CN113767280A - 利用渗透失衡在膜中插入纳米孔的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于在覆盖孔的膜中插入纳米孔的系统和方法。通过建立跨所述膜的渗透梯度而使所述膜向外弯曲，以便驱动流体进入所述孔中，这会增加所述孔中流体的量并使得所述膜向外弯曲。然后便可在弯曲的膜上启动纳米孔插入。

Description

利用渗透失衡在膜中插入纳米孔的系统和方法

背景技术

基于纳米孔的测序芯片是一种可用于 DNA 测序的分析工具。此类装置可以包含大量配置为阵列的传感器单元。例如，测序芯片可以包括一百万个单元的阵列，例如具有1000 行乘 1000 列的单元。阵列的每个单元可包括膜和蛋白质孔，该蛋白质孔具有内径为一纳米等级的孔径。这种纳米孔已被证明在快速核苷酸测序中有效。

当在浸入导电流体中的纳米孔上施加电压电位时，可能存在因离子跨所述纳米孔的传导而产生的小离子电流。电流的大小对孔径和位于纳米孔内的分子类型敏感。分子可以是附着到特定核苷酸的特定标签，从而可以检测核酸特定位置处的核苷酸。可测量包含纳米孔的电路中的电压或其他信号（例如，在集成电容器上）以作为测量分子的电阻的方式，从而可以检测哪些分子在纳米孔中。

其中一个挑战是增加阵列中具有膜且在膜中布置有单孔的单元的产率。通常，阵列中仅有一部分可用单元将具有单孔膜并且适用于测序。

因此，需要改善在膜中插入孔的能力并提高具有膜和单孔的单元的产率。

发明内容

各种实施例提供与在膜中插入纳米孔相关的技术和系统。

根据一个实施例，提供一种在膜中插入纳米孔的方法。所述方法包括：用具有第一渗透压的第一缓冲剂填充孔的孔贮存器，所述孔包含工作电极，其中所述孔是流动池中孔阵列的一部分；在所述孔的上方形成膜以将所述第一缓冲剂包封在所述孔贮存器内；使具有第二渗透压的第二缓冲剂在所述膜的上方流动，使得所述膜位于所述第一缓冲剂与所述第二缓冲剂之间，其中所述第一缓冲剂相比所述第二缓冲剂具有较高的渗透压；由于来自所述第二缓冲剂的流体跨所述膜扩散至所述第一缓冲剂中，使所述膜向外弯曲并远离所述工作电极；以及在向外弯曲的膜中插入纳米孔。

在一些实施例中，所述第二渗透压减去所述第一渗透压得到负值并且量级为至少10 mOsm/kg。在一些实施例中，所述第二渗透压减去所述第一渗透压得到负值并且量级为至少 50 mOsm/kg。在一些实施例中，所述第二渗透压减去所述第一渗透压得到负值并且量级为至少 100 mOsm/kg。在一些实施例中，所述第二渗透压减去所述第一渗透压得到负值并且量级为至少 150 mOsm/kg。

在一些实施例中，所述膜包含脂质。在一些实施例中，所述膜包含三嵌段共聚物。

在一些实施例中，形成所述膜的步骤包括使溶解在溶剂中的膜材料在所述孔的上方流动。在一些实施例中，使所述第二缓冲剂流动的步骤包括用所述第二缓冲剂置换所述流动池中的所述膜材料和溶剂以在所述孔的上方留下膜材料层。在一些实施例中，通过所述第二缓冲剂在所述膜材料层的上方的流动而将所述膜材料层减薄成所述膜。在一些实施例中，通过使用所述工作电极对所述膜材料层施加电压刺激而将所述膜材料层减薄成所述膜。

在一些实施例中，所述第二缓冲剂包含多个纳米孔。在一些实施例中，每个纳米孔是分子复合物的一部分，所述分子复合物包含纳米孔、拴接至所述纳米孔的聚合酶和与所述聚合酶缔合的核酸。

在一些实施例中，在所述膜中插入所述纳米孔的步骤包括使包含所述纳米孔的第三缓冲剂在所述膜的上方流动。在一些实施例中，所述第三缓冲剂与所述第二缓冲剂具有相同的渗透压。在一些实施例中，所述第三缓冲剂与所述第二缓冲剂具有不同的渗透压。

在一些实施例中，所述方法进一步包括用所述工作电极测量电信号以检测所述膜中的纳米孔插入。

根据另一个实施例，提供了一种用于在膜中插入纳米孔的系统。所述系统包含：流动池，所述流动池包含孔阵列，每个孔包含孔贮存器和工作电极；第一流体贮存器，其包含具有第一渗透压的第一缓冲剂；第二流体贮存器，其包含具有第二渗透压的第二缓冲剂，其中所述第一缓冲剂相比所述第二缓冲剂具有较高的渗透压；第三流体贮存器，其包含溶解在溶剂中的膜材料；第四流体贮存器，其包含第三缓冲剂和多个纳米孔；泵，其配置为与所述流动池、所述第一流体贮存器、所述第二流体贮存器和所述第三流体贮存器流体连通；以及控制器，其编程为：将所述第一缓冲剂泵入所述流动池中以用所述第一缓冲剂填充至少一个孔贮存器；将溶解在所述溶剂中的所述膜材料泵入所述流动池中以将所述第一缓冲剂从所述流动池中置换，同时将所述第一缓冲剂留在所述孔贮存器中；将所述第二缓冲剂泵入所述流动池中以将所述膜材料和溶剂从所述流动池中置换，从而在所述孔的上方留下膜材料层；通过驱动所述第二缓冲剂在所述膜材料层的上方流动和/或通过向所述膜材料层施加电压而将所述膜材料层减薄成膜；等候一段时间，待减薄的膜向外弯曲远离所述工作电极；以及将具有所述多个纳米孔的所述第三缓冲剂泵入所述流动池中，以在所述向外弯曲的膜中插入纳米孔。在一些实施例中，所述控制器进一步编程为通过用所述工作电极测量电信号以检测所述膜中的纳米孔插入。

在一些实施例中，所述第二渗透压减去所述第一渗透压得到负值并且量级为至少10 mOsm/kg。在一些实施例中，所述第二渗透压减去所述第一渗透压得到负值并且量级为至少 50 mOsm/kg。在一些实施例中，所述第二渗透压减去所述第一渗透压得到负值并且量级为至少 100 mOsm/kg。在一些实施例中，所述第二渗透压减去所述第一渗透压得到负值并且量级为至少 150 mOsm/kg。

在一些实施例中，所述一段时间是预先确定的。在一些实施例中，所述一段时间由所述控制器确定，所述控制器进一步编程为用所述工作电极测量电信号以检测所述膜的弯曲。在一些实施例中，所述电信号是所述膜的电容和/或电阻。

其他实施例涉及与本文描述的方法相关联的系统和计算机可读介质。

参考以下具体实施方式和附图，可以更好地理解本发明的实施例的性质和优点。

附图说明

图 1 是具有纳米孔单元阵列的纳米孔传感器芯片的实施例的俯视图。

图 2 示出可以用于表征多核苷酸或多肽的纳米孔传感器芯片中的纳米孔单元的实施例。

图 3 示出使用基于纳米孔的边合成边测序 (Nano-SBS) 技术执行核苷酸测序的纳米孔单元的实施例。

图 4 示出纳米孔单元中的电路的实施例。

图 5 显示在 AC 循环的亮时段和暗时段期间从纳米孔单元捕获的数据点实例。

图 6A 示出在根据实施例的方法的时间 t₁，在基于纳米孔的测序芯片的单元中跨孔的脂质双层中插入初始纳米孔。

图 6B 示出在时间 t₂，具有比孔溶液的渗透度更低的渗透度的第一电解质溶液流入孔外部的贮存器中，使得水从孔流入外部贮存器。

图 6C 示出在时间 t₃，脂质双层的形状已经变为足以排出初始纳米孔的程度。

图 6D 示出在时间 t₄，具有置换纳米孔和与初始孔溶液的渗透度相同或类似的渗透度的第二电解质溶液流入孔外部的贮存器中，使得水从外部贮存器流入单元。

图 6E 示出在时间 t₅，脂质双层的形状已经基本上恢复到原来的形态。

图 6F 示出在时间 t₆，已在脂质双层中插入置换孔。

图 7 是根据实施例的用于置换膜中纳米孔的过程的流程图。

图 8 是根据本公开的某些方面的流动体系。

图 9A 是在无需应用孔置换方法的情况下，绘制基于纳米孔的测序芯片的单元的两个独立 k_fc 值测量结果之间关系的图。

图 9B 是根据两个测量结果之间的实施例，在应用孔置换方法的情况下绘制基于纳米孔的测序芯片的单元的两个独立 k_fc 值测量结果之间关系的图。

图 10A 是在纳米孔没有排出和置换的情况下，绘制测序单元的 ADC 计数随时间变化的图。

图 10B 是根据实施例的纳米孔排出和置换的情况下，绘制测序单元的 ADC 计数随时间变化的图。

图 11 示出根据本公开某些方面的计算机系统。

图 12A 至图 12C 示出如何利用渗透失衡使覆盖孔的膜向内或向外弯曲。

图 13 总结了图 12A 至图 12C 中所示的各种渗透势差的影响。

图 14 总结了渗透势 δ 在通过大量实验观察到的各类产率上的一般趋势。

图 15 至图 18 示出各种表明 Δosmo 对孔产率的影响的实验数据。

具体实施方式

术语

除非另有定义，否则本文所用的科学技术术语具有如本领域的普通技术人员通常理解的相同意义。与本文所述的方法、装置和材料类似或等效的方法、装置和材料均可用于所公开技术的实践中。提供以下术语旨在有利于理解频繁使用的一些术语，并无限制本公开范围之意。本文中使用的缩写在化学和生物领域中具有其常规含义。

“纳米孔”指在膜中形成或以其他方式提供的孔、通道或通路。膜可以是有机膜，诸如脂质双层，或合成膜，诸如由聚合材料形成的膜。纳米孔可以设置成邻近或接近于传感电路或耦合至传感电路的电极，诸如，例如，互补金属氧化物半导体 (CMOS) 或场效应晶体管(FET) 电路。在一些实例中，纳米孔具有 0.1 纳米 (nm) 至约 1000 nm 等级的特征宽度或直径。在一些实施例中，纳米孔可以是蛋白质。

“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，这些核苷酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，它们具有与参考核酸相似的结合特性，并且其以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的示例包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酰胺、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸 (PNA)。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体（例如，简并密码子替换）和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子替换可通过产生序列来实现，其中一个或多个所选（或全部）密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基所取代 (Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。

除非上下文另外明确指出，否则术语“核苷酸”除了指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体外，还可理解为是指其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其在使用该核苷酸的特定情况下（例如，与互补碱基杂交）在功能上是等同的。

术语“标签”指可检测部分，所述可检测部分可以是原子或分子，或者是原子或分子的集合。标签可以提供光学、电化学、磁性或静电（例如，感应、电容）标记，所述标记可以借助纳米孔来检测。通常，当核苷酸附着到标签上时，所述核苷酸被称为“带标签的核苷酸”。所述标签可以通过磷酸部分附着到核苷酸上。

术语“模板”指复制到 DNA 核苷酸的互补链中用于 DNA 合成的单链核酸分子。在一些情况下，模板可以指在 mRNA 合成期间复制的 DNA 序列。

术语“引物”指为 DNA 合成提供起点的短核酸序列。催化 DNA 合成的酶（诸如DNA 聚合酶）可以添加新的核苷酸至引物以用于 DNA 复制。

“聚合酶”指一种执行模板导向多核苷酸合成的酶。该术语涵盖全长多肽和具有聚合酶活性的结构域。DNA 聚合酶为本领域技术人员熟知的，包括但不限于从强烈火球菌、嗜 热高温球菌和海栖热袍菌分离或衍生的 DNA 聚合酶或其修饰形式。此类聚合酶包括 DNA依赖性聚合酶和 RNA 依赖性聚合酶，诸如逆转录酶。目前已知的 DNA 依赖性聚合酶至少有 5 个家族，但是大多数 DNA 聚合酶属于 A、B 和 C 家族，不同家族之间的序列相似性很小，甚至没有。大多数 A 家族聚合酶是单链蛋白质，可包含多种酶功能，包括聚合酶、3'至 5' 核酸外切酶活性和 5' 至 3' 核酸外切酶活性。B 家族聚合酶通常有一个单一的催化结构域，所述催化结构域具有聚合酶和 3' 至 5' 核酸外切酶活性，以及辅助因子。C 家族聚合酶通常是具有聚合和 3' 至 5' 核酸外切酶活性的多亚基蛋白质。在大肠杆菌中发现了三种类型的 DNA 聚合酶：DNA 聚合酶 I（A 家族）、DNA 聚合酶 II（B 家族）和 DNA 聚合酶 III（C 家族）。在真核细胞中，三种不同的 B 家族聚合酶，即 DNA 聚合酶 α、β 和 ε与核复制有关，以及 A 家族聚合酶，即聚合酶 γ 用于线粒体DNA复制。其他类型的 DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。类似地，RNA 聚合酶通常包括真核 RNA 聚合酶 I、II 和 III、细菌 RNA 聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA 聚合酶可以是 DNA 依赖性的，也可以是非 RNA 依赖性的。

术语“亮时段”通常指带标签的核苷酸的标签通过 AC 信号施加的电场而被迫进入纳米孔时的时间段。术语“暗时段”通常指带标签的核苷酸的标签通过 AC 信号施加的电场被推出纳米孔时的时间段。AC 循环可以包括亮时段和暗时段。在不同的实施例中，施加至纳米孔单元以将纳米孔单元置于亮时段（或暗时段）的电压信号的极性可以不同。

术语“信号值”指从测序单元输出的测序信号的值。根据某些实施例，测序信号是从一个或多个测序单元的电路中的点测量和/或输出的电信号，例如，信号值是（或表示）电压或电流。信号值可以表示电压和/或电流的直接测量结果和/或可以表示间接测量结果，例如，信号值可以是电压或电流达到指定值所需的测量持续时间。信号值可以表示与纳米孔的电阻率相关的任何可测量的量，并且可以从这些量中导出纳米孔（穿线和/或未穿线）的电阻率和/或电导率。作为另一个实例，信号值可以对应于光强度，例如，来自通过聚合酶添加到核酸上的附着到核苷酸的荧光团。

术语“渗透度”，也称为渗透浓度，指溶质浓度的量度。渗透度测量每单位体积溶液中溶质粒子的渗透压摩尔数量。渗透压摩尔是溶质摩尔数量的量度，所述溶质摩尔对溶液的渗透压力起作用。渗透度可实现测量溶液的渗透压力和测定溶剂如何沿分离两种不同渗透浓度的溶液的半透膜（渗透）扩散。

术语“渗透物”指任何可溶性化合物，所述可溶性化合物当溶解到溶液中时会增加所述溶液的渗透度。

根据某些实施例，本文公开的技术和系统涉及在膜，例如脂质双层膜中去除和插入孔。在诸如使用基于纳米孔的测序芯片的 DNA 测序的应用中，无需重塑膜双层便可除去和置换聚合酶-孔复合物的能力可以提高分析物通量。然而，标准的孔去除方法，例如主要涉及流体静力或电动势的方法，通常使得膜破裂或破坏。此外，此类膜的重塑涉及几个额外的步骤，这增加了过程的复杂性，并降低了效率。

为解决此类问题，本文提供的方法可用于无损地改变膜（例如，脂质双层）的形状直至插入所述膜内的孔不再稳定，并且自动排出。膜的这种变形是通过用渗透度与原始溶液不同的新溶液置换膜一侧的原有溶液来实现的。在所述孔排出后，可以恢复溶液的初始渗透条件，使得膜恢复至其初始形状而不会使得其破损。然后便可在所述膜中插入新孔以置换已移除的孔。由于该方法的体积和浓度尺度，从膜中移除并排出的孔重新插入同一膜中的可能性几近为零。本文公开的孔交换技术一般可用于增加单分子传感器阵列的通量，特别是纳米孔碱基测序芯片的通量。

首先描述了实例纳米孔系统、电路和测序操作，之后描述了用于置换 DNA 测序单元中纳米孔的实例技术。本发明的实施例可以以多种方式实现，包括作为过程，系统和在计算机可读存储介质和/或处理器上体现的计算机程序产品，诸如被配置为执行存储在耦合到处理器的存储器上和/或由所述存储器提供的指令的处理器。

I 基于纳米孔的测序芯片

图 1 是具有纳米孔单元 150 的阵列 140 的纳米孔传感器芯片 100 的实施例的俯视图。每个纳米孔单元 150 包括集成在纳米孔传感器芯片 100 的硅基底上的控制电路。在一些实施例中，侧壁 136 包括在阵列 140 中以分隔纳米孔单元150的组，使得每组可以接收用于表征的不同样本。每个纳米孔单元可用于核酸测序。在一些实施例中，纳米孔传感器芯片 100 包括盖板 130。在一些实施例中，纳米孔传感器芯片 100 还包括与诸如计算机处理器的其他电路相连接的多个管引脚 110。

在一些实施例中，纳米孔传感器芯片 100 包括同一封装中的多个芯片，例如多芯片模块 (MCM) 或系统级封装 (SiP)。芯片可以包括例如存储器、处理器、现场可编程门阵列 (FPGA)、专用集成电路 (ASIC)、数据转换器、高速 I/O 接口等。

在一些实施例中，纳米孔传感器芯片 100 耦合至（例如，对接至）纳米芯片工作站120，该纳米芯片工作站可以包括用于执行（例如，自动执行）本文公开的过程中的各种实施例的各种组件。此类过程可包括，例如，分析物输送机构，诸如用于输送脂质悬浮液或其他膜结构悬浮液、分析物溶液和/或其他液体、悬浮液或固体的移液器。纳米芯片工作站组件还可包括机器臂，一个或多个计算机处理器和/或存储器。在纳米孔单元 150 的阵列 140上可以检测到多个多核苷酸。在一些实施例中，每个纳米孔单元 150 是可以单独寻址的。

II 纳米孔测序单元

纳米孔传感器芯片 100 中的纳米孔单元 150 可以以许多不同的方式实现。例如，在一些实施例中，不同尺寸和/或化学结构的标签附着到待测序的核酸分子中的不同核苷酸。在一些实施例中，待测序的核酸分子的模板的互补链可以通过使带不同聚合物标签的核苷酸与模板杂交来合成。在一些实施方式中，核酸分子和附着的标签两者可以移动通过纳米孔，并且由于附着到核苷酸的标签的特定尺寸和/或结构，因此流过纳米孔的离子电流可以指示纳米孔中的核苷酸。在一些实施方式中，仅标签移入纳米孔中。也可以有许多不同的方式来检测纳米孔中的不同标签。

A. 纳米孔测序单元结构

图 2 示出可以用于表征多核苷酸或多肽的纳米孔传感器芯片中的实例纳米孔单元 200 的实施例，诸如在图 1 的纳米孔传感器芯片 100 中的纳米孔单元 150。纳米孔单元 200 可以包括由介电层 201 和 204 形成的孔 205；在孔 205 上方形成的膜，诸如脂质双层 214；以及在脂质双层 214 上并通过脂质双层 214 与孔 205 分离的样品室 215。孔 205 可以包含一定体积的电解质 206，并且样品室 215 可以容纳包含纳米孔的主体电解质 208，例如，可溶性蛋白纳米孔跨膜分子复合物 (PNTMC)，以及目标分析物（例如，待测序的核酸分子）。

纳米孔单元 200 可以包括位于孔 205 底部的工作电极 202 和设置在样品室215 中的对电极 210。信号源 228 可以在工作电极 202 与对电极 210 之间施加电压信号。单个纳米孔（例如，PNTMC）可以通过由电压信号引起的电穿孔工艺插入脂质双层 214中，从而在脂质双层 214 中形成纳米孔 216。阵列中的单个膜（例如，脂质双层 214 或其他膜结构）可以彼此既不化学连接也不电连接。因此，阵列中的每一个纳米孔单元可以是独立的测序仪，产生与纳米孔相关的单个聚合物分子所特有的数据，所述纳米孔对目标分析物起作用，并调节通过其他不可透过的脂质双层的离子电流。

如图 2 所示， 纳米孔单元 200 可以在基底 230 （诸如硅基底）上形成。介电层201 可以在基底 230 上形成。用于形成介电层 201 的介电材料可以包括，例如，玻璃、氧化物、氮化物等。用于控制电刺激并用于处理从纳米孔单元 200 检测到的信号的电路 222可以在基底 230 上和/或在介电层 201 内形成。例如，多个图案化的金属层（例如，金属 1至金属 6）可以在介电层 201 中形成，并且多个有源装置（例如，晶体管）可以在基底 230上制造。在一些实施例中，信号源 228 被包括作为电路 222 的一部分。电路 222 可以包括，例如，放大器、积分器、模数转换器、噪声滤波器、反馈控制逻辑和/或各种其他部件。电路 222 还可以耦合至处理器 224，所述处理器 224 耦合至存储器 226，其中处理器 224可以分析测序数据以确定已在阵列中测序的聚合物分子的序列。

工作电极 202 可以在介电层 201 上形成，并且可以形成孔 205 的底部的至少一部分。在一些实施例中，工作电极 202 是金属电极。对于非法拉第传导，工作电极 202可以由抗腐蚀和抗氧化的金属或其他材料制成，例如，铂、金、氮化钛和石墨。例如，工作电极 202 可以是具有电镀铂的铂电极。在另一个实例中，工作电极 202 可以是氮化钛(TiN) 工作电极。工作电极 202 可以是多孔的，从而增加其表面积以及与工作电极 202相关的产生的电容。因为纳米孔单元的工作电极可以不依赖于另一纳米孔单元的工作电极，所以在本公开中，该工作电极可以称为单元电极。

介电层 204 可以在介电层 201 之上形成。介电层 204 形成环绕阱 205 的壁。用于形成介电层 204 的介电材料可以包括，例如，玻璃、氧化物、一氮化硅 (SiN)、聚酰亚胺或其他合适的疏水绝缘材料。介电层 204 的顶表面可以硅烷化。硅烷化可以在介电层204 的顶表面之上形成疏水层 220。在一些实施方案中，疏水层 220 具有约 1.5 纳米(nm) 的厚度。

由介电层壁 204 形成的孔 205 包括工作电极 202 之上的电解质 206 的体积。电解质 206 的体积可以缓冲，并且可以包括以下项的一种或多种：氯化锂 (LiCl)、氯化钠(NaCl)、氯化钾 (KCl)、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙(CaCl₂)、氯化锶 (SrCl₂)、氯化锰 (MnCl₂) 和氯化镁 (MgCl₂)。在一些实施例中，电解质206 的体积具有约 3 微米 (µm) 的厚度。

同样如图 2 所示，可以在介电层 204 的顶部上形成膜并跨过孔 205。在一些实施例中，膜可包括在疏水层 220 的顶部上形成的脂质单层 218。当膜到达孔 205 的开口时，脂质单层 208 可以转变为跨孔 205 的开口的脂质双层 214。脂质双层可以包括磷脂或由其组成，例如，选自二植烷酰基-磷脂酰胆碱 (DPhPC)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-O-植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DoPhPC)、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱 (POPC)、二油酰基-磷脂酰-甲基酯 (DOPME)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱 (DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、鞘磷脂、1,2-二-O-植烷酰基-sn-甘油、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-350]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-550]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-750]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-乳糖酰基、GM1 神经节苷脂、溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 或其任意组合。

如所示，脂质双层 214 嵌有单个纳米孔 216，所述纳米孔例如由单个PNTMC 形成。如上所述，纳米孔 216 可以通过电穿孔将单个 PNTMC 插入脂质双层 214 中形成。纳米孔 216 可以足够大以使至少一部分目标分析物和/或小离子（例如，Na⁺、K⁺、Ca²⁺、CI^-）在脂质双层 214 的两侧之间通过。

样品室 215 位于脂质双层 214 上方，并且可以容纳目标分析物的溶液以用于表征。所述溶液可以是含有主体电解质 208 的水溶液，并缓冲至最佳离子浓度且维持在最佳pH 以保持纳米孔 216 开放。纳米孔 216 穿过脂质双层 214，并且为从主体电解质 208至工作电极 202 的离子流动提供唯一路径。除纳米孔（例如，PNTMC）和目标分析物之外，主体电解质 208 还可以包括以下项的一种或多种：氯化锂 (LiCl)、氯化钠 (NaCl)、氯化钾(KCl)、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙 (CaCl₂)、氯化锶(SrCl₂)、氯化锰 (MnCl₂) 和氯化镁 (MgCl₂)。

对电极 (CE) 210 可以是电化学电位传感器。在一些实施例中，对电极 210 在多个纳米孔单元之间共享，并且因此可以称为共用电极。在一些情况下，共用电位和共用电极可以为特定分组内的所有纳米孔单元或至少所有纳米孔单元所共用。共用电极可以被配置为向与纳米孔 216 接触的主体电解质 208 施加共用电位。对电极 210 和工作电极 202可以耦合至信号源 228，以提供跨脂质双层 214 的电刺激（例如，电压偏置），并且可以用于感测脂质双层 214 的电特性（例如，电阻、电容和离子电流）。在一些实施例中，纳米孔单元 200 还可包括参考电极 212。

在一些实施例中，作为校准的一部分，在创建纳米孔单元期间进行各种检查。一旦纳米孔单元创建，可以执行进一步的校准步骤，例如，以识别性能符合期望的纳米孔单元（例如，单元中的一个纳米孔）。此类校准检查可以包括物理检查、电压校准、开放通道校准以及具有单个纳米孔的单元识别。

B. 纳米孔测序单元的检测信号

纳米孔传感器芯片中的纳米孔单元，诸如纳米孔传感器芯片 100 中的纳米孔单元 150，可以使用基于单分子纳米孔的边合成边测序 (Nano-SBS) 技术进行平行测序。

图 3 示出使用 Nano-SBS 技术执行核苷酸测序的纳米孔单元 300 的实施例。在Nano-SBS 技术中，可以将待测序的模板 332（例如，核苷酸分子或另一目标分析物）和引物引入纳米孔单元 300 样品室中的主体电解质 308 中。作为实例，模板 332 可以呈圆形或线形。核酸引物可以与模板 332 的一部分杂交，可以该模板的一部分添加四种带不同聚合物标签的核苷酸 338。

在一些实施例中，酶（例如，聚合酶 334，诸如 DNA 聚合酶）与纳米孔 316 缔合，以用于合成模板 332 的互补链。例如，聚合酶 334 可以共价附着到纳米孔 316。聚合酶334 可以使用单链核酸分子作为模板以催化核苷酸 338 掺入到引物上。核苷酸 338 可以包括标签种类（“标签”），其中核苷酸是四种不同类型中的一种：A、T、G 或 C。当带标签的核苷酸与聚合酶 334 正确复合时，可以通过电动力将标签拉到（例如，负载）到纳米孔中，诸如在电场作用下产生的力，所述电场由跨脂质双层 314 和/或纳米孔 316 施加的电压生成。标签尾可以位于纳米孔 316 的筒体中。由于标签的独特的化学结构和/或尺寸，保持在纳米孔 316 的筒体中的标签可以生成独特的离子阻断信号 340，从而电子识别标签所附着到的添加碱基。

如本文所用，“负载的”或“穿线的”标签可以是定位在纳米孔中和/或保持在纳米孔中或附近相当长的时间，例如，0.1 毫秒 (ms) 至 10000 ms。在一些情况下，标签在从核苷酸释放之前被负载在纳米孔中。在一些情况下，在核苷酸掺入事件释放后，负载的标签穿过纳米孔（和/或被其检测）的概率适当较高，例如，90% 至 99%。

在一些实施例中，在将聚合酶 334 连接至纳米孔 316 之前，纳米孔 316 具有高电导，例如，约 300 皮西门子 (300 pS)。当标签负载在纳米孔中时，由于标签的独特的化学结构和/或尺寸，生成独特的电导信号（例如，信号 340）。例如，纳米孔的电导可以为约60 pS、80 pS、100 pS 或 120 pS，各自对应于四种带标签的核苷酸中的一种。然后，聚合酶可以进行异构化和转磷酸化反应以将核苷酸掺入到正在生长的核酸分子中并释放标签分子。

在一些情况下，一些带标签的核苷酸可以与核酸分子（模板）的当前位置不匹配（互补碱基）。不与核酸分子碱基配对的带标签的核苷酸也可以穿过纳米孔。这些未配对的核苷酸可以在比正确配对的核苷酸保持与聚合酶缔合的时间范围更短的时间范围内被聚合酶拒绝。与未配对核苷酸结合的标签可以快速穿过纳米孔，并在短时间内（例如，少于 10ms）检出，而与配对核苷酸结合的标签可以负载到纳米孔中并在长时间内（例如，至少 10ms）检出。因此，未配对的核苷酸可以由下游处理器至少部分地基于在纳米孔中检测核苷酸的时间来进行识别。

包括负载的（穿线的）标签的纳米孔的电导（或等效电阻）可以通过信号值（例如，流过纳米孔的电压或电流）来进行测量，从而提供标签种类的识别，并由此提供当前位置的核苷酸的识别。在一些实施例中，直流 (DC) 信号施加至纳米孔单元（例如，使得标签移动穿过纳米孔的方向不是反向的）。但是，使用直流电长时间操作纳米孔传感器可以改变电极的组成，使穿过纳米孔的离子浓度失衡，并产生其他不期望的效果，从而影响纳米孔单元的寿命。施加交流 (AC) 波形可以减少电迁移，从而避免这些不期望的效果，并具有如下所述的某些优点。本文所述的利用带标签的核苷酸的核酸测序方法与施加的 AC 电压完全兼容，因此 AC 波形可用于实现这些优点。

当使用牺牲电极，即在载流反应中改变分子特性的电极（例如，含银电极），或在载流反应中改变分子特性的电极时，在 AC 检测循环期间对电极再充电的能力可能有利。当使用直流信号时，电极可以在检测周期中耗尽。再充电可以防止电极达到耗尽极限，诸如变得完全耗尽，这在电极较小时（当电极足够小以提供具有每平方毫米至少 500 个电极的电极阵列时）可能会出现问题。在一些情况下，电极寿命与电极的宽度成比例，并且至少部分取决于电极的宽度。

用于测量流过纳米孔的离子电流的合适条件是本领域已知的，并且本文提供了实例。可以通过跨膜和孔施加电压来进行测量。在一些实施例中，使用的电压在 -400 mV 至+400 mV 的范围内。使用的电压优选地在具有选自 -400 mV、-300 mV、-200 mV、-150 mV、-100 mV、-50 mV、-20 mV 和 0 mV 的下限和独立地选自 +10 mV、+20 mV、+50 mV、+100 mV、+150 mV、+200 mV、+300 mV 和 +400 mV 的上限的范围内。使用的电压可以更优选地在100 mV 至 240 mV 的范围内，并且最优选地在 160 mV 至 240 mV 的范围内。使用增加的施加电位，通过纳米孔来增加不同核苷酸之间的区别是可能的。使用 AC 波形和带标签的核苷酸进行核酸测序在 2013 年 11 月 6 日提交的题为“使用标签的核酸测序”的美国专利公开号 US 2014/0134616 中有描述，该美国专利全文以引用方式并入本文。除了 US2014/0134616 中描述的带标签的核苷酸外，还可以使用缺少糖或无环部分的核苷酸类似物，例如，五个常见核碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶的 (S)-甘油核苷三磷酸 (gNTP) (Horhota et al., Organic Letters, 8:5345-5347 [2006]) 进行测序。

C. 纳米孔测序单元的电路

图 4 示出在纳米孔单元（诸如纳米孔单元 400）中的电路 400（该电路可以包括图 2 中的电路 222 的部分）的实施例。如上所述，在一些实施例中，电路 400 包括对电极410，该电极可以在纳米孔传感器芯片中的多个纳米孔单元或所有纳米孔单元之间共享，并且因此也可以称为作为共用电极。共用电极可以被配置为通过连接至电压源 V_liq 420 而向与纳米孔单元中的脂质双层（例如，脂质双层 214）接触的主体电解质（例如，主体电解质208）施加共用电位。在一些实施例中，可以利用 AC 非法拉第模式来用 AC 信号（例如，方波）调节电压 _Vliq，并将其施加到与纳米孔单元中的脂质双层接触的主体电解质上。在一些实施例中，V_liq 是幅度为 ±200-250 mV 且频率介于例如 25 至 400 Hz 之间的方波。对电极 410 和脂质双层（例如，脂质双层 214）之间的主体电解质可以通过诸如，例如 100 μF 或更大的大电容器（未示出）来进行建模。

图 4 还示出表示工作电极 402（例如，工作电极 202）和脂质双层（例如，脂质双层 214）的电特性的电模型 422。电模型 422 包括对脂质双层相关的电容进行建模的电容器 426 (C_双层) 和对纳米孔相关的可变电阻进行建模的电阻器 428 R_孔，所述电模型可以基于纳米孔中特定标签的存在而变化。电模型 422 还包括电容器 424，所述电容器 424 具有双层电容 (C_双层)，并且表示工作电极 402 和 孔 205 的电特性。工作电极 402 可以被配置为不依赖于其他纳米孔单元中的工作电极来施加不同的电位。

通路装置 406 是开关，所述开关可以用于将脂质双层和工作电极连接至电路400 或者断开与之的连接。通路装置 406 可以由控制线 407 控制，以启用或禁用跨纳米孔单元中的脂质双层施加的电压刺激。在脂质沉积以形成脂质双层之前，两个电极之间的阻抗可以非常低，因为纳米孔单元的孔未密封，因此通路装置 406 可以保持开放以避免短路情况。在脂质溶剂已经沉积到纳米孔单元以密封纳米孔单元的孔之后，通路装置 406 可以关闭。

电路 400 还可包括芯片上积分电容器 408 (n_cap)。积分电容器 408 可以通过使用复位信号 403 来闭合开关 401 而进行预充电，使得积分电容器 408 连接至电压源V_pre 405。在一些实施例中，电压源 V_pre 405 提供幅度为例如 900 mV 的恒定参考电压。当开关 401 闭合时，积分电容器 408 可以预充电至电压源 V_pre 405 的参考电压电平。

在对积分电容器 408 进行预充电之后，复位信号 403 可以用于断开开关 401，以断开积分电容器 408 与电压源 V_pre 405 的连接。此时，根据电压源 V_liq 的电平，对电极 410 的电位可以处于高于工作电极 402（和积分电容器 408）的电位的电平，或反之亦然。例如，在来自电压源 V_liq 的方波的正相位期间（例如，AC 电压源信号周期的亮时段或暗时段），对电极 410 的电位处于高于工作电极 402 的电位的电平。在来自电压源 V_liq的方波的负相位期间（例如，AC 电压源信号周期的暗时段或亮时段），对电极 410 的电位处于低于工作电极 402 的电位的电平。因此，在一些实施例中，由于对电极 410 与工作电极 402 之间的电位差，积分电容器 408还可以在从电压源 V_pre 405 的预充电电压电平预充电至较高电平的亮时段期间充电，并在暗时段期间放电至较低电平。在其他实施例中，充电和放电可以分别在暗时段和亮时段中发生。

根据模数转换器 (ADC) 435 的采样率，积分电容器 408 可以在固定的时间段充电或放电，所述采样率可以高于 1 kHz、5 kHz、10 kHz、100 kHz 或更多。例如，以 1 kHz的采样率，积分电容器 408 可以在约 1 ms 的时间段充电/放电，然后可以在积分时段结束时由 ADC 435 对电压电平进行采样和转换。特定的电压电平将对应于纳米孔中的特定标签种类，并且因此对应于模板上当前位置的核苷酸。

在由 ADC 435 采样之后，积分电容器 408 可以通过使用复位信号 403 来闭合开关 401 而再次进行预充电，使得积分电容器408 再次连接至电压源 V_pre 405。可以在整个测序过程的循环中重复以下步骤：对积分电容器 408 进行预充电，等待积分电容器 408在固定的时间段充电或放电，以及由 ADC 435对积分电容器的电压电平进行采样和转换。

数字处理器 430 可以处理 ADC 输出数据，例如，用于归一化、数据缓冲、数据过滤、数据压缩、数据缩减、事件提取、或将来自纳米孔单元阵列的 ADC 输出数据组装成各种数据帧。在一些实施例中，数字处理器 430 还执行下游处理，诸如碱基确定。数字处理器430 可以作为硬件实施（例如，在 图形处理单元 (GPU)、FPGA、ASIC 等中）或作为硬件和软件的组合实施。

因此，跨纳米孔施加的电压信号可用于检测纳米孔的特定状态。当纳米孔的筒体中不存在附着标签的多磷酸盐时，纳米孔的一种可能状态是开放通道状态，本文中也称为纳米孔的未穿线状态。纳米孔的另外四种可能状态各自对应于四种不同类型的附着标签的多磷酸核苷酸（A、T、G 或 C）中的一种被保持在纳米孔的筒体中的状态。纳米孔的另一种可能状态是脂质双层破裂时。

当在固定的时间段之后测量积分电容器 408 上的电压电平时，纳米孔的不同状态可以产生对不同电压电平的测量。这是因为积分电容器 408 上的电压衰减率（通过放电降低或通过充电而增加）（即，积分电容器 408 上的电压斜率的陡度与时间绘制图）取决于纳米孔电阻（例如，电阻器 R_孔 428 的电阻）。更特别地，由于分子（标签）的不同化学结构，与处于不同状态的纳米孔相关的电阻不同，因此可以观察到对应的不同电压衰减率，并且可以用于识别纳米孔的不同状态。电压衰减曲线可以是具有 RC 时间常数 τ= RC 的指数曲线，其中 R 是与纳米孔相关的电阻（即，R_孔 电阻器 428），C 是与 R 平行的膜相关的电容（即，C_双层 电容器 426）。纳米孔单元的时间常数可以是，例如，约 200-500 ms。由于双层的详细实施方式，衰减曲线可以非完全拟合指数曲线，但是衰减曲线可以类似于指数曲线并且是单调的，从而实现标签检测。

在一些实施例中，与处于开放通道状态的纳米孔相关联的电阻在 100 MOhm 至20 GOhm 的范围内。在一些实施例中，在标签在纳米孔的筒体内的状态下，与纳米孔相关的电阻可以在 200 MOhm 至 40 GOhm 的范围内。在其他实施例中，可以省略积分电容器408，因为通向 ADC 435的电压仍将随电模型 422 中的电压衰减而变化。

积分电容器 408 上的电压衰减率可以以不同的方式确定。如上所述，电压衰减率可以通过在固定的时间间隔内测量电压衰减来确定。例如，积分电容器 408 上的电压可以首先在时间 t1 处由 ADC 435 测量，然后在时间 t2 处由 ADC 435 再次测量电压。当积分电容器 408 上的电压斜率相对于时间曲线较陡时，电压差较大，而当电压曲线的斜率较缓时，电压差较小。因此，电压差可以用作确定积分电容器 408 上的电压衰减率以及纳米孔单元状态的度量。

在其他实施例中，电压衰减率通过测量所选电压衰减量所需的持续时间来确定。例如，可以测量电压从第一电压电平 V1 下降或增加至第二电压电平 V2 所需的时间。当电压相对于时间曲线的斜率较陡时，所需的时间较少，而当电压相对于时间曲线的斜率较缓时，所需的时间较多。因此，所需的测量时间可以用作确定积分电容器 n_cap 408 上的电压衰减率以及纳米孔单元状态的度量。本领域技术人员将理解可用于测量纳米孔的电阻的各种电路，例如，包括信号值测量技术，诸如电压或电流测量。

在一些实施例中，电路 400 不包括在芯片上制造的通路装置（例如，通路装置406）和额外的电容器（例如，积分电容器 408 (n_cap)，从而有助于减小基于纳米孔的测序芯片的尺寸。由于膜（脂质双层）的薄性质，仅与膜相关的电容（例如，电容器 426 (C_双层)）就足以产生所需的 RC 时间常数，而无需额外的芯片上电容。因此，电容器 426 可以用作积分电容器，并且可以通过电压信号 V_PRE 预充电并且随后可以通过电压信号 V_LIQ 放电或充电。消除原本在电路中的芯片上制造的额外电容器和通路装置，可以显著减小纳米孔测序芯片中单个纳米孔单元的占位面积，从而有利于纳米孔测序芯片的缩放以包括越来越多的单元（例如，在纳米孔测序芯片中具有数百万个单元）。

D. 纳米孔单元中的数据采样

为了执行核酸测序，积分电容器（例如，积分电容器 408 (n_cap) 或电容器 426(C_双层)的电压电平可以由 ADC（例如，ADC 435）采样和转换，同时将带标签的核苷酸添加到核酸中。例如，当所施加的电压使得 V_liq 低于 V_pre 时，核苷酸的标签可以通过穿过对电极和工作电极施加的跨纳米孔的电场推入纳米孔的筒体中。

1. 穿线

穿线事件是将带标签的核苷酸附着到模板（例如，核酸片段），并且标签移动进出纳米孔的筒体时。在穿线事件期间，该移动可以发生多次。当标签位于纳米孔的筒体中时，纳米孔的电阻可以更高，并且更低的电流可以流过纳米孔。

在测序期间，标签可以不在某些 AC 循环（称为开放通道状态）的纳米孔中，其中电流最高，因为纳米孔的电阻较低。当标签被吸引至纳米孔的筒体中时，纳米孔处于亮模式。当标签从纳米孔的筒体中推出时，纳米孔处于暗模式。

2. 亮时段和暗时段

在 AC 循环内，ADC 可以多次采样积分电容器上的电压。例如，在一个实施例中，以例如约 100Hz 跨系统施加 AC 电压信号，并且 ADC 的获取速率可以是每个单元约2000 Hz。因此，每个 AC 循环（AC 波形的循环）可以捕获约 20 个数据点（电压测量）。对应于 AC 波形的一个循环的数据点可以称为一组。在 AC 循环的一组数据点中，亚组可以例如在 V_liq 低于 V_pre 时捕获，所述亚组可以对应于亮模式（时段），此时标签被迫进入纳米孔的筒体中。另一亚组可以对应于暗模式（时段），此时标签在例如 V_liq 高于 V_pre 时由所施加的电场从纳米孔的筒体中推出。

3. 测得电压

对于每个数据点，当开关 401 断开时，积分电容器（例如，积分电容器 408 (n_cap)或电容器 426 (C_双层)）处的电压将因 V_liq 的充电/放电而以衰减的方式发生变化，例如，当V_liq 高于 V_pre 时从 V_pre 增加到 V_liq，或者当 V_liq 低于 V_pre 时从 V_pre 减少到 V_liq。当工作电极充电时，最终电压值可以偏离 V_liq。积分电容器上电压电平的变化率可以由双层的电阻值控制，所述双层可以包括纳米孔，所述纳米孔反过来可以包括纳米孔中的分子（例如，带标签的核苷酸的标签）。电压电平可以在开关 401 断开之后的预定时间测量。

开关 401 可以以数据获取速率操作。开关 401 可以在两次数据获取之间相对短的时间段内闭合，通常在 ADC 测量之后立即闭合。所述开关允许在 V_LIQ 的每一个 AC 循环的每一个子时段（亮或暗）期间收集多个数据点。如果开关 401 保持断开，则积分电容器上的电压电平以及 ADC 的输出值完全衰减并保持不动。相反，如果开关 401 闭合，积分电容器再次预充电（至 V_pre），并且准备好进行另一次测量。因此，开关 401 允许针对每一个AC 循环的每一个子时段（亮或暗）收集多个数据点。如此多次测量可以利用固定的 ADC 实现更高的分辨率（例如，由于更多的测量次数，因此为 8 位至 14 位，所述次数可以取平均）。多次测量还可以提供有关进入纳米孔中穿线的分子的动力学信息。定时信息可以确定穿线发生的时间长短。这也可以用于帮助确定添加到核酸链的多个核苷酸是否正在测序。

图 5 显示在 AC 循环的亮时段和暗时段期间从纳米孔单元捕获的数据点实例。在图 5 中，出于说明目的，放大数据点的变化。施加到工作电极或积分电容器的电压(V_PRE) 处于恒定电平，诸如，例如 900 mV。施加到纳米孔单元的对电极的电压信号 510(V_LIQ) 是显示为矩形波的 AC 信号，其中占空比可以是任何合适的值，诸如小于或等于50%，例如，约 40%。

在亮时段 520 期间，施加到对电极的电压信号 510 (V_LIQ) 低于施加到工作电极的电压 V_PRE，使得标签可能通过施加在工作电极和对电极上的不同电压电平（例如，由于标签上的电荷和/或离子的流动）所引起的电场而被迫进入纳米孔的筒体中。当开关 401 断开时，ADC 之前的节点处（例如，积分电容器处）的电压将减小。在捕获电压数据点之后（例如，在指定时间段之后），开关 401 可以闭合，并且测量节点处的电压将再次增加回到V_PRE。该工艺可以重复以测量多个电压数据点。以这种方式，可以在亮时段期间捕获多个数据点。

如图 5 所示，在 V_LIQ 信号的符号改变之后的亮时段中的第一数据点 522（也称为第一点δ (FPD)）可以低于随后的数据点 524。这可能是因为纳米孔（开放通道）中没有标签，因此它具有低电阻和高放电速率。在一些情况下，第一数据点 522 可以超过 _LIQ 电平，如图 5 所示。这可能是由将信号耦合到芯片上电容器的双层电容引起的。数据点 524 可以在发生穿线事件之后捕获，即，标签被迫进入纳米孔的筒体中，其中纳米孔的电阻以及积分电容器的放电速率取决于标签的特定类型，所述标签被迫进入纳米孔的筒体中。如下所述，由于电荷在 C_双层 424 处累积，因此对于每次测量，数据点 524 可能稍微减小。

在暗时段 530 期间，施加到对电极的电压信号 510 (V_LIQ) 高于施加到工作电极的电压 (V_PRE)，使得任何标签将被推出纳米孔的筒体。当开关 401 断开时，因为电压信号510 的电压电平 (V_LIQ) 高于 V_PRE，所以测量节点处的电压增加。在捕获电压数据点之后（例如，在指定时间段之后），开关 401 可以闭合，并且测量节点处的电压将再次降低回到V_PRE。该工艺可以重复以测量多个电压数据点。因此，可以在暗时段期间捕获多个数据点，包括第一点δ 532 和后续数据点 534。如上所述，在暗时段期间，任何核苷酸标签被推出纳米孔，因此除了用于归一化之外，还获得了关于任何核苷酸标签的最少信息。

图 5 还示出在亮时段 540 期间，即使施加到对电极的电压信号 510 (V_LIQ) 低于施加到工作电极的电压 (V_PRE)，也不会发生穿线事件（开放通道）。因此，纳米孔的电阻低，并且积分电容器的放电速率高。结果，包括第一数据点 542 和后续数据点 544 的捕获数据点显示低电压电平。

对于纳米孔的恒定电阻的每一次测量，可以预期在亮时段或暗时段期间测量的电压大致相同（例如，在既定 AC 循环的亮模式下，当一个标签在纳米孔中时进行测量），但是当电荷在双层电容器 424 (C_双层) 处累积时，情况可以并非如此。这种电荷累积可以导致纳米孔单元的时间常数变长。结果，电压电平可以发生偏移，从而导致在循环中每一个数据点的实测值减小。因此，在循环内，数据点可以从一个数据点到另一个数据点有所变化，如图5 所示。

关于测量的更多详细信息可见，例如，题为“具有可变电压刺激的基于纳米孔的测序”的美国专利公开号 2016/0178577、题为“具有可变电压刺激的基于纳米孔的测序”的美国专利公开号 2016/0178554、题为“使用对电刺激的双层响应测量进行无损双层监测”的美国专利申请号 15/085,700 和题为“双层形成的电增强”的美国专利申请号 15/085,713，其公开内容全文出于所有目的以引用方式并入本文。

4. 归一化和碱基识别

对于纳米孔传感器芯片的每一个可用的纳米孔单元，可以运行生产模式以对核酸进行测序。测序期间捕获的 ADC 输出数据可以进行归一化以提供更高准确度。归一化可以考虑偏移效应，诸如循环形状、增益漂移、电荷注入偏移和基线偏移。在一些实施方式中，可以扁平对应于穿线事件的亮时段周期循环的信号值，从而获得用于循环的单个信号值（例如，平均值）或可以调整测量的信号以减少循环内衰减（一种循环形状效应）。增益漂移通常会缩放整个信号，并以 100 秒到 1,000 秒的等级改变。作为示例，可以通过溶液（孔电阻）的变化或双层电容的变化来触发增益漂移。基线偏移发生的时间尺度约为 100 ms，并且与工作电极处的电压偏移有关。由于需要在亮时段到暗时段维持测序单元中的电荷平衡，因此可以通过从穿线的有效整流比的变化来驱动基线漂移。

在归一化之后，实施例可以确定用于穿线的通道的电压群集，其中每一个群集对应于不同的标签种类，并且因此对应于不同的核苷酸。群集可用于确定对应于既定核苷酸的既定电压的概率。作为另一个实例，群集可以用于确定区分不同核苷酸（碱基）的截止电压。

III 移除并置换纳米孔

如上所述，纳米孔和相关模板的每个复合物可用于提供目标特定核酸分子的序列信息。为了用相同的单元阵列对额外的不同分子进行测序，可以置换测序芯片的纳米孔复合物。实现这一操作的一种方法包括破坏每个单元的膜，以便从芯片中移除其中的纳米孔，形成新的膜，并将置换的纳米孔复合物插入到新的膜中。然而，这些步骤增加了测序过程的复杂性，并显著影响了设备和方法的通量和效率。

本文所述的替代方法涉及对测序芯片内的脂质双层膜的无损处理。已经发现，通过控制半透脂质双层膜的两侧的相对渗透度，可以产生跨膜的渗透水流。这种水流以及由此导致的与膜相邻的贮存器的体积的变化使得膜从基本上平面的构型改变为，例如，向内弯曲的构型。当膜向内弯曲和增厚时，膜的双层性质可能会丧失，这种双层的丧失可能会导致膜内蛋白质孔的定位产生不稳定性。因此，通过跨膜引入渗透失衡并使得膜改变形状，膜内的纳米孔可以通过自发排出从膜中移除，而不会使得膜失去结构完整性。通过随后恢复渗透平衡，膜可以返回到其最初的基本上平面的形状和双层构型。然后，这种双层构型再次有利于蛋白质孔的稳定性，并且可以在其中被动地或主动地插入置换纳米孔。

A. 纳米孔置换的说明

图 6A 示出基于纳米孔的测序芯片的单元的跨孔 602 的平面脂质双层膜 601。在脂质双层中插入初始纳米孔 603。双层将孔与外部贮存器 604 分开。在初始时间 t₁，孔中的盐/电解质溶液的渗透度 [E_W] 与外部贮存器的渗透度 [E_R] 基本上相同。在其他实施方式中，这两种渗透度可以不同，但这种不同不足以排出初始纳米孔 603。

图 6B 示出在稍后的时间 t₂ 时的单元，此时第一电解质溶液流入外部贮存器器。第一电解质溶液具有渗透度 [E_S1]，其大于初始外部贮存器渗透度 [E_R] 和孔渗透度[E_W]。由于第一电解质溶液的流动将增加外部贮存器的渗透度，因此在脂质双层膜的相对侧的溶液之间产生了渗透失衡。这种失衡为渗透提供了一种驱动力，在渗透过程中，水从孔向贮存器跨膜扩散，以平衡孔和贮存器的渗透浓度。

图 6C 示出在稍后的时间 t₃ 时的单元，此时水的渗透扩散使得孔内的液体体积减少。这种体积的变化在脂质双层膜 601 上产生应变，使得膜通过朝孔向内弯曲而改变其形状。向内移动可以导致膜增厚到在跨孔的至少某些部分中，膜不再是脂质双层的程度。这进而会使得初始纳米孔 603 从膜中丢失，孔被排出到外部贮存器中，如图 6C 所示。排出后，初始纳米孔通常扩散到更大体积的外部贮存器中，如此该初始纳米孔不再靠近单元。

图 6D 示出了稍后时间 t₄ 时的单元，此时第二电解质溶液流入外部贮存器。第二电解质溶液可含有多个置换纳米孔 605。在一些实施方式中，中间溶液可以流动，其不含置换纳米孔，但是可以减少膜的弯曲。

第二电解质溶液中的置换纳米孔的浓度可以足够高，使得置换纳米孔靠近单元的可能性显著大于初始纳米孔靠近单元的可能性。如图所示，第二电解质溶液的渗透度 [E_S2]小于第一电解质溶液的渗透度 [E_S1]。由于第二电解质溶液的流动将降低外部贮存器的渗透度，因此在膜的相对侧的溶液之间产生了另一种渗透失衡。所述第二渗透失衡为渗透提供另一种驱动力，水现在从贮存器沿着相反的方向跨膜扩散入孔中，以平衡孔和贮存器的电解质浓度。

图 6E 示出稍后时间 t₅ 时的单元，此时水的渗透扩散使得孔内的液体体积增加。孔的这种体积变化减轻了膜上先前的张力，允许膜恢复到其跨孔的初始平面形状。移动可导致膜在跨孔的所有或大部分位置再次成为脂质双层，从而允许在膜中再次插入纳米孔。

图 6F 示出稍后时间 t₆ 时的单元，此时已经在跨孔的平面脂质双层膜中插入置换纳米孔。纳米孔在膜中的插入可以是被动的，也可以是主动的。主动的示例为，可以通过在膜上施加电穿孔电压来诱导插入。

B. 纳米孔置换过程

图 7 示出用于在基于纳米孔的测序芯片的单元中置换插入脂质双层中的纳米孔的过程 700 的实施例，以分析分子。改进的技术包括在平面脂质双层膜的上方施加第一电解质流，其中电解质流具有不同于平面脂质双层的下方（即，在单元的孔内）的电解质溶液的渗透度。第一电解质流促进初始纳米孔或纳米孔复合物从膜中的排出。所述技术进一步包括在膜的上方施加第二电解质流，其中电解质流具有与膜的下方的电解质溶液的渗透度相似或相同的渗透度。第二电解质流还可以含有多个置换纳米孔，并且第二电解质溶液的流动可以促进在脂质双层膜中置换纳米孔的插入。

所公开的技术具有许多优点，包括能够增加待测序分析物的通量。还应当理解，所公开的技术可以应用于其他允许水跨膜流动但限制离子或其他渗透物流动的渗透性的半透膜（例如，除脂质双层外）。例如，所公开的方法和系统可以与聚合物膜一起使用。在一些实施例中，膜是共聚物。在一些实施例中，膜是三嵌段共聚物。还应当理解，所公开的技术可以应用于不是基于纳米孔的测序芯片的元件的膜。

在一些实施例中，膜是基于纳米孔的测序芯片的元件。在一些实施例中，如图 1所示的基于纳米孔的测序芯片 100 用于图 7 的过程。在一些实施例中，用于图 7 的过程的基于纳米孔的测序芯片包括图 2 的多个单元 200。

在可选步骤 701 中，进行核酸测序。可以利用上述数据采样方法和技术来执行测序。在一些实施例中，核酸测序用如图 4 中建模的电子系统进行，所述电子系统用于检测与四种附着标签的多磷酸核苷酸的穿线相对应的纳米孔状态。

在步骤 702 中，第一电解质溶液流至单元孔外部的贮存器（即，第一电解质贮存器）。在第一电解质溶液流动之前，外部贮存器通常与孔室（即，第二电解质贮存器）内溶液的渗透度（即，第二初始渗透度）具有相同或类似的渗透度（即，第一初始渗透度）。第一电解质溶液与第一电解质贮存器或第二电解质贮存器具有不同的电解质或渗透物的浓度。在一个实施例中，第一电解质溶液具有大于流动之前的第一电解质贮存器的渗透度。应当理解，在替代实施例中，第一电解质溶液具有小于流动之前的第一电解质贮存器的渗透度。在任一种情况下，第一电解质溶液的流动发挥作用以使外部贮存器的渗透度从第一初始渗透度改变为不同于初始渗透度的新的渗透度。

第一电解质贮存器、第二电解质贮存器和第一电解质溶液中的每一个可以独立地具有一种或多种渗透物。第一电解质贮存器、第二电解质贮存器和第一电解质溶液中的两个或多个可以包括相似或不同的渗透物。用于本发明的渗透物包括但不限于离子盐，诸如氯化锂 (LiCl)、氯化钠 (NaCl)、氯化钾 (KCl)、谷氨酸锂、谷氨酸钠，谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙 (CaCl₂)、氯化锶 (SrCl₂)、氯化锰 (MnCl₂)和氯化镁 (MgCl₂)；多元醇和糖，诸如丙三醇、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇、甘露糖甘露醇、甘油葡萄糖苷、葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖和异氟糖苷；聚合物，诸如右旋糖酐、左旋糖酐和聚乙二醇；以及一些氨基酸及其衍生物，诸如甘氨酸、丙氨酸、α - 丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、牛磺酸、甜菜碱、章鱼碱、谷氨酸、肌氨酸、y-氨基丁酸和氧化三甲胺 (TMAO)（另参见，例如，Fisher 等，美国专利号 20110053795，该专利全文以引用方式并入本文）。在一个实施例中，溶液包括作为离子盐的渗透物。本领域的普通技术人员将理解用于本发明的合适渗透物的其他化合物。另一方面，本发明提供了包括两种或多种不同的渗透物的溶液。

第一电解质贮存器和第二电解质贮存器的初始渗透度（即，分别是第一初始渗透度和第二初始渗透度）可以是，例如但不限于，在 100 mM 至 1M 的范围内，例如，从 100mM 至 400 mM、从 125 mM 至 500 mM、从 160 mM 至 625 mM、从 200 mM 至 800 mM 或从250 mM 至 1 M。第一电解质贮存器和第二电解质贮存器可具有在 200 mM 到 500 mM 的范围内的初始渗透度，例如从 200 mM 至 350 mM、从 220 mM 至 380 mM、从 240 mM 至420 mM、从 260 mM 至 460 mM，或从 290 mM 至 500 mM。就下限而言，第一电解质贮存器和第二电解质贮存器可具有大于 100 mM、大于 125 mM、大于 160 mM、大于 200 mM大于250 mM、大于 400 mM、大于 500 mM、大于 625 mM 或大于 800 mM 的初始渗透度。就上限而言，第一电解质贮存器和第二电解质贮存器的初始渗透度可以小于1 M、小于 800 mM、小于 625 mM、小于 500 mM、小于 400 mM、小于 250 mM、小于 200 mM、小于 160 mM 或小于125 mM。

在一个实施例中，所述外部贮存器中的溶液的浓度为在约 10 nM 和 3 M 之间。在另一个实施例中，所述外部贮存器中的溶液的浓度为约 10 mM、约 20 mM、约 30 mM、约40 mM、约 50 mM、约 60 mM、约 70 mM、约 80 mM、约 90 mM、约 100 mM、约 110 mM、约 120mM、约 130 mM、约 140 mM、约 150 mM、约 160 mM、约 170 mM、约 180 mM、约 190 mM、约200 mM、约 210 mM、约 220 mM、约 230 mM、约 240 mM、约 250 mM、约 260 mM、约 270 mM、约 280 mM、约 290 mM、约 300 mM、约 305 mM、约 310 mM、约 315 mM、约 320 mM、约 325mM、约 330 mM、约 335 mM、约 340 mM、约 345 mM、约 350 mM、约 355 mM、约 360 mM、约365 mM、约 370 mM、约 375 mM、约 380 mM、约 385 mM、约 390 mM、约 395 mM、约 400 mM、约 450 mM、约 500 mM、约 550 mM、约 600 mM、约 650 mM、约 700 mM、约 750 mM、约 800mM、约 850 mM、约 900 mM、约 950 mM、约 1 M、约 1.25 M、约 1.5 M、约 1.75 M、约 2 M、约 2.25 M、约 2.5 M、约 2.75 M 或约 3 M。在另一个实施例中，孔中溶液的浓度为约 305mM、约 310 mM、约 315 mM、约 320 mM、约 325 mM、约 330 mM、约 335 mM、约 340 mM、约345 mM、约 350 mM、约 355 mM、约 360 mM、约 365 mM、约 370 mM、约 375 mM、约 380 mM、约 385 mM、约 390 mM、约 395毫、约 400 mM、约 450 mM、约 500 mM、约 550 mM、约 600mM、约 650 mM、约 700 mM、约 750 mM、约 800 mM、约 850 mM、约 900 mM、约 950 mM 或约1 M。在另一个实施例中，外部贮存器中溶液的浓度为约 300 mM，以及在孔中溶液的浓度选自包含以下浓度的组：约 310 mM、约 320 mM、约 330 mM、约 340 mM、约 350 mM、约 360mM、约 370 mM、约 380 mM、约 390 mM 或约 400 mM。在其它实施例中，溶液浓度选自包含以下浓度的组：(i) 外部贮存器中的 300 mM 和孔中的 310 mM、(ii) 外部贮存器中的300 mM 和孔中的 320 mM、(iii) 外部贮存器中的 300 mM 和孔中的 330 mM、(iv) 外部贮存器中的 300 mM 和孔中的 340 mM、(v) 外部贮存器中的 300 mM 和孔中的 350 mM、(vi)外部贮存器中的 300 mM 和孔中的 360 mM、(vii) 外部贮存器中的 300 mM 和孔中的 370 mM、(viii)外部贮存器中的 300 mM 和孔中的 380 mM、(ix) 外部贮存器中的 300mM 和孔中的 390 mM 以及外部贮存器中的 300 mM 和孔中的 400 mM。

第一电解质溶液的渗透度与外部贮存器的渗透度的比例可以，例如但不限于，在1.05 至 1.5 的范围内，例如从 1.05 至 1.3、从 1.08 至 1.35、从 1.13 至 1.4、从1.17 至 1.45 或从 1.21 至 1.5。第一电解质溶液的渗透度与外部贮存器的渗透度的比例可以在 1.12 至 1.4 的范围内，例如从 1.12 至 1.28、从 1.15 至 1.31、从 1.17 至1.34、从 1.2 至 1.37 或从 1.22 至 1.4。就下限而言，第一电解质溶液的渗透度与外部贮存器的渗透度的比例可以大于 1.05、大于 1.08、大于 1.17、大于 1.21、大于 1.3、大于1.35、大于 1.4 或大于 1.45。就上限而言，第一电解质溶液的渗透度与外部贮存器的渗透度的比例可以小于1.5、小于 1.45、小于 1.4、小于 1.35、小于 1.3、小于 1.21、小于1.17、小于 1.13 或小于 1.08。

在可选步骤 703 中，确定是否应该继续或重复第一电解质溶液的流动。在这一步中，可以使用不同的标准来确定。在一些实施例中，步骤 702 将被执行预定次数，并且步骤703 将步骤 702 已经执行的次数与预定次数进行比较。在一些实施例中，步骤 702 将被执行预定时间段，并且步骤 703 将已经执行步骤 702 的累积时间量与预定时间段进行比较。在一些实施例中，测量外部贮存器内溶液的渗透度，或从外部贮存器离开的流出物的渗透度。如果外部贮存器或流出物的渗透度尚未达到预定值，则可以重复步骤 702。在一些实施例中，重复步骤 702，直到外部贮存器内或离开外部贮存器的溶液的渗透度在进入外部贮存器的溶液（即，第一电解质溶液）的渗透度的预定百分比范围内为止。

对于步骤 702 的每次迭代，第一电解质溶液中的电解质的浓度可以相同，相似或不同。可将较低或较高浓度的电解质用于一个或多个额外循环。例如，每次重复步骤 702时，盐电解质溶液的浓度可以从初始电解质浓度或溶液渗透度（即，步骤 702 的第一次迭代的条件）逐渐增加到最终的电解质浓度或溶液渗透度（即，步骤 702 的最后一次迭代的条件），直到 [E_S1]/[E_W] 比例增加到预定的目标比例。可以通过测量离开体系的外部贮存器流体的渗透度来估计该比例。如果重复电解质溶液（在步骤 702 中）的流动，则过程 700可以从步骤 703 进入到步骤 702；否则，过程 700 可以进入到步骤 704。

在步骤 704 中，第二电解质溶液流至单元孔外部的贮存器。第二电解质溶液具有与第一电解质溶液中的电解质不同的电解质或渗透物浓度。第二电解质溶液的渗透度也比第一电解质溶液的渗透度更接近第二初始渗透度（即，孔室中电解质溶液的初始渗透度）。换言之，第二电解质溶液的渗透度和第二初始渗透度之间的差小于第一电解质溶液的渗透度和第二初始渗透度之间的差。在一个实施例中，第二电解质溶液具有小于第一电解质溶液的渗透度。应当理解，在替代实施例中，第二电解质溶液具有大于第一电解质溶液的渗透度。在任一种情况下，第一电解质溶液的流动发挥作用以改变外部贮存器的渗透度，使得外部贮存器的渗透度更接近初始孔贮存器渗透度。第二电解质溶液可具有一个或多个渗透物，其中的每一个可独立地是上述任何渗透物。

第二电解质溶液可包括多个置换纳米孔。所述多个置换纳米孔中的每个置换纳米孔可以是多个置换纳米孔复合物中一个的一部分。置换纳米复合物可以包括，例如，聚合酶和模板。每个置换纳米孔复合物的模板可以不同于被置换的初始纳米孔复合物中存在的模板。初始和置换纳米孔或初始和置换纳米孔复合物的纳米孔可以各自独立地是，例如但不限于，外膜蛋白 (OmpG)；细菌淀粉样蛋白分泌通道 CsgG；耻垢分枝杆菌孔蛋白 (MspA)；α- 溶血素 (α-HL)；与 OmpG、CsgG、MspA 或 α-HL 中的至少一种具有至少 70% 同源性的任何蛋白质；或其任意组合。

第一电解质溶液的渗透度与第二电解质溶液的渗透度的比例可以，例如但不限于，在 1.05 至 1.5 的范围内，例如从 1.05 至 1.3、从 1.08 至 1.35、从 1.13 至 1.4、从 1.17 至 1.45 或从 1.21 至 1.5。第一电解质溶液的渗透度与第二电解质溶液的渗透度的比例可以在 1.12 至 1.4 的范围内，例如从 1.12 至 1.28、从 1.15 至 1.31、从1.17 至 1.34、从 1.2 至 1.37 或从 1.22 至 1.4。就下限而言，第一电解质溶液的渗透度与第二电解质溶液的渗透度的比例可以大于 1.05、大于 1.08、大于 1.17、大于 1.21、大于 1.3、大于 1.35、大于 1.4 或大于 1.45。就上限而言，第一电解质溶液的渗透度与第二电解质溶液的渗透度的比例可以小于1.5、小于 1.45、小于 1.4、小于 1.35、小于 1.3、小于 1.21、小于 1.17、小于 1.13 或小于 1.08。

在步骤 702 中的第一电解质溶液流动（即，第一初始渗透度）之前，第二电解质溶液的渗透度与孔溶液的渗透度或外部贮存器的渗透度的比例可以，例如但不限于，在 0.85至 1.15 的范围内，例如从 0.85 至 1.03、从 0.88 至 1.06、从 0.91 至 1.09、从 0.94至 1.12 或从 0.97 至 1.15。第二电解质溶液的渗透度与第一初始渗透度的比例可以在0.94 至 1.06 的范围内，例如从 0.94 至 1.02，从 0.95 至 1.03，从 0.96 至 1.04，从0.97 至 1.05 或从 0.98 至 1.06。就下限而言，第二电解质溶液的渗透度与第一初始渗透度的比例可以大于 0.85、大于 0.88、大于 0.91、大于 0.94、大于 0.97、大于 1、大于1.03、大于 1.06、大于 1.09 或大于 1.12。就上限而言，第二电解质溶液的渗透度与第一初始渗透度的比例可以小于 1.15、小于 1.12、小于 1.09、小于 1.06、小于 1.03、小于 1、小于 0.97、小于 0.94、小于 0.91 或小于 0.88。

在可选步骤 705 中，确定是否应该继续或重复第二电解质溶液的流动。在这一步中，可以使用不同的标准来确定。在一些实施例中，步骤 704 被执行预定次数，并且步骤705 将步骤 704 已经执行的次数与预定次数进行比较。在一些实施例中，步骤 704 将被执行预定时间段，并且步骤 705 将已经执行步骤 704 的累积时间量与预定时间段进行比较。在一些实施例中，测量外部贮存器内溶液的渗透度，或从外部贮存器离开的流出物的渗透度。如果外部贮存器或流出物的渗透度尚未达到预定值，则可以重复步骤 704。在一些实施例中，重复步骤 704，直到外部贮存器内或离开外部贮存器的溶液的渗透度在进入外部贮存器的溶液（即，第一电解质溶液）的渗透度的预定百分比范围内为止。在一些实施例中，重复步骤 704，直到外部贮存器内或离开外部贮存器的溶液的渗透度在孔室中的溶液（即，第二外部贮存器）的渗透度的预定百分比范围内为止。

对于步骤 704 的每次迭代，第一电解质溶液中的电解质的浓度可以相同，相似或不同。可将较低或较高浓度的电解质用于一个或多个额外循环。例如，每次重复步骤 704时，盐电解质溶液的浓度可以从初始电解质浓度或溶液渗透度（即，步骤 704 的第一次迭代的条件）逐渐降低到最终的电解质浓度或溶液渗透度（即，步骤 704 的最后一次迭代的条件），直到 [E_S2]/[E_W] 比例降低到预定的目标比例。可以通过测量离开体系的外部贮存器流体的渗透度来估计该比例。如果重复电解质溶液（在步骤 704 中）的流动，则过程 700可以从步骤 705 进入到步骤 704；否则，过程 700 可以进入到步骤 706。

在过程 700 的任选步骤 706 中，在单元的膜中插入第二电解质溶液的多个置换纳米孔中的一个。可以使用不同的技术在基于纳米孔的测序芯片的单元中插入纳米孔。在一些实施例中，将纳米孔被动地插入，即，不使用外部刺激。在一些实施例中，跨脂质双层膜施加搅拌或电刺激（例如，以一秒为增量施加 0 mV 到 1.0V 的电压，持续 50 毫秒到3600 秒），使得脂质双层内破坏并启动脂质双层中的纳米孔插入。在一些实施例中，跨膜施加的电压是交流 (AC) 电压。在一些实施例中，跨膜施加的电压是直流 (DC) 电压。跨单元膜所施加的电穿孔电压通常可以应用于基于纳米孔的测序芯片的所有单元，或者电压可以特异性地靶向芯片的一个或多个单元。

在过程 700 的可选步骤 707 中，进行核酸测序。可以利用上述数据采样方法和技术来执行测序。在一些实施例中，与步骤 706 中插入的置换纳米孔复合物缔合的模板不同于与由于步骤 704 的第一电解液的流动而排出的初始纳米孔复合物缔合的模板。在这种情况下，可以使用步骤 707 的测序操作来分析与用步骤 701 的测序操作分析的核酸序列不同的核酸序列。这可以提高测序芯片的效率，由于置换了测序纳米孔，允许芯片的单个单元用于多个不同核酸分子的测序。

C. 纳米孔置换的流动体系

图 7 的过程 700 包括步骤（例如，步骤 701、步骤 702、步骤 704 和步骤 707），其中不同类型的流体（例如，液体或气体）流过孔外部的贮存器。具有显著不同性质（例如渗透度、压缩性、疏水性和粘度）的多种流体可以在基于纳米孔的测序芯片（例如，诸如图 1的芯片 100）的表面上的传感器单元（例如，图 2 的单元 200）阵列的上方流动。在一些实施例中，执行过程 700 的体系包括引导和/或监视不同流体流入和流出外部贮存器的流动系统。

图 8 示出与图 7 的过程 700 一起使用的流动体系 800 的实施例。流动体系包括孔阵列 802 外部的第一电解质贮存器 801。对于每个孔，可以通过包括插入的初始纳米孔或纳米孔复合物的膜 803 将内部孔室（即，第二电解液贮存器）与第一电解液贮存器分开。在过程 700 的步骤 701 中，可以使用流动系统 800 进行核酸测序。作为所述核酸测序的一部分，一个或多个流体可以流入或流过第一电解质贮存器 801。所述一个或多个流体最初可以储存在第一电解质贮存器外部的一个或多个储存容器（例如，图 8 的第一储存容器 804）中。一个或多个储存容器中的每一个可以独立地或联合地通过一个或多个通道、导管或管道（例如，第一通道 805）与第一电解质贮存器流体连接。流体从第一储存容器804 通过第一通道 805 并进入第一电解质贮存器 801 的传输可以通过一个或多个泵（例如，泵 806）的作用进行。每个泵可以是，例如，正排量泵或脉冲泵。控制电路 812 可以与泵806 通信耦合，例如，用于向泵 806 发送控制信号，以用于控制流体从第一储存容器 804通过第一通道 805 并进入第一电解质贮存器 801 的传输。流体可以跨过第一贮存器 801的基本上整个宽度进入第一贮存器 801，或者可以通过引导第一电解质贮存器 801 内的流动的通道（例如，蛇形通道）进入第一贮存器 801。

流动体系 800 还可包括第二储存容器 807，所述第二储存容器可用于储存过程700 的步骤 702 的第一电解质溶液。第二储存容器 807 可以通过通道，导管或管道（例如，第二通道 808）与第一电解质贮存器流体连接。流体从第二储存容器 807 通过第二通道 808 并进入第一电解质贮存器 801 的传输可以通过一个或多个泵的作用进行。在步骤702 中用于从第二储存容器 807 传输流体的一个或多个泵可以与在步骤 701 中用于从第一储存容器 804 传输流体的一个或多个泵相同。例如，如图 8 所示，泵 806 可以用于通过第一通道 805 和第二通道 808 的共同部分来泵送流体。

在一些实施例中，一个或多个阀门（例如，阀门 809 和阀门 810）用于控制离开一个或多个储存容器的流体流动。例如，当过程 700 从步骤 701 进入到步骤 702 时，可以完全关闭第一阀门 809 并打开第二个阀门 807，从而停止与核酸测序相关的液体流动，并开始第一电解液的流动。作为另一示例，当过程 700 从步骤 701 进入到步骤 702 时，可以缩小第一阀门 809 的开度和/或扩大第二阀门 807 的开度，从而调节来自储存容器804 和储存容器 807的流体进入第一电解液贮存器 801 的比率。控制电路 812 可以与第一阀门 809 和第二阀门 810 通信耦合，例如，用于向第一阀门 809 和/或第二阀门 810发送控制信号，以用于控制从第一储存容器 804 和第二储存容器 807 进入第一电解质贮存器 801 的流体的比例。

流动体系 800 还可以包括检测器 811，以监测离开第一电解质贮存器 801 的流体的渗透度。在一些实施例中，检测器 811 可通信连接至控制电路，以用于监测流体的渗透度和控制电解质溶液的流动。在一些实施例中，另一个检测器（未示出）位于第一电解质贮存器内，以测量第一电解质贮存器内的流体的渗透度。在其他实施例中，流动体系没有渗透度检测器。

在过程 700 的步骤 703 中，检测器 811 可用于确定是否应继续或重复将第一电解质溶液从储存容器 807 流入第一电解质贮存器 801。例如，检测器 811 可以报告渗透度测量结果，并且可以使用该测量结果与预先选择的渗透度值的比较来确定是否将过程700 从步骤 703 进入到步骤 702 或步骤 704。在一些实施例中，如果过程 700 进入到步骤 702，则控制第一阀门 809 和第二阀门 810 以在新的步骤 702 迭代中调整进入第一电解质贮存器 801 的流体的比例。例如，如果第二储存容器 807 内的第一电解质溶液的渗透度大于第一储存容器 804 内的溶液的渗透度，则每次重复步骤 702 时，可以缩小第一阀门 809 的开度和/或扩大第二阀门 807 的开度。以这种方式，进入第一电解质贮存器801 的盐电解质溶液的浓度可以从初始电解质浓度或溶液渗透度（即，步骤 702 的第一次迭代的条件）逐渐增加到最终的电解质浓度或溶液渗透度（即，步骤 702 的最后一次迭代的条件），直到 [E₈₀₁]/[E₈₀₂] 比例增加到预定的目标比例。

在一些实施例中，通过使用泵代替阀门来调整从储存容器 804 和储存容器 807进入第一电解质贮存器 801 的流体的比例。例如，可以降低从储存容器 804 输送流体的泵的流量和/或可以增加从储存容器 807 输送第一电解质溶液的泵的流量，从而逐渐增加第一电解质贮存器 801 内的渗透度。

在过程 700 的步骤 704 中流动到第一电解质贮存器 801 的第二电解质溶液也可以储存在流动体系 800 的一个或多个储存容器中。在一些实施例中，第二电解质溶液与过程 700 的步骤 701 的核酸测序期间使用的一种或多种流体相同。在一些实施例中，第二电解质溶液在第一储存容器 804 内。在一些实施例中，第二电解质溶液在除第一储存容器 804 或第二储存容器 807 之外的储存容器内。第二电解质溶液的储存容器可以通过上述类型和配置的通道、导管、管道、泵或阀门中的任何一个或多个与第一贮存器流体连接。在一些实施例中，当过程 700 从步骤 703 进入到步骤 704 时，完全关闭第一阀门 809并打开第二个阀门 810，从而停止第一电解质溶液的流动，并开始第二电解液的流动。在一些实施例中，当过程 700 从步骤 703 进入到步骤 704 时，扩大阀门 809 的开度和/或缩小第二阀门 807 的开度，从而调节从储存容器 804 和储存容器 807 进入第一电解液贮存器 801 的流体的比率。

流动体系 800 的检测器 811 还可用于过程 700 的步骤 705，以确定是否应继续或重复将第二电解质溶液流入第一电解质贮存器 801。例如，检测器 811 可以报告渗透度测量结果，并且可以使用该测量结果与预先选择的渗透度值的比较来确定是否将过程700 从步骤 705 进入到步骤 704 或步骤 706。在一些实施例中，如果过程 700 进入到步骤 704，则控制第一阀门 809 和第二阀门 810 以在新的步骤 704 迭代中调整进入第一电解质贮存器 801 的流体的比例。例如，如果第二储存容器 807 内的第一电解质溶液的渗透度 u大于第一储存容器 804 内的第二电解质溶液的渗透度，则每次重复步骤 704时，可以扩大第一阀门 809 的开度和/或缩小第二阀门 807 的开度。

以这种方式，进入第一电解质贮存器 801 的盐电解质溶液的浓度可以从初始电解质浓度或溶液渗透度（即，步骤 704 的第一次迭代的条件）逐渐降低到最终的电解质浓度或溶液渗透度（即，步骤 704 的最后一次迭代的条件），直到 [E₈₀₁]/[E₈₀₂] 比例降低到预定的目标比例。在一些实施例中，通过使用泵代替阀门来调整从储存容器 804 和储存容器 807 进入第一电解质贮存器 801 的流体的比例。例如，可以增加从储存容器 804 输送第二电解质溶液的泵的流量和/或可以降低从储存容器 807 输送第一电解质溶液的泵的流量，从而逐渐降低电解质贮存器 801 内的渗透度。

D. 纳米孔置换的示例

鉴于以下非限制性示例，将更好地理解本发明的实施例。

将初始 α - 溶血素纳米孔电穿孔到具有外部贮存器和孔贮存器的测序芯片的单元的膜中，每个贮存器都包含 380 mM 谷氨酸钾 (KGlu) 缓冲剂。链霉亲和素结合的寡核苷酸 (dT)₄₀ 标签随后流入 300 mM 的 KGlu 缓冲剂中的外部贮存器。作为阳性对照，对芯片中每个单孔单元的自由捕获率 (k_fc) 进行两次独立测量。自由捕获率指对于给定孔，在单位时间内发生的标签插入事件的数量。这两种测量是在不同的时间对同一单元进行的，没有排出或新的孔插入。

图 9A 示出根据这些测量结果所绘制的图 900。图 9A 的图的 x 轴和 y 轴指示k_fc 测量值，并且每个数据点表示单个单元和纳米孔的两次测量之间的关系。由于孔在两次测量之间没有变化，理想的结果应该是产生的所有点都位于 y = x 虚线上。数据点位置与这条理想线的小偏差表示标准实验误差，例如数据采集噪声。如图所示，测量通常遵循一条线，这与使用本发明实施例进行孔交换的单元的测量形成对比，如下所述。

然后使 380 mM KGlu 的第一电解质溶液流入测序芯片的外部贮存器，然后再流入 300 mM KGlu 的第二电解质溶液。第二电解质溶液含有置换 α - 溶血素纳米孔和置换链霉亲和素结合的寡核苷酸 (dT)₄₀ 标签。使置换纳米孔被动地插入芯片的单元膜中，并与置换标签复合以形成置换纳米孔复合物。对芯片中每个单元的 k_fc 进行另一次测量，并将这些新测量结果与电解质溶液流动前的测量结果进行比较。

图 9B 示出绘制这些测量结果的图 901。x 轴和 y 轴再次表示 k_fc 的测量结果，图 9B 的每个数据点表示电解液流动前后单个单元的测量结果之间的关系。从所述图可以看出，图 9B 的绘制的数据点位置与理想 y = x 线的平均偏差显著大于图 9A 的绘制的平均偏差。这表明电解质溶液流动后单元具有不同的性质，这些不同的性质不是由实验或测量误差或噪声引起的，而是由用置换纳米孔和纳米孔复合物置换初始纳米孔和纳米孔复合物造成的。因此，图 9A 和图 9B 显示使用本发明的实施例，使孔排出并插入新的孔。

孔交换事件的不存在和存在也可以在 ADC 输出的数据追踪中显示，例如图 10A和图 10B 的数据追踪。

图 10A 示出用未诱导孔交换的测序单元测量的 ADC 计数（在 x 轴上绘制）随时间（在 y 轴上绘制）变化的图 1001。图中所示厚型带表示亮开放通道 1002 和暗开放通道1003 输出的电压测量结果。在时间 1004 时，使第一电解质溶液流入测序单元的外部贮存器，其中第一电解质溶液具有与外部贮存器的初始渗透度不同的渗透度，但是其中渗透度差不足以促使测序单元的纳米孔的排出。

在紧接着时间 1004 之后的时间，外部贮存器与测序单元的孔贮存器的新渗透度之间的小渗透失衡使得测序单元膜的构型产生微小变化。这种微小变化导致亮开放通道1002 和暗开放通道 1003 输出之间的间隔 1005 增加。在时间 1006 时，使第二电解质溶液流入外部贮存器，其中第二电解质溶液具有比第一电解质溶液的渗透度更接近测序单元的孔贮存器的初始渗透度的渗透度。由于所述第二电解质溶液的流动，亮开放通道 1002和暗开放通道 1003 之间的间隔 1005 恢复到与在时间 1004 之前观察到的量相似的量。

图 10B 示出用诱导孔交换的测序单元测量的 ADC 计数随时间变化的图 1011。在时间 1014 时，使第一电解质溶液流入测序单元的外部贮存器，其中第一电解质溶液具有与外部贮存器的初始渗透度不同的渗透度，并且其中渗透度差足以促使测序单元的纳米孔的排出。在紧接着时间 1014 之后的时间，纳米孔排出导致亮开放通道 1012 和暗开放通道 1013 之间的间隔 1015 破裂，其中分离的缺失表示缺少插入的纳米孔。

在时间 1016 时，使第二电解质溶液流入外部贮存器，其中第二电解质溶液具有比第一电解质溶液的渗透度更接近测序单元的孔贮存器的初始渗透度的渗透度。由于所述第二电解质溶液的流动，测序单元的膜的构型恢复到其原始构型，并且再次有利于孔插入。在时间 1017 时，在膜中插入一个置换孔，并重新引入亮开放通道 1012 和暗开放通道1013 输出之间的间隔 1015，其中间隔表明存在插入的纳米孔。因此，图 10B 还与图 10A对比显示使用本发明的实施例，使孔排出并插入新的孔。

IV 用于孔插入的渗透失衡

除了如上所述从膜上移除纳米孔之外，跨膜的渗透失衡如美国专利公开号 2017/0369944 所述还可用于增加纳米孔的稳定性和寿命，并如 WO2018/001925 中所述可用于形成膜，上述专利中的每个全文出于所有目的以引用方式各自并入本文。此外，如下所述，渗透失衡也可以用来促进膜中孔插入。

在一些实施例中，通过在膜中插入孔或更通常地插入蛋白质之前，在膜上建立渗透失衡（即，脂质双层或三嵌段共聚物单层或双层）可以改变（即，增加）在膜中插入孔的概率。如本文所使用，术语渗透势、渗透度和渗透压可以用来描述渗透失衡，并且这些术语可以在整个说明书中互换使用。虽然这些术语相关联，但它们的单位是不同的。例如，渗透势可以定义为渗透度 (M) 乘以理想气体常数 (R)、绝对温度 (T) 和范特霍夫因子 (i)。渗透度定义为每升溶剂中溶质粒子的数量。渗透压定义为每千克溶剂中溶质粒子的数量。

如图 12A 至图 12C 所示，跨膜 1204 的渗透失衡可通过如下操作建立：用具有第一渗透势、渗透度或渗透压（即，以 10 mOsm/kg 为增量的 50-2000 mOsm/kg）的第一溶液（即，缓冲剂 X 或缓冲剂 Y）1202 填充孔贮存器 1200，通过在孔贮存器 1200 的上方，例如通过使溶剂 1206 中的膜材料（即，脂质或三嵌段共聚物）在孔贮存器 1200 的上方流动来创建脂质双层或膜 1204，进而密封孔贮存器 1200，然后使具有与第一渗透势不同的第二渗透势的第二溶液（即，以 10 mOsm/kg 为增量的 50-2000 mOsm/kg）的第二溶液1208 流到膜 1204 的上方以建立跨膜 1204 的渗透势δ或梯度。

第一溶液和第二溶液之间的渗透势差将使得水移动跨膜向膜的顺式侧（在孔贮存器外）移动，或向膜的反式侧（在孔贮存器内）移动。水的移动将使得反式侧（孔贮存器）的体积增加或减少。这最终导致膜向外扩张或向内收缩，如图 12B 和图 12C 所示。由此产生的膜面积的变化、膜形状的变化、膜上的应力变化和/或膜稳定性或结构（即，厚度和/或阻力）的变化可以影响如何在膜中插入孔或从膜中排出孔。例如，增加膜的表面积预期通常会增加穿孔率和/或穿孔产率。类似地，增加膜的不稳定性可以使孔更容易地将其自身插入膜中，但是也可以使孔更容易地从膜中排出。膜减薄往往也有助于提高孔将其自身插入膜中的能力，并且增加膜的表面积通常与由此产生的减薄的膜的量的增加有关（即，随着材料分布在更大的面积上，由特定数量的材料制成的膜往往会变薄）。膜的厚度和/或不稳定性可以通过测量膜的电阻来电学表征。

由于许多孔的大小和形状相对于横向平分该孔的纵轴的线（沿着该孔通道的轴线延伸）是不对称的，因此通常孔的一部分延伸到膜的一侧的上方，所述膜的一侧通常是该孔被插入的一侧（即，相对窄的孔茎被插入到膜中，而相对宽的孔帽在插入之后位于所述膜的上方）。这种孔的尺寸和形状的不对称性可以部分地解释为什么孔倾向于将自身插入向外弯曲的膜并保持插入状态，而对于向内弯曲的膜，同一孔将倾向于从膜中排出而不是保持插入状态。

膜组合物的变化（即，用于形成膜的脂质或三嵌段共聚物的类型）和/或纳米孔的结构可以影响最佳 Δosmo 以促进孔插入。

例如，图 12A 示出当第一溶液 1202 和第二溶液 1208 基本上相同并且具有相同的渗透势时，其可以例如根据渗透度或渗透压来指定。当两种溶液之间的渗透势相同时，水不会跨膜移动，并且因此，膜不会向外或向内弯曲，而是呈相对稳定、无应力的构型。注意，在一些实施例中，两种不同溶液的渗透势最初可能是相同的，但随着时间的推移，对膜可渗透的某些溶质可以穿过膜，并使得溶液的渗透势发生变化。

图 12B 示出其中孔贮存器 1200 中的第一溶液 1202 具有比第二溶液 1208 更高的渗透压的实施例。在这种情况下，水跨膜 1204 从第二溶液 1208 扩散到第一溶液1202，从而增加第一溶液 1202 的体积并使得膜 1204 向外弯曲远离所述孔贮存器 1200。

图 12C 示出其中孔贮存器 1200 中的第一溶液 1202 具有比第二溶液 1208 更低的渗透压的实施例。在这种情况下，水跨膜 1204 从第一溶液 1202 扩散到第二溶液1208，从而降低第一溶液 1202 的体积并使得膜 1204 向内朝所述孔贮存器 1200 弯曲。

如图 12B 所示，当从膜的顺式侧引入孔时，通过例如增加穿孔率/或单孔产率（具有单个孔的膜的数量除以孔的数量），使得膜 1204 向外弯曲，以便可以促进孔插入。在一些实施例中，当从反式侧插入孔时，还通过膜 1204 的向外弯曲来促进穿孔，这可能意味着一个或多个孔包括在布置在孔贮存器 1200 中的第一溶液 1202 中。增加的孔插入可以由向外弯曲的膜 1204 呈现的增加的表面积和/或由膜 1204 完整性的失稳和/或膜 1204的增薄引起和/或与之相关。

在一些实施例中，如图 12C 所示，使得膜 1204 向内弯曲可以促进从膜 1204 的孔排出，如上文第三节中进一步描述的，这可以用于从具有一个以上的插入孔的膜上去除孔。

在一些实施例中，第二溶液 1208 可包括孔，以便在冲洗掉膜材料/溶剂溶液1206 以形成膜 1204 后，可立即启动孔插入步骤。这可以减少形成带孔的膜所需的时间，但是如果需要大量的第二溶液 1208 来冲洗膜材料/溶剂并减薄膜 1204，则可能导致使用或浪费更多的孔材料。

在其他实施例中，使用第二溶液 1208 一次或多次冲洗来移除膜材料/溶剂溶液1206，所述第二溶液 1208 可能不包括孔，以减少材料成本和珍贵试剂的使用。当膜减薄完成时，可以引入具有孔的缓冲溶液，所述缓冲剂可以具有与所述第二溶液 1208 相同的渗透势。这项技术可能需要花更长的时间，但可能会需要使用较少的孔材料。

图 13 总结了上述各种渗透势差的影响，在考虑顺式侧溶液渗透势的情况下，通过从顺式侧溶液的渗透势中减去反式侧溶液的渗透势 (Δosmo = osmo(顺式) – osmo(反式))，计算出参考渗透势和渗透势差（即，渗透度差或渗透压差）。在这一框架下，当反式侧溶液的渗透势大于顺式侧溶液的渗透势时，渗透势 δ 为负，这使得水跨膜 1304 流动并进入孔贮存器 1300，这进而使得膜 1304 向外弯曲；当顺式侧和反式侧的渗透势相等时，渗透势 δ 为零，并且膜 1304 保持平坦或处于无应力状态，因为没有水从孔贮存器 1300 流入或流出；并且当反侧溶液的渗透势小于顺式侧溶液的渗透势时，渗透势 δ 为正，并且水跨膜 1304 流动并离开孔贮存器 1300，这使得膜 1304 向内弯曲。

在膜向外弯曲之后或在膜向外弯曲的过程中，可以在膜的上放引入含有纳米孔的溶液以开始穿孔过程。例如，在一些实施例中，可以首先使用渗透缓冲剂建立弯曲的膜，然后可以引入具有纳米孔的缓冲剂来冲洗渗透缓冲剂。在一些实施例中，具有纳米孔的缓冲剂可以具有与渗透缓冲剂相同的渗透势，但是它也可以具有比渗透缓冲剂更高或更低的渗透势，以便在穿孔步骤期间增加或减少弯曲量。在其他实施例中，用于弯曲膜的渗透缓冲剂还可以包括纳米孔，使得穿孔步骤可以与膜弯曲步骤同时发生。

图 14 总结了渗透势 δ 在各种产率上的一般趋势，这些趋势是基于大量的实验观察得到的，下文将更详细地描述其中一些趋势。如图 14 所示，产生向外弯曲的膜的负渗透电位 δ 导致更高的单孔产率和更高的潜在孔产率，其中可以表征孔（即，单孔、多孔和势孔），并且可以基于对来自例如孔的工作电极的电信号的分析来表征膜（即，双层、原双层、短（无膜））。随着渗透势 δ 变为更小负的值或更大正的值，单孔产率和潜在孔产率一般呈下降的趋势。

图 15 和图 16 示出一些实验数据，这些数据显示在某些条件下，相比在正 Δosmo (80 osmo/L) 或较小的负 Δosmo (-100 osmo/L) 下进行穿孔步骤，-180 osmo/L的 Δosmo 在穿孔过程中产生显著更高的潜在孔产率和单孔产率。

图 17 和图 18 示出测试更大范围的不同 Δosmo 的附加实验数据。图 17 示出从 -146 osmo/L 到 220 osmo/L 的 Δosmo 的影响，图 18 示出从 -175 osmo/L 到 5osmo/L 的 Δosmo 的影响。该数据通常支持图 14 中呈现的趋势，如上所述，图 14 是对更大的数据集的提炼。

在一些实施例中，穿孔期间的 Δosmo 至少为 -10、-20、-30、-40、-50、-60、-70、-80、-90、-100、-110、-120、-130、-140、-150、-160、-170、-180、-190、-200、-210、-220、-230、-240、-250、-260、-270、-280、-290、-300 mOsm/kg（其中至少 -10 表示 -10、-11、-12等）。换言之，在一些实施例中，穿孔期间的 Δosmo 是负的，并且以 10 mOsm/kg 为增量具有至少 10-500 mOsm/kg 的绝对值。在其他实施例中，Δosmo 是负的并且具有的绝对值为10-2000 mOsm/kg、或 10-1500 mOsm/kg、或 10-1000 mOsm/kg 或 10-900 mOsm/kg、或10-800 mOsm/kg、或 10-700 mOsm/kg、或 10-600 mOsm/kg、或 10-500 mOsm/kg、或 10-400 mOsm/kg、或 10-300 mOsm/kg、或 10-200 mOsm/kg、或 50-500 mOsm/kg、或 50-400mOsm/kg、或 50-300 mOsm/kg、或 50-200 mOsm/kg、或 100 至 500 mOsm/kg、或 100-400mOsm/kg、或 100-300 mOsm/kg 或 100-200 mOsm/kg。这些负 Δosmo 值特别适用于在顺式侧引入孔溶液的实施例中。

在一些实施例中，Δosmo 可以表示为渗透度较小的一侧相对于渗透度较大的一侧的分数或百分比。例如，-20% Δosmo 指顺式侧渗透度为反式侧渗透度的 80%。如果顺式侧为零渗透度的纯水，则 Δosmo 将为 -100%（顺式侧渗透度为反式侧渗透度的 0%）。在一些实施例中，Δosmo 大约为 -5%、-10%、-15%、-20%、-25%、-30%、-35%、-40%、-45%、-50%、-55%、-60%、-65%、-70%、-75%、-80%、-85%、-90%、-95% 或 -100%。在一些实施例中，Δosmo 至少约为 -5%、-10%、-15%、-20%、-25%、-30%、-35%、-40%、-45%、-50%、-55%、-60%、-65%、-70%、-75%、-80%、-85%、-90% 或 -95%。在一些实施例中，Δosmo 不超过约 -5%、-10%、-15%、-20%、-25%、-30%、-35%、-40%、-45%、-50%、-55%、-60%、-65%、-70%、-75%、-80%、-85%、-90%、-95% 或 -100%。在一些实施例中，如本段所述，Δosmo 具有正百分比而非负百分比。

在其他实施例中，当从反式侧插入孔时（即，孔被载入孔中，然后在孔的开口的上方形成膜），则 Δosmo 可以是正值，并且具有如上所述的用于顺式侧孔插入的相同绝对值。在一些实施例中，即使当从反式侧插入孔时，负的 Δosmo 仍然可以增加穿孔率或穿孔量，因为弯曲的膜无论弯曲的方向如何，在双层区域中可能具有较少的溶剂，这可能导致较高的穿孔概率。类似地，当从顺式侧插入孔时，正的 Δosm 也可以增加穿孔。

IV 计算机系统

本文提到的任何计算机系统视情况均可以利用任何数量的子系统。这种子系统的实例在图 11 的计算机系统 1110 中示出。在一些实施方案中，计算机系统包括单个计算机设备，其中子系统可以是计算机设备的组件。在其他实施例中，计算机系统包括多个计算机设备，每个计算机设备是具有内部组件的子系统。计算机系统可以包括台式计算机和膝上型计算机、平板电脑、移动电话和其他移动装置。

图 11 所示的子系统经由系统总线 1180 互连。示出附加子系统，诸如打印机1174、键盘 1178、存储装置 1179、监视器 1176（其与显示适配器 1182 联接）等。耦合至I/O 控制器 1171 的外围装置和输入/输出 (I/O) 装置可以通过本领域已知的任何数量的装置，诸如 I/O 端口 1177（例如，USB、FireWire^®）连接至计算机系统。例如，I/O 端口1177 或外部接口 1181（例如，以太网，Wi-Fi 等）可用于将计算机系统 1110 连接至广域网诸如因特网、鼠标输入装置或扫描仪。经由系统总线 1180 的互连允许中央处理器 1173与每个子系统通信并控制对来自系统存储器 1172 或存储装置 1179（例如，固定磁盘，诸如硬盘驱动器，或光盘）的多个指令的执行，以及子系统之间的信息交换。系统存储器 1172和/或存储装置 1179 可以具体表现为计算机可读介质。另一个子系统是数据收集装置1175，诸如照相机、麦克风、加速度计等。本文提到的任何数据都可以从一个组件输出到另一组件，并可以输出给用户。

计算机系统可以包括多个相同的部件或子系统，例如，通过外部接口 1181、通过内部接口或通过可移动存储装置连接在一起，该可移动存储装置可以从一个部件连接或移动至另一个部件。在一些实施例中，计算机系统、子系统或装置在网络上通信。在这种情况下，一台计算机可视为客户端，另一台计算机可视为服务器，其中每台计算机可视为同一计算机系统的一部分。客户端和服务器可以各自包含多个系统、子系统或组件。

实施例的各方面可以使用硬件电路（例如，APSIC 或 FPGA）和/或使用具有一般可编程处理器的计算机软件，以控制逻辑的形式，以模块化或集成方式来实施。如本文所用，处理器可包括单核处理器、在同一集成芯片上的多核处理器、或在单电路板上或联网的多个处理单元，以及专用硬件。基于本文提供的公开内容和教导，本领域普通技术人员将知道并理解使用硬件以及硬件和软件的组合来实现本发明的实施方案的其他方式和/或方法。

可以使用任何合适的计算机语言诸如 Java、C、C++、C#、Objective-C、Swift 或脚本语言诸如 Perl 或 Python，使用例如传统技术或面向对象技术，将本申请中描述的任何软件组件或功能实现为由处理器执行的软件代码。软件代码可以作为一系列指令或命令存储在计算机可读介质上，以进行存储和/或传输。合适的非暂时性计算机可读介质可以包括随机存取存储器 (RAM)、只读存储器 (ROM)、磁性介质诸如硬盘驱动器或软盘、或者光学介质诸如光盘 (CD) 或 DVD（数字通用光盘）、闪存等。所述计算机可读介质可以是这种存储或传输设备的任何组合。

也可以使用载波信号对此类程序进行编码和发送，载波信号适合于通过符合包括互联网在内的各种协议的有线、光学和/或无线网络来传输。如此，计算机可读介质可以使用经这种程序编码的数据信号来创建。可以将以程序代码编码的计算机可读介质与兼容装置打包在一起，或者与其他装置分开提供（例如，经由互联网下载）。任何此类计算机可读介质可以驻留在单个计算机产品（例如，硬盘驱动器、CD 或整个计算机系统）上或内部，并且可以存在于系统或网络内的不同计算机产品上或内部。计算机系统可以包括监测器、打印机或其他合适的显示器，用于向用户提供本文提到的任何结果。

本文描述的任何方法可以由包括一个或多个处理器的计算机系统完全或部分地执行，该计算机系统可以构造为用于执行步骤。因此，实施方案可以针对被配置成执行本文描述的任何方法的步骤的计算机系统，可能具有执行相应步骤或相应步骤组的不同组件。尽管以编号的步骤呈现，但是可以同时或在不同时间或以不同顺序执行本文所述方法的步骤。此外，部分的这些步骤可以与其他方法中其他步骤的部分一起使用。另外，全部或部分步骤可以任选。另外，任何方法的任何步骤都可以用模块、单元、电路或用于执行这些步骤的系统的其他装置来执行。

在不脱离本发明实施例的精神和范围的情况下，可以以任何合适的方式组合特定实施例的具体细节。然而，本发明的其他实施例可以针对与每个单独方面或者这些单独方面的特定组合有关的特定实施例。

尽管为了清楚理解的目的先前已经相当详细地描述了前述实施例，但是本发明并不局限于所提供的细节。还有许多实现本发明的替代方法。所公开的实施例是说明性的而不是限制性的。为了说明和描述的目的，已经给出了本发明的示例性实施例的以上描述。并不旨在穷举本发明或将本发明限制为所描述的精确形式，并且根据以上教导，许多修改和变化是可能的。

除非特别指出是相反情况，否则对“一个”、“一种”或“该”的引用旨在表示“一个或更多个”。除非特别指出是相反情况，否则“或”的使用旨在表示“包含或”，而不是“排除或”。提及“第一”组件并不一定要求提供第二组件。此外，除非明确说明，否则对“第一”或“第二”组件的引用仅仅是为了区分组件，并不是将所引用的组件限于特定位置或顺序。术语“基于”旨在表示“至少部分基于”。

本文提及的所有专利、专利申请、出版物和说明书全文出于所有目的以引用方式并入本文。没有一项被认为是现有技术。

Claims (26)

1.一种在膜中插入纳米孔的方法，所述方法包括：

用具有第一渗透压的第一缓冲剂填充孔的孔贮存器，所述孔包含工作电极，其中所述孔是流动池中孔的阵列的一部分；

在所述孔的上方形成膜以将所述第一缓冲剂包封在所述孔贮存器内；

使具有第二渗透压的第二缓冲剂在所述膜上方流动，使得所述膜位于所述第一缓冲剂与所述第二缓冲剂之间，其中所述第一缓冲剂具有比所述第二缓冲剂更高的渗透压；

由于来自所述第二缓冲剂的流体跨所述膜扩散至所述第一缓冲剂中，使所述膜向外弯曲并远离所述工作电极；以及

在向外弯曲的膜中插入纳米孔。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二渗透压减去所述第一渗透压是负的并且具有至少10 mOsm/kg的量级。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二渗透压减去所述第一渗透压是负的并且具有至少50 mOsm/kg的量级。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二渗透压减去所述第一渗透压是负的并且具有至少100 mOsm/kg的量级。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二渗透压减去所述第一渗透压是负的并且具有至少150 mOsm/kg的量级。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述膜包含脂质。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述膜包含三嵌段共聚物。

8.根据权利要求1所述的方法，其中形成所述膜的步骤包括使溶解在溶剂中的膜材料在所述孔的上方流动。

9.根据权利要求8所述的方法，其中使所述第二缓冲剂流动的步骤包括用所述第二缓冲剂置换所述流动池中的所述膜材料和溶剂以在所述孔的上方留下膜材料层。

10.根据权利要求9所述的方法，其中通过所述第二缓冲剂在所述膜材料层的上方的流动而将所述膜材料层减薄成所述膜。

11.根据权利要求9所述的方法，其中通过使用所述工作电极对所述膜材料层施加电压刺激而将所述膜材料层减薄成所述膜。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二缓冲剂包含多个纳米孔。

13.根据权利要求12所述的方法，其中每个纳米孔是分子复合物的一部分，所述分子复合物包含纳米孔、拴接至所述纳米孔的聚合酶和与所述聚合酶缔合的核酸。

14.根据权利要求1所述的方法，其中在所述膜中插入所述纳米孔的步骤包括使包含所述纳米孔的第三缓冲剂在所述膜的上方流动。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三缓冲剂与所述第二缓冲剂具有相同的渗透压。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三缓冲剂与所述第二缓冲剂具有不同的渗透压。

17.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括用所述工作电极测量电信号以检测所述膜中的纳米孔插入。

18.一种用于在膜中插入纳米孔的系统，所述系统包含：

流动池，所述流动池包含孔的阵列，每个孔包含孔贮存器和工作电极；

第一流体贮存器，其包含具有第一渗透压的第一缓冲剂；

第二流体贮存器，其包含具有第二渗透压的第二缓冲剂，其中所述第一缓冲剂具有比所述第二缓冲剂更高的渗透压；

第三流体贮存器，其包含溶解在溶剂中的膜材料；

第四流体贮存器，其包含第三缓冲剂和多个纳米孔；

泵，其配置为与所述流动池、所述第一流体贮存器、所述第二流体贮存器和所述第三流体贮存器流体连通；以及

控制器，其编程为：

将所述第一缓冲剂泵入到所述流动池中以用所述第一缓冲剂填充至少一个孔贮存器；

将溶解在所述溶剂中的所述膜材料泵入到所述流动池中以将所述第一缓冲剂从所述流动池中置换，同时将所述第一缓冲剂留在所述孔贮存器中；

将所述第二缓冲剂泵入到所述流动池中以将所述膜材料和溶剂从所述流动池中置换，以便在所述孔的上方留下膜材料层；

通过驱动所述第二缓冲剂在所述膜材料层的上方流动和/或通过向所述膜材料层施加电压而将所述膜材料层减薄成膜；

等候一段时间，待减薄的膜向外弯曲远离所述工作电极；以及

将具有所述多个纳米孔的所述第三缓冲剂泵入到所述流动池中，以在所述向外弯曲的膜中插入纳米孔。

19.根据权利要求18所述的系统，其中所述控制器进一步编程为通过用所述工作电极测量电信号以检测所述膜中的纳米孔插入。

20.根据权利要求18所述的系统，其中所述第二渗透压减去第一渗透压是负的并且具有至少10 mOsm/kg的量级。

21.根据权利要求18所述的系统，其中所述第二渗透压减去第一渗透压是负的并且具有至少50 mOsm/kg的量级。

22.根据权利要求18所述的系统，其中所述第二渗透压减去第一渗透压是负的并且具有至少100 mOsm/kg的量级。

23.根据权利要求18所述的系统，其中所述第二渗透压减去第一渗透压是负的并且具有至少150 mOsm/kg的量级。

24.根据权利要求18所述的系统，其中所述一段时间是预先确定的。

25.根据权利要求18所述的系统，其中所述一段时间由所述控制器确定，所述控制器进一步编程为用所述工作电极测量电信号以检测所述膜的弯曲。

26.根据权利要求25所述的系统，其中所述电信号包含所述膜的电容和/或电阻。

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