CN109416354B - 用于双层形成的渗透不平衡方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种在基于纳米孔的测序芯片中的测定池阵列上形成多个脂双层的方法。每个测定池包括孔。使具有第一摩尔渗透压浓度的第一盐缓冲溶液流过所述基于纳米孔的测序芯片中的测定池以基本上用所述第一盐缓冲溶液充满所述测定池中的孔。使脂质和溶剂混合物流过所述测定池以在所述孔上沉积脂膜，所述脂膜封闭所述孔中的所述第一盐缓冲溶液。使具有第二摩尔渗透压浓度的第二盐缓冲溶液在所述孔上方流动以减小所述脂膜的厚度，其中所述第二摩尔渗透压浓度是比所述第一摩尔渗透压浓度低的摩尔渗透压浓度，从而使得在所述孔内的第一容积和所述孔外的第二容积之间产生渗透不平衡。

Description

用于双层形成的渗透不平衡方法
发明背景
纳米孔（nanopore）测序系统通常使用悬浮在含有电解质溶液的孔（例如，圆柱形孔）上的平面脂双层（PLB）中的蛋白质孔，所述电解质溶液也存在于大得多的外部储蓄器（reservoir）中（例如，在孔上方）。使用工作电极和参比电极穿过孔和外部储蓄器施加电偏压（electrical bias）。PLB在孔上延伸以对孔进行电和物理密封，并且将孔与较大的外部储蓄器分开。当脂质溶剂混合物首先沉积到测定池（cell）中以形成脂双层时，在一些测定池中自发地形成脂双层，但是在其他测定池中，仅有跨越测定池的每个孔的厚的脂膜，其具有和溶剂组合在一起的多层脂质分子。为了增加基于纳米孔的测序芯片的得率（即，具有正确形成的脂双层和纳米孔的基于纳米孔的测序芯片中的测定池的百分比），所述基于纳米孔的测序芯片可以执行额外的步骤以促进在另外的测定池中形成脂双层。因此，用于在基于纳米孔的测序芯片的测定池中形成脂双层的改进技术将是所期望的。
附图简述
在下面的详述和附图中公开了本发明的各种实施方案。
图1举例说明了基于纳米孔的测序芯片中的测定池100的实施方案。
图2举例说明了用Nano-SBS技术进行核苷酸测序的测定池200的实施方案。
图3举例说明了将要用预载标记物（pre-loaded tags）进行核苷酸测序的测定池的实施方案。
图4举例说明了用于使用预载标记物进行核酸测序的过程400的实施方案。
图5举例说明了基于纳米孔的测序芯片中的测定池500的实施方案。
图6A举例说明了基于纳米孔的测序芯片的测定池中的电路系统600的实施方案，其中所述电路系统可经配置以在不导致已形成的脂双层破坏的情况下检测是否在测定池中形成脂双层。
图6B举例说明了与图6A中所示的相同的基于纳米孔的测序芯片的测定池中的电路系统600。与图6A相比较，不在工作电极和对电极之间显示脂膜/双层，而显示表示工作电极和脂膜/双层的电性质的电模型。
图7举例说明了在系统的脂双层测量阶段期间表示电路系统600的一部分的电性质的电模型700。
图8A举例说明了小的响应于±ΔVliq观察到的±ΔVADC检测到在测定池中尚未形成脂双层。
图8B举例说明了大的响应于±ΔVliq观察到的±ΔVADC检测到在测定池中已经形成脂双层。
图9A举例说明了在测定池内形成脂双层之前和之后的VADC对时间的示例性图表。
图9B举例说明了在当脂双层尚未形成时的时间段t1期间VADC对时间的示例性图表（参见图9A）的推变焦距镜头拍摄视图。
图9C举例说明了在当脂双层已经形成时的时间段t2期间VADC对时间的示例性图表（参见图9A）的推变焦距镜头拍摄视图。
图10（包括图10A和10B）举例说明了一个实施方案，其中在脂膜上方和下方的盐缓冲溶液之间引入渗透不平衡，这引起脂质溶剂膜向上弯曲。
图11举例说明了用于在基于纳米孔的测序芯片的测定池中形成脂双层的改进技术的过程1100的实施方案。
图12举例说明了基于纳米孔的测序系统1200的俯视图，所述系统具有包围硅芯片的改进的流动室，其允许液体和气体通过并接触芯片表面上的传感器。
图13举例说明了用于在过程1100的步骤1108的脂双层起始刺激阶段期间应用机械脂双层起始刺激（例如振动刺激）的过程1300的实施方案。
图14举例说明了用于在过程1100的步骤1108的脂双层起始刺激阶段期间应用电脂双层起始刺激的过程1400的实施方案。
图15举例说明了用于在过程1100的步骤1108的脂双层起始刺激阶段期间应用物理脂双层起始刺激的过程1500的实施方案。
图16A是直方图，其举例说明了在没有在脂膜上方和下方的盐缓冲溶液之间引入渗透不平衡的情况下，在具有正确形成的脂双层的基于纳米孔的测序芯片中测定池的总百分比（即，基于纳米孔的测序芯片的得率）增加至可接受的阈值之前，盐缓冲溶液需要流动多次（93次）。
图16B是直方图，其举例说明了在脂膜上方和下方的盐缓冲溶液之间引入渗透不平衡的情况下，16个盐缓冲溶液流动循环实现了具有正确形成的脂双层的基于纳米孔的测序芯片中测定池的更高总百分比。
详述
本发明可以以多种方式实现，包括作为方法；设备，装置；系统；物质的组合物；在计算机可读存储介质上具体化的计算机程序产品；和/或处理器，例如被配置为执行存储在与处理器配合的存储器上和/或由与处理器配合的存储器提供的指令的处理器。在本说明书中，这些实现或本发明可以采用的任何其他形式可以称为技术。通常，可以在本发明的范围内改变所公开的过程的步骤的顺序。除非另有说明，否则被描述为被配置为执行任务的诸如处理器或存储器的组件可以被实现为临时被配置为在给定时间执行所述任务的通用组件或者被制造为执行所述任务的具体组件。如本文所使用的，术语‘处理器’指被配置为处理数据例如计算机程序指令的一种或多种设备、电路和/或处理核心。
下面与附图一道提供本发明的一个或多个实施方案的详述，其举例说明了本发明的原理。本发明连同这种实施方案进行描述，但是本发明不限于任何实施方案。本发明的范围仅由权利要求限制，并且本发明包括许多替换方案、修饰形式和等同方案。在以下描述中陈述了许多具体细节，以提供对本发明的透彻理解。这些细节是为了示例起见提供的，并且可以在没有这些具体细节中的一些或全部的情况下根据权利要求来实践本发明。为了清楚起见，没有详细描述与本发明相关的技术领域中已知的技术材料，从而不会不必要地使本发明模糊不清。
具有内径约1纳米的孔径大小的纳米孔膜设备已显示在快速核苷酸测序中有希望。当穿过浸没在导电流体中的纳米孔施加电压电势时，可以观察到归因于离子通过纳米孔的传导的小离子电流。电流的大小对孔径大小敏感。
基于纳米孔的测序芯片可用于核酸（例如DNA）测序。基于纳米孔的测序芯片含有配置为阵列的大量传感器测定池。例如，一百万个测定池的阵列可包括1000行×1000列的测定池。
图1举例说明了基于纳米孔的测序芯片中的测定池100的实施方案。在测定池表面上形成膜102。在一些实施方案中，膜102是脂双层。含有可溶性蛋白质纳米孔跨膜分子复合体（PNTMC）和所考虑的分析物的主体电解质（bulk electrolyte）114直接放置在测定池表面上。在一个实施方案中，单个PNTMC 104 通过电穿孔插入膜102中。阵列中的个别膜彼此既不是化学连接的也不是电连接的。因此，阵列中的每个测定池是独立的测序机器，从而产生与PNTMC缔合的单个聚合物分子独特的数据。PNTMC 104对分析物起作用并调节通过否则不透的双层的离子电流。
继续参考图1，模拟测量电路系统112连接到金属电极110，所述金属电极110由一定体积的电解质108覆盖。电解质108的体积通过离子不透膜102与主体电解质114隔离。PNTMC 104穿过膜102并且提供离子电流从主体液体（bulk liquid）流到工作电极110的唯一途径。测定池还包括对电极（CE）116，其与主体电解质114电接触。测定池还可以包括参比电极117。
在一些实施方案中，纳米孔阵列使得能够进行使用基于单分子纳米孔的合成测序（Nano-SBS）技术的平行测序。图2举例说明了用Nano-SBS技术进行核苷酸测序的测定池200的实施方案。在Nano-SBS技术中，将待测序的模板202和引物引入测定池200。对于该模板-引物复合体，将四种不同标记的核苷酸208添加到主体（bulk）水相中。当正确标记的核苷酸与聚合酶204复合时，标记物的尾部位于纳米孔206的桶中。保持在纳米孔206的桶中的标记物产生独特的离子阻断信号210，从而由于标记物的不同化学结构而电子鉴定添加的碱基。
图3举例说明了将要用预载标记物进行核苷酸测序的测定池的实施方案。纳米孔301形成在膜302中。酶303（例如，聚合酶，例如DNA聚合酶）与纳米孔缔合。在一些情况下，聚合酶303共价附着于纳米孔301。聚合酶303与待测序的核酸分子304缔合。在一些实施方案中，核酸分子304是环状的。在一些情况下，核酸分子304是线性的。在一些实施方案中，核酸引物305 与核酸分子304的一部分杂交。聚合酶303使用单链核酸分子304作为模板催化核苷酸306参入引物305。核苷酸306包含标记物种类（“标记物”）307。
图4举例说明了用于使用预载标记物进行核酸测序的过程400的实施方案。阶段A举例说明了如图3中描述的组件。阶段C显示加载到纳米孔中的标记物。“加载的”标记物可以是位于纳米孔中和/或保持在纳米孔中或附近相当大的时间量的标记物，例如，0.1毫秒（ms）至10,000 ms。在一些情况下，预载的标记物在从核苷酸释放之前加载在纳米孔中。在一些情况下，如果标记物在核苷酸参入事件时释放后通过纳米孔（和/或被纳米孔检测）的概率合适地高，例如90％至99％，则标记物是预载的。
在阶段A，标记的核苷酸（四种不同类型之一：A、T、G或C）不与聚合酶缔合。在阶段B，标记的核苷酸与聚合酶缔合。在阶段C，聚合酶停靠到纳米孔。在停靠期间通过电力将标记物拉入纳米孔中，例如在有穿过膜和/或纳米孔施加的电压产生的电场的情况下产生的力。
一些缔合的标记的核苷酸不与核酸分子碱基配对。这些非配对的核苷酸一般在比正确配对的核苷酸保持与聚合酶缔合的时间尺度（time scale）更短的时间尺度内被聚合酶排斥。由于非配对的核苷酸仅与聚合酶短暂缔合，所以如图4所示的过程400一般不进行到超过阶段D。例如，在阶段B或在该过程进入阶段C后不久，聚合酶排斥非配对的核苷酸。
在聚合酶停靠到纳米孔之前，纳米孔的电导为~300皮西门子（300 pS）。在阶段C，纳米孔的电导为约60 pS、80 pS、100 pS或120 pS，分别对应于四种类型的标记的核苷酸之一。聚合酶经历异构化和磷酸根转移反应以将核苷酸参入生长中的核酸分子中并释放标记物分子。特别地，当标记物保持在纳米孔中时，由于标记物的不同化学结构，产生独特的电导信号（例如，参见图2中的信号210），从而电子鉴定添加的碱基。重复该循环（即，阶段A至E或阶段A至F）允许核酸分子的测序。在阶段D，释放的标记物通过纳米孔。
在一些情况下，未参入到生长中的核酸分子中的标记的核苷酸也将通过纳米孔，如在图4的阶段F中所看到的。在一些情况下，纳米孔可以检测未参入的核苷酸，但该方法提供了至少部分基于在纳米孔中检测核苷酸的时间来区分参入的核苷酸和未参入的核苷酸的手段。与未参入的核苷酸结合的标记物快速通过纳米孔并且被检测达短的时间段（例如，小于10 ms），而与参入的核苷酸结合的标记物被加载到纳米孔中并且被检测达长的时间段（例如，至少10 ms）。
图5举例说明了基于纳米孔的测序芯片中的测定池500的实施方案。测定池500包括具有两个侧壁和底部的孔505。在一个实施方案中，每个侧壁包括介电层504，并且底部包括工作电极502。在一个实施方案中，工作电极502具有顶侧和底侧。在另一实施方案中，502的顶侧构成孔505的底部，而502的底侧与介电层501接触。在另一实施方案中，介电层504位于介电层501上方。介电层504形成围绕孔505的壁，其中工作电极502位于底部。用于本发明（例如，介电层501或504）的合适的介电材料包括但不限于瓷（陶瓷）、玻璃、云母、塑料、氧化物、氮化物（例如，一氮化硅或SiN）、氧氮化硅、金属氧化物、金属氮化物、金属硅酸盐、过渡金属氧化物、过渡金属氮化物、过渡金属硅酸盐、金属氧氮化物、金属铝酸盐、硅酸锆、铝酸锆、二氧化铪、绝缘材料（如，聚合物、环氧化物、光致抗蚀剂等等）或其组合。本领域普通技术人员将理解适用于本发明的其他介电材料。
在一个方面，测定池500还包括一个或多个疏水层。如图5所示的，每个介电层504具有顶表面。在一个实施方案中，每个介电层504的顶表面可包括疏水层。在一个实施方案中，硅烷化在介电层504的顶表面上方形成疏水层520。例如，使用硅烷分子（i）含有6-20个碳-长的链（例如，十八烷基-三氯硅烷、十八烷基-三甲氧基硅烷或十八烷基-三乙氧基硅烷），（ii）二甲基辛基氯硅烷（DMOC）或（iii）有机官能烷氧基硅烷分子（例如，二甲基氯-十八烷基-硅烷、甲基二氯-十八烷基-硅烷、三氯-十八烷基-硅烷、三甲基-十八烷基-硅烷或三乙基-十八烷基-硅烷）进一步硅烷化可以在介电层504的顶表面上进行。在一个实施方案中，疏水层是硅烷化层或硅烷层。在一个实施方案中，硅烷层的厚度可以是一个分子。在一个方面，介电层504包括适合于粘附膜（例如，包含纳米孔的脂双层）的顶表面。在一个实施方案中，适合于粘附膜的顶表面包含如本文所述的硅烷分子。在一些实施方案中，疏水层520具有以纳米（nM）或微米（μm）尺度提供的厚度。在其他实施方案中，疏水层可以沿着介电层504的全部或一部分向下延伸（也参见Davis等人，U.S. 20140034497，其全部内容引入本文作为参考）。
在另一方面，孔505（由介电层壁504形成）进一步包括在工作电极502上方的一定体积的盐溶液506。通常，本发明的方法包括使用包含渗压剂的溶液（例如，盐溶液、盐缓冲溶液、电解质、电解质溶液或主体电解质）。如本文所用的，“渗压剂”是指任何可溶性化合物，其在溶解于溶液中时增加该溶液的摩尔渗透压浓度。在本发明中，渗压剂是在纳米孔测序系统的结构内的溶液中可溶的化合物，所述结构例如含有如本文所述的盐溶液或主体电解质的孔。因此，本发明的渗压剂影响渗透，特别是穿过脂双层的渗透。用于本发明的渗压剂包括但不限于离子盐，例如，氯化锂（LiCl）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙（CaCl2）、氯化锶（SrCl2）、氯化锰（MnCl2）和氯化镁（MgCl2）；多元醇和糖类，例如，甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、甘露糖甘露醇（mannisidomannitol）、糖基甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖和isofluoroside；聚合物，例如，葡聚糖、左聚糖和聚乙二醇；和一些氨基酸及其衍生物，如甘氨酸、丙氨酸、α-丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、牛磺酸、甜菜碱、章鱼氨酸、谷氨酸、肌氨酸、y-氨基丁酸和N-氧化三甲胺（“TMAO”）（也参见，例如，Fisher等人，U.S. 20110053795，其全部内容引入本文作为参考）。在一个实施方案中，本发明利用包含渗压剂的溶液，其中渗压剂是离子盐。本领域普通技术人员将理解用于本发明的合适渗压剂的其他化合物。另一方面，本发明提供了包含两种或更多种不同渗压剂的溶液。
本文描述的基于纳米孔的测序芯片的结构包括具有各种容量的孔阵列（例如，图5），包括纳升（nL）、皮升（pL）、飞升（fL）、渺升（aL）、zeptoliter（zL）和yocoliter（yL）容量。例如，电解质108（例如，图1）或盐溶液506（例如，图5）的体积以nL、pL、fL、aL、zL或yL尺度提供。在本发明的一个实施方案中，由本发明的孔（例如，图5中的孔505）形成的电解质或盐溶液的体积，或本文所述方法中使用的电解质或盐溶液的体积可以以纳升（nL）、皮升（pL）、飞升（fL）、渺升（aL）、zeptoliter（zL）或yocoliter（yL）尺度提供。另一方面，可以地通过它们的用立方微米或类似尺寸的体积而不是容积来描述所述孔。确定单位之间的必要转化，例如从立方微米到皮升、飞升等，将在本领域技术人员的能力范围内。
如图5所示的，膜形成在介电层504的顶表面上并跨越孔505。例如，膜包括形成在疏水层520上面的脂单层518。当膜到达孔505的开口时，脂单层转变为跨越孔的开口的脂双层514。脂单层518还可以沿着介电层504的垂直表面（即，侧壁）的全部或一部分延伸。在一个实施方案中，单层518沿其延伸的垂直表面504包括疏水层。将含有蛋白质纳米孔跨膜分子复合体（PNTMC）和所考虑的分析物的主体电解质508直接放置于孔上方。将单个PNTMC/纳米孔516插入脂双层514中。在一个实施方案中，通过电穿孔插入双层中。纳米孔516穿过脂双层514并且提供从主体电解质508到工作电极502的离子流的唯一途径。
测定池500包括对电极（CE）510，其与主体电解质508电接触。测定池500可以任选地包括参考电极512。在一些实施方案中，对电极510在多个测定池之间共享，并因此也称为共同电极。共同电极可以被配置为向与测量测定池中的纳米孔接触的主体液体施加共同电势。共同电势和共同电极对于所有测量测定池是共同的。
在一些实施方案中，工作电极502是金属电极。对于非法拉第传导，工作电极502可以由耐腐蚀和氧化的金属制成，例如，铂、金、一氮化钛和石墨。例如，工作电极502可以是具有电镀铂的铂电极。在另一个例子中，工作电极502可以是一氮化钛（TiN）工作电极。
如图5所示的，将纳米孔516插入悬浮在孔505上的平面脂双层514中。电解质溶液存在于孔505内部，即另一边（trans side），（参见盐溶液506）和大得多的外部储蓄器522中，即这一边（cis side），（参见主体电解质508）。外部储蓄器522中的主体电解质508位于基于纳米孔的测序芯片的多个孔上方。脂双层514在孔505上延伸并转变为脂单层518，在那里单层附着到疏水层520。该几何结构对孔505进行电和物理密封并将孔与较大的外部储蓄器分开。虽然中性分子（例如水和溶解的气体）可以通过脂双层514，但离子不能。脂双层514中的纳米孔516提供了离子导入和导出孔505的单一途径。
对于核酸测序，聚合酶附着于纳米孔516。核酸（例如，DNA）模板由聚合酶保持。例如，聚合酶通过参入与模板互补的来自溶液的六磷酸单核苷酸（HMN）来合成DNA。每一HMN都附着有独特的聚合物标记物。在参入期间，标记物借助于由对电极510和工作电极502之间的电压产生的电场梯度穿过纳米孔。标记物部分地阻塞纳米孔516，从而实现通过纳米孔516的离子电流中可测量的改变。在一些实施方案中，在电极之间施加交流（AC）偏压或直流（DC）电压。
在确定脂双层已在基于纳米孔的测序芯片的测定池内正确形成之后，执行将纳米孔插入脂双层中的步骤。在一些技术中，确定脂双层是否已在测定池中正确形成的过程可能引起已经正确形成的脂双层被破坏。例如，可能施加刺激电压以引起电流流过电极。尽管测量的对刺激电压的响应可以用于区别具有正确形成的脂双层的测定池（即，两层脂质分子厚的脂双层）和没有正确形成的脂双层的测定池（例如，具有跨越测定池的孔的厚脂质和溶剂组合膜的测定池），但刺激电压水平高到足以引起已经正确形成的脂双层在一些情况下破坏。换句话说，用于测试脂双层的刺激电压可能对脂双层是破坏性的。万一已经正确形成的脂双层被刺激电压破坏，则作为短路状态的结果，非常高的电流开始流过电极。作为响应，该系统可以尝试再次在特定测定池中重新形成新脂双层；然而，这既耗时又低效。此外，脂双层在随后的试验中可能不会在特定测定池中重新形成。结果，具有正确形成的脂双层和纳米孔的基于纳米孔的测序芯片中测定池的总百分比（即，基于纳米孔的测序芯片的得率）降低。
公开了一种检测在基于纳米孔的测序芯片的测定池中形成的脂双层的非破坏性技术。检测脂双层的非破坏性技术具有许多优点，包括提高基于纳米孔的测序芯片的效率和得率。
图6A举例说明了基于纳米孔的测序芯片的测定池中的电路系统600的实施方案，其中所述电路系统可经配置以在不导致已形成的脂双层破坏的情况下检测是否在测定池中形成脂双层。
图6A显示位于测定池工作电极614和对电极616之间的脂膜或脂双层612，从而使得穿过脂膜/双层612施加电压。脂双层是由两层脂质分子构成的薄膜。脂膜是由几层（多于两层）脂质分子构成的膜。脂膜/双层612也与主体液体/电解质618接触。注意，与图1中的工作电极、脂双层和对电极相比，工作电极614、脂膜/双层612和对电极616被颠倒绘制。在一些实施方案中，对电极在多个测定池之间共享，并因此也称为共同电极。共同电极可以被配置为通过将共同电极连接到电压源Vliq 620而将共同电势施加到与测量测定池中的脂膜/双层接触的主体液体。共同电势和共同电极对于所有测量测定池都是共同的。每个测量测定池内都有工作测定池电极；与共同电极相对比，工作测定池电极614可配置为施加独立于其他测量测定池中的工作测定池电极的不同电势。
图6B举例说明了与图6A中所示的相同的基于纳米孔的测序芯片的测定池中的电路系统600。与图6A相比较，不在工作电极和对电极之间显示脂膜/双层，而显示表示工作电极和脂膜/双层的电性质的电模型。
电模型622包括表示工作电极614的电性质的电容器624。与工作电极614有关的电容也称为偶层电容（C偶层）。电模型622进一步包括模拟与脂膜/双层有关的电容的电容器626（C双层）和模拟与脂膜/双层有关的电阻的电阻器628（R双层）。与脂膜/双层有关的电阻非常高，且因此R双层可以用断路代替，这将电模型622简化为与C双层串联的C偶层。
电压源Vliq 620是交流（AC）电压源。将对电极616浸入主体液体618中，并利用AC非法拉第模式调制方波电压Vliq，并将其施加到与测量测定池中的脂膜/双层接触的主体液体。在一些实施方案中，Vliq是方波，其数值为±200-250 mV，且频率为25-100 Hz。
通过设备606是可用于将脂膜/双层和电极与测量电路系统600连接或断开的开关。该开关启动或禁用可以穿过测定池中的脂膜/双层施加的电压刺激。在脂质沉积到测定池以形成脂双层之前，两个电极之间的阻抗非常低，这是因为测定池的孔未密封，且因此开关606保持断开以避免短路状况。一旦脂质溶剂已经沉积到测定池，其密封测定池的孔，开关606就可以闭合。
电路系统600进一步包括片上（on-chip）制造的积分电容器608 （ncap）。通过使用复位信号603来闭合开关601，从而使得积分电容器608连接到电压源Vpre 605，来对积分电容器608进行预先充电。在一些实施方案中，电压源Vpre 605提供具有900 mV数值的恒定正电压。当开关601闭合时，积分电容器608被预先充电到电压源Vpre 605的正电压水平。
在积分电容器608被预先充电之后，复位信号603用于断开开关601，从而使得积分电容器608与电压源Vpre 605断开。这里，取决于Vliq的水平，对电极616的电势可以处于比工作电极614的电势更高的水平，或反之亦然。例如，在方波Vliq的正相位（即，AC电压源信号周期的暗周期（dark period））期间，对电极616的电势处于比工作电极614的电势高的水平。类似地，在方波Vliq的负相位（即，AC电压源信号周期的亮周期（bright period））期间，对电极616的电势处于比工作电极614的电势低的水平。由于该电势差，积分电容器608可以在AC电压源信号周期的暗周期期间充电，并且在AC电压源信号周期的亮周期期间放电。
依赖于模拟数字转换器（ADC）610的采样速率（sampling rate），积分电容器608充电或放电达固定的时间段，且然后积分电容器608中存储的电压可由ADC 610读出。在通过ADC 610进行采样之后，通过使用复位信号603来闭合开关601，从而使得积分电容器608再次连接到电压源Vpre 605，来再次对积分电容器608进行预先充电。在一些实施方案中，ADC610的采样速率在1500至2000 Hz之间。在一些实施方案中，ADC 610的采样速率最高达5kHz。例如，对于1 kHz的采样速率，积分电容器608充电或放电达~1 ms的时间段，并然后由ADC 610读出存储在积分电容器608中的电压。在通过ADC 610进行采样之后，通过使用复位信号603来闭合开关601，从而使得积分电容器608再次连接到电压源Vpre 605，来再次对积分电容器608进行预先充电。然后，在整个系统的脂双层测量阶段期间，循环重复对积分电容器608进行预先充电、等待用于积分电容器608充电或放电的固定时间段以及通过ADC610对积分电容器中存储的电压进行采样的步骤。
电路系统600可以用于通过监控响应于施加到与脂膜/双层接触的主体液体的Δ电压改变（ΔVliq）的积分电容器608（ncap）处的Δ电压改变ΔVADC来检测是否在测定池中形成脂双层。如将在下文更详细描述的，在脂双层测量阶段期间，电路系统600可以被设计为具有串联连接的C双层626、C偶层624和ncap 608的分压器，并且ADC 610可以读取在分压器的中间点（intermediate point ）处分接的电压改变，以用于确定是否已形成脂双层。
图7举例说明了在系统的脂双层测量阶段期间表示电路系统600的一部分的电性质的电模型700。如图7中所示的，C偶层624与C双层626串联连接，但R双层628（参见图6B）从电模型700中消除。R双层628可以从电模型700中移除，这是因为与脂膜/双层有关的电阻非常高，且因此R双层可以近似为断路。如图7中所示的，C偶层624和C双层626进一步与ncap 608串联连接。
当在AC模式下运行时，由ADC读取的电压（VADC）可以通过下述确定：
VADC = Vliq *
Figure 252697DEST_PATH_IMAGE001
方程式（1）
其中Z = 1/(jωC)，
Z(ncap)是与ncap有关的AC阻抗，
Z(偶层)是与工作电极有关的AC阻抗，
且Z(双层)是与脂膜/双层有关的AC阻抗。
与Z(双层)和Z(ncap)相比，偶层的AC阻抗Z(偶层)具有非常低的值，这是因为C偶层比C双层或ncap的电容大得多。因此，代入Z(ncap)= 1/(jωCnap)，Z(双层)=1/jωC双层以及Z(偶层)=0，方程式（1）可以简化为：
VADC = Vliq *
Figure 107521DEST_PATH_IMAGE002
方程式（2）
其中C(ncap)是与ncap有关的电容，
且C(双层)是与脂膜/双层有关的电容。
当脂质首先沉积到测定池中以形成脂双层时，一些测定池具有自发地形成的脂双层，但是一些测定池仅具有跨越测定池的每个孔的厚的脂膜（具有组合在一起的多层脂质分子和溶剂）。与脂双层有关的电容大于与脂膜有关的电容，所述脂膜超过两层脂质分子厚，这是因为脂膜/双层的电容与其厚度成反比。当脂膜变薄并转变成脂双层时，厚度减小并且其有关的电容增加。在上面的方程式（2）中，当脂双层开始在测定池内形成时，C(双层)增加而C(ncap)保持恒定，从而使得整个VADC增加。因此，VADC的增加可以用作在测定池内已经形成脂双层的指示器。
在一些实施方案中，监控响应于施加到与脂膜/双层接触的主体液体的Δ电压改变（ΔVliq）的积分电容器608（ncap）处的Δ电压改变ΔVADC，以检测脂双层是否已经在测定池中形成。例如，方程式（2）可以重写为：
ΔVADC = ΔVliq *
Figure 887258DEST_PATH_IMAGE002
方程式（3）
其中ΔVADC是由ADC读取的积分电容器608（ncap）处的电压改变，
ΔVliq是施加于主体液体的电压改变，
C(ncap)是与ncap有关的电容，
且C(双层)是与脂膜/双层有关的电容。
在上面的方程式（3）中，因为C(ncap)保持恒定，而当脂双层开始在测定池内形成时，C(双层)增加，所以ΔVADC也增加。ΔVADC大致上和与脂膜/双层有关的电容C(双层)成比例。因此，ΔVADC的增加可以用作在测定池内已经形成脂双层的指示器。
在一些实施方案中，为了使可观察到的ΔVADC最大化以更可靠地检测脂双层，监控响应于施加至与脂膜/双层接触的主体液体的最大电压改变（最大ΔVliq）的ΔVADC以检测是否已在测定池中形成脂双层。
图8A举例说明了小的响应于正/负电压改变±ΔVliq观察到的正/负电压改变±ΔVADC导致检测到在测定池中尚未形成脂双层。图8B举例说明了大的响应于正/负电压改变±ΔVliq观察到的正/负电压改变±ΔVADC导致检测到在测定池中已经形成脂双层。
在图8A中，当方波Vliq从负相位改变为正相位时，发生最大正电压改变+ΔVliq，而当方波Vliq从正相位改变为负相位时，发生最大负电压改变-ΔVliq。在图8A中，在当ΔVliq为正最大值时的情况下，如果在测定池中尚未形成脂双层，则仅可观察到小的+ΔVADC；在当ΔVliq为负最大值时的情况下，如果在测定池中尚未形成脂双层，则仅可观察到小的-ΔVADC。
在图8B中，在当ΔVliq为正最大值时的情况下，如果已经在测定池中形成脂双层，则可以观察到大的正电压改变+ΔVADC。并且在当ΔVliq为负最大值时的情况下，如果已经在测定池中形成脂双层，则可以观察到大的负电压改变-ΔVADC。
在一些实施方案中，将当ΔVliq的绝对值（|ΔVliq|）为最大值时观察到的ΔVADC的绝对值（|ΔVADC|）与预定阈值进行比较。如果（|ΔVADC|>预定阈值），则确定检测到脂双层。相反，如果（|ΔVADC| <预定阈值），则确定未检测到脂双层。
图9A举例说明了在测定池内形成脂双层之前和之后的VADC对时间的示例性图表。图9A中的图表基于实际测试数据。如图9A中所示的，y-轴上的VADC单位为ADC计数。然而，也可以使用其他单位。如图9A中所示的，在当尚未形成脂双层时的时间段t1期间，记录的|ΔVADC|值小于在测定池中已经形成脂双层后的时间段t2期间记录的那些值。
图9B举例说明了在当脂双层尚未形成时的时间段t1期间VADC对时间的示例性图表（参见图9A）的推变焦距镜头拍摄视图。图9B中所示的结果与图8A一致。在图9B中，当方波Vliq从负相位改变为正相位时，发生最大+ΔVliq，而当方波Vliq从正相位改变为负相位时，发生最大-ΔVliq。在图9B中，在当ΔVliq为正最大值时的情况下，因为在测定池中尚未形成脂双层，所以仅可观察到小的+ΔVADC；在当ΔVliq为负最大值时的情况下，因为在测定池中尚未形成脂双层，所以仅可观察到小的-ΔVADC。
图9C举例说明了在当脂双层已经形成时的时间段t2期间VADC对时间的示例性图表（参见图9A）的推变焦距镜头拍摄视图。图9C中所示的结果与图8B一致。在图9C，在当ΔVliq为正最大值时的情况下，因为已经在测定池中形成脂双层，所以可以在两个连续的样品点之间观察到大的+ΔVADC。在当ΔVliq为负最大值时的情况下，因为已经在测定池中形成脂双层，所以可以观察到大的-ΔVADC。注意，在方波Vliq从一个相位改变到另一个相位之后不久，ΔVliq保持在零，并且作为响应VADC减小到零。如图9C中所示的，当已经在测定池中形成脂双层时，可以观察到VADC中的正或负峰值（spike）。正峰值或负峰值后面是小得多的VADC值。
当脂质溶剂混合物首先沉积到测定池中以形成脂双层时，在一些测定池中自发地形成脂双层，但是在其他测定池中，仅有跨越测定池的每个孔的厚的脂膜，其具有和溶剂组合在一起的多层脂质分子。为了增加基于纳米孔的测序芯片的得率（即，具有正确形成的脂双层和纳米孔的基于纳米孔的测序芯片中的测定池的百分比），所述基于纳米孔的测序芯片可以执行额外的步骤以促进在另外的测定池中形成脂双层。因此，用于在基于纳米孔的测序芯片的测定池中形成脂双层的改进技术将是所期望的。
在本申请中，公开了在用于分析分子的基于纳米孔的测序芯片的测定池中形成脂双层的改进的技术。一种改进的技术应用一种或多种脂双层起始刺激。可以应用不同类型的脂双层起始刺激，如下文将更详细描述的。例如，可以应用机械、电或物理刺激。本领域普通技术人员将理解，其他类型的刺激可适合由本发明使用。可以同时或以不同顺序应用一种或多种类型的脂双层起始刺激。一种或多种类型的脂双层起始刺激可以在重复多次的过程中应用。
脂双层起始刺激促进在厚脂膜上产生小的脂双层。一旦在厚脂膜上形成小的瞬时脂双层，额外的脂双层起始刺激的应用就起到正反馈的作用，以继续扩大脂双层的表面积。结果，可以显著减少在基于纳米孔的测序芯片的测定池中形成脂双层所需的时间。
一种类型的脂双层起始刺激是机械刺激，例如振动刺激。厚脂膜的机械振动将引起脂质分子重排并围绕彼此移动，从而促进一些脂质分子自组装成双层片，尾部指向片的中心以形成小面积的脂双层。在一些实施方案中，脂膜的振动可以通过在外部储蓄器（参见图5中的外部储蓄器522）中含有的主体电解质（参见图1中的主体电解质114和图5中的主体电解质508）中产生波来引入。例如，波发生器、声波泵（acoustic pump）或射流泵（fluidicpump）可以偶联到流动室，以在外部储蓄器中含有的主体电解质中产生波。
另一种类型的脂双层起始刺激是电刺激。向其中尚未形成脂双层的测定池应用电脂双层起始刺激可以提高液体在厚脂膜上方流动的效率，从而促进去除任何过量的脂质溶剂，从而使得厚的脂膜可以变薄并更有效地转变为脂双层。向其中尚未形成脂双层的测定池应用电脂双层起始刺激也将产生静电力，该静电力倾向于挤出过量的脂质溶剂并使厚的脂膜变薄为脂双层。另一方面，已经在其中正确形成脂双层的测定池不应该进一步暴露于相同的电脂双层起始刺激，这是因为电刺激可引起一些薄的脂双层破坏。因此，有利的是使用本申请中描述的非破坏性技术来检测其中已形成脂双层的基于纳米孔的测序芯片中的测定池部分，并将其与其中尚未正确形成脂双层的测定池部分分开。通过将测定池分成不同的组，可以不同地处理不同组中的测定池，从而实现更高的效率并增加基于纳米孔的测序芯片的总得率。
另一种类型的脂双层起始刺激是物理刺激。例如，使盐/电解质缓冲溶液经由流动室流过基于纳米孔的测序芯片的测定池促进在每个测定池上形成脂双层。流过测定池的盐缓冲溶液促进去除任何过量的脂质溶剂，从而使得厚的脂膜可以变薄并更有效地转变为脂双层。在一些实施方案中，盐缓冲溶液流动两秒钟的时间段。然而，也可以使用其他预定时间段。缓冲溶液流动循环可以重复多次。然而，已经发现，获得基于纳米孔的测序芯片的令人满意的得率所需的缓冲溶液流动循环的数目可以高达数十或数百个循环。
一种改进的技术在脂膜上方施加盐/电解质缓冲溶液流，其具有比在脂膜下方的盐缓冲溶液的摩尔渗透压浓度更低的摩尔渗透压浓度/渗透浓度，以在脂膜上方和下方的盐缓冲溶液之间引入渗透不平衡，这引起脂质溶剂膜向上弯曲。随着脂膜从孔向外推出，脂膜的更大接触表面积暴露于盐缓冲溶液的流动，且结果，盐缓冲溶液的流动可以更有效地去除任何过量的脂质溶剂，从而使得厚的脂膜可以变薄并更有效地转变为脂双层。这个技术具有许多优点，包括减少形成脂双层的时间和提高基于纳米孔的测序芯片的效率和得率。
图10（包括图10A和10B）举例说明了一个实施方案，其中在脂膜上方和下方的盐缓冲溶液之间引入渗透不平衡，这引起脂质溶剂膜向上弯曲。
图10A举例说明最初在时间t1，当脂质溶剂混合物首先沉积到测定池中以形成脂双层时，测定池仅具有跨越测定池的孔1002的厚脂膜1004，其具有与溶剂组合在一起的多层脂质分子。脂膜1004将孔与孔外部的储蓄器1008密封。最初在时间t1，孔中的盐/电解质溶液的摩尔渗透压浓度[EW]与外部储蓄器中的主体电解质溶液的摩尔渗透压浓度[ER]相同。摩尔渗透压浓度，也称为渗透浓度，是溶质浓度的量度。摩尔渗透压浓度测量每单位体积溶液中溶质颗粒的渗透压摩尔数。渗透压摩尔是有助于溶液的渗透压的溶质的摩尔数。摩尔渗透压浓度允许测量溶液的渗透压并确定溶剂将如何穿过分开两种不同渗透浓度的溶液的半透膜扩散（渗透）。
图10B举例说明了在较后的时间t2，通过当脂膜在孔和外部储蓄器之间就位时使比在孔中最初存在的电解质溶液更低浓度的电解质溶液流过脂膜，过量的水被迫使进入孔中，从而导致脂膜向上弯曲。
图11举例说明了用于在基于纳米孔的测序芯片的测定池中形成脂双层的改进技术的过程1100的实施方案。过程1100应用一种或多种不同类型的脂双层起始刺激。可以同时或以不同顺序应用一种或多种类型的脂双层起始刺激。所述一种或多种类型的脂双层起始刺激可以在重复多次的过程1100中应用。在一些实施方案中，图11的基于纳米孔的测序芯片包括多个图1的测定池100。在一些实施方案中，图11的基于纳米孔的测序芯片包括多个图5的测定池500。在一些实施方案中，图11的基于纳米孔的测序芯片包括图6A和6B的电路系统600。
过程1100包括步骤，其中不同类型的流体（例如，液体或气体）经由流动室流过基于纳米孔的测序芯片的测定池。具有显著不同性质（例如，压缩性、疏水性和粘度）的多种流体流过基于纳米孔的测序芯片表面上的传感器阵列。考虑到提高的效率，应以一致的方式将阵列中的每个传感器暴露于流体。例如，每种不同类型的流体都应流过基于纳米孔的测序芯片，从而使得流体可以被输送到芯片，均匀地涂覆并接触每个测定池的表面，并然后从芯片输出。如上所述，基于纳米孔的测序芯片含有配置为阵列的大量传感器测定池。随着基于纳米孔的测序芯片被改变比例以包括越来越多的测定池，实现不同类型的流体穿过芯片的测定池的均匀流动变得更具挑战性。
在一些实施方案中，执行图11的过程1100的基于纳米孔的测序系统包括具有蛇形流体流动通道的改进的流动室，其引导流体沿着通道的长度在芯片的不同传感器上经过。图12举例说明了基于纳米孔的测序系统1200的俯视图，所述系统具有包围硅芯片的改进的流动室，其允许液体和气体通过并接触芯片表面上的传感器。流动室包括蛇形或弯曲流动通道1208，其引导流体直接在传感器组（sensor bank）1206（每个组包括数千个传感器测定池）的单列（或单行）上从芯片的一端流到相反的一端，且然后引导流体重复地循环回并直接在传感器组的其他邻近列上流动，直到所有传感器组已经被经过了至少一次。如图12中所示的，系统1200包括入口1202和出口1204。
参考图12，流体通过入口1202被引导到系统1200中。入口1202可以是管或针。例如，管或针可具有一毫米的直径。代替将液体或气体直接进料到具有单个连续空间的宽流动室中，入口1202将液体或气体进料到蛇形流动通道1208中，该蛇形流动通道1208引导液体或气体直接在传感器组1206的单列上流动。蛇形通道1208可以通过下述形成：将顶板和垫片与分隔器1210堆叠在一起，所述分隔器1210将所述室分成蛇形通道以形成流动测定池，并然后将流动测定池安装在芯片上面。一旦液体或气体流过蛇形通道1208，所述液体或气体就被向上引导通过出口1204并离开系统1200。
系统1200允许流体更均匀地在芯片表面上的所有传感器的上面流动。通道宽度配置得足够窄，从而使得毛细管作用具有效果。更具体地，表面张力（其由流体内的内聚力引起）和流体与封闭表面之间的粘着力发挥作用以将流体保持在一起，从而防止流体或气泡崩裂并产生空区（dead zone）。例如，通道可具有1毫米或更小的宽度。窄通道使得能够实现流体的受控流动并使来自先前流体或气体流的剩余物的量最小化。
参考图11，在1102处，使盐/电解质缓冲溶液经由流动室流过基于纳米孔的测序芯片的测定池，以基本上用盐缓冲溶液充满测定池中的孔。如本文进一步所述的，盐缓冲溶液可包括以下渗压剂中的至少一种：氯化锂（LiCl）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙（CaCl2）、氯化锶（SrCl2）、氯化锰（MnCl2）和氯化镁（MgCl2）。盐缓冲溶液还可包括不是单纯离子盐的渗压剂（影响渗透的化合物），包括N-氧化三甲胺（TMAO）、脯氨酸、海藻糖等。在一些实施方案中，盐缓冲溶液的浓度为2 M（摩尔）。
在1104处，使脂质和溶剂混合物经由流动室流过基于纳米孔的测序芯片的测定池。在一些实施方案中，脂质和溶剂混合物包括脂质分子，例如二植烷酰磷脂酰胆碱或1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPhPC）和1,2-二-O-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPhPC）。在一些实施方案中，脂质和溶剂混合物包括癸烷或十三烷。当脂质和溶剂混合物首先沉积到测定池中以形成脂双层时，一些测定池具有自发地形成的脂双层，但是一些测定池仅具有跨越测定池的每个孔的厚的脂膜（具有组合在一起的多层脂质分子和溶剂）。
在1106处，使盐/电解质缓冲溶液经由流动室流过基于纳米孔的测序芯片的测定池，以基本上用盐缓冲溶液充满外部储蓄器。
在1108处，为了增加基于纳米孔的测序芯片的得率（即，具有正确形成的脂双层和纳米孔的基于纳米孔的测序芯片中的测定池的百分比），基于纳米孔的测序芯片可以应用一种或多种类型的脂双层起始刺激以促进在另外的测定池中形成脂双层。如上文所述的，在脂双层起始刺激阶段（步骤1108）期间，可以同时或以不同顺序应用一种或多种类型的脂双层起始刺激，其可以重复多次（由步骤1110确定）。
图13举例说明了用于在过程1100的步骤1108的脂双层起始刺激阶段期间应用机械脂双层起始刺激（例如振动刺激）的过程1300的实施方案。在1302处，应用机械脂双层起始刺激。厚脂膜的机械振动将引起脂质分子重排并围绕彼此移动，从而促进一些脂质分子自组装成双层片，尾部指向片的中心以形成小面积的脂双层。在一些实施方案中，脂膜的振动可以通过在外部储蓄器（参见图5中的外部储蓄器522）中含有的主体电解质（参见图1中的主体电解质114和图5中的主体电解质508）中产生波来引入。例如，波发生器、声波泵或射流泵可以偶联到流动室，以在外部储蓄器中含有的主体电解质中产生波。
在1304处，使用本申请中描述的非破坏性技术来使用图6A和图6B的电路系统600检测是否在测定池中形成了脂双层。检测包括监控响应于施加到与脂膜/双层接触的主体液体的电压改变（ΔVliq）的积分电容器608（ncap）处的电压改变ΔVADC。将检测到脂双层的测定池与未检测到脂双层的测定池分成不同的组。
在1306处，确定是否应该重复机械刺激阶段。在该步骤可以使用不同的标准。在一些实施方案中，机械刺激阶段执行预定次数。在一些实施方案中，重复机械刺激阶段，直到已达到基于纳米孔的测序芯片的目标得率。在一些实施方案中，如果在最后一轮通过刺激变薄期间刚刚检测到形成脂双层的测定池的增量数目或百分比低于预定阈值，则终止过程1300。
如果接下来要重复机械刺激阶段，则过程1300进行到步骤1308。在步骤1308，确定要应用的下一个机械刺激水平。在一些实施方案中，机械刺激水平增加固定的预定量。在一些实施方案中，如果在最后一次重复期间刚刚检测到形成脂双层的测定池的增量数目或百分比低于预定阈值，则机械刺激水平增加固定的预定量；否则，发现先前的机械刺激是有效的，且因此再次使用相同的机械刺激水平。然后，过程1300进行到1302，并重复该过程。
图14举例说明了用于在过程1100的步骤1108的脂双层起始刺激阶段期间应用电脂双层起始刺激的过程1400的实施方案。在1402处，应用电脂双层起始刺激。向其中尚未形成脂双层的测定池应用电刺激可以提高液体在厚脂膜上方流动的效率，从而促进去除任何过量的脂质溶剂，从而使得厚的脂膜可以变薄并更有效地转变为脂双层。向其中尚未形成脂双层的测定池应用电刺激也将产生静电力，该静电力倾向于挤出过量的脂质溶剂并使厚的脂膜变薄为脂双层。在一些实施方案中，图6A和图6B的相同电路系统600可用于应用电刺激。在脂双层检测和脂质变薄/脂双层起始之间的电路系统600的设置中的唯一差异是用于脂双层检测的Vliq的绝对数值较低。例如，用于脂双层检测的绝对数值Vliq可以为100 mV至250 mV，而用于脂质变薄的绝对数值Vliq可以为250 mV至500 mV。
在1404处，使用本申请中描述的非破坏性技术来使用图6A和图6B的电路系统600检测是否在测定池中形成了脂双层。检测包括监控响应于施加到与脂膜/双层接触的主体液体的电压改变（ΔVliq）的积分电容器608（ncap）处的电压改变ΔVADC。将检测到脂双层的测定池与未检测到脂双层的测定池分成不同的组。在检测到脂双层的每个测定池内，断开通过设备606以使脂双层和电极与测量电路系统600断开，从而使得任何电脂双层起始刺激（如果应用于芯片）不能应用于测定池。
在1406处，确定是否应该重复电刺激阶段。在该步骤可以使用不同的标准。在一些实施方案中，电刺激阶段执行预定次数。在一些实施方案中，重复电刺激阶段，直到已达到基于纳米孔的测序芯片的目标得率。在一些实施方案中，如果在最后一轮通过刺激变薄期间刚刚检测到形成脂双层的测定池的增量数目或百分比低于预定阈值，则终止过程1400。
如果接下来要重复电刺激阶段，则过程1400进行到步骤1408。在步骤1408，确定要应用的下一个电刺激水平。在一些实施方案中，电刺激水平增加固定的预定量。在一些实施方案中，如果在最后一次重复期间刚刚检测到形成脂双层的测定池的增量数目或百分比低于预定阈值，则电刺激水平增加固定的预定量；否则，发现先前的电刺激是有效的，且因此再次使用相同的电刺激水平。然后，过程1400进行到1402，并重复该过程。
图15举例说明了用于在过程1100的步骤1108的脂双层起始刺激阶段期间应用物理脂双层起始刺激的过程1500的实施方案。在1502处，使盐/电解质缓冲溶液经由流动室流过基于纳米孔的测序芯片的测定池。通过过程1500确定盐电解质缓冲溶液的浓度或摩尔渗透压浓度，以便在脂膜上方和下方的电解质溶液之间引入渗透不平衡。通过当脂膜在孔和外部储蓄器之间就位时使比在孔中最初存在的电解质溶液更低浓度的电解质溶液流过脂膜，过量的水被迫使进入孔中，从而引起脂膜向上弯曲。随着脂膜从孔向外推出，脂膜的更大接触表面积暴露于盐缓冲溶液的流动，且结果，盐缓冲溶液的流动可以更有效地去除任何过量的脂质溶剂，从而使得厚的脂膜可以变薄并更有效地转变为脂双层。
例如，在步骤1502中经由流动室流过基于纳米孔的测序芯片的测定池的盐电解质缓冲溶液具有比存在于孔中的电解质溶液（例如，2 M）更低的浓度（例如，500 mM），从而产生1.5 M的摩尔渗透压浓度差。响应于在外部储蓄器中流动的较低浓度电解质溶液（即，在脂膜的这一边），水从储蓄器穿过脂膜扩散进入孔中，以均衡脂膜的这一边和另一边的浓度。这种均衡几乎立即发生，这是因为水分子容易流过脂膜。脂膜两侧的浓度均衡到这一边的浓度（例如，500 mM），这是因为外部储蓄器的容积显著大于另一边（孔）的容积。这有效地增加孔中脂膜下水的体积，从而引起脂膜向上弯曲，如图10B中所示的。
如上文所示，由于水可以穿过脂膜扩散，且流过测定池的盐电解质缓冲溶液随着时间的过去可以将不同的渗压剂引入外部储蓄器，所以保持在外部储蓄器和孔中的液体的体积和渗压剂含量都可以随着时间的过去而改变。应认识到，外部储蓄器可以由第一储蓄器摩尔渗透压浓度来表征，其是在特定时间包含在外部储蓄器中的液体的摩尔渗透压浓度。测定池中的孔也可以由第二储蓄器摩尔渗透压浓度来表征，其是在特定时间包含在孔中并且由脂双层封闭的液体的摩尔渗透压浓度。
在1504处，使用本申请中描述的非破坏性技术来使用图6A和图6B的电路系统600检测是否在测定池中形成了脂双层。检测包括监控响应于施加到与脂膜/双层接触的主体液体的电压改变（ΔVliq）的积分电容器608（ncap）处的电压改变ΔVADC。将检测到脂双层的测定池与未检测到脂双层的测定池分成不同的组。
在1506处，确定是否应该重复盐缓冲溶液流动阶段。在该步骤可以使用不同的标准。在一些实施方案中，盐缓冲溶液流动阶段执行预定次数。在一些实施方案中，重复所述阶段，直到已达到基于纳米孔的测序芯片的目标得率。在一些实施方案中，如果在最后一轮通过缓冲溶液流动变薄期间刚刚检测到形成脂双层的测定池的增量数目或百分比低于预定阈值，则终止过程1500。
如果接下来要重复过程1500的盐缓冲溶液流动阶段，则过程1500进行到步骤1508。在步骤1508，确定要应用的下一个盐缓冲溶液浓度。例如，盐缓冲溶液的浓度可以从步骤1502的最后一次重复中使用的浓度逐步增加。盐缓冲溶液的浓度逐步增加，这是因为当盐缓冲溶液流动阶段重复多次时，形成越来越多的脂双层，并且在脂膜上方和下方的电解质溶液之间的较小浓度差异将确保脂双层不被迫使进入孔中的过量水破裂。然后，过程1500进行到1502，并重复该过程。
图16A是直方图，其举例说明了在没有在脂膜上方和下方的盐缓冲溶液之间引入渗透不平衡的情况下，在具有正确形成的脂双层的基于纳米孔的测序芯片中测定池的总百分比（即，基于纳米孔的测序芯片的得率）增加至可接受的阈值之前，盐缓冲溶液需要流动多次（93次）。图16B是直方图，其举例说明了在脂膜上方和下方的盐缓冲溶液之间引入渗透不平衡的情况下，16个盐缓冲溶液流动循环实现了具有正确形成的脂双层的基于纳米孔的测序芯片中测定池的更高总百分比。
对于每个图，x-轴是响应于施加到与脂膜/双层接触的主体液体的电压改变（ΔVliq）的积分电容器608（ncap）处的电压改变ΔVADC，而y-轴是其ΔVADC值在确定的ΔVADC箱（bin）中的测定池的数目。在该实例中，具有50或更高的ΔVADC值的测定池被确定为在其中形成了脂双层。比较图16A和图16B，在脂膜上方和下方的盐缓冲溶液之间引入渗透不平衡的情况下，即使具有较少的盐缓冲溶液流动循环，基于纳米孔的测序芯片中的大多数测定池也检测到脂双层。

Claims (15)

1.一种在基于纳米孔的测序芯片中的测定池阵列上形成多个脂双层的方法，每个测定池包括孔，所述方法包括：
使具有第一摩尔渗透压浓度的第一盐缓冲溶液流过所述基于纳米孔的测序芯片中的测定池以用所述第一盐缓冲溶液充满所述测定池中的孔；
使脂质和溶剂混合物流过所述测定池以在所述孔上沉积脂膜，所述脂膜封闭所述孔中的所述第一盐缓冲溶液；以及
使具有第二摩尔渗透压浓度的第二盐缓冲溶液在所述孔上方流动以减小所述脂膜的厚度，其中所述第二摩尔渗透压浓度是比所述第一摩尔渗透压浓度低的摩尔渗透压浓度，从而使得在所述孔内的第一容积和所述孔外的第二容积之间产生渗透不平衡。
2.权利要求1的方法，其中所述渗透不平衡引起水通过所述脂膜扩散到所述孔中并引起所述脂膜向上弯曲。
3.权利要求1的方法，进一步包括应用脂双层起始刺激以促进在所述脂膜上产生小的脂双层。
4.权利要求3的方法，其中应用脂双层起始刺激的步骤随着时间的过去在多个循环中进行，并且其中脂双层起始刺激水平在多个循环中是可适应的。
5.权利要求3的方法，其中所述脂双层起始刺激包括振动刺激。
6.权利要求5的方法，其中应用所述振动刺激包括在所述孔外的所述第二容积中产生波。
7.权利要求3的方法，其中所述脂双层起始刺激包括电刺激。
8.权利要求1的方法，其中使具有第二摩尔渗透压浓度的第二盐缓冲溶液在所述孔上方流动的步骤随着时间的过去在多个循环中进行，并且其中所述第二摩尔渗透压浓度在多个循环中逐步增加。
9.一种用于在基于纳米孔的测序芯片中的测定池阵列上形成多个脂双层的装置，所述装置包括：
包含测定池阵列的基于纳米孔的测序芯片，每个测定池包括孔；
偶联到所述基于纳米孔的测序芯片的流动室；和
处理器或电路系统，其配置成：
使具有第一摩尔渗透压浓度的第一盐缓冲溶液流过所述基于纳米孔的测序芯片中的测定池以用所述第一盐缓冲溶液充满所述测定池中的孔；
使脂质和溶剂混合物流过所述测定池以在所述孔上沉积脂膜，所述脂膜封闭所述孔中的所述第一盐缓冲溶液；以及
使具有第二摩尔渗透压浓度的第二盐缓冲溶液在所述孔上方流动以减小所述脂膜的厚度，其中所述第二摩尔渗透压浓度是比所述第一摩尔渗透压浓度低的摩尔渗透压浓度，从而使得在所述孔内的第一容积和所述孔外的第二容积之间产生渗透不平衡。
10.权利要求9的装置，其中所述渗透不平衡引起水通过所述脂膜扩散到所述孔中并引起所述脂膜向上弯曲。
11.权利要求9的装置，其中所述处理器或电路系统进一步配置成应用脂双层起始刺激以促进在所述脂膜上产生小的脂双层。
12.权利要求11的装置，其中应用脂双层起始刺激的步骤随着时间的过去在多个循环中进行，并且其中脂双层起始刺激水平在多个循环中是可适应的。
13.权利要求11的装置，其中所述脂双层起始刺激包括振动刺激。
14.权利要求11的装置，其中所述脂双层起始刺激包括电刺激。
15.权利要求9的装置，其中使具有第二摩尔渗透压浓度的第二盐缓冲溶液在所述孔上方流动的步骤随着时间的过去在多个循环中进行，并且其中所述第二摩尔渗透压浓度在多个循环中逐步增加。
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