寻址的。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子是单链的。
12.如权利要求1所述的方法，其还包括将所述核酸分子捕获于所述纳米孔中。
13.如权利要求12所述的方法，其中在形成于所述核酸分子的一个或多个端部的大体积结构的辅助下，所述核酸分子被捕获于所述纳米孔中。
14.如权利要求12所述的方法，其中在附着于所述核酸分子的一个或多个端部的大体积结构的辅助下，所述核酸分子被捕获于所述纳米孔中。
15.如权利要求1所述的方法，其还包括逆转所述核酸分子穿过所述纳米孔的流动方向。
16.如权利要求15所述的方法，其还包括当逆转所述核酸分子的流动方向时，对所述地址区域的至少一部分进行重新测序。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述报道分子在所述报道分子的端部包含抗体或适体，并且其中所述抗体或适体与所述靶分子相关联。
18.如权利要求1所述的方法，其中地址区域和探针区域具有已知的核酸序列。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述报道分子包含与所述探针区域的核酸序列互补的核酸序列。
20.如权利要求1所述的方法，其中在被引导穿过所述纳米孔之前，所述核酸分子与所述报道分子相关联。
21.如权利要求1所述的方法，其中，在(b)之前，所述核酸分子穿过所述纳米孔，并且其中，在(b)中，所述报道分子与已穿过所述纳米孔的所述核酸分子相关联。
CN201810865708.1A 2012-02-16 2013-02-15 产生用于纳米孔传感器的双层的方法 Pending CN108949944A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261599871P 2012-02-16 2012-02-16
US61/599,871 2012-02-16
US201261600398P 2012-02-17 2012-02-17
US61/600,398 2012-02-17
CN201380015148.6A CN104254619B (zh) 2012-02-16 2013-02-15 产生用于纳米孔传感器的双层的方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380015148.6A Division CN104254619B (zh) 2012-02-16 2013-02-15 产生用于纳米孔传感器的双层的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108949944A true CN108949944A (zh) 2018-12-07

Family

ID=48984792

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810865708.1A Pending CN108949944A (zh) 2012-02-16 2013-02-15 产生用于纳米孔传感器的双层的方法
CN201380015148.6A Active CN104254619B (zh) 2012-02-16 2013-02-15 产生用于纳米孔传感器的双层的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380015148.6A Active CN104254619B (zh) 2012-02-16 2013-02-15 产生用于纳米孔传感器的双层的方法

Country Status (7)

Country Link
US (4) US9850534B2 (zh)
EP (2) EP3540077B1 (zh)
JP (4) JP6178805B2 (zh)
CN (2) CN108949944A (zh)
CA (1) CA2864125C (zh)
ES (1) ES2732256T3 (zh)
WO (1) WO2013123450A1 (zh)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012083249A2 (en) 2010-12-17 2012-06-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by synthesis using modified nucleotides and nanopore detection
CA2861457A1 (en) * 2012-01-20 2013-07-25 Genia Technologies, Inc. Nanopore based molecular detection and sequencing
CN108949944A (zh) 2012-02-16 2018-12-07 吉尼亚科技公司 产生用于纳米孔传感器的双层的方法
US10246479B2 (en) 2012-04-09 2019-04-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method of preparation of nanopore and uses thereof
WO2013188841A1 (en) * 2012-06-15 2013-12-19 Genia Technologies, Inc. Chip set-up and high-accuracy nucleic acid sequencing
US20150119259A1 (en) 2012-06-20 2015-04-30 Jingyue Ju Nucleic acid sequencing by nanopore detection of tag molecules
US10648026B2 (en) 2013-03-15 2020-05-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Raman cluster tagged molecules for biological imaging
CN105102627B (zh) 2013-03-15 2018-10-19 纽约哥伦比亚大学理事会 用于检测样品中多种预定化合物的方法
US20140329225A1 (en) 2013-05-06 2014-11-06 Two Pore Guys, Inc. Target detection with nanopore
KR102245192B1 (ko) * 2013-05-06 2021-04-29 온테라 인크. 나노포어를 이용한 표적 검출
WO2014190299A2 (en) * 2013-05-23 2014-11-27 Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University Chemistry, systems and methods of translocation of a polymer through a nanopore
CA2926138A1 (en) 2013-10-23 2015-04-30 Genia Technologies, Inc. High speed molecular sensing with nanopores
US9567630B2 (en) * 2013-10-23 2017-02-14 Genia Technologies, Inc. Methods for forming lipid bilayers on biochips
MA39774A (fr) 2014-03-24 2021-05-12 Roche Sequencing Solutions Inc Procédés chimiques pour produire des nucléotides étiquetés
EP3982121B1 (en) * 2014-07-31 2024-04-24 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing with hybrid nanopore sensors
CA2966246C (en) 2014-10-31 2020-07-14 Genia Technologies, Inc. Alpha-hemolysin variants with altered characteristics
US10036739B2 (en) 2015-01-27 2018-07-31 Genia Technologies, Inc. Adjustable bilayer capacitance structure for biomedical devices
CN104651500B (zh) 2015-01-30 2017-06-30 华东理工大学 气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法及其应用
EP3712261A1 (en) 2015-02-02 2020-09-23 F. Hoffmann-La Roche AG Polymerase variants and uses thereof
US9791432B2 (en) * 2015-03-20 2017-10-17 Genia Technologies, Inc. Serpentine flow channels for flowing fluids over chip sensors
TWI571626B (zh) * 2015-07-15 2017-02-21 力晶科技股份有限公司 具有奈米腔的集成生物感測器及其製作方法
US10809243B2 (en) 2015-08-31 2020-10-20 Roche Sequencing Solutions, Inc. Small aperture large electrode cell
WO2017050723A1 (en) 2015-09-22 2017-03-30 Genia Technologies, Inc. Pol7 polymerase variants
EP3766987B1 (en) 2015-09-24 2023-08-02 F. Hoffmann-La Roche AG Alpha-hemolysin variants
US10102338B2 (en) * 2015-09-24 2018-10-16 Genia Technologies, Inc. Adaptive compression and modification of nanopore measurement data
US10935512B2 (en) 2015-09-24 2021-03-02 Roche Sequencing Solutions, Inc. Encoding state change of nanopore to reduce data size
US20180299400A1 (en) * 2015-10-21 2018-10-18 Genia Technologies, Inc. Use of fluoropolymers as a hydrophobic layer to support lipid bilayer formation for nanopore based dna sequencing
CN105368938B (zh) * 2015-11-06 2018-09-21 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 一种基于电击穿在氮化硅薄膜上精确制备纳米孔的方法
US10718737B2 (en) 2016-01-21 2020-07-21 Roche Sequencing Solutions, Inc. Molded flow channel
ES2882646T3 (es) 2016-02-29 2021-12-02 Genia Tech Inc Polimerasas carentes de actividad exonucleasa
US10465240B2 (en) * 2016-03-30 2019-11-05 Roche Sequencing Solutions, Inc. Electrical enhancement of bilayer formation
EP3436602A1 (en) 2016-03-31 2019-02-06 Genia Technologies, Inc. Nanopore protein conjugates and uses thereof
EP3445775A1 (en) 2016-04-21 2019-02-27 H. Hoffnabb-La Roche Ag Alpha-hemolysin variants and uses thereof
CN109416354B (zh) * 2016-06-27 2020-07-10 豪夫迈·罗氏有限公司 用于双层形成的渗透不平衡方法
ES2910406T3 (es) 2016-06-30 2022-05-12 Hoffmann La Roche Nanoporos de alfa-hemolisina de larga duración
GB201612458D0 (en) * 2016-07-14 2016-08-31 Howorka Stefan And Pugh Genevieve Membrane spanning DNA nanopores for molecular transport
CN106443008A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 一种基于固态纳米孔的hiv‑1蛋白酶检测方法
CN110114458A (zh) 2016-09-22 2019-08-09 豪夫迈·罗氏有限公司 Pol6聚合酶变体
WO2018136487A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Omniome, Inc. Process for cognate nucleotide detection in a nucleic acid sequencing workflow
US10913978B2 (en) * 2017-02-14 2021-02-09 Axbio Inc. Apparatus and methods for continuous diagnostics of macromolecules
WO2019018398A1 (en) * 2017-07-17 2019-01-24 President And Fellows Of Harvard College PROTEIN SHUTTLE WITH NANOPORA MATCHING FOR MOLECULAR CHARACTERIZATION
CA3079411C (en) * 2017-10-19 2023-12-05 Omniome, Inc. Simultaneous background reduction and complex stabilization in binding assay workflows
JP7012841B2 (ja) * 2017-10-23 2022-01-28 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 浸透性の不均衡を利用した膜内のタンパク質ナノポアの除去および再挿入
CN109709185A (zh) * 2017-10-25 2019-05-03 深圳宣泽生物医药有限公司 一种修饰生物探针的纳米孔检测装置及制作方法
JP2021513962A (ja) 2018-02-15 2021-06-03 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 分析物の検出および分析のためのナノポアタンパク質コンジュゲート
CN112041331A (zh) 2018-02-28 2020-12-04 豪夫迈·罗氏有限公司 α-溶血素变体及其用途
EP3775893A1 (en) * 2018-04-13 2021-02-17 F. Hoffmann-La Roche AG Methods and compositions for detection and analysis of analytes
EP3802875A1 (en) 2018-05-28 2021-04-14 F. Hoffmann-La Roche AG Enzymatic enrichment of dna-pore-polymerase complexes
US20210375391A1 (en) 2018-06-29 2021-12-02 Roche Sequencing Solutions, Inc Detection of microsatellite instability
WO2020120542A2 (en) * 2018-12-11 2020-06-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Systems and methods for self-limiting protein pore insertion in a membrane
WO2020241453A1 (ja) * 2019-05-27 2020-12-03 国立大学法人山形大学 脂質二分子膜チャネル評価チップ及びその製造方法並びに評価装置
WO2021013805A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Systems and methods for cell of origin determination from variant calling data
EP4031679A1 (en) 2019-09-20 2022-07-27 F. Hoffmann-La Roche AG Immune repertoire profiling by primer extension target enrichment
CN114730609A (zh) 2019-11-21 2022-07-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于下一代测序样品中的污染检测的系统和方法
WO2021239834A1 (en) 2020-05-28 2021-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Sequence alignment systems and methods to identify short motifs in high-error single-molecule reads
CA3191929A1 (en) * 2020-09-08 2022-03-17 Harold G. Monbouquette Lateral flow nucleic acid assay with integrated pore-based detection
US20220177950A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Roche Sequencing Solutions, Inc. Whole transcriptome analysis in single cells
JP2024506899A (ja) 2021-02-09 2024-02-15 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 核酸中のメチル化の塩基レベル検出のための方法
JP2024509424A (ja) 2021-03-03 2024-03-01 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 生物学的試料からの核酸の電気泳動抽出のための装置および方法
CN117730155A (zh) 2021-05-24 2024-03-19 豪夫迈·罗氏有限公司 用于核酸杂交的增强子寡核苷酸
WO2023107899A2 (en) 2021-12-07 2023-06-15 Caribou Biosciences, Inc. A method of capturing crispr endonuclease cleavage products
CN114410459A (zh) * 2022-01-11 2022-04-29 深圳清华大学研究院 基因测序装置和测序方法
WO2023242075A1 (en) 2022-06-14 2023-12-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of epigenetic cytosine modification
WO2024038069A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of epigenetic modifications
CN115651821B (zh) * 2022-12-07 2023-04-07 北京齐碳科技有限公司 一种分子检测单元、芯片以及制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101932933A (zh) * 2007-12-19 2010-12-29 牛津纳米孔技术有限公司 两性分子层的形成
US20110193249A1 (en) * 2010-02-08 2011-08-11 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for forming a nanopore in a lipid bilayer
WO2011097028A1 (en) * 2010-02-08 2011-08-11 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for manipulating a molecule in a nanopore

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993021528A1 (en) * 1992-04-22 1993-10-28 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Lipid membrane sensors
US6413792B1 (en) * 2000-04-24 2002-07-02 Eagle Research Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
US6952651B2 (en) * 2002-06-17 2005-10-04 Intel Corporation Methods and apparatus for nucleic acid sequencing by signal stretching and data integration
EP1601760A4 (en) * 2003-02-28 2009-08-19 Univ Brown NANOPORES, METHOD OF THEIR USE, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND METHOD FOR CHARACTERIZING BIOMOLECULES USING THEREOF
US20050023156A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Ramsey J. Michael Nanostructured material transport devices and their fabrication by application of molecular coatings to nanoscale channels
US20050136408A1 (en) * 2003-12-19 2005-06-23 May Tom-Moy Methods and systems for characterizing a polymer
JP4953044B2 (ja) 2005-05-09 2012-06-13 財団法人生産技術研究奨励会 脂質二重膜の形成方法およびその装置
CN101248189B (zh) * 2005-05-26 2013-05-01 通信改革公司 通过核酸模板化学生物检测的相关应用
US8038885B2 (en) 2005-10-14 2011-10-18 The Regents Of The University Of California Formation and encapsulation of molecular bilayer and monolayer membranes
US7777505B2 (en) 2006-05-05 2010-08-17 University Of Utah Research Foundation Nanopore platforms for ion channel recordings and single molecule detection and analysis
DK2122344T3 (da) 2007-02-20 2019-07-15 Oxford Nanopore Tech Ltd Lipiddobbeltlags-sensorsystem
AU2008236694B2 (en) * 2007-04-04 2014-01-23 The Regents Of The University Of California Compositions, devices, systems, and methods for using a nanopore
GB0713402D0 (en) 2007-07-11 2007-08-22 Cardiff & Vale Nhs Trust A method of diagnosing a condition using a neural network
US8277628B2 (en) * 2007-07-13 2012-10-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and apparatus using electric field for improved biological assays
JP5441142B2 (ja) * 2007-11-26 2014-03-12 国立大学法人 東京大学 マイクロ流体による平面脂質二重膜アレイ及びその平面脂質二重膜を用いた分析方法
GB2467479B (en) * 2007-11-30 2011-12-28 Electronic Bio Sciences Llc Method and apparatus for single side bilayer formation
US8628649B2 (en) * 2008-03-18 2014-01-14 Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University Nanopore and carbon nanotube based DNA sequencer and a serial recognition sequencer
WO2010082860A1 (en) * 2009-01-19 2010-07-22 Instituto De Biologia Experimental E Tecnologia (Ibet) Method and device for nanopore based single-molecule protein/ protein interaction detection
JP5372570B2 (ja) * 2009-03-30 2013-12-18 株式会社日立ハイテクノロジーズ ナノポアを用いたバイオポリマー決定方法、システム、及びキット
CA2808576A1 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 Quantapore, Inc. Ultrafast sequencing of biological polymers using a labeled nanopore
US8324914B2 (en) 2010-02-08 2012-12-04 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for characterizing a molecule
AU2011279083B2 (en) 2010-07-14 2015-03-26 The Curators Of The University Of Missouri Nanopore-facilitated single molecule detection of nucleic acids
WO2012088341A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Genia Technologies, Inc. Nanopore-based single dna molecule characterization, identification and isolation using speed bumps
US8968539B2 (en) * 2011-03-08 2015-03-03 Electronic Biosciences, Inc. Methods for voltage-induced protein incorporation into planar lipid bilayers
EP2737084B1 (en) * 2011-07-25 2017-10-18 Oxford Nanopore Technologies Limited Hairpin loop method for double strand polynucleotide sequencing using transmembrane pores
CN108949944A (zh) 2012-02-16 2018-12-07 吉尼亚科技公司 产生用于纳米孔传感器的双层的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101932933A (zh) * 2007-12-19 2010-12-29 牛津纳米孔技术有限公司 两性分子层的形成
US20110193249A1 (en) * 2010-02-08 2011-08-11 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for forming a nanopore in a lipid bilayer
WO2011097028A1 (en) * 2010-02-08 2011-08-11 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for manipulating a molecule in a nanopore

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
冯辉等: "基于电聚合硫堇膜与纳米复合材料界面的直接电化学免疫传感器的构建 ", 《传感技术学报》 *
董杉木等: "纳米多孔硅阻抗生物传感器的研究 ", 《生物加工过程》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220333187A1 (en) 2022-10-20
WO2013123450A1 (en) 2013-08-22
EP2814983A4 (en) 2016-02-10
EP2814983A1 (en) 2014-12-24
JP2018112557A (ja) 2018-07-19
CN104254619B (zh) 2018-08-24
JP6617167B2 (ja) 2019-12-11
JP6178805B2 (ja) 2017-08-09
US11299781B2 (en) 2022-04-12
US9850534B2 (en) 2017-12-26
EP3540077B1 (en) 2021-01-27
JP6431108B2 (ja) 2018-11-28
US20150337366A1 (en) 2015-11-26
US20190249244A1 (en) 2019-08-15
CA2864125C (en) 2021-08-31
EP3540077A1 (en) 2019-09-18
JP2017106933A (ja) 2017-06-15
EP2814983B1 (en) 2019-04-24
JP2015508896A (ja) 2015-03-23
ES2732256T3 (es) 2019-11-21
CA2864125A1 (en) 2013-08-22
US10316360B2 (en) 2019-06-11
CN104254619A (zh) 2014-12-31
JP2019164155A (ja) 2019-09-26
US20190085386A1 (en) 2019-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104254619B (zh) 产生用于纳米孔传感器的双层的方法
CN104254771B (zh) 基于纳米孔的分子检测与测序
CN105637082B (zh) 用于生物传感器小孔形成的方法
CN104903715B (zh) 纳米孔阵列
CN104955958A (zh) 使用标记的核酸测序
JP6795612B2 (ja) 二重層形成の電気的促進
CN104350162A (zh) 芯片设置和高精确度核酸测序
WO2014074922A1 (en) Concentrating a target molecule for sensing by a nanopore
AU2013316042A1 (en) Systems, devices, and methods for identifying a disease state in a biological host using internal controls
Shoji et al. Recessed Ag/AgCl microelectrode-supported lipid bilayer for nanopore sensing
Confederat et al. Nanopore fingerprinting of supramolecular DNA nanostructures

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination