CN111108383B

CN111108383B - 用于在线双层电容监视的方法

Info

Publication number: CN111108383B
Application number: CN201780095239.3A
Authority: CN
Inventors: A.瓦巴
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-09-26
Filing date: 2017-09-26
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2037-09-26
Also published as: WO2019063063A1; JP6893582B2; JP2020535409A; CN111108383A; EP3688463A1; EP3688463B1

Abstract

公开了一种检测基于纳米孔的测序芯片的单元中的脂质膜的状态的方法。脂质膜与积分电容器耦合，其中脂质膜在工作电极和对电极之间。将交流（AC）电压施加到对电极。由模数转换器（ADC）周期性地对跨积分电容器的电压进行采样。AC电压的中间变化被插入到AC电压的两个量值之间。响应于AC电压的中间变化，确定跨积分电容器的采样电压的变化。响应于AC电压的中间变化，基于所确定的跨积分电容器的采样电压的变化来确定脂质膜的状态。

Description

用于在线双层电容监视的方法

背景技术

近年来半导体产业内微小型化方面的进步已使得生物技术专家能够开始将传统上庞大的感测工具打包到越来越小的形状因子中，打包到所谓的生物芯片上。生物芯片可用于基于纳米孔的测序。

在确定已经在基于纳米孔的测序芯片的单元内适当形成脂质双层之后，执行将纳米孔插入脂质双层的步骤。在一些技术中，确定脂质双层是否已经在单元中正确形成的过程可能导致已经正确形成的脂质双层被破坏。换句话说，用于测试脂质双层的刺激电压可能对脂质双层具有破坏性。在已经适当形成的脂质双层被刺激电压破坏的情况下，由于短路状况，非常大的电流开始流过电极。作为响应，系统可能会尝试再次在特定单元中重新形成新的脂质双层；但是，这既耗时又效率低下。此外，在随后的试验中，脂质双层可能不会在特定单元中重新形成。结果，基于纳米孔的测序芯片中的具有适当形成的脂质双层和纳米孔的单元的总百分比（即，基于纳米孔的测序芯片的产率）降低。将会希望开发使基于纳米孔的测序生物芯片更加强健、高效并且成本有效的用于基于纳米孔的测序生物芯片的技术。

发明内容

一方面，本发明提供了检测基于纳米孔的测序芯片的单元中脂质膜的状态的方法。在一个实施例中，该方法包括将脂质膜与积分电容器耦合的步骤。在附加的实施例中，脂质膜设置在工作电极和对电极之间。在另一个实施例中，该方法还包括将交流（AC）电压施加到对电极的步骤。在一个另外的实施例中，该方法还包括以下步骤：通过模数转换器（ADC）周期性地对跨积分电容器的电压进行采样。在进一步的实施例中，该方法还包括在AC电压的两个量值之间插入AC电压的中间变化。在另一个实施例中，该方法还包括确定跨积分电容器的采样电压的变化的步骤。在一个附加的实施例中，所确定的变化是响应于AC电压的中间变化而得到的。在一个实施例中，该方法还包括以下步骤：基于所确定的跨积分电容器的采样电压的变化来检测脂质膜的状态。在一个附加的实施例中，所确定的变化是响应于AC电压的中间变化而得到的。

在一个另外的实施例中，该方法进一步包括，响应于检测到脂质双层已经破裂，通过打开单元中的开关，使不能跨脂质双层施加进一步的电刺激的步骤。

在一个另外的实施例中，该方法还包括响应于AC电压的中间变化，确定跨积分电容器的采样电压的变化。在一个实施例中，确定步骤在（i）当AC电压从第一阶段切换到第二阶段时；或（ii）当AC电压从第二阶段切换到第一阶段时执行。在一个进一步的实施例中，AC电压第一阶段包括第一阶段量值，以及AC电压第二阶段包括第二阶段量值。在一个附加的实施例中，AC电压的第一阶段量值大于AC电压的第二阶段量值。在另一个实施例中，第一阶段包括正方波，以及第二阶段包括负方波。在一个另外的实施例中，AC电压处于中间监视量值，其中该中间监视量值小于第一阶段量值但大于第二阶段量值。在一个附加的实施例中，该方法进一步包括以下步骤：至少部分地基于ADC的ADC参考窗口来选择中间监视量值。

在一个实施例中，该方法还包括将跨积分电容器的采样电压的变化与一个或多个预定阈值进行比较的步骤。在另一个实施例中，该方法进一步包括基于与一个或多个预定阈值的比较来检测脂质膜的状态的步骤。在一个另外的实施例中，脂质膜的状态选自以下各项组成的组：具有两个以上脂质分子层的脂质膜，脂质双层和破裂的脂质双层。在进一步的实施例中，该方法还包括以下步骤：选择中间监视量值，使得在脂质双层已破裂的情况下，跨积分电容器的采样电压在ADC的ADC参考窗口内。

在一个另外的方面，本发明提供了包括响应于AC电压的中间变化来确定跨积分电容器的采样电压的变化的方法，其中，该单元是基于纳米孔的测序芯片中的多个单元之一。在一个实施例中，确定步骤在（i）AC电压从第一阶段切换到第二阶段；或（ii）AC电压从第二阶段切换到第一阶段时执行。在一个进一步的实施例中，AC电压第一阶段包括第一阶段量值，以及AC电压第二阶段包括第二阶段量值。在一个附加的实施例中，AC电压的第一阶段量值大于AC电压的第二阶段量值。在一个另外的实施例中，该方法还包括以下步骤：通过使用全局预充电信号将积分电容器连接到恒定的预充电电压源，来对积分电容器进行预充电。在另一个实施例中，全局预充电信号用于控制多个单元中的积分电容器的预充电的定时。在一个附加的实施例中，该方法还包括在将积分电容器充电至恒定的预充电电压源值之后，使用全局预充电信号从积分电容器断开预充电电压源的步骤。在一个另外的实施例中，全局预充电信号用于控制预充电电压源与多个单元中的积分电容器断开的定时。在进一步的实施例中，该方法还包括以下步骤：等待预定时间段，以使积分电容器通过与脂质双层相关的电容充电或放电。在一个另外的实施例中，该方法还包括以下步骤：在预定的等待时段之后，对跨积分电容器的电压进行采样。在一个实施例中，将预充电电压源与多个单元中的积分电容器断开的定时被配置为使得该定时与当AC电压被切换到中间监视量值时的定时基本相同。在另一个实施例中，多个单元中的积分电容器的预充电的定时被配置为使得该定时是在已经读出了来自多个单元的测序数据的帧之后。在附加的实施例中，该帧是当AC电压切换到中间监视量值时的帧之前的一帧。

在一个附加的方面，本发明提供了一种用于检测基于纳米孔的测序芯片的单元中的脂质膜的状态的系统和仪器。在一个实施例中，该系统包括积分电容器；耦合到积分电容器的工作电极；对电极，其中沉积在工作电极和对电极之间的脂质膜与积分电容器耦合；向对电极施加交流（AC）电压的AC电压源；模数转换器（ADC），其周期性地对跨积分电容器的电压进行采样；以及处理器或电路。在另一个实施例中，处理器或电路被配置为在AC电压的两个量值之间插入AC电压的中间变化。在一个另外的实施例中，处理器或电路还被配置为响应于AC电压的中间变化来确定跨积分电容器的采样电压的变化。在附加的实施例中，处理器或电路还被配置为响应于AC电压的中间变化，基于所确定的跨积分电容器的采样电压的变化来检测脂质膜的状态。在另一个实施例中，处理器或电路还被配置为：当AC电压从第一阶段切换到第二阶段时，或者当AC电压从第一阶段切换到第二阶段时，响应于AC电压的中间变化来确定跨积分电容器的采样电压的变化。在一个进一步的实施例中，AC电压第一阶段包括第一阶段量值，以及AC电压第二阶段包括第二阶段量值。在一个附加的实施例中，AC电压的第一阶段量值大于AC电压的第二阶段量值。在另一个实施例中，第一阶段包括正方波，以及第二阶段包括负方波。在附加的实施例中，处理器或电路还被配置为：当AC电压处于中间监视量值时，响应于AC电压的中间变化，确定跨积分电容器的采样电压的变化。在一个另外的实施例中，中间监视量值小于第一阶段量值但大于第二阶段量值。在附加的实施例中，处理器或电路还被配置为选择中间监视量值，使得在脂质双层已破裂的情况下，跨积分电容器的采样电压在ADC的ADC参考窗口内。在附加的实施例中，处理器或电路还被配置为将跨积分电容器的采样电压的变化与一个或多个预定阈值进行比较。在一个实施例中，处理器或电路还被配置为基于与一个或多个预定阈值的比较来检测脂质膜的状态。在一个附加的实施例中，脂质膜的状态选自以下各项组成的组：具有两个以上脂质分子层的脂质膜，脂质双层和破裂的脂质双层。在另一个实施例中，处理器电路还被配置为选择中间监视量值，使得在脂质双层已破裂的情况下，跨积分电容器的采样电压在ADC的ADC参考窗口内。

在另一方面，本发明提供了一种用于检测基于纳米孔的测序芯片的单元中的脂质膜的状态的系统和仪器，其中，该系统包括处理器或电路，该处理器或电路被配置为响应于AC电压的中间变化来确定跨积分电容器的采样电压的变化，其中该单元是基于纳米孔的测序芯片中的多个单元之一。在一个实施例中，中间监视量值小于第一阶段量值但大于第二阶段量值。在另一个实施例中，该系统还包括恒定的预充电电压源。在一个附加的实施例中，处理器或电路还被配置为通过使用全局预充电信号将积分电容器连接到恒定的预充电电压源来对积分电容器进行预充电。在一个实施例中，全局预充电信号用于控制多个单元中的积分电容器的预充电的定时。在另一个实施例中，处理器或电路还被配置为在将积分电容器充电至恒定的预充电电压源值之后，使用全局预充电信号将预充电电压源与积分电容器断开。在进一步的实施例中，全局预充电信号用于控制预充电电压源与多个单元中的积分电容器断开的定时。在附加的实施例中，处理器或电路还被配置为等待预定时间段，以使积分电容器通过与脂质双层相关的电容充电或放电。在一个另外的实施例中，处理器或电路还被配置为在预定的等待时段之后使ADC对跨积分电容器的电压进行采样。在一个附加的实施例中，将预充电电压源与多个单元中的积分电容器断开的定时被配置为使得该定时与当AC电压被切换到中间监视量值时的定时基本相同。在一个实施例中，多个单元中的积分电容器的预充电的定时被配置为使得该定时是在已经读出来自多个单元的测序数据的帧之后。在另一个实施例中，该帧是当AC电压被切换到中间监视量值时的帧之前的一帧。

在进一步的实施例中，用于检测基于纳米孔的测序芯片的单元中的脂质膜的状态的系统或仪器还包括单元中由处理器或电路控制的开关。在一个实施例中，处理器或电路还被配置为响应于检测到脂质双层已经破裂，以通过打开单元中的开关来禁止跨脂质双层施加进一步的电刺激。

附图说明

在以下详细描述和附图中公开了本发明的各种实施例。

图1图示了基于纳米孔的测序芯片中的单元100的实施例。

图2图示了利用Nano-SBS技术来执行核苷酸测序的单元200的实施例。

图3图示了将要用预加载的标签进行核苷酸测序的单元的实施例。

图4图示了用于用预加载的标签进行核酸测序的过程400的实施例。

图5图示基于纳米孔的测序芯片中的单元500的实施例。

图6A图示了基于纳米孔的测序芯片的单元中的电路600的实施例，其中该电路可以被配置为检测脂质双层是否在单元中形成而不会引起已经形成的脂质双层分解。

图6B图示了基于纳米孔的测序芯片的单元中与图6A所示相同的电路600。与图6A相比，代替示出了工作电极和对电极之间的脂质膜/双层，示出了代表工作电极和脂质膜/双层的电特性的电模型。

图7图示了电模型700，其表示在系统的脂质双层测量阶段期间电路600的一部分的电特性。

图8A图示了响应于正/负电压变化±ΔV_liq的小的观察到的正/负电压变化±ΔV_ADC检测到单元中尚未形成脂质双层。

图8B图示了响应于正/负电压变化±ΔV_liq的大的观察到的正/负电压变化±ΔV_ADC检测到在单元中已经形成了脂质双层。

图9A图示了在单元内形成脂质双层之前和之后V_ADC相对时间的示例性曲线图。

图9B图示了在尚未形成脂质双层的时间段t1期间，V_ADC相对时间的示例性曲线图（参见图9A）的放大视图。

图9C图示了在已经形成脂质双层的时间段t2期间，V_ADC相对时间的示例性曲线图（参见图9A）的放大视图。

图10图示了电模型1000，其表示在系统的测序阶段期间电路600的一部分的电特性。

图11A图示了响应于正/负电压变化±ΔV_liq的大的观察到的正/负电压变化±ΔV_ADC指示单元中的脂质双层仍完整。图11A与图8B相同。

图11B图示了响应于正/负电压变化±ΔV_liq的观察到的正/负电压变化±ΔV_ADC的进一步增加指示脂质双层刚刚在单元中破裂。

图12图示了用于在系统的不同阶段（包括测序阶段）期间检测基于纳米孔的测序芯片的单元中的脂质膜的状态的改进的V_liq波形1200的示例性曲线图。

图13图示了为了在测序阶段期间检测具有短路状态的单元，电路600可以在V_liq从亮量值切换到监视信号量值时响应于施加到与脂质膜/双层接触的主体液体（bulkliquid）的增量电压变化（ΔV_liq）来监视在积分电容器608（n_cap）处的增量电压变化ΔV_ADC。

图14图示了单元库的任何给定行中的单元共享相同的积分时间间隔，但相邻行的积分时间间隔彼此交错，从而导致行依赖性效应，其降低了检测破裂脂质双层的总体性能。

图15图示了当V_liq将要切换到中间监视信号时，全局预充电信号1502用于使单元库的不同行中的单元的积分同步。

图16图示了当V_liq将要切换到中间监视信号时，修改的全局预充电信号1602用于使单元库的不同行中的单元的积分同步。

图17A图示了破裂的脂质双层检测技术的行依赖性效应。

图17B图示了通过使用图16中的全局预充电信号，行依赖性效应大大降低。

图18A是当检测到破裂脂质双层时响应于在单元中监视到属于单元库的不同行的信号所观察到的电压变化ΔV_ADC的曲线图。

图18B是示出了当检测到破裂的脂质双层时响应信号的分布的直方图。

图18C是当未检测到破裂的脂质双层时响应于在单元中监视到属于单元库的不同行的信号所观察到的电压变化ΔV_ADC的曲线图。

图18D是示出当未检测到破裂的脂质双层时响应信号的分布的直方图。

图19图示了用于在基于纳米孔的测序芯片的单元中形成脂质层的改进技术的过程1900的实施例。

图20图示了具有包围硅芯片的改进的流动室的基于纳米孔的测序系统2000的俯视图，该硅芯片允许液体和气体通过并接触芯片表面上的传感器。

图21A图示了具有不同ΔV_ADC值的单元的初始分布。

图21B图示了在过程1000的脂质减薄刺激阶段和盐缓冲溶液流动阶段甚至已重复许多次后具有不同ΔV_ADC值的单元的分布。

图21C图示了在脂质减薄刺激阶段和盐缓冲溶液中流动的过程1000的阶段已重复的次数甚至更大数目后具有不同ΔV_ADC值的单元的分布。

图22图示了双层测量阶段，电脂质减薄刺激阶段和盐缓冲溶液流动阶段的定时图的实施例。

具体实施方式

本发明可以以多种方式来实现，包括作为过程；仪器；系统；物质的组成；体现在计算机可读存储介质上的计算机程序产品；和/或处理器，例如配置为执行存储在耦合到该处理器的存储器上和/或由该存储器提供的指令的处理器。在本说明书中，可以将这些实现方式或本发明可以采取的任何其它形式称为技术。一般地，可以在本发明的范围内改变所公开过程的步骤的顺序。除非另有说明，否则可以将被描述为被配置成执行任务的诸如处理器或存储器之类的组件实现为暂时地被配置成在给定时间执行任务的通用组件或被制造成执行任务的专用组件。如本文所使用的，术语“处理器”是指被配置为处理诸如计算机程序指令之类的数据的一个或多个装置，电路和/或处理核。

下面连同图示本发明的原理的附图一起提供对本发明的一个或多个实施例的详细描述。结合这样的实施例对本发明进行描述，但是本发明并不限于任何实施例。本发明的范围仅受权利要求限制，并且本发明涵盖众多替换方案、修改和等同物。在以下描述中阐述了众多具体细节，以便提供对本发明的透彻理解。这些细节被提供用于示例的目的，并且可以根据权利要求在没有这些具体细节中的一些或全部的情况下实践本发明。为了清晰起见，在与本发明相关的技术领域中已知的技术材料并未被详细描述，以免不必要地模糊本发明。

具有大约一纳米内径的孔大小的纳米孔膜装置在快速核苷酸测序方面显示了希望。当跨沉浸于传导流体中的纳米孔施加电压电势时，可以观察到归因于跨纳米孔的离子传导的小离子电流。该电流的大小对孔大小敏感。

基于纳米孔的测序芯片可用于DNA测序。基于纳米孔的测序芯片并入配置为阵列的大量传感器单元。例如，具有一百万个单元的阵列可以包括1000行×1000列个单元。

图1图示了基于纳米孔的测序芯片中的单元100的实施例。膜102形成于单元的表面之上。在一些实施例中，膜102是脂质双层。包含可溶性蛋白质纳米孔跨膜分子复合物（PNTMC）和感兴趣的分析物的主体电解液（bulk electrolyte）114被直接放置到单元的表面上。单个PNTMC 104通过电穿孔而被插入到膜102中。阵列中的个体膜彼此既不化学连接也不电连接。因此，阵列中的每个单元是独立的测序机器，产生对与PNTMC相关联的单个聚合物分子而言唯一的数据。PNTMC 104对分析物操作并且通过另外的不可渗透的双层来调制离子电流。

继续参考图1，模拟测量电路112连接到被电解液的薄膜108所覆盖的金属电极110。电解液108的薄膜通过离子不可渗透膜102与主体电解液114隔离。PNTMC 104穿过膜102并且提供离子电流从主体液体流到工作电极110的唯一路径。单元还包括对电极（CE）116，其是电化学电势传感器。单元还包括参考电极117。

在一些实施例中，纳米孔阵列使用基于单分子纳米孔的合成测序（Nano-SBS）技术实现了并行测序。图2图示了利用Nano-SBS技术来执行核苷酸测序的单元200的实施例。在Nano-SBS技术中，将要被测序的模板202和先导物引入到单元200。针对该模板-先导物复合物，四个不同地加标签的核苷酸208被添加到主体水相。随着被正确加标签的核苷酸与聚合酶204复合，标签的尾部被定位在纳米孔206的桶状体中。保持在纳米孔206桶状体中的标签会产生独特的离子封锁信号210，从而通过电子方式识别由于标签的独特的化学结构而增加的碱基。

图3图示了将要利用预加载的标签来执行核苷酸测序的单元的实施例。在膜302中形成纳米孔301。酶303（例如，聚合酶，诸如DNA聚合酶）与纳米孔相关联。在一些情况中，聚合酶303共价地附连到纳米孔301。聚合酶303与要被测序的核酸分子304相关联。在一些实施例中，核酸分子304是圆形的。在一些情况中，核酸分子304是线性的。在一些实施例中，核酸先导物305与核酸分子304的一部分杂交。聚合酶303使用单链核酸分子304作为模板来将核苷酸306催化并入到先导物305上。核苷酸306包含标签种类（“标签”）307。

图4图示了用于用预加载的标签进行核酸测序的过程400的实施例。阶段A图示了如图3中描述的组件。阶段C示出了被加载到纳米孔中的标签。“加载的”标签可以是被放置在纳米孔中和/或保留在纳米孔中或附近达可观的时间量（例如0.1毫秒（ms）至10000ms）的标签。在一些情况中，预加载的标签在从核苷酸释放之前被加载到纳米孔中。在一些实例中，如果在核苷酸并入事件时标签在被释放之后穿过纳米孔（和/或被纳米孔检测到）的概率合适地高，例如90%到99%，则标签被预加载。

在阶段A处，加标签的核苷酸（四种不同类型A，T，G或C之一）与聚合酶不相关。在阶段B处，加标签的核苷酸与聚合酶相关联。在阶段C处，聚合酶对接到纳米孔。标签在对接期间被电动力拉到纳米孔中，所述电动力诸如是在由跨膜和/或纳米孔施加的电压所生成的电场存在的情况下生成的力。

一些相关的加标签的核苷酸没有与核酸分子碱基配对。这些未配对的核苷酸通常在一时间尺度内被聚合酶拒绝，该时间尺度比正确配对的核苷酸保持与聚合酶相关联的时间尺度短。由于未配对的核苷酸仅与聚合酶短暂关联，因此图4中所示的过程400通常不会超过阶段D。例如，未配对的核苷酸会在阶段B或过程进入阶段C后不久被聚合酶拒绝。

在聚合酶对接至纳米孔之前，纳米孔的电导约为300微微西门子（300 pS）。在阶段C处，纳米孔的电导率约为60 pS，80 pS，100 pS或120 pS，分别对应于四种类型的加标签的核苷酸之一。聚合酶经受异构化和转磷酸反应以将核苷酸并入到生长的核酸分子中并且释放标签分子。特别地，当标签被保持在纳米孔中时，由于标签的独特化学结构而产生了独特的电导信号（例如，参见图2中的信号210），从而电子地识别了所添加的碱基。重复所述循环（即，阶段A到E或者阶段A到F）允许对核酸分子测序。在阶段D处，所释放的标签穿过纳米孔。

在某些情况下，未被并入正在生长的核酸分子中的加标签的核苷酸也将通过纳米孔，如图4的阶段F所示。在一些实例中，未被并入的核苷酸可以被纳米孔检测到，但该方法提供了用于至少部分地基于在纳米孔中检测到核苷酸的时间来区分被并入的核苷酸与未被并入的核苷酸的手段。结合到未被并入的核苷酸的标签快速地穿过纳米孔并且在短时间段（例如，小于10ms）内被检测到，而被结合到被并入的核苷酸的标签被加载到纳米孔中并且在长时间段（例如，至少10 ms）内被检测到。

图5图示基于纳米孔的测序芯片中的单元500的实施例。单元500包括介电层501。用于形成介电层501的介电材料包括玻璃，氧化物，氮化物等。单元500还包括在介电层501上方的介电层504。介电层504形成围绕井505的壁，工作电极502位于该井505的底部。用于形成介电层504的介电材料包括玻璃，氧化物，一氮化硅（SiN）等。介电层504的顶表面可以被硅烷化。硅烷化在介电层504的顶表面上方形成疏水层520。在一些实施例中，疏水层520具有约1.5纳米（nm）的厚度。

由介电层壁504形成的井505在工作电极502上方还包括盐溶液506的薄膜。盐溶液506可以包含以下之一：氯化锂（LiCl），氯化钠（NaCl），氯化钾（KCl），谷氨酸锂，谷氨酸钠，谷氨酸钾，乙酸锂，乙酸钠，乙酸钾，氯化钙（CaCl₂），氯化锶（SrCl₂），氯化锰（MnCl₂）和氯化镁（MgCl₂）。在一些实施例中，盐溶液506的薄膜具有约三微米（μm）的厚度。

如图5所示，在介电层504的顶部形成膜，并且该膜跨过井505。例如，该膜包括在疏水层520的顶部上形成的脂质单层518。当膜到达井505的开口时，脂质单层过渡到跨越井的开口的脂质双层514。包含蛋白质纳米孔跨膜分子复合物（PNTMC）和感兴趣的分析物的主体电解液508置于井的正上方。通过电穿孔将单个PNTMC /纳米孔516插入脂质双层514中。纳米孔516穿过脂质双层514并且为离子从主体电解液508到工作电极502的流动提供了唯一的路径。主体电解液508还可包括以下之一：氯化锂（LiCl），氯化钠（NaCl），氯化钾（KCl），谷氨酸锂，谷氨酸钠，谷氨酸钾，乙酸锂，乙酸钠，乙酸钾，氯化钙（CaCl₂），氯化锶（SrCl₂），氯化锰（MnCl₂）和氯化镁（MgCl₂）。

单元500包括对电极（CE）510，其是电化学电势传感器。单元500还包括参考电极512。在一些实施例中，对电极510在多个单元之间共享，并因此也被称为公共电极。公共电极可以被配置成向与测量单元中的纳米孔接触的主体液体施加公共电势。公共电势和公共电极对所有测量单元而言是公共的。

在一些实施例中，工作电极502是金属电极。对于非法拉第传导，工作电极502可以由耐腐蚀和抗氧化的金属（例如铂，金，氮化钛和石墨）制成。例如，工作电极502可以是具有电镀铂的铂电极。在另一个示例中，工作电极502可以是氮化钛（TiN）工作电极。

在确定脂质双层已经在基于纳米孔的测序芯片的单元内适当形成之后，执行将纳米孔插入脂质双层的步骤。在一些技术中，确定脂质双层是否已经在单元中正确形成的过程可能导致已经正确形成的脂质双层被破坏。例如，可以施加刺激电压以使电流流过电极。尽管所测量的对刺激电压的响应可以用于区分具有适当形成的脂质双层（即，两层脂质分子厚的脂质双层）的单元与没有适当形成的脂质双层的单元（例如，具有厚脂质和跨单元的井的溶剂结合薄膜的单元），刺激电压水平足够高，以致在某些情况下会导致已经正确形成的脂质双层分解。换句话说，用于测试脂质双层的刺激电压可能对脂质双层具有破坏性。在已经适当形成的脂质双层被刺激电压破坏的情况下，由于短路状况，非常大的电流开始流过电极。作为响应，系统可能尝试再次在特定单元中重新形成新的脂质双层；但是，这既耗时又效率低下。另外，在随后的试验中，脂质双层可能不会在特定单元中重新形成。结果，基于纳米孔的测序芯片中的具有适当形成的脂质双层和纳米孔的单元的总百分比（即，基于纳米孔的测序芯片的产率）降低。

公开了一种检测基于纳米孔的测序芯片的单元中形成的脂质双层的非破坏性技术。检测脂质双层的非破坏性技术具有许多优势，包括提高基于纳米孔的测序芯片的效率和产率。

图6A图示了基于纳米孔的测序芯片的单元中的电路600的实施例，其中该电路可以被配置为检测脂质双层是否在单元中形成而不会导致已经形成的脂质双层分解。

图6A示出了位于单元工作电极614和对电极616之间的脂质膜或脂质双层612，从而跨脂质膜/双层612施加电压。脂质双层是由两层脂质分子组成的薄膜。脂质膜是由几层（超过两层）脂质分子组成的膜。脂质膜/双层612也与主体液体/电解液618接触。请注意，与图1中的工作电极，脂质双层和对电极相比，工作电极614，脂质膜/双层612和对电极616上下颠倒。在一些实施例中，对电极在多个单元之间被共享，并且因此也被称为公共电极。通过将公共电极连接到电压源V_liq 620，公共电极可以配置为向与测量单元中的脂质膜/双层接触的主体液体施加公共电势。公共电势和公共电极对所有测量单元而言是公共的。每个测量单元内都有一个工作单元电极；与公共电极相反，工作单元电极614可配置为施加独立于其他测量单元中的工作单元电极的独特电势。

图6B图示了基于纳米孔的测序芯片的单元中与图6A所示相同的电路600。与图6A相比，代替示出工作电极和对电极之间的脂质膜/双层，示出了代表工作电极和脂质膜/双层的电特性的电模型。

电模型622包括代表工作电极614的电特性的电容器624。与工作电极614相关联的电容也称为双电层电容（C_{double layer}）。电模型622还包括电容器626（C_bilayer），其建模与脂质膜/双层相关联的电容，以及电阻器628（R_bilayer），其建模与脂质膜/双层相关联的电阻。与脂质膜/双层相关联的电阻非常高，并且因此R_bilaye可以由开路代替，这将电模型622简化为C_{double layer}与C_bilayer串联。

电压源V_liq 620是交流（AC）电压源。对电极616浸入主体液体618中，并且利用AC非法拉第模式来调制方波电压V_liq并将其施加到与测量单元中的脂质膜/双层接触的主体液体中。在一些实施例中，V_liq是量值为±200-250mV且频率在25至100Hz之间的方波。

通过装置606是开关，其可用于使脂质膜/双层和电极与测量电路600连接或断开。该开关启用或禁用可跨单元中的脂质膜/双层施加的电压刺激。在脂质沉积到单元上以形成脂质双层之前，两个电极之间的阻抗非常低，因为单元的井未被密封，并且因此开关606保持打开状态以避免短路情况。一旦脂质溶剂已经沉积到井以密封单元的井，就可以关闭开关606。

电路600还包括片上制造的集成电容器608（n_cap）。积分电容器608通过使用复位信号603来闭合开关601而被预充电，使得积分电容器608被连接到电压源V_pre 605。在一些实施例中，电压源V_pre 605提供量值为900mV的恒定正电压。当开关601闭合时，积分电容器608被预充电到电压源V_pre 605的正电压水平。

在对积分电容器608进行预充电之后，将复位信号603用于打开开关601，以使积分电容器608与电压源V_pre 605断开。此时，取决于V_liq的水平，对电极616的电势可以处于比工作电极614的电势高的水平，反之亦然。例如，在方波V_liq的正阶段（即，AC电压源信号周期的暗时段）期间，对电极616的电势处于比工作电极614的电势高的水平。类似地，在方波V_liq的负阶段（即AC电压源信号周期的亮时段）期间，对电极616的电势处于低于工作电极614的电势的水平。由于该电势差，积分电容器608可以在AC电压源信号周期的暗时段期间被充电并且可以在AC电压源信号周期的亮时段期间被放电。

取决于模数转换器（ADC）610的采样率，积分电容器608会在固定时间段内充电或放电，然后ADC 610可以读出存储在积分电容器608中的电压。在由ADC 610采样之后，积分电容器608通过使用复位信号603以闭合开关601而再次被预充电，使得积分电容器608再次被连接到电压源V_pre 605。在一些实施例中，ADC 610的采样率在1500至2000Hz之间。在一些实施例中，ADC 610的采样率高达5kHz。例如，以1 kHz的采样率，积分电容器608进行约1ms时段的充电或放电，以及然后由ADC 610读出存储在积分电容器608中的电压。在由ADC 610采样之后，积分电容器608通过使用复位信号603以闭合开关601而再次被预充电，使得积分电容器608再次被连接到电压源V_pre 605。然后，在系统的整个脂质双层测量阶段中循环地重复以下步骤：对积分电容器608进行预充电，等待固定时间段以使积分电容器608充电或放电以及通过ADC 610对存储在积分电容器中的电压进行采样。

电路600可用于通过响应于施加到与脂质膜/双层接触的主体液体的增量电压变化（ΔV_liq）来监视在积分电容器608（n_cap）处的增量电压变化ΔV_ADC以检测是否在单元中形成脂质双层。如下面将更详细描述的，在脂质双层测量阶段期间，电路600可以被建模为分压器，其中C_bilayer 626，C_{double layer} 624和n_cap 608串联连接，并且ADC 610可以在分压器的中间点搭接读取电压变化，以便确定是否已经形成脂质双层。

图7图示了电模型700，其表示在系统的脂质双层测量阶段期间电路600的一部分的电特性。如图7所示，C_{double layer} 624与C_bilayer 626串联连接，但从电模型700中删除了R_bilayer 628（见图6B）。由于与脂质膜/双层相关联的电阻非常高，所以可以从电模型700中去除R_bilayer 628，因此可以将R_bilayer近似为开路。如图7所示，C_{double layer}624和C_bilayer 626进一步与n_cap 608串联连接。

在AC模式下操作时，由ADC读取的电压（V_ADC）可以通过以下方式确定：

　　　　　　等式（1）

其中Z = 1 /（jωC），

Z（ncap）是与n_cap相关的AC阻抗_，

Z（double layer）是与工作电极相关的AC阻抗，

以及Z（double layer）是与脂质膜/双层相关的AC阻抗。

双电层的AC阻抗Z（double layer）与Z（bilayer）和Z（n_cap）相比具有非常低的值，因为C_{double layer}比C_bilayer或n_cap的电容大得多。因此，代入Z（ncap）= 1/(jωC_ncap)，Z(bilayer) = 1 /jωC_bilayer ，以及Z（double layer）= 0，等式（1）可以简化为：

　　　　　　等式（2）

其中C（ncap）是与n_cap相关的电容_，

以及C（bilayer）是与脂质膜/双层相关的电容。

当脂质首先沉积到单元中形成脂质双层时，一些单元会自发形成脂质双层，但是某些单元仅具有厚脂质膜（具有结合在一起的多层脂质分子和溶剂）跨越单元的每个井。与脂质双层相关的电容大于与脂质膜相关的电容，脂质膜大于两层的脂分子厚度，因为脂质膜/双层的电容与其厚度成反比。随着脂质膜减薄并转变为脂质双层，其厚度减小，并且其相关的电容增加。在上面的等式（2）中，随着脂质双层开始在单元内形成，C（bilayer）增加，而C（ncap）保持恒定，从而整个V_ADC增加。因此，V_ADC的增加可用作单元内已形成脂质双层的标志。

在一些实施例中，响应于施加到与脂质膜/双层接触的主体液体的增量电压变化（ΔV_liq）来监视在积分电容器608（n_cap）处的增量电压变化ΔV_ADC，以便检测是否已在单元中形成脂质双层。例如，等式（2）可以被重写为：

　　　　　　等式（3）

其中_，ΔV_ADC 是在积分电容器608（n_cap）处由ADC读取的电压变化

ΔV_liq是施加到主体液体的电压变化，

C（ncap）是与n_cap相关的电容_，

以及C（bilayer）是与脂质膜/双层相关的电容。

在上面的等式（3）中，因为C（ncap）保持不变，当C（bilayer）随着脂质双层开始在单元内形成而增加时，ΔV_ADC也增加。ΔV_ADC大致正比于与脂质膜/双层相关联的电容C（bilayer）。在ΔV_ADC的增加因此可以被用作脂质双层已经在单元中形成的标志。

在一些实施例中，为了最大化可观察到的ΔV_ADC以便于脂质双层的更可靠的检测，响应于施加到与脂质膜/双层接触的主体液体的最大电压变化（最大ΔV_liq）来监视ΔV_ADC，以便检测脂质双层是否已经在单元中形成。

图8A图示了响应于正/负电压变化±ΔV_liq的小的观察到的正/负电压变化±ΔV_ADC导致检测到尚未在单元中形成脂质双层的结果。图8B图示了响应于正/负电压变化±ΔV_liq的大的观察到的正/负电压变化±ΔV_ADC导致检测到单元中已形成的脂质双层。

在图8A中，最大正电压变化+ΔV_liq在方波V_liq从负阶段到正阶段变化时发生，而最大负电压变化_-ΔV_liq在方波V_liq从正阶段到负阶段变化时发生。在图8A中，在ΔV_liq处于正最大值时的情况下，如果在该单元中尚未形成脂质双层，则只能观察到小的₊ΔV_ADC；在ΔV_liq为负最大值的情况下，如果在该单元中尚未形成脂质双层，则只能观察到小的–ΔV_ADC。

在图8B中，在ΔV_liq处于正最大值时的情况下，如果在该单元中已经形成脂质双层，则可以观察到大的正电压变化 ₊ΔV_ADC。以及在ΔV_liq处于负最大值的情况下，如果在该单元中已经形成脂质双层，则可以观察到大的负电压变化–ΔV_ADC。

图9A图示了在单元内形成脂质双层之前和之后V_ADC相对时间的示例性曲线图。图9A中的曲线图是基于真实的测试数据。如图9A所示，y轴上的V_ADC单位为ADC计数。然而，也可以使用其他单位。如图9A所示，在尚未形成脂质双层的时间段t1期间，所记录的|ΔV_ADC |值小于在单元中已经形成脂质双层之后的时间段t2期间记录的值。

图9B图示了在尚未形成脂质双层的时间段t1期间，V_ADC相对时间的示例性曲线图（参见图9A）的放大视图。图9B所示的结果与图8A一致。在图9B中，当方波V_liq从负阶段到正阶段变化时出现最大₊ΔV_liq，而当方波V_liq从正阶段变化到负阶段时出现最大_-ΔV_liq。在图9B中，在ΔV_liq处于正最大值时的情况下，仅可以观察到小的₊ΔV_ADC，因为脂质双层尚未在所述单元中形成；在ΔV_liq处于负最大值时的情况下，由于在单元中尚未形成脂质双层，因此只能观察到小的–ΔV_ADC。

图9C图示了在已经形成脂质双层的时间段t2期间，V_ADC相对时间的示例性曲线图（参见图9A）的放大视图。图9C所示的结果与图8B一致。在图9C中，在当ΔV_liq处于正最大值的情况下，可在两个连续采样点之间观察到大的₊ΔV_ADC，因为脂质双层已经在单元中形成。在当ΔV_liq为负最大值的情况下，可以观察到大的–ΔV_ADC，因为在单元中已经形成了脂质双层。请注意，在方波V_liq从一阶段改变到另一阶段后不久，ΔV_liq保持为零，并且作为响应，V_ADC减小为零。如图9C所示，当在单元中已经形成脂质双层时，可以观察到V_ADC中的正尖峰或负尖峰。正尖峰或负尖峰之后是小得多的V_ADC值。

在使用上述技术确定已经在基于纳米孔的测序芯片的单元内正确形成脂质双层之后，可以将纳米孔插入脂质双层中，并且可以将具有插入的纳米孔的单元用于核酸测序。在测序阶段期间，基于纳米孔的测序芯片中某些单元中的脂质双层可能由于渗透失衡或其他原因而破裂。单元中的破裂的脂质双层是不希望的，因为它会由于类似短路的情况而导致极高的电流流过电极，并且高电流还可能影响相邻单元中的数据采集。因此，期望一种在测序阶段期间检测由于脂质双层破裂而具有短路状态的单元的技术。该技术使基于纳米孔的测序芯片能够禁用检测到的单元，从而提高了芯片的整体性能。

如图6A或图6B所示，可以通过控制通过装置606来实现以短路状态来禁用单元。通过装置606可以用作开关，其用以通过断开电极与测量电路600的连接以禁用单元，从而不再跨单元中破裂的脂质双层/膜施加电压刺激。

在测序阶段期间检测具有短路状态的单元可以通过使用电路600来响应于施加到与脂质膜/双层接触的主体液体的增量电压变化（ΔV_liq）来监视在积分电容器608（n_cap）处的增量电压变化ΔV_ADC来实现，这类似于上面描述的用于检测单元中脂质双层形成的技术。如下面将更详细地描述的，在测序阶段期间，电路600可以被建模为分压器，其中n_cap与同工作电极和脂质双层/膜相关联的阻抗Z 1002串联连接，这类似于先前描述的用于在脂质双层测量阶段期间对电路600进行建模的模型7000。 ADC 610可以读取在分压器的中间点处分接的电压变化，以确定是否存在由于单元中破裂的脂质双层而引起的短路状况。

图10图示了电模型1000，其表示在系统的测序阶段期间电路600的一部分的电特性。如图10所示，阻抗Z 1002用于对工作电极和脂质双层/膜进行建模，并且Z 1002与n_cap608串联连接。

当在AC模式下工作时，ADC读取的电压（V_ADC）可以通过以下方式确定：

　　　　　　等式（4）

其中Z = 1 /（jωC），

Z（ncap）是与n_cap相关的AC阻抗_，

并且Z 1002是与工作电极和脂质双层/膜相关的AC阻抗。

在上面的等式（4）中，随着脂质双层破裂，由于短路状况，Z 1002显著减小，使得V_ADC的值接近于V_liq。因此，V_ADC的进一步增加可以用作在单元内脂质双层已经破裂的标志。

在一些实施例中，响应于施加到与脂质膜/双层接触的主体液体的增量电压变化（ΔV_liq）来监视在积分电容器608（n_cap）处的增量电压变化ΔV_ADC，以便检测脂质双层是否已经在单元中破裂。例如，等式（4）可以被重写为：

　　　　　　等式（5）

其中，ΔV_ADC 是在积分电容器608（n_cap）处由ADC读取的电压变化

ΔV_liq是施加到主体液体的电压变化，

Z（ncap）是与n_cap相关的AC阻抗_，

并且Z 1002是与工作电极和脂质双层/膜相关的AC阻抗。

在上面的等式（5）中，因为随着单元内的脂质双层破裂，Z 1002减小，ΔV_ADC增加到接近于ΔV_liq的值。因此ΔV_ADC的进一步增加可以用作脂质双层刚刚在单元内破裂的标志。

在一些实施例中，为了最大化可观察到的ΔV_ADC以便于破裂的脂质双层的更可靠的检测，响应于施加到与脂质膜/双层接触的主体液体的最大电压变化（最大ΔV_liq）来监视ΔV_ADC，以便检测脂质双层是否刚刚在单元中破裂。

图11A图示了响应于正/负电压变化±ΔV_liq的大的观察到的正/负电压变化±ΔV_ADC指示单元中的脂质双层仍完整。图11A与图8B相同。图11B图示了响应于正/负电压变化±ΔV_liq的观察到的正/负电压变化±ΔV_ADC的进一步增加指示脂质双层刚刚在单元中破裂。

在图11B中，在当ΔV_liq处于正最大值时的情况下，如果脂质双层刚刚在单元破裂，则可以观察到正电压变化₊ΔV_ADC的量值的进一步增加。并且在当ΔV_liq处于负最大值的情况下，如果脂质双层刚刚在单元中破裂，则可以观察到负电压变化–ΔV_ADC量值的进一步增加。

然而，在系统的测序阶段期间，应用上述诊断技术以检测基于纳米孔的测序芯片的单元中破裂的脂质双层具有许多挑战。挑战之一是选择对于核酸测序（主要实验）和诊断测试两者有效的合适ADC参考窗口和合适的V_liq量值。ADC参考窗口是ADC可以转换的最小至最大模拟值的范围。ADC参考窗口指定了满量程测量范围，例如–V_ref至+ V_ref毫伏/伏，并且可以在ADC芯片上进行编程。在基于纳米孔的测序芯片的测序阶段期间，可用于核酸测序的信号非常小，并且因此ADC参考窗口被编程为小电压窗口，从而可以将小信号解析为不同的离散水平。然而，响应于具有破裂脂质双层的单元的方波V_liq的阶段变化，|ΔV_ADC|远大于可用于核酸测序的信号。结果，适用于核酸测序的较小的ADC参考窗口可能会导致ADC读取的ΔV_ADC信号饱和。降低V_liq量值以防止ΔV_ADC信号的饱和不是可行的解决方案，因为V_liq量值由用于核酸测序的生物化学过程约束。因此，上述诊断技术可能不再可靠地区分完整的脂质双层和单元中破裂的脂质双层，尤其是当V_liq的调制频率超过某个阈值水平（例如80 Hz或100 Hz）时。因此，将期望在系统的不同阶段期间检测基于纳米孔的测序芯片的单元中的脂质膜状态的改进技术。

图12图示了用于在系统的不同阶段（包括测序阶段）期间检测基于纳米孔的测序芯片的单元中的脂质膜的状态的改进的V_liq波形1200的示例性曲线图。状态包括具有结合在一起的多层脂质分子和溶剂的脂质膜，脂质双层和破裂的脂质双层。改进的V_liq波形1200可以施加到图6A中的电路600。与最初的V_liq波形（其是当波形从正阶段变为负阶段时（或者反之亦然（例如，参见图11B））在两个量值之间切换的方波）不同，改进的V_liq波形1200包括额外的监视信号1202。在图12中，x轴绘制帧，并且y轴以mV为单位绘制V_liq波形。在该特定实施例中，当V_liq波形1200从亮时段切换到暗时段时，插入附加监视信号1202。特别地，V_liq在其切换到暗量值（帧＃6或＃17处10mV）之前，从亮量值（帧＃4或＃15处80 mV）切换到中间监视信号量值（帧5或＃16处60 mV）。V_liq AC电压的中间变化被插入在AC电压的两个量值（亮量值和暗量值）之间。在一些其他实施例中，当波形从暗时段切换到亮时段时，插入附加监视信号。在这些实施例中，V_liq在其切换到亮量值水平之前从暗量值水平切换到中间监视信号量值。中间监视信号量值可以是与监视信号之前的电压水平相比小的电压增量（例如，-20 mV，如图12所示）。V_liq AC电压的中间变化被插入到AC电压的两个量值（暗量值和亮量值）之间。在一些实施例中，当波形在阶段之间切换时，电压的增量变化可以是V_liq量值的总变化的部分（例如，如图12所示的2/7）。在图12中，V_liq波形1200从亮时段到暗时段的量值变化是70mV。在其他实施例中，取决于用于核酸测序的生物化学过程，量值范围可以更小或更大，例如从50mV至500mV。采样或帧速率的范围可能是1-10 kHz。

图13图示了为了在测序阶段期间检测具有短路状态的单元，电路600可以在V_liq从亮量值切换到监视信号量值时，响应于施加到与脂质膜/双层接触的主体液体的增量电压变化（ΔV_liq）来监视在积分电容器608（n_cap）处的增量电压变化ΔV_ADC。在图13的上部曲线图中，x轴绘制帧，并且y轴绘制以mV为单位的V_liq波形1300。在图13的下部曲线图中，x轴绘制ADC样本，并且y轴绘制ADC在积分电容器608处读取的ADC计数。如顶部曲线所示，在ADC上编程了窄的ADC参考窗口1310（-25 mV至+25 mV），以提高分辨率，从而可用于核酸测序的相对较小的信号。窄的ADC参考窗口1310使ADC值1306和ADC值1308分别在0和255计数处饱和。但是，由于当波形在阶段之间切换时，监视信号1302引入的电压变化仅是V_liq量值总变化的部分，因此对监视信号1304的响应不会饱和，并且相应的增量电压变化可用于更可靠地检测脂质双层是完整还是破裂。例如，可以使用两个阈值水平来确定脂质膜的状态，其中阈值1<阈值2。如果（|ΔV_ADC | <阈值1），则确定该脂质膜具有结合在一起的多层脂质分子和溶剂，且还不是脂质双层。如果（（阈值1 <= |ΔV_ADC | <阈值2），则确定脂质双层是完整的。如果（|ΔV_ADC |> =阈值2），则确定脂质双层破裂。

如图13所示，当波形在阶段之间切换时，由监视信号1302引入的电压变化量约为V_liq的量值的总变化的1/5。但是，根据所选的ADC参考窗口，当V_liq波形在各相之间切换时，只要对监视信号的响应保持不饱和，监视信号的量值可以缩放为V_liq的量值的总变化的任何适当部分。

在基于纳米孔的测序芯片的一些实施例中，纳米孔阵列被分成单元库。例如，每个单元库可以包括M行×N列单元。行选择线和列选择线用于控制各个单元的状态。M和N可以是任何整数。例如，大小为8k的单元库（称为8k库）可以配置为64行乘128列，总共64 x 128个单元。由于每个单元库都是自主的，因此可以通过添加其他库来缩放纳米孔阵列。例如，128k阵列可以实现为16个8k库元素。512k阵列可以实现为8k库元素的8x8阵列。在一些实施例中，纳米孔阵列可以缩放以包括数百万个单元。

在一些实施例中，单元库的任何给定行中的单元共享相同的积分时间间隔，即，同一行中的每个单元在同一时间开始和结束其积分，并且相邻行的积分时间间隔彼此交错。因为相邻行的积分时间间隔在时间上彼此偏移，所以使用上述监视信号的检测技术具有行依赖性效果，并且结果使检测技术的整体性能降低。如以下将更详细描述的，当V_liq将要切换到监视信号时，可以通过引入用于使单元库的不同行中的单元的积分同步的全局预充电信号来减轻行依赖性效应，从而提高了检测技术的整体性能。

图14图示了单元库的任何给定行中的单元共享相同的积分时间间隔，但相邻行的积分时间间隔彼此交错，从而导致行依赖性效应，其降低了检测脂质膜的状态的总体性能。图14的顶部示出了 V_liq波形1300（参见图13）的放大版本。V_liq 1300以亮量值1422开始，并在切换到暗量值1426之前切换到中间监视信号量值1424。

图14的底部示出了指示帧的定时图，单元库的不同行（例如，行0，行1和行63）的积分时间间隔，以及ADC的读出定时。

垂直箭头1401-1405定义了V_liq波形1300的帧的开始；它们是当系统可以确定是将V_liq量值保持在其当前值还是切换到不同值时的时间实例。在帧1401和1402，V_liq 1300维持在亮量值1422。在帧1403，V_liq 1300切换到中间监视信号量值1424。在帧1404，V_liq 1300切换到暗量值1426。并且在帧1405，V_liq 1300保持在暗量值1426。

每个水平箭头指示单元库的特定行中的单元的积分时间间隔。例如，最上面的水平箭头组指示行0中的单元的积分时间间隔，第二组水平箭头指示行1中的单元的积分时间间隔，并且最下面的水平箭头组指示行63中的单元的积分时间间隔。如图所示，相邻行的积分时间间隔在时间上彼此偏移。例如，行0的积分时间间隔的开始和行1的积分时间间隔的开始之间偏移了小的增量时间差；行1的积分时间间隔的开始和行2的积分时间间隔的开始之间偏移了小的增量时间差，以此类推。

单元库的任何给定行中的单元共享相同的积分时间间隔，但是相邻行的积分时间间隔彼此交错，因为用于触发针对一行中的单元的积分电容器608（参见图6A）的预充电的复位信号603的定时与其他行中的定时不同。

例如，在时间1417，行0中的每个单元使其复位信号603闭合单元的开关601，以使其积分电容器608连接到电压源V_pre 605。在对积分电容器608进行预充电之后，将复位信号603用于打开开关601，以使积分电容器608与电压源V_pre 605断开。此时，积分电容器608开始放电，并且行0的积分时间间隔1411开始。在行0的积分时间间隔1411结束之后，存储在行0中的每个单元的积分电容器608中的电压可以在时间1414由ADC 610读出。在由ADC 610采样之后，积分电容器608通过使用复位信号603以闭合开关601而再次被预充电，使得积分电容器608再次被连接到电压源V_pre 605。然后，循环地重复以下步骤：对积分电容器608进行预充电，等待固定时间段以使积分电容器608进行积分，以及通过ADC 610对存储在积分电容器608中的电压进行采样。

在时间1418，用于触发行1中的单元的预充电和积分的复位信号603落后行0的复位信号达小的增量时间差。在行1的积分时间间隔1412结束之后，可以在时间1415由ADC610读出存储在行1中的每个单元的积分电容器608中的电压。类似地，用于触发行2中的单元的预充电和积分的复位信号603落后行1的复位信号达小的增量时间差，行3中的单元的复位信号603落后行2的复位信号达小的增量时差，依此类推。重复此模式直到行63。特别地，在时间1419，行63中的每个单元具有其复位信号603，其触发单元的预充电和积分。在行63的积分时间间隔1413结束之后，ADC 610在时间1416读出存储在行63中的每个单元的积分电容器608中的电压。

因为不同行的单元的积分时间间隔在时间上偏移，所以当V_liq 1300从亮量值1422切换到中间监视信号量值1424时，两个不同行中的单元在其各自的积分时间间隔内在不同时间经历监视电压变化，从而导致两个不同行的ADC输出不同。例如，行0的单元在积分时间间隔1411的后面部分经历监视电压变化，而行63的单元在积分时间间隔1413的前面部分经历监视电压变化；因此，行0的ADC输出相对于行63的ADC输出比相同行的ADC输出具有更大的变化，从而引起行依赖性效应。

图15图示了当V_liq将要切换到中间监视信号时，全局预充电信号1502用于使单元库的不同行中的单元的积分同步。图14和图15是相似的，只是有一些区别：一个区别是全局预充电信号1502的引入，这将在下面更详细地描述；另一个区别是，在图15中，当V_liq 1300切换到中间监视时信号量值1424，相邻行的积分时间间隔不再像它们在图14中那样彼此交错（参见积分时间间隔1511、1512和1513）。例如，现在同时出现行0的积分时间间隔1511的开始，行1的积分时间间隔1512的开始和行63的积分时间间隔1513的开始。

全局预充电信号1502是预充电信号，其用于控制单元库中所有单元上的开关601。相反，复位信号603是预充电信号，其用于控制单个单元或单元库的仅单个行中的单元中的开关601。如图15所示，全局预充电信号1502在帧1402（V_liq 1300被切换到中间监视量值1424之前的帧）处被设置为高，这闭合了单元库的单元中的所有开关601，例如所有积分电容器608都连接到电压源 V_pre 605并被预充电到V_pre电压水平。全局预充电信号1502然后在帧1403（当V_liq 1300被切换到中间监视量值1424时的帧）处被设置为低，这打开了单元库的单元中的所有开关601，使得所有积分电容器608从电压源V_pre 605 断开，并且同时开始放电并积分（参见积分时间间隔1511、1512和1513）。

在行0的积分时间间隔1511结束之后，存储在行0中的每个单元的积分电容器608中的电压可以在时间1514由ADC 610读出。在读取行0之后，行1的积分时间间隔1512结束，并且存储在行1中的每个单元的积分电容器608中的电压可以在时间1515由ADC 610读出。类似地，随后的行被一个接一个地读出，直到在时间1516读出行63为止。

虽然对于不同的行的积分时间间隔的长度是不相同的（例如，1511，1512和1513的长度不同），当V_liq 1300在中间监视信号量值1424时，所有单元（不管它们所属的行）积分，同时V_liq量值保持在中间监视信号量值1424处。结果，不同行中的ADC输出具有较小的方差，从而降低了行依赖性效应。

然而，使用全局预充电信号1502的一个缺点是，当在1402和1403之间将全局预充电信号1502设置为高时，一组测序数据丢失。数据点1507是无效的，因为存储在单元库中所有单元的积分电容器608中的电压被预充电到V_pre电压水平。

图16图示了当V_liq将要切换到中间监视信号时，修改的全局预充电信号1602用于使单元库的不同行中的单元的积分同步。图15和图16是相似的，只是有一些区别：一个区别是对全局预充电信号1602的修改，这将在下面更详细地描述；另一个区别是，在图16中，可用于测序目的的数据点1607不再被全局预充电信号1602破坏。

全局预充电信号1602是用于控制单元库中所有单元上的开关601的预充电信号。相反，复位信号603是预充电信号，其用于控制单个单元或单元库的仅单个行中的单元中的开关601。如图16所示，全局预充电信号1602在时间1621处设置为高，这将闭合单元库的单元中的所有开关601，以使所有积分电容器608连接到电压源 V_pre 605且预充电至V_pre电压水平。全局预充电信号1602然后在时间1620被设置为低，这打开了单元库的单元中的所有开关601，使得所有积分电容器608从电压源V_pre 605 断开并且开始放电并在同一时间处积分（参见积分时间间隔1611、1612和1613）。

在行0的积分时间间隔1611结束之后，存储在行0中的每个单元的积分电容器608中的电压可以在时间1614由ADC 610读出。在读取行0之后，行1的积分时间间隔1612结束，并且存储在行1中的每个单元的积分电容器608中的电压可以在时间1615由ADC 610读出。类似地，随后的行被一个接一个地读出，直到在时间1616读出行63为止。

尽管不同行的积分时间间隔的长度不相同（例如1611、1612和1613的长度不同），但是当V_liq 1300处于中间监视信号量值1424时，所有单元（不管它们所属的行）积分，同时V_liq量值保持在中间监视信号量值1424。结果，不同行中的ADC输出具有较小的方差，从而降低了行依赖性效应。

另外，可用于测序目的的数据点1607不再被全局预充电信号1602破坏。全局预充电信号1602在时间1621（其在时间1622（在帧1402（监视电压阶跃之前的帧）期间的读出已经完成的时间）之后出现）被设置为高，从而保留对测序目的有用的数据点1607。然后在时间1620将全局预充电信号1602设置为低。在一些实施例中，时间1620与帧1403（V_liq 1300切换到中间监视量值1424时的帧）同时。在一些实施例中，时间1620与帧1403基本上在同一时间，或者紧接在帧1403之前或者紧接在帧1403之后。

图17A图示了脂质膜状态检测技术的行依赖性效应。在图17A中，该底部部分是当检测到破裂脂质双层时响应于在单元中监视到属于单元库的不同行的信号所观察到的电压变化ΔV_ADC的曲线图。在x轴上，行号0-63对应于单元库1中的行号0-63，行号64-127对应于单元库2中的行号0-63，行号128-191对应于单元库3中的行号0-63，以及行号192-255对应于单元库4中的行号0-63。在y轴上，以ADC计数绘制对监视信号的响应。如图17A的底部所示，响应信号随着行数的增加而逐渐增加。大多数响应信号的范围是约15到40个ADC计数。图17A的顶部是示出响应信号的分布的直方图。响应信号的范围是从0到约40个ADC计数。

图17B图示了通过使用图16中的全局预充电信号，行依赖性效应大大降低。在图17B中，该底部部分是当检测到破裂脂质双层时响应于在单元中监视到属于单元库的不同行的信号所观察到的电压变化ΔV_ADC的曲线图。在x轴上，行号0-63对应于单元库1中的行号0-63，行号64-127对应于单元库2中的行号0-63，行号128-191对应于单元库3中的行号0-63，以及行号192-255对应于单元库4中的行号0-63。在y轴上，以ADC计数绘制对监视信号的响应。如图17B的底部所示，响应信号仅随着行数的增加而稍微增加。大多数响应信号的范围是约40到60个ADC计数。图17B的顶部是示出响应信号的分布的直方图。响应信号的范围是从40到约60个ADC计数，其中大约50个ADC计数是最可能的ADC值。

图18A是当检测到破裂脂质双层时响应于在单元中监视到属于单元库的不同行的信号所观察到的电压变化ΔV_ADC的曲线图。图18B是示出当检测到破裂的脂质双层时响应信号的分布的直方图。图18C是当未检测到破裂的脂质双层时响应于在单元中监视到属于单元库的不同行的信号所观察到的电压变化ΔV_ADC的曲线图。图18D是示出当未检测到破裂的脂质双层时响应信号的分布的直方图。

如图18D 中所示，当未检测到破裂脂质双层时，响应信号范围是从0到约45 ADC计数；以及如图18B所示，当检测到破裂的脂质双层时，响应信号的范围为约55至120 ADC。由于两种脂质双层状况的响应信号范围彼此不重叠，因此可以使用检测技术可靠地确定脂质双层是完整还是破裂。

上述公开的检测技术具有许多优点。监视信号量值的选择与V_liq亮/暗量值的选择不挂钩。可以选择ADC参考窗口以增加用于核酸测序的信号的分辨率，而不会导致对监视信号的响应信号饱和。即使在测序阶段期间，该技术也可用于检测双层的状况。另外，当V_liq的调制频率超过100 Hz时，该技术可以可靠地检测双层的状况。

如上所述，当脂质溶剂混合物首先沉积到单元中以形成脂质双层时，一些单元具有自发形成的脂质双层，但是一些单元仅具有厚的脂质膜，其跨越单元的每个井具有多层与溶剂结合的脂质分子。为了增加基于纳米孔的测序芯片的产率（即，基于纳米孔的测序芯片中的具有适当形成的脂质双层和纳米孔的单元的百分比），基于纳米孔的测序芯片可以执行额外的步骤以在附加的单元中促进脂质双层的形成。例如，对尚未在其中形成脂质双层的单元施加电脂质减薄刺激，可以提高在厚脂质膜上方的液体流动效率，从而促进去除任何多余的脂质溶剂，从而使厚脂质膜可以减薄并更有效地转变为脂质双层。向尚未在其中形成脂质双层的单元施加电脂质减薄刺激，也会产生静电力，该静电力倾向于将多余的脂质溶剂挤出并将厚的脂质膜减薄成脂质双层。另一方面，已经在其中适当形成脂质双层的单元不应再暴露于相同的电脂质减薄刺激下，因为电刺激可能会导致一些薄的脂质双层分解。因此，使用本申请中描述的非破坏性技术来检测并分离基于纳米孔的测序芯片中具有在其中形成的脂质双层的单元部分与还不具有在其中适当形成的脂质双层的单元部分是有利的。通过将单元分为不同的组，可以对不同组中的单元进行不同的处理，从而实现更高的效率并提高基于纳米孔的测序芯片的总产率。

图19图示了用于在基于纳米孔的测序芯片的单元中形成脂质层的改进技术的过程1900的实施例。在一些实施例中，图19的基于纳米孔的测序芯片包括图1的多个单元100。在一些实施例中，图19的基于纳米孔的测序芯片包括图5的多个单元500。在一些实施例中，图19的基于纳米孔的测序芯片包括图6A和6B的电路600。

过程1900包括其中不同类型的流体（例如，液体或气体）经由流动室流过基于纳米孔的测序芯片的单元的步骤。具有明显不同的特性（例如，可压缩性，疏水性和粘度）的多种流体流过基于纳米孔的测序芯片表面上的传感器阵列。为了提高效率，阵列中的每个传感器都应以一致的方式暴露于流体中。例如，每种不同类型的流体应流过基于纳米孔的测序芯片，以使流体可以被输送到芯片，均匀地涂覆和接触每个单元的表面，然后被输送出芯片。如上所述，基于纳米孔的测序芯片并入了大量配置为阵列的传感器单元。随着基于纳米孔的测序芯片缩放到包括越来越多的单元，实现不同类型流体在芯片单元上的均匀流动变得更具挑战性。

在一些实施例中，执行图19的过程1900的基于纳米孔的测序系统包括具有蛇形流体流动通道的改进的流动室，其引导流体沿着通道的长度在芯片的不同传感器上穿过。图20图示了具有包围硅芯片的改进的流动室的基于纳米孔的测序系统2000的俯视图，该硅芯片允许液体和气体通过并接触芯片表面上的传感器。流动室包括蜿蜒的或弯曲的流动通道2008，其引导流体从芯片的一端到相对端在传感器库2006（每个库包括数千个传感器单元）的单列（或单行）的正上方流动，并且然后引导流体重复回环并在传感器库的其他相邻列的正上方流动，直到所有传感器库已被穿过了至少一次。如图20所示，系统2000包括入口2002和出口2004。

参考图20，流体通过入口2002被引导到系统2000中。入口2002可以是管或针。例如，管或针的直径可以为一毫米。并非将液体或气体直接馈入具有单个连续空间的宽流动室中，入口2002将液体或气体馈入蛇形流动通道2008中，该蛇形流动通道引导液体或气体在传感器库2006的单列的正上方流动。可以通过将顶板和具有分隔器2010的垫片堆叠在一起来形成蛇形通道2008，该分隔器将该腔室分成蛇形通道以形成流动池，并且然后将流动池安装在芯片的顶部。一旦液体或气体流过蛇形通道2008，液体或气体就被引导通过出口2004并离开系统2000。

系统2000允许流体更均匀地流过在所述芯片表面上的所有传感器的顶部。通道宽度被配置为足够窄，使得毛细管作用起效。更特别地，表面张力（这是由流体内的内聚力引起的）和流体与封闭表面之间的粘附力起到将流体保持在一起的作用，从而防止流体或气泡破裂并形成死区。例如，通道可具有1毫米或更小的宽度。窄的通道实现了流体的受控流动，并最小化以前的流体或气体流产生的残留物的量。

参考图19，在1902处，使盐/电解液缓冲溶液经由流动室流过基于纳米孔的测序芯片的单元，以用盐缓冲溶液基本上填充单元中的井。盐缓冲溶液可包括以下之一：氯化锂（LiCl），氯化钠（NaCl），氯化钾（KCl），谷氨酸锂，谷氨酸钠，谷氨酸钾，乙酸锂，乙酸钠，乙酸钾，氯化钙（CaCl₂），氯化锶（SrCl₂），氯化锰（MnCl₂）和氯化镁（MgCl₂）。在一些实施例中，盐缓冲溶液的浓度为300mM（毫摩尔）。

在1904处，脂质和溶剂混合物经由流动室流动通过基于纳米孔测序芯片的单元。在一些实施例中，脂质和溶剂混合物包括脂质分子，例如二植烷酰基磷脂酰胆碱（diphytanoylphosphatidylcholine）（DPhPC）。在一些实施例中，脂质和溶剂混合物包括癸烷或十三烷。当首先将脂质和溶剂混合物沉积到单元中以形成脂质双层时，一些单元会自发形成脂质双层，但一些单元仅具有跨越单元的每个井的厚的脂质膜（具有结合在一起的多层脂质分子和溶剂）。为了提高基于纳米孔的测序芯片的产率（即基于纳米孔的测序芯片中的具有适当形成的脂质双层和纳米孔的单元的百分比），基于纳米孔的测序芯片将反复经历两个阶段，即电脂质减薄刺激阶段和缓冲流动阶段，以促进在附加单元中形成脂质双层。

过程1900的电脂质减薄刺激阶段包括步骤1906、1908和1910。在一些实施例中，在该阶段期间，可以按照如图19所示的顺序执行步骤1906、1908和1910。在一些实施例中，步骤1906、1908和1910可以以不同的顺序执行。在一些实施例中，这些步骤可以同时执行。

在1906处，在本申请中描述的非破坏性技术被用来检测是否使用图6A和图6B的电路600在单元中形成脂质双层。所述检测包括响应于施加到与脂质膜/双层接触的主体液体的电压变化（ΔV_liq）来监视在积分电容器608（n_cap）处的电压变化ΔV_ADC。已检测到脂质双层的单元与未检测到脂质双层的单元分为不同的组。在检测到具有脂质双层的每个单元内，通过装置606被打开，以便使脂质双层和电极与测量电路600断开，从而使得不能将电脂质减薄刺激施加到单元上。

在1908处，将电脂质减薄刺激施加到基于纳米孔的测序芯片的单元上。对尚未在其中形成脂质双层的单元施加电脂质减薄刺激可以提高在厚脂质膜上的液体流动效率，从而有助于去除任何多余的脂溶剂，从而可以减薄厚脂质膜并更有效地转变为脂质双层。向尚未在其中形成脂质双层的单元施加电脂质减薄刺激，也会产生静电力，该静电力倾向于将多余的脂质溶剂挤出并将厚的脂质膜减薄成脂质双层。在一些实施例中，图6A和图6B的相同电路600可以用于施加电脂质减薄刺激。脂质双层检测和脂质减薄之间的电路600的设置的唯一区别是，对于脂质双层检测，V_liq的绝对量值较低。例如，用于脂质双层检测的绝对量值V_liq可以在100 mV至250 mV之间，而用于脂质减薄的绝对量值V_liq可以在250 mV至500mV之间。

在步骤1910，确定电脂质减薄刺激阶段是否结束。在一些实施例中，电脂质减薄刺激被施加到在两秒钟的时段内尚未检测到其中具有脂质双层的任何单元。但是，也可以使用其他预定时间段。如果该阶段尚未结束，则过程1900再次返回到步骤1906和1908，直到该时间段结束为止；否则，过程1900接下来进行到盐缓冲溶液流动阶段。

过程1900的盐缓冲溶液流动阶段包括步骤1912、1914和1916。在一些实施例中，在该阶段期间，可以按照如图19所示的顺序执行步骤1912、1914和1916。在一些实施例中，步骤1912、1914和1916可以以不同的顺序执行。在一些实施例中，这些步骤可以同时执行。

在1912，使用图6A和图6B的电路600，使用在步骤1906使用的相同的非破坏性技术来检测脂质双层是否在单元中形成。已检测到脂质双层的单元与未检测到脂质双层的单元分为不同的组。在检测到具有脂质双层的每个单元中，通过装置606被打开，以便使脂质双层和电极与测量电路600断开。

在1914，使盐/电解液缓冲溶液经由流动室流动通过基于纳米孔的测序芯片的单元。使盐缓冲溶液在单元上流动的目的是促进每个单元上的脂质双层的形成。当盐缓冲溶液在单元上流动时，沉积在单元上的脂质和溶剂混合物的厚度减小，从而有助于脂质双层的形成。

在1916，确定盐缓冲溶液流动阶段是否结束。在一些实施例中，盐缓冲溶液流动达两秒钟的时段。但是，也可以使用其他预定时间段。如果阶段还没有结束，则过程1900再次返回到步骤 1912和1914，直到该时间段结束为止；否则，过程1900进行到步骤1918。

在1918，确定是否应当重复过程1900的电脂质减薄刺激阶段和盐缓冲溶液流动阶段。在此步骤中可以使用不同的标准。在一些实施例中，电脂质减薄刺激阶段和盐缓冲溶液流动阶段被执行预定次数。在一些实施例中，重复两个阶段，直到已达到基于纳米孔的测序芯片的目标产率。在一些实施例中，如果在刺激的最后一轮减薄期间刚刚检测为具有形成的脂质双层的单元的增量数目或百分比和缓冲溶液流量低于预定阈值，则过程1000终止。在一些实施例中，重复两个阶段，直到最近施加的电脂质减薄刺激水平已达到预定的最大阈值（例如500mV）为止。

如果接下来将要重复过程1900的电脂质减薄刺激阶段和盐缓冲溶液流动阶段，则过程1900进行到步骤1920。在步骤1920，确定要施加的下一个电脂质减薄刺激。在一些实施例中，电脂质减薄刺激水平增加固定的预定量，例如100mV的增量。在一些实施例中，如果在最后一次迭代期间刚刚被检测为具有形成的脂质双层的单元的增量数目或百分比低于预定阈值，则电脂质减薄刺激水平被增加固定的预定量；否则，发现先前的电脂质减薄刺激是有效的，并且因此再次使用相同的电脂质减薄刺激水平。

图21A，21B和21C是直方图，它们图示了随着过程1900的电脂质减薄刺激阶段和盐缓冲溶液流动阶段重复多次，具有适当形成的脂质双层的基于纳米孔的测序芯片中单元的总体百分比（即，基于纳米孔的测序芯片的产率）增加。对于每一个图，x轴是响应于施加到与脂质膜/双层接触的主体液体的电压变化（ΔV_liq）的在积分电容器608（n_cap）上的电压变化ΔV_ADC，而y轴是其ΔV_ADC值在某些ΔV_ADC仓内的单元的数目。图21A图示了具有不同ΔV_ADC值的单元的初始分布。图21B图示了在过程1000的脂质减薄刺激阶段和盐缓冲溶液流动阶段已重复许多次后具有不同ΔV_ADC值的单元的分布。图21C图示了在过程1000的脂质减薄刺激阶段和盐缓冲溶液流动阶段已重复甚至更多次之后的具有不同ΔV_ADC值的单元的分布。在这个示例中，具有50或以上的ΔV_ADC值的单元被确定为具有形成于其中的脂质双层。如图21A所示，最初，仅少数单元具有检测到的脂质双层。如图21B所示，在已经多次重复过程1900的脂质减薄刺激阶段和盐缓冲溶液流动阶段之后，具有检测到的脂质双层的单元数目增加。最终，如图21C所示，在过程1900的脂质减薄刺激阶段和盐缓冲溶液流动阶段已经重复了甚至更多次之后，基于纳米孔的测序芯片中的大多数单元都具有检测到的脂质双层。

图22图示了用于双层测量阶段，电脂质减薄刺激阶段和盐缓冲溶液流动阶段的定时图的实施例。在这个示例中，在脂质沉积到单元中之后，双层测量阶段开始。双层测量阶段持续约2秒的时间。在此阶段期间启用所有单元。V_liq的绝对值为250 mV。

双层测量阶段之后是电脂质减薄刺激阶段，该阶段持续约2秒的时间。在这个阶段期间，当ΔV_ADC的绝对值（|ΔV_ADC |）超过单元内的阈值1时，则在单元内检测到脂质双层，并且从电压源断开单元。V_liq的绝对值在250-500 mV之间。

电脂质减薄刺激阶段之后是盐缓冲溶液流动阶段，并且后者持续约2 -10秒的时间。在这个阶段期间，当ΔV_ADC 的绝对值（|ΔV_ADC |）超过单元内的阈值2时，则在单元内检测到脂质双层，并且从电压源断开单元。V_liq的绝对值为250 mV。

虽然出于理解清晰的目的已对前述实施例做出了比较详细的描述，但是本发明并不局限于所提供的细节。存在实现本发明的许多替换方式。所公开的实施例是说明性的而不是限制性的。

Claims

1.一种检测基于纳米孔的测序芯片的单元中的脂质膜的状态的方法，包括：

将脂质膜与积分电容器耦合，其中脂质膜在工作电极和对电极之间；

向对电极施加交流（AC）电压；

通过模数转换器（ADC）周期性地对跨积分电容器的电压进行采样；

在AC电压的两个量值之间插入AC电压的中间变化；

响应于AC电压的中间变化，确定跨积分电容器的采样电压的变化；以及

响应于AC电压的中间变化，基于所确定的跨积分电容器的采样电压的变化来检测脂质膜的状态。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括：当AC电压从第一阶段切换到第二阶段时或当AC电压从第二阶段切换到第一阶段时，响应于AC电压的中间变化，确定跨积分电容器的采样电压的变化，其中AC电压的第一阶段量值大于AC电压的第二阶段量值。

3.根据权利要求2所述的方法，还包括：当AC电压从第一阶段切换到第二阶段时或当AC电压从第二阶段切换到第一阶段时，响应于AC电压的中间变化，确定跨积分电容器的采样电压的变化，其中第一阶段包括正方波，并且第二阶段包括负方波。

4.根据权利要求2所述的方法，还包括：当AC电压处于中间监视量值时，响应于AC电压的中间变化，确定跨积分电容器的采样电压的变化，其中，所述中间监视量值小于所述第一阶段量值，但大于第二阶段量值。

5.根据权利要求4所述的方法，还包括至少部分地基于所述ADC的ADC参考窗口来选择所述中间监视量值。

6.根据权利要求4所述的方法，还包括：

将跨积分电容器的采样电压的变化与一个或多个预定阈值进行比较，以及

基于与一个或多个预定阈值的比较，检测脂质膜的状态，其中脂质膜的状态选自以下各项组成的组：具有两个以上脂质分子层的脂质膜，脂质双层和破裂的脂质双层。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述单元是基于纳米孔的测序芯片中的多个单元之一，并且其中，所述方法还包括：

通过使用全局预充电信号将积分电容器连接到恒定的预充电电压源来对积分电容器进行预充电，其中全局预充电信号用于控制多个单元中积分电容器的预充电的定时；

在将积分电容器充电至恒定的预充电电压源值之后，使用全局预充电信号将预充电电压源与积分电容器断开连接，其中，全局预充电信号用于控制从多个单元中的积分电容器断开预充电电压源的连接的定时；

等待预定时间段以便使积分电容器通过与脂质双层相关的电容充电或放电；以及

在预定的等待时段之后，对跨积分电容器的电压进行采样。

8.根据权利要求1所述的方法，还包括：

响应于检测到脂质双层已破裂，通过打开单元中的开关，使不能跨脂质双层施加进一步的电刺激。

9.一种用于检测基于纳米孔的测序芯片的单元中脂质膜的状态的系统或仪器，包括：

积分电容器；

工作电极，其耦合到积分电容器；

对电极，其中沉积在工作电极和对电极之间的脂质膜与积分电容器耦合；

向对电极施加交流（AC）电压的AC电压源；

模数转换器（ADC），其周期性地对跨积分电容器的电压进行采样；以及

处理器或电路，其被配置为：

在AC电压的两个量值之间插入AC电压的中间变化；

10.根据权利要求9所述的系统或仪器，其中，所述处理器或电路还被配置为：

当AC电压从第一阶段切换到第二阶段时或当AC电压从第二阶段切换到第一阶段时，响应于AC电压的中间变化，确定跨积分电容器的采样电压的变化，其中，AC电压的第一阶段量值大于AC电压的第二阶段量值。

11.根据权利要求10所述的系统或仪器，其中，所述处理器或电路还被配置为：

当AC电压从第一阶段切换到第二阶段时或当AC电压从第二阶段切换到第一阶段时，响应于AC电压的中间变化，确定跨积分电容器的采样电压的变化，其中第一阶段包括正方波，并且第二阶段包括负方波。

12.根据权利要求10所述的系统或仪器，其中，所述处理器或电路还被配置为：

当AC电压处于中间监视量值时，响应于AC电压的中间变化，确定跨积分电容器的采样电压的变化，其中，中间监视量值小于第一阶段量值但大于第二阶段量值。

13.根据权利要求12所述的系统，其中，所述处理器或电路还被配置为：

至少部分基于ADC的ADC参考窗口选择中间监视量值。

14.根据权利要求12所述的系统或仪器，其中，所述处理器或电路还被配置为：

将跨积分电容器的采样电压的变化与一个或多个预定阈值进行比较；

15.根据权利要求12所述的系统或仪器，其中，所述单元是基于纳米孔的测序芯片中的多个单元之一，还包括：

恒定的预充电电压源；

其中所述处理器或电路还被配置为：

等待预定时间段，以便使积分电容器通过与脂质双层相关的电容充电或放电；以及

在预定的等待时段之后，使ADC对跨积分电容器的电压进行采样。

16.根据权利要求12所述的系统或仪器，还包括：

单元中由处理器或电路控制的开关；

其中所述处理器或电路还被配置为：

响应于检测到脂质双层已经破裂，通过打开单元中的开关，禁止跨脂质双层施加进一步的电刺激。