CN110133065A - 一种利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用α‑溶血素纳米孔检测铜离子的方法，属于铜离子检测技术领域。上述方法包括：步骤1：α‑溶血素纳米孔的组装；步骤2：利用上述α‑溶血素纳米孔检测不同浓度铜离子样品，建立信号频率与铜离子浓度的工作曲线；步骤3：检测未知铜离子浓度样品中铜离子的信号频率，利用上述工作曲线计算铜离子浓度。本发明只涉及两个单链DNA底物探针，在铜离子和抗坏血酸钠存在的情况下，能够催化点击反应的发生，两条DNA探针通过点击反应成分叉DNA，利用纳米孔检测具有较高的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及铜离子检测技术领域，具体提供一种利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法。
背景技术
铜元素是生物体内所必需的一种微量重金属元素和必需的营养素，在细胞中的含量仅次于锌和铁，在各种有机体的基本生理过程中发挥着重要作用。然而，高铜摄入量会对健康造成不利影响，如胃和胃肠紊乱、肝肾损害、老年人认知功能丧失和威尔逊病等。随着现代工业和农业的发展，各种工业废水和固体废弃物的渗出液直接排入水体，致使水体中铜含量越来越高。因此建立快速、简便的铜离子检测方法，在人体健康、环境监测等方面都具有非常重要的意义。
目前检测铜离子的方法主要有荧光光谱法、比色法、分光光度测定方法、原子吸收光谱法、循环伏安法、电感藕合等离子体一质谱法等方法。虽然这些方法是有效的，但它们普遍存在一些缺点，如使用有毒化学品、需要复杂的有机合成、灵敏度和选择性差等。近年来，铜(I)离子(Cu+)催化点击化学的发现为Cu2+的检测开辟了一条新的途径。这种化学反应称为Cu+-催化叠氮-烷基1，3-偶极环加成(CuAAC)，是指叠氮与炔基发生反应，生成环加成产物。点击反应具有连接效率高、选择性高、反应条件温和等特点，在电化学、比色和荧光等传感系统中得到了广泛的应用。然而，这些方法通常涉及纳米材料的制备及修饰、探针的精心设计或结合复杂的循环放大以达到理想的灵敏度。
近年来，纳米孔传感技术因其快速、低成本、无需标记等优点，在化学和生物等诸多研究领域得到广泛应用，已发展成为一种新颖的、独具特色的单分子分析手段。由于单个待测物在纳米通道中的物理占位作用等，改变了通道的电阻，从而引发流经纳米通道的离子电流发生变化，形成阻断电流信号。离子流阻断程度和阻断时间等信号可反映待测物的序列、结构特征等信息，信号频率可反映待测物的浓度。将纳米孔技术应用于铜离子的检测，是一种新颖的、独具特色的金属离子分析方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法，该方法以纳米孔工作站为平台，能够简便、快速、灵敏地检测铜离子，无需标记和循环放大。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
一种利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法，包括：
步骤1：α-溶血素纳米孔的组装；
步骤2：利用上述α-溶血素纳米孔检测不同浓度铜离子样品，建立信号频率与铜离子浓度的工作曲线；
步骤3：检测未知铜离子浓度样品中铜离子的信号频率，利用上述工作曲线计算铜离子浓度。
进一步的，所述步骤1具体为：
用貂毛笔在trans检测池的小孔内外两侧均匀涂抹磷脂溶液；将cis检测池和trans检测池组装后分别加入1M KCl电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加电压，使用提拉法在trans池的小孔处形成磷脂双分子层膜；在cis检测池中加入α-溶血素，当α-溶血素在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道时，离子流将量子化阶跃；在+150mV电压条件下，单个纳米孔的稳定开孔电流为150±10pA。
进一步的，所述步骤2具体为：
21)将不同浓度的铜离子溶液分别与DNA探针、还原剂和铜离子螯合剂混合均匀，在30℃下孵育2h；
22)将上述步骤21)的样品注入cis检测池，在外加电场+150mV的驱动下，待测物逐一通过α-溶血素纳米孔，产生特征性的阻断电流信号；
23)实时观测并记录阻断电流信号，建立铜离子浓度和阻断电流信号频率之间的线性关系。
优选的，所述步骤21)中，铜离子浓度分别为5μM、1μM、0.1μM、10-2μM、10-3μM、10-4μM。
优选的，所述DNA探针为C10(5’-CCCCCC(azide)CCCC-3’)与C6(5’-CCCCCC(alkyne)-3’)，所述C10与C6的浓度为100μM。其中，C10进行叠氮修饰，C6进行炔基修饰，5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光猝灭基团。
进一步的，所述还原剂为抗坏血酸；所述铜离子螯合剂为三羟丙基三唑甲基胺。
优选的，所述C10、C6、三羟丙基三唑甲基胺和抗坏血酸混合后，使用PBS溶液调整液体体积，使得C10、C6、三羟丙基三唑甲基胺和抗坏血酸的最终浓度分别为10μM、10μM、1mM和1mM。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)特异性好：本发明中使用的方法称为一价铜离子催化的叠氮化物-炔环加成反应(CuAAC)，是指叠氮化物与炔基发生反应，形成环加成产物。与传统的检测铜离子的方法相比较，点击反应具有、选择性好、反应条件温和反应效率高等优势，因此反应的特异性极高；不仅如此，发明人对具体的反应条件也进行了较为全面细致的优化，因此几乎不发生非特异性反应；生成的产物在纳米孔中会产生高度特征性的阻断信号，这也大大提高了该方法的特异性。
2)灵敏度高：纳米孔是一种非常灵敏的单分子分析手段，本发明所述方法检测下限可达67pM(S/N＝3)。
3)无需标记和循环放大：本发明中没有进行任何标记，没有引入任何循环扩增，仅仅利用纳米孔的高灵敏度优点即可对铜离子的灵敏检测，这是其他检测方法如荧光法、比色法做不到的。
4)本发明只涉及两个单链DNA底物探针，在铜离子和抗坏血酸钠存在的情况下，能够催化点击反应的发生，两条DNA探针通过点击反应成分叉DNA，利用纳米孔检测即可。
附图说明
图1为本发明实施例1中含有铜离子和不含铜离子的样品的电流轨迹图；
图2为本发明实施例1中含有铜离子和不含铜离子的样品的散点图，其中横坐标代表阻断程度(阻断电流与开孔电流的比值)，纵坐标代表阻断时间(待测物与纳米孔作用的时间)；
图3为本发明实施例1的信号频率与铜离子浓度工作曲线图；
图4为本发明实施例4的不同离子的阻断电流信号对比图；
图5为本发明实施例5中的自来水和人体血清中铜离子测定的回收率图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明中寡核苷酸(DNA探针)由宝生物Takara Biotechnology Co.Ltd.(Dalian，China)合成并纯化，分别为C10(5’-CCCCCC(azide)CCCC-3’)和C6(5’-CCCCCC(alkyne)-3’)。
本发明中氯化铜(II)(CuCl2，≥99.995％)、抗坏血酸钠(AA，≥99％)、三羟丙基三唑甲基胺(THPTA，95％)从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)购买；其他金属盐从阿拉丁购买。所有其他化学品均属分析级。
实施例1
一种利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法，包括：
步骤1：α-溶血素纳米孔的组装
用貂毛笔在trans检测池的小孔内外两侧均匀涂抹磷脂溶液；将cis检测池和trans检测池组装后分别加入1M KCl电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加电压，使用提拉法在trans池的小孔处形成磷脂双分子层膜；在cis检测池中加入α-溶血素，当α-溶血素在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道时，离子流将量子化阶跃；在+150mV电压条件下，单个纳米孔的稳定开孔电流为150±10pA。
步骤2：利用上述α-溶血素纳米孔检测不同浓度铜离子样品，建立信号频率与铜离子浓度的工作曲线
21)将不同浓度的铜离子溶液分别与寡核苷酸、还原剂和铜离子螯合剂混合均匀，在30℃下孵育2h；
将10μL 100μM的C10与C6分别加入到PBS溶液中，然后加入还原剂抗坏血酸钠和THPTA，加入不同浓度的铜离子，铜离子浓度分别为5μM、1μM、0.1μM、10-2μM、10-3μM、10-4μM，以铜离子浓度为0视为对照组。C10、C6、THPTA和AA的最终浓度分别为10μM、10μM、1mM和1mM。最后，混匀的混合物在30℃孵育2h，所述DNA探针为C10(5’-CCCCCC(azide)CCCC-3’)与C6(5’-CCCCCC(alkyne)-3’)，其中，C10进行叠氮修饰，C6进行炔基修饰。
22)将上述步骤21)的样品分别注入cis检测池，在外加电场+150mV的驱动下，待测物逐一通过α-溶血素纳米孔，产生特征性的阻断电流信号；
实验产生的pA级电流通过电流放大器放大采集，并通过低通滤波器进行滤波，滤波频率为5kHz；放大器采集得到的模拟信号通过数模转换器转换为数字量，并传输到电脑上，放大器和数模转换器集成到Cube-D0纳米通道单分子电化学工作站上(华东理工大学龙亿涛课题组研制)。
23)通过SmartNanopre软件(华东理工大学龙亿涛课题组开发)实时观测并记录阻断电流信号，建立铜离子浓度和阻断电流信号频率之间的线性关系。
步骤3：检测未知铜离子浓度样品中铜离子的信号频率，利用上述工作曲线计算铜离子浓度。
实施例2
本发明对上述制备的α-溶血素纳米孔检测铜离子的可行性进行了研究，将不同铜离子浓度的样品分别加入至α-溶血素纳米孔中，研究含有铜离子和不含铜离子样品的电流轨迹(见图1)和散点图(见图2)，从图中看出，散点图中实验组(with Cu2+)和对照组(without Cu2+)分布在两个完全不同的区域，可以明显区分开来。
实施例3
图3为信号频率与铜离子浓度的工作曲线，图3表明，随着铜离子浓度的升高，信号的频率也随之增加，在铜离子浓度为100pM到5μM之间，信号频率与铜离子浓度的对数呈良好的线性关系，线性方程为f＝13.643+1.282log C(R＝0.987)，其中f为信号频率，C代表铜离子浓度，由此计算出该方法的检测限为67pM，具有较高的灵敏度。
实施例4
本发明还对上述体系进行特异性测试，选取Al3+、Fe3+、Cr3+、Cd2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、Co2+、K+和Na+，替换上述铜离子，分别进行完全相同的反应和纳米孔检测，结果见图4。由图4可知，只有Cu2+存在时能够在纳米孔实验中检测到高频率的特征性阻断电流信号，其他金属离子存在时的信号都接近于空白对照，表明该方法对Cu2+具有非常高的特异性。
由上述分析可知，本发明的利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法具有较高的灵敏度和较好的特异性，可以用来定量检测铜离子浓度。
实施例5
利用实施例1中体系分别检测自来水和人体血清中铜离子浓度，其中自来水在使用前首先进行灭菌，灭菌后通过0.22μm的过滤膜过滤器进行过滤以除去水中的杂质。血清在使用前稀释十倍。在自来水和稀释的血清中加入标准浓度的铜离子(终浓度1μM、2μM和4μM)，铜离子浓度为0时为对照组。得到的样品分别与其他组分混合，步骤与实施例1中相同，混合物在30℃孵育2h，反应好的样品通过纳米孔进行检测，施加电压为+150mV。结果见图5，从图5可以看出，自来水样品中Cu2+的回收率在90.2％到103.8％之间，血清样品中Cu2+的回收率在89.5到105.3％之间，表明该方法具有较强的抗干扰能力，可以用于实际样品中Cu2+的检测。
综上可知，本发明的利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法，操作简单，灵敏度高，特异性好，抗干扰能力强，能够快速进行铜离子定量检测。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法，其特征在于，包括：
步骤1：α-溶血素纳米孔的组装；
步骤2：利用上述α-溶血素纳米孔检测不同浓度铜离子样品，建立信号频率与铜离子浓度的工作曲线；
步骤3：检测未知铜离子浓度样品中铜离子的信号频率，利用上述工作曲线计算铜离子浓度。
2.根据权利要求1所述的利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法，其特征在于，所述步骤1具体为：
用貂毛笔在trans检测池的小孔内外两侧均匀涂抹磷脂溶液；将cis检测池和trans检测池组装后分别加入1M KCl电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加电压，使用提拉法在trans池的小孔处形成磷脂双分子层膜；在cis检测池中加入α-溶血素，当α-溶血素在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道时，离子流将量子化阶跃；在+150mV电压条件下，单个纳米孔的稳定开孔电流为150±10pA。
3.根据权利要求1所述的利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法，其特征在于，所述步骤2具体为：
21)将不同浓度的铜离子溶液分别与DNA探针、还原剂和铜离子螯合剂混合均匀，在30℃下孵育2h；
22)将上述步骤21)的样品注入cis检测池，在外加电场+150mV的驱动下，待测物逐一通过α-溶血素纳米孔，产生特征性的阻断电流信号；
23)实时观测并记录阻断电流信号，建立铜离子浓度和阻断电流信号频率之间的线性关系。
4.根据权利要求3所述的利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法，其特征在于，所述步骤21)中，铜离子浓度分别为5μM、1μM、0.1μM、10-2μM、10-3μM、10-4μM。
5.根据权利要求4所述的利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法，其特征在于，所述DNA探针为C10(5’-CCCCCC(azide)CCCC-3’)和C6(5’-CCCCCC(alkyne)-3’)，所述C10与C6的浓度为100μM。
6.根据权利要求5所述的利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法，其特征在于，所述还原剂为抗坏血酸；所述铜离子螯合剂为三羟丙基三唑甲基胺。
7.根据权利要求6所述的利用α-溶血素纳米孔检测铜离子的方法，其特征在于，所述C10、C6、三羟丙基三唑甲基胺和抗坏血酸混合后，使用PBS溶液调整液体体积，使得C10、C6、三羟丙基三唑甲基胺和抗坏血酸的最终浓度分别为10μM、10μM、1mM和1mM。
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