CN104651500B - 气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，包括以下步骤：⑴气单胞菌溶素的前处理；⑵用提拉法制备磷脂双分子层；⑶形成气单胞菌溶素纳米孔通道，获得电流在50±5pA的单个气单胞菌溶素纳米孔通道。本发明制备的气单胞菌溶素纳米孔通道结构稳定、分辨率高、内腔整体带正电荷、无需修饰即可用于检测且操作简单，能在DNA测序、DNA损伤、Micro‑RNA检测中应用，包括能区分仅具有一个碱基差别的DNA序列；能实现DNA测序；能实现对DNA边剪切边测定；能通过绑定phi29 DNA聚合酶降低DNA通过孔的速度；能检测DNA损伤，包括碱基的替换、消失和插入；能用于检测多种RNA，包括对Micro‑RNA的检测。

Description

气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子检测和DNA测序技术领域，具体的是气单胞菌溶素(aerolysin)纳米孔通道的制备方法及其应用。
背景技术
生物纳米通道是利用跨膜通道最为天然的纳米器件，其孔径一般仅为1～10纳米，只能容纳一个分子（如DNA、Micro-RNA、多肽、糖等）穿过孔道，因此，能够在水溶液体系实现对单个分子的实时、高通量、无标记超灵敏分析。目前，应用较多的生物纳米通道为α-溶血素、MspA纳米通道和SP1纳米通道。这些纳米通道能够实现对待测分子的超灵敏分析。然而，它们对于分子间微小的差别，如单个不同种类碱基的区分、不同Micro-RNA种类的区分以及DNA损伤的测试仍存在不足：分子穿过纳米孔道的速度过快、分辨率不够等。
为进一步提高纳米通道的分辨率，现有很多研究都在致力于对α-溶血素纳米通道进行修饰，以缩短纳米孔的有效孔径。例如，Bayley研究小组利用基因工程，定点突变α-溶血素孔道内部的氨基酸，嵌入环糊精以达到缩小孔径的目的，最终实现对分子微小变化的超灵敏检测。但是，这一技术的实现需要掌握基因突变技术，工作量大且不容易重复再现。此外，另一些研究致力于通过改变电解质溶液的浓度、引入DNA聚合酶、基因突变等方式使纳米通道内部带正电荷来降低DNA分子穿过纳米孔的速度。2008年，人们发现了孔径为1.2nm的MspA纳米通道，由于其孔径相对α-溶血素缩短了0.2纳米，使对DNA检测的分辨率能力有了显著的提高。但是，由于野生型MspA通道内氨基酸带负电，若不经修饰得到的孔有相当多的背景信号，根本不能用于实验，因此，MspA用作纳米通道分析必须先经过基因突变的方法，将其孔道内部的负电荷转变为正电荷。这无疑增加了实验的难度，使得实验的过程更为复杂和困难。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供一种气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，它能在水溶液中自组装形成七聚体结构并经过构象变化插入磷脂膜中，形成纳米尺寸的通道，这种天然结构的纳米通道具有更小的孔径，更好的分辨率，在气单胞菌溶素纳米通道内腔表现出正电性，能与带负电的分子相互作用减慢待测分子的过孔速度，因此能够在单分子水平上分辨更为细微的变化，实现对单个碱基的超灵敏分辨；本发明的第二目的是，提供所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro- RNA检测中的具体应用。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）气单胞菌溶素的前处理
将trypsin-EDTA溶液和气单胞菌溶素以1:100混合并在室温下培养10min，活化后的气单胞菌溶素用PBS缓冲液配置并在-20℃冰箱中存储，储存浓度范围为0.1～10mg/ml；
（2）用提拉法制备磷脂双分子层
用聚缩醛树脂检测池作为载体制备磷脂双分子层，所述聚缩醛树脂检测池含有检测池I（即顺室）和检测池II（也即反室），所述检测池II嵌入所述检测池I中；在磷脂双分子层形成后将所述聚缩醛树脂检测池分为两个区域：由于所述气单胞菌溶素纳米孔插入磷脂膜时是单向的，因此，定义气单胞菌溶素纳米孔嵌入磷脂膜后与大口端对应的是检测池I，与小口端对应的为检测池II；在所述检测池II上有直径为50μm的小孔，用于形成磷脂双分子层；在检测池I的侧边有与池体连通的提拉孔，用于插入注射器对内部溶液进行提拉；将形成磷脂双分子层膜所用的1，2-二植烷酰基磷脂储存在氯仿溶液中，保存在-20℃冰箱中；具体过程为：
①配置磷脂正癸烷溶液，制备磷脂双分子层膜前须先将1，2-二植烷酰基磷脂氯仿溶液中的氯仿抽去，然后将90μl正癸烷加入抽好的1，2-二植烷酰基磷脂中配置成磷脂正癸烷溶液；
②涂抹磷脂正癸烷溶液，用貂毛画笔在1mL检测池2的小孔内外两侧均匀涂抹磷脂正癸烷溶液并用N2吹干；
③施加电压，将检测池I和检测池II组装后分别加入1mL电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加100mV电压并指定顺室为虚拟接地端；
④反复提拉溶液，在反室的小孔处形成磷脂双分子层膜，在磷脂双分子层膜形成过程中，通过电容监测其形成质量并利用电压考察磷脂双分子的机械强度，对所得磷脂膜施加400mV电压；
若磷脂双分子层膜被击破则应重新拉起，重新提拉后的磷脂双分子层膜的电容与被击破的磷脂双分子层膜的电容相同或更大，该磷脂双分子层膜能用于形成纳米孔；若所述电容减小则应继续施加400mV；
⑤检测与重复，若磷脂双分子层膜在400mV电压下不能被击破，应用貂毛画笔将其刷破，再重新提拉成膜，重复步骤③和④，直至得到可用于形成纳米孔的磷脂双分子层膜；
（3）形成气单胞菌溶素纳米孔通道
在稳定的磷脂双分子层膜形成后，在所述顺室加入1-10μl气单胞菌溶素，施加电压使气单胞菌溶素嵌入所述磷脂双分子层膜，当气单胞菌溶素在磷脂双分子层膜上形成稳定的纳米通道时，离子流会发生跃升；在100mV电压下获得电流在50±5pA的单个气单胞菌溶素纳米孔通道。
进一步，步骤（3）施加的电压范围为100-300mV。
进一步，所述制备方法能同时获得多个纳米孔，每增加一个纳米孔，100mV电压下电流值相应增加50±5pA。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用。
进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，其检测方法为：
（1）在纳米通道的两端施加电压，将待测分子加入检测池的一端，待测分子随离子流驱动进入气单胞菌溶素纳米孔，通过与气单胞菌溶素纳米孔的相互作用产生与其结构变化相对应的阻断电流信号；
（2）改变施加在气单胞菌溶素纳米孔两端的电压，在不同电压下记录产生的阻断电流信号；
（3）对记录的信号的阻断时间、阻断程度、信号频率进行归类分析，获得待测分子的相应结构信息。
检测应用中所有测得的阻断信号（阻断事件）涉及两个重要参数：阻断电流和阻断时间。一个完整的阻断事件包括阻断电流从开孔电流处以一定幅值量子化阶跃至返回开孔电流，直到下一阻断事件的发生点，为一个轮回。因此，涉及相关的检测参数有四项：阻断时间（t）、阻断电流（i）、事件发生频率（f）和峰形。这四项检测参数直接反映了单个分子通过气单胞菌溶素纳米孔的过程。通过对阻断事件的统计分析，能够得到分子构型、分子通过模式、分子在通道内速率以及样品中待测分子浓度等多方面的信息。而改变检测条件，如改变分子长度、分子构象、外加电压、缓冲液浓度、溶液pH值和温度等，都将引起这四项检测参数的变化。
进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，能实现单碱基分辨，即能区分仅具有一个碱基差别的DNA序列（如AGA、GGA、CGA、TGA）。
进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，能实现DNA测序：通过在气单胞菌溶素纳米孔内嵌入γ-环糊精的方式，使气单胞菌溶素纳米孔的有效孔道内径更小，具有更高的分辨率。
进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，能实现DNA测序：以四个碱基为一个单元，对四种碱基的不同组合进行检测，根据每种组合对应的特征电流值确定DNA序列。
进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，在气单胞菌溶素纳米孔通道口连接DNA剪切酶，在DNA通过气单胞菌溶素纳米孔的过程中实现对DNA边剪切边测定。
进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，在气单胞菌溶素纳米孔通道口绑定phi29 DNA聚合酶，在DNA进入气单胞菌溶素纳米孔时与phi29 DNA聚合酶产生相互作用，降低DNA通过孔的速度。
进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，可检测DNA损伤：包括碱基的替换、消失、插入；具体地可分为：
⑴碱基的异构互变，如烯醇式与酮式碱基间的互变导致的错误配对；
⑵碱基的脱氨基作用，即碱基的环外氨基自发脱落，从而胞嘧啶会变成尿嘧啶、腺嘌呤会变成次黄嘌呤（H）、鸟嘌呤会变成黄嘌呤（X）等；
⑶脱嘌呤与脱嘧啶，自发的水解可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落下来；
⑷碱基修饰与链断裂，细胞呼吸产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，还可能引起DNA单链断裂等损伤，体内DNA的甲基化，羟甲基化等结构变化；
⑸烷化剂造成的碱基烷基化、碱基脱落、DNA链断裂。
进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，能用于端粒不同长度的检测；所述端粒由DNA序列构成，其长短与人体寿命相关，可通过该方法能对不同DNA序列作分辨，进行端粒不同长度的检测。
进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，能用于无需探针标记检测多种Micro-RNA；所述Micro-RNA具有调节人体内基因的表达的作用，人体内Micro-RNA的水平与多种疾病直接相关，通过本发明提供的检测应用，能无需标记的在单分子水平特异性上检测实际样品中Micro-RNA的水平，从而进行疾病的临床诊断。
本发明的积极效果是：
（1）制备的气单胞菌溶素纳米孔通道结构稳定，一旦获得可长时间保持其稳定开孔状态且不受外界条件改变的干扰，能在很高浓度变性剂条件下性质稳定。
（2）分辨率高，由于气单胞菌溶素具有天然的小口径，因此无需修饰或进行氨基酸突变即可获得优于其他孔道的分辨率。
（3）内腔整体带正电荷，使得带负电的DNA分子与气单胞菌溶素纳米孔内腔作用，能降低过孔速度，对实现单碱基分辨十分有利。
（4）无需修饰即可用于检测应用，操作简单。
附图说明
图1为本发明气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法的流程框图。
图2为检测池I的结构示意图。
图3为检测池II的结构示意图。
图4为 1，2-二植烷酰基磷脂的分子结构图。
图5为提拉法原理示意图。
图6为具有一个不同碱基的DNA序列单碱基分辨示意图。
图7为通过嵌入环糊精进行DNA测序的示意图。
图8为甲基化前后胞嘧啶的结构图。
图9为用phi29 DNA聚合酶进行DNA测序的示意图。
图中的标号分别为：
1、顺室； 2、提拉孔； 3、反室；
4、小孔； 5、聚缩醛树脂检测池； 6、电解质溶液；
7、磷脂双分子层； 8、环糊精； 9、剪切酶；
10、单个核苷酸； 11、模板链； 12、引物链；
13、低聚DNA链； 14、DNA聚合酶。
具体实施方式
以下结合附图介绍本发明气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法的具体实施方式，提供5个实施例；7个应用实施例。但是应该指出，本发明的实施不限于以下的实施方式。
实施例1
参见图1。一种气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，包括以下步骤：
（1）气单胞菌溶素的前处理
将trypsin-EDTA溶液和气单胞菌溶素以1:100混合并在室温下培养10min，活化后的气单胞菌溶素用PBS缓冲液配置并在-20℃冰箱中存储，储存浓度为0.1mg/ml。
（2）用提拉法制备磷脂双分子层
用聚缩醛树脂检测池5作为载体制备磷脂双分子层7，所述聚缩醛树脂检测池5含有检测池I（也即顺室1，参见图2）和检测池II（也即反室3，参见图3），所述检测池II嵌入所述检测池I中；在磷脂双分子层7形成后将所述聚缩醛树脂检测池5分为两个区域：由于所述气单胞菌溶素纳米孔插入磷脂膜时是单向的，因此，定义气单胞菌溶素纳米孔嵌入磷脂膜后与大口端对应的是顺室1（即检测池I），与小口端对应的为反室3（即检测池II）；在所述检测池II上有直径为50μm的小孔4，用于形成磷脂双分子层7；在检测池I的侧边有与池体连通的提拉孔2，用于插入注射器对内部溶液进行提拉；将形成磷脂双分子层膜7所用的1，2-二植烷酰基磷脂（参见图4）储存在氯仿溶液中，保存在-20℃冰箱中。
具体过程为：
①涂抹磷脂正癸烷溶液，备磷脂双分子层膜前须先将1，2-二植烷酰基磷脂氯仿溶液中的氯仿抽去，然后将90μl正癸烷加入抽好的1，2-二植烷酰基磷脂中配置成磷脂正癸烷溶液。
②涂抹磷脂正癸烷溶液，用貂毛画笔在1mL检测池II的小孔4内外两侧均匀涂抹磷脂正癸烷溶液并用N2吹干。
③施加电压，将检测池I和检测池II组装后分别加入1mL电解质溶液6，将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液6中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层7膜两端施加100mV电压并指定顺室1为虚拟接地端。
④反复提拉溶液（提拉法原理参见图5），在反室3的小孔4处形成磷脂双分子层膜，在磷脂双分子层7成膜过程中，通过电容监测其形成质量并利用电压考察磷脂双分子层膜的机械强度，对所得磷脂膜施加400mV电压；若磷脂双分子层膜被击破则应重新拉起，重新提拉后的磷脂双分子层膜的电容与被击破的磷脂双分子层膜的电容相同或更大，该磷脂双分子层膜能用于形成纳米孔；若所述电容减小则应继续施加400mV电压。
⑤检测与重复，若磷脂双分子层膜在400mV电压下不能被击破，应用貂毛画笔将其刷破，再重新提拉成膜，重复步骤③和④，直至得到可用于形成纳米孔的磷脂双分子层膜。
（3）形成气单胞菌溶素纳米孔通道
在稳定的磷脂双分子层膜形成后，在所述顺室1中加入10μl气单胞菌溶素，施加100mV电压使气单胞菌溶素嵌入所述磷脂双分子层膜，当气单胞菌溶素在磷脂双分子层膜上形成稳定的纳米通道时，离子流会发生跃升；在100mV电压下获得电流在50±5pA的单个气单胞菌溶素纳米孔通道。
对实施例1制备的气单胞菌溶素纳米孔通道的检测分析：
为了确定得到的气单胞菌溶素纳米孔通道能否用于检测，首先，应确定制备的气单胞菌溶素纳米孔通道显示的电流值是否在正常范围，即100mV电压下单个纳米孔对应的电流值在50±5pA内；其次，得到制备的气单胞菌溶素纳米孔通道后，应记录不同电压下（-200mV～+200mV)未加待测物时的时间-电流曲线，用于判断所得气单胞菌溶素纳米孔通道是否稳定，若记录的时间-电流曲线稳定表示可用于检测。
实施例1制备的气单胞菌溶素纳米孔通道经检测分析的结果表明：可进行检测应用。
实施例2
一种气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，包括以下步骤：
（1）气单胞菌溶素的前处理，基本同实施例1，所不同的是：活化后气单胞菌溶素的存储浓度为10mg/ml。
（2）用提拉法制备磷脂双分子层（同实施例1）。
（3）形成气单胞菌溶素纳米孔通道，基本同实施例1，所不同的是：在稳定的磷脂双分子层膜形成后，在所述顺室1加入1μl气单胞菌溶素,施加200mV电压使气单胞菌溶素嵌入磷脂双分子层膜，当气单胞菌溶素在磷脂双分子层膜上形成稳定的纳米通道时，离子流会发生跃升；在200mV电压下获得电流在100±5pA的单个气单胞菌溶素纳米孔通道。
对实施例2制备的气单胞菌溶素纳米孔通道的检测分析基本同实施例1。
将电压调至100mV，可验证实施例2制备的气单胞菌溶素纳米孔通道的电流是否在50±5pA范围内。
实施例3
一种气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，包括以下步骤：
（1）气单胞菌溶素的前处理，基本同实施例1，所不同的是：活化后气单胞菌溶素存储的浓度为1.5mg/ml。
（2）用提拉法制备磷脂双分子层（同实施例1）。
（3）形成气单胞菌溶素纳米孔通道，基本同实施例1，所不同的是：在稳定的磷脂双分子层膜形成后，在所述顺室1加入3ul气单胞菌溶素施加+300mV电压使气单胞菌溶素嵌入磷脂双分子层膜，当气单胞菌溶素在磷脂双分子层膜上形成稳定的纳米通道时，离子流会发生跃升；在300mV电压下获得电流在150±5pA的单个气单胞菌溶素纳米孔通道。
对实施例3制备的气单胞菌溶素纳米孔通道的检测分析基本同实施例1。
将电压调至100mV，可验证实施例3制备的气单胞菌溶素纳米孔通道的电流是否在50±5pA范围内。
实施例4
一种气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，包括以下步骤：
（1）气单胞菌溶素的前处理，基本同实施例1，所不同的是：活化后气单胞菌溶素存储的浓度为0.5mg/ml。
（2）用提拉法制备磷脂双分子层（同实施例1）。
（3）形成气单胞菌溶素纳米孔通道，基本同实施例1，所不同的是：在稳定的磷脂双分子层膜形成后，在所述顺室1加入5μl气单胞菌溶素,施加150mV电压使气单胞菌溶素嵌入磷脂双分子层膜，当气单胞菌溶素在磷脂双分子层膜上形成稳定的纳米通道时，离子流会发生跃升；在150mV电压下获得电流在75±5pA的单个气单胞菌溶素纳米孔通道。
对实施例4制备的气单胞菌溶素纳米孔通道的检测分析基本同实施例1。
将电压调至100mV，可验证实施例4制备的气单胞菌溶素纳米孔通道的电流是否在50±5pA范围内。
实施例5
一种气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，包括以下步骤：
（1）气单胞菌溶素的前处理，基本同实施例1，所不同的是：活化后气单胞菌溶素存储的浓度为1.5mg/ml。
（2）用提拉法制备磷脂双分子层（同实施例1）。
（3）形成气单胞菌溶素纳米孔通道，基本同实施例1，所不同的是：在稳定的磷脂双分子层膜形成后，在所述顺室1加入3μl气单胞菌溶素施加+100mV电压使气单胞菌溶素嵌入磷脂双分子层膜，当气单胞菌溶素在磷脂双分子层膜上形成稳定的纳米通道时，离子流会发生跃升；在100mV电压下获得电流在150±5pA的三个气单胞菌溶素纳米孔通道。
对实施例5制备的气单胞菌溶素纳米孔通道的检测分析基本同实施例1。
应用实施例1
用气单胞菌溶素纳米孔通道进行单碱基分辨，包括以下步骤：
（1）在纳米通道的两端施加电压，在聚缩醛树脂检测池5的一端加入只有一个碱基序列不同的单链DNA，序列可以是AGA、GGA、CGA、TGA，或AAA、TAA、CAA、GAA，以及其他长度的、含有一个不同碱基位点的DNA序列，其中一组可实施的DNA序列结构参见图6。所述单链DNA随离子流驱动进入气单胞菌溶素纳米孔，通过与气单胞菌溶素纳米孔的相互作用产生与其结构变化相对应的阻断电流信号。
（2）改变施加在气单胞菌溶素纳米孔两端的电压，在不同电压下记录产生的阻断电流信号。
（3）对采集到的信号阻断程度（即阻断电流与开孔电流的比值）进行统计，所测含有不同碱基的DNA序列可以被完全区分开。进而能够对DNA损伤造成的单个或多个碱基的差别进行检测。
应用实施例2
在气单胞菌溶素纳米孔通道口加入剪切酶进行DNA测序，包括以下步骤：
（1）对任意DNA序列，取四个碱基序列为一个单元，四个碱基总共有64种排列方式，每一排列方式对应一特征阻断电流值。将64种排列方式不同的DNA序列分别加入聚缩醛树脂检测池5的顺室1，统计每一排列方式对应的阻断电流值。
（2）将一段待测单链DNA加入顺室1，单链DNA在剪切酶的作用下，以四个碱基为单位被剪切并落入气单胞菌溶素纳米孔中产生有其特征的阻断电流值。
（3）将步骤（2）产生的阻断电流值与步骤（1）测出的64种阻断电流值进行对照，既可得出所测单链DNA的序列。
应用实施例3
通过在气单胞菌溶素纳米孔内嵌入环糊精进行DNA测序，其实验原理参见图7。
（1）将γ-环糊精8从顺室1或者反室3加入，γ-环糊精8能嵌在气单胞菌溶素纳米孔内，使气单胞菌溶素纳米孔的有效孔道内径更小。
（2）γ-环糊精8嵌入后，开孔电流下降，此时分别单独加入A、T、C、G四种碱基，所述环糊精8修饰的气单胞菌溶素纳米孔能对A、T、C、G四种碱基产生不同的特征电流。
（3）在聚缩醛树脂检测池5的顺室1中加入DNA剪切酶9，再加入待测单链DNA，待测单链DNA能被DNA剪切酶9剪成单个碱基（单个核苷酸10），能在嵌入了环糊精9的气单胞菌溶素纳米孔中被依次检测。
（4）检测中为了使剪切酶9接近纳米孔孔口，采取在气单胞菌溶素纳米孔两端施加盐浓度梯度的方法，顺室1中氯化钾浓度为250mM，反室3中氯化钾浓度为500mM，两端电解质溶液均含25mM Tris-HCl，调节PH为7.9。
应用实施例4
在气单胞菌溶素纳米孔通道口绑定phi29 DNA聚合酶14进行DNA测序。
所述Phi29 DNA聚合酶14为β-家族聚合酶中的一员，phi29 DNA聚合酶能像齿轮一样以转动单链DNA进入纳米孔，每一条DNA链在聚合酶校对过程中伸入纳米通道并在DNA聚合过程中退出纳米通道，从而实现纳米通道对每一个核苷酸的二次检测，提高气单胞菌溶素纳米孔对DNA测序的时间分辨率及准确性。
（1）将phi29 DNA聚合酶14加入顺室1，另加入含有待测DNA序列的DNA链，这段DNA链包括一段包含待测序列的模板链11、一段引物链12以及阻断低聚DNA链13，所述引物链12在5’-磷酸末端有一段发卡结构以阻止phi29 DNA聚合酶与互补配对后的双链DNA反应。所述低聚DNA链13和所述模板链11均含有缺碱基位点，从而能通过待测DNA序列起止端的电流变化进行识别。
（2）将10mM氯化镁和dCTP、dATP、dTTP、dGTP各100uM加入聚缩醛树脂检测池5顺室1用于DNA的合成；检测应在室温下进行。
（3）用phi29DNA聚合酶14进行DNA测序的原理参见图8：模板链11首先进入纳米孔中，在继续进入的过程中，低聚DNA链13与模板链11慢慢解旋，解旋至缺碱基位点处则低聚DNA链13离去。引物链12在5’-磷酸末端的发卡结构阻止了phi29聚合酶进一步与双链DNA作用，此时，聚缩醛树脂检测池5中的dCTP、dATP、dTTP、dGTP在phi29DNA聚合酶14的作用下与模板链11配对聚合到低聚DNA链13上，同时使低聚DNA链13反向运动，由于聚合作用使得低聚DNA链13过孔速率减慢，进而可以对单个碱基进行分辨。
应用实施例5
用气单胞菌溶素纳米孔通道进行DNA损伤的检测。
（1）对DNA进行甲基化，一种实施方案为对胞嘧啶进行甲基化，甲基化前后的胞嘧啶结构参见图9所示。
（2）单独将含有未甲基化的胞嘧啶的“CG”DNA序列加入检测池中。
（3）将含有未甲基化胞嘧啶的DNA序列和甲基化后胞嘧啶的DNA序列1︰1混合加入检测池中。
（4）对步骤（1）、（2）、（3）获得的信号进行统计分析，可以看到本发明的气单胞菌溶素纳米孔通道能将两种DNA序列区分开来，混合加入时产生的阻断电流峰值与单独加入时的阻断电流峰值有很好的对应。
应用实施例6
用气单胞菌溶素纳米孔通道进行端粒的检测。
所述“端粒”是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，其作用是保持染色体的完整性。端粒DNA是由简单的DNA高度重复序列组成的，端粒酶可用于给端粒DNA加尾，DNA分子每次分裂复制，端粒就会缩短一点（如冈崎片段），一旦端粒消耗殆尽，染色体就易于突变而导致动脉硬化和某些癌症。所以端粒的长度能反映细胞复制史及复制潜能，被称作细胞寿命的“有丝分裂钟”。人体内端粒DNA序列是由n个TTAGGG序列的重复单元构成的，不同年龄对应不同长度的端粒，从而对应不同的特征信号。根据这一原理，人们可以对不同年龄段的人体中的端粒进行检测，检测其对应的阻断电流和阻断时间，从而得到不同年龄的人端粒长度的分布。
具体检测为：
（1）取不同年龄段的人体细胞，用生物手段对其染色体末端的端粒DNA序列进行提取，以10岁为一个跨度，即对年龄为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100的人体内端粒进行检测，每一年龄段随机选20人取样，样品离心稀释后加入检测池进行检测。
（2）对每一年龄段的检测结果进行统计，取峰值对应的阻断电流和阻断时间为这一年龄段的两个特征值，分别绘制成“年龄段-电流阻断曲线”以及“年龄段-阻断时间曲线”。
（3）将待测未知年龄的样品进行离心，稀释后加入检测池，统计其电流阻断和阻断时间，绘制对应的“年龄段-电流阻断曲线”以及“年龄段-阻断时间曲线”，可以初步确定未知年龄样品的年龄段。
实施例7
用气单胞菌溶素纳米孔通道进行Micro-RNA的检测。
Micro-RNA具有调节人体内基因的表达的作用，人体内micro-RNA的水平与多种疾病直接相关。目前的研究显示，在直肠癌患者体内Micro-RNA-21-5P和Micro-RNA-92a-3P的水平均呈上升趋势。用本发明的气单胞菌溶素纳米孔通道不仅能够区分多种Micro-RNA，而且可以对实际样品进行定量检测，能无需标记的在单分子水平特异性上检测实际样品中的Micro-RNA水平，从而进行疾病的临床诊断。
待测Micro-RNA序列分别为：
Micro-RNA21：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；
Micro-RNA92：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU。
具体检测步骤为：
（1）分别将相同浓度的Micro-RNA21、Micro-RNA92加入检测池中，统计三种Micro-RNA产生的电流信号。
（2）分别测定不同浓度的Micro-RNA21、Micro-RNA92，其浓度应与信号出现频率呈线性关系。
（3）将待测样品离心处理后加入检测池，根据步骤（1）测得的浓度——频率曲线可得到待测样品中Micro-RNA的水平，从而进行疾病的早期诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种气单胞菌溶素纳米孔通道的用途，其特征在于，将其气单胞菌溶素纳米孔通道用于非诊断用途的DNA测序、DNA损伤或Micro-RNA检测；
所述气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法为：
（1）气单胞菌溶素的前处理
将trypsin-EDTA溶液和气单胞菌溶素以1:100混合并在室温下培养10min，活化后的气单胞菌溶素用PBS缓冲液配置并在-20℃冰箱中存储，储存浓度范围为0.1～10mg/ml；
（2）用提拉法制备磷脂双分子层
用聚缩醛树脂检测池作为载体制备磷脂双分子层，所述聚缩醛树脂检测池含有检测池I和检测池II，所述检测池II嵌入所述检测池I中；在磷脂双分子层形成后将所述聚缩醛树脂检测池分为两个区域：由于所述气单胞菌溶素纳米孔插入磷脂膜时是单向的，因此，定义气单胞菌溶素纳米孔嵌入磷脂膜后与大口端对应的是检测池I，与小口端对应的为检测池II；在所述检测池II上有直径为50μm的小孔，用于形成磷脂双分子层；在检测池I的侧边有与池体连通的提拉孔，用于插入注射器对内部溶液进行提拉；将形成磷脂双分子层膜所用的1，2-二植烷酰基磷脂储存在氯仿溶液中，保存在-20℃冰箱中；
具体过程为：
①制备磷脂双分子层膜前须先将1，2-二植烷酰基磷脂氯仿溶液中的氯仿抽去，然后将90μl正癸烷加入抽好的1，2-二植烷酰基磷脂中配置成磷脂正癸烷溶液；
②用貂毛画笔在1mL检测池2的小孔内外两侧均匀涂抹磷脂正癸烷溶液并用N2吹干；
③将检测池I和检测池II组装后分别加入1mL电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加100mV电压并指定顺室为虚拟接地端；
④反复提拉溶液，在反室的小孔处形成磷脂双分子层膜，在磷脂双分子层膜形成过程中，通过电容监测其形成质量并利用电压考察磷脂双分子的机械强度，对所得磷脂膜施加400mV电压；
若磷脂双分子层膜被击破则应重新拉起，重新提拉后的磷脂双分子层膜的电容与被击破的磷脂双分子层膜的电容相同或更大，该磷脂双分子层膜能用于形成纳米孔；若所述电容减小则应继续施加400mV；
⑤若磷脂双分子层膜在400mV电压下不能被击破，应用貂毛画笔将其刷破，再重新提拉成膜，重复步骤③和④，直至得到可用于形成纳米孔的磷脂双分子层膜；
（3）形成气单胞菌溶素纳米孔通道
在稳定的磷脂双分子层膜形成后，在所述顺室加入1-10μl气单胞菌溶素，施加电压使气单胞菌溶素嵌入所述磷脂双分子层膜，当气单胞菌溶素在磷脂双分子层膜上形成稳定的纳米通道时，离子流会发生跃升；在100mV电压下获得电流在50±5pA的单个气单胞菌溶素纳米孔通道；
所述DNA测序、DNA损伤或Micro-RNA检测的方法为：
（1）在纳米通道的两端施加电压，将待测分子加入检测池的一端，待测分子随离子流驱动进入气单胞菌溶素纳米孔，通过与气单胞菌溶素纳米孔的相互作用产生与其结构变化相对应的阻断电流信号；
（2）改变施加在气单胞菌溶素纳米孔两端的电压，在不同电压下记录产生的阻断电流信号；
（3）对记录的信号的阻断时间、阻断程度、信号频率进行归类分析，获得待测分子的相应结构信息。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述形成气单胞菌溶素纳米孔通道的步骤中，同时获得多个纳米孔，每增加一个纳米孔，100mV电压下电流值相应增加50±5pA。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，能实现单碱基分辨。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，能实现DNA测序：通过在气单胞菌溶素纳米孔内嵌入γ-环糊精的方式，使气单胞菌溶素纳米孔的有效孔道内径更小，具有更高的分辨率。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，能实现DNA测序：以四个碱基为一个单元，对四种碱基的不同组合进行检测，根据每种组合对应的特征电流值确定DNA序列。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，在气单胞菌溶素纳米孔通道口连接DNA剪切酶，在DNA通过气单胞菌溶素纳米孔的过程中实现对DNA边剪切边测定。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，在气单胞菌溶素纳米孔通道口绑定phi29DNA聚合酶，在DNA进入气单胞菌溶素纳米孔时与phi29 DNA聚合酶产生相互作用，降低DNA通过孔的速度。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，能检测包括碱基的替换、消失、插入的DNA损伤。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述DNA损伤为：
⑴碱基的异构互变；
⑵碱基的脱氨基作用；
⑶脱嘌呤与脱嘧啶；
⑷碱基修饰与链断裂；
⑸烷化剂造成的碱基烷基化、碱基脱落、DNA链断裂。
10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，用于无需探针标记检测多种Micro-RNA。
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