KR102245192B1 - 나노포어를 이용한 표적 검출 - Google Patents

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Abstract

샘플에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 입자를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 표적 분자 또는 입자가 리간드에 결합하게 하고 결합 도메인이 결합 모티프에 결합하게 하는 조건 하에, (i) 표적 분자 또는 입자에 결합할 수 있는 리간드 및 결합 도메인을 포함하는 융합 분자, 및 (ii) 결합 도메인이 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 모티프를 포함하는 폴리머 스캐폴드와 샘플을 접촉시키는 단계; (b) 디바이스의 내부 공간을 두 개의 용적으로 분리하는 구조에서 개구를 포함하는 포어를 포함하는 디바이스로 폴리머를 적재하고, 폴리머를 포어를 통해 한 용적으로부터 다른 용적으로 통과시키도록 디바이스를 구성하는 단계(여기에서 디바이스는 포어를 통과하는 대상을 식별하도록 구성된 센서를 더 포함한다); 및 (c) 센서를 이용하여, 결합 모티프에 결합된 융합 분자 또는 입자가 표적 분자 또는 입자에 결합되는지를 결정하고, 이로 인해 샘플에 표적 분자 또는 입자가 존재하는지를 검출하는 단계를 포함한다.

Description

나노포어를 이용한 표적 검출{TARGET DETECTION WITH NANOPORE}
나노-규모 및 마이크로-규모 입자, 예를 들어 순환성 종양 세포, 박테리아 및 바이러스의 검출은 매우 높은 임상적 유용성을 가진다. 현재 이용 가능한 방법으로는 면역조직화학법 및 핵산-기반 검출이 있으며, 민감성 검출을 실행하기 전에 전형적으로 세포 증식을 필요로 한다.
분자적 검출 및 정량이 또한 중요하며, 이는 분자의 유형에 따라 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열은 프로브 또는 프라이머에 대한 서열 상보성에 의해, 교잡(hybridization) 및/또는 증폭을 통해, 또는 몇몇의 경우에는, 서열을 인식하는 단백질을 이용하여 검출될 수 있다. 다른 한편으로, 단백질은 일반적으로 특이적으로 단백질을 인식하고 이에 결합하는 항체로 검출된다. 이와 관련하여 효소-결합 면역 흡착 검정(ELISA)은 매우 상업화되어 있고 일반적으로 사용된다.
다양한 다른 대분자 또는 소분자, 예를 들어 탄수화물, 화합물, 이온, 및 원소를 검출 또는 정량하는 방법이 또한 존재한다.
분자뿐 아니라 입자, 예를 들어 종양 세포 및 병원성 유기체를 고도로 민감하게 검출하는 방법 및 시스템은 특히, 임상적으로, 예를 들어 병원체 검출 및 질환 진단을 위한 광범위한 용도를 가진다. 또한, 이러한 검출은 의학적 치료 및 건강 프로그램의 개인화를 가능하게 하고; 효과적인 약학적 약물 화합물 및 생체 치료제에 대한 검색을 용이하게 하고; 임상의가 비정상적인 호르몬, 이온, 단백질, 또는 환자의 신체에 의해 생산된 다른 분자를 식별하고 및/또는 독, 불법 약물, 또는 환자에게 섭취되거나 주사된 다른 해로운 화학물질의 존재를 식별하는 것을 가능하게 할 수 있다.
분자 및 입자의 검출을 위해 현재 이용 가능한 기술은 일반적으로 비싸고, 노동 집약적이며, 숙련 집약적이고, 및/또는 시간 집약적이다. 따라서, 정확한 결과를 빠르고, 싸고, 쉽게 산출할 수 있는 개선된 검출 기술이 필요하다.
본원에서 개시된 다양한 양태는 전술된 필요성 중 하나 이상을 성취할 수 있다. 본원에서 개시된 시스템 및 방법 각각은 여러 양태를 가지고 있으며, 이것들 중 단 하나가 전적으로 그것의 바람직한 속성에 대한 원인은 아니다. 하기 청구범위에 의해 표현된 바와 같이 본 개시물의 범위를 제한하지 않으면서, 더 중요한 특징들이 간략하게 논의될 것이다. 본 논의, 구체적으로는 "상세한 설명"이라는 제목의 섹션을 읽으면, 본원에서 기술된 샘플 특징이 어떻게 개선된 시스템 및 방법을 제공하는지를 이해할 수 있을것이다.
한 구체예에서, 본 개시물은 표적 분자 또는 입자가 샘플에 존재하는지를 검정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 표적 분자 또는 입자가 리간드에 결합하고 결합 도메인이 결합 모티프에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서, (i) 표적 분자 또는 입자에 결합할 수 있는 리간드 및 결합 도메인을 포함하는 융합 분자, 및 (ii) 융합 분자의 결합 도메인이 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 모티프(motif)를 포함하는 폴리머 스캐폴드(scaffold)와 샘플을 접촉시키는 단계; (b) 디바이스의 내부 공간을 두 개의 용적으로 분리하는 포어를 포함하는 디바이스에 폴리머를 로딩하고, 폴리머를 포어를 통해 한 용적에서 다른 용적으로 통과시키도록 디바이스를 구성하는 단계로서, 상기 디바이스는 포어를 통과하는 대상을 식별하도록 구성된 센서를 포함하는 것인, 단계; 및 (c) 센서를 이용하여, 결합 모티프에 결합된 융합 분자가 표적 분자 또는 입자에 결합되는지를 결정하고, 이로 인해 샘플에서의 표적 분자 또는 입자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 표적 분자는 단백질, 펩타이드, 핵산, 화합물, 지질, 수용체, 이온, 및 요소로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 표적 입자는 단백질 복합체 및 단백질 응집체, 펩타이드 응집체, 단백질/핵산 복합체, 단편화된 또는 완전 조립된 바이러스, 박테리아, 세포, 및 세포 응집체로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 표적 분자 또는 입자가 샘플에 존재하는지를 검정하는 방법의 단계 (a)는 단계 (b) 이전에 수행된다. 일부 양태에서, 단계 (b)는 단계 (a) 이전에 수행된다.
일부 양태에서, 상기 방법은 표적 분자 또는 입자와 리간드 간의 결합을 변경하는 것으로 의심되는 조건을 적용하여 다시 상기 결정을 수행하는 단계를 더 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조건은 샘플로부터의 표적 분자 또는 입자의 제거, 결합에 대하여 표적 분자 또는 입자 또는 리간드와 경쟁하는 시약의 첨가, 및 pH, 염 농도 또는 온도의 변화로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 결합 모티프는 결합 도메인에의 결합을 위한 화학적 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 화학적 변형은 아세틸화, 메틸화, 서몰레이션(summolation), 글리코실화, 인산화 및 산화로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 폴리머는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 펩타이드 핵산(PNA), DNA/RNA 하이브리드(hybrid) 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리머는 합성 스캐폴드이다.
일부 양태에서, 결합 도메인은 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix), 징크 핑거(zinc finger), 류신 지퍼(leucine zipper), 윙드 헬릭스(winged helix), 윙드 헬릭스 턴 헬릭스(winged helix turn helix), 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 및 HMG-박스(HMG-box)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 결합 도메인은 잠금 핵산(locked nucleic acid; LNA), PNA, 전사 활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease; TALEN), 군집성 주기적인 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복서열 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat; CRISPR), 펩타이드, 덴드리머 및 압타머(DNA 및/또는 단백질)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 리간드는 단백질이다. 일부 양태에서, 리간드는 항체, 항체 단편, 에피토프, 호르몬, 신경전달물질, 사이토카인, 성장 인자, 세포 인식 분자, 핵산, 펩타이드 및 수용체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 리간드는 압타머(예를 들어, DNA, 단백질 또는 DNA/단백질)이다. 일부 양태에서, 리간드는 소분자 화합물이다.
일부 양태에서, 결합 도메인 및 리간드는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 금속 결합, 반 데르 발스 힘(van der Walls force), 소수성 상호작용 또는 평면 적층 상호작용(planar stacking interaction)을 통해 연결되거나, 또는 연속적 폴리펩타이드로서 번역되어 융합 분자를 형성한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 표적 분자, 표적 입자 또는 표적/리간드 복합체에 결합할 수 있는 검출 가능한 라벨과 샘플을 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
일부 양태에서, 폴리머는 결합 모티프의 적어도 두 개의 유닛을 포함한다.
일부 양태에서, 폴리머는 적어도 두 개의 다른 결합 모티프를 포함한다. 이러한 양태에서, 샘플은 적어도 두 개의 융합 분자와 접촉되어 있으며, 융합 분자 각각은 적어도 두 개의 다른 결합 모티프 중 다른 하나에 결합할 수 있는 다른 결합 도메인, 및 다른 표적 분자 또는 입자에 결합할 수 있는 다른 리간드를 포함하고; 센서는 각각의 결합 모티프에 결합된 융합 분자가 표적 분자 또는 입자에 결합되는지를 식별하도록 구성된다.
일부 양태에서, 센서는 두 개의 용적에 걸쳐 전압을 인가하도록 구성된 전극을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 디바이스는 상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하는데, 상부 챔버는 제1 포어를 통해 중간 챔버와 교류하고, 중간 챔버는 제2 포어를 통해 하부 챔버와 교류한다.
한 양태에서, 제1 포어 및 제2 포어는 직경이 약 1 nm 내지 약 100 nm이다. 이러한 포어는 분자, 예를 들어 단백질 및 핵산을 검출하는데 적합할 수 있다. 한 양태에서, 제1 포어 및 제2 포어는 직경이 약 50,000 nm 정도로 크며, 이러한 포어는 더 큰 입자, 예를 들어 종양 및 박테리아 세포를 검출하는데 적합할 수 있다.
일부 양태에서, 포어는 서로 약 10 nm 내지 약 1,000 nm 이격되어 있다. 일부 이러한 양태에서, 포어 간의 이러한 거리는 폴리머 스캐폴드가 제1 및 제2 포어 둘 다를 통해 동시에 연장할 수 있는 크기이다. 다른 양태에서, 포어는 서로 1,000 nm 이상 이격되어 있다.
일부 양태에서, 각각의 챔버는 전원 장치에 연결하기 위한 전극을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 각각의 결합 모티프에 결합된 융합 분자가 표적 분자 또는 입자에 결합되는지를 다시 식별하기 위해, 결합 모티프가 적어도 하나의 포어를 통과한 후 역방향으로 폴리머를 이동시키는 단계를 더 포함한다.
또한, 표적 분자 또는 입자의 존재를 검출하는 키트, 패키지 또는 혼합물이 제공된다. 일부 양태에서, 키트, 패키지 또는 혼합물은 (a) 자체가 표적 분자 또는 입자에 결합할 수 있는 리간드 및 결합 도메인인 융합 분자, (b) 결합 도메인이 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 모티프로 구성된 폴리머 스캐폴드, (c) 디바이스의 내부 공간을 두 개의 용적으로 분리하는 포어로 구성된 디바이스로서, 상기 디바이스는 폴리머를 포어를 통해 한 용적에서 다른 용적으로 통과시키도록 구성되고, 결합 모티프가 (i) 융합 분자에 결합되는 한편 리간드는 표적 분자 또는 입자에 결합되거나, (ii) 융합 분자에 결합되는 한편 리간드는 표적 분자 또는 입자에 결합되지 않거나, 또는 (iii) 융합 분자에 결합되지 않는지를 식별하도록 구성된 센서를 추가로 포함하는 디바이스로 구성된다. 일부 양태에서, 디바이스는 세 개의 용적, 즉 상부 챔버, 중간 챔버, 및 하부 챔버가 존재하는 디바이스의 내부 공간을 더 분리하는 제2 포어를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 키트, 패키지 또는 혼합물은 표적 분자 또는 입자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 더 포함한다. 일부 양태에서, 상기 샘플은 표적 분자, 표적 입자, 리간드/표적 복합체 또는 리간드/입자 복합체에 결합할 수 있는 검출 가능한 라벨을 더 포함한다.
비 제한적이며, 단지 예시에 의해 특징을 도시하는 도면이 본 개시물의 구체예로서 제공된다.
도 1은 개시된 방법의 한 구체예로 표적 분자 또는 입자의 검출을 도시한다.
도 2는 더 구체적인 예의 삽도를 제공하는데, 이중 가닥 DNA는 폴리머 스캐폴드로서 사용되고, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 외피 단백질은 리간드로서 사용된다. 이 조합은 항-HIV 항체를 검출하는데 사용된다.
도 3은 세 가지 예시적 분자의 대표적이고 이상화된 전류 프로파일을 나타내며, 표적 분자(또는 입자)와 융합 분자 간의 결합이, 융합 분자 단독 또는 DNA 단독과 비교하여, 다른 전류 프로파일을 갖기 때문에 그것이 나노포어를 통과할 때 검출될 수 있다는 것을 입증한다. 구체적으로, 도 3a는 실험 버퍼 및 양의 인가 전압(applied voltage)에서 더 높은 염 농도(>0.4 M KCl, 예를 들어 1M KCl에서)와 일치하는 전류 프로파일을 나타내며, 포어를 통해 양의 전류 흐름을 발생시킨다. 또 다른 예로서, 도 3b는 실험 버퍼 및 다시 양의 인가 전압에서 더 낮은 염 농(<0.4 M KCl, 예를 들어, 100 mM KCl에서)와 일치하는 전류 프로파일을 나타낸다. 또 다른 예로서, 도 3c는 실험 버퍼 및 음의 인가 전압에서 더 낮은 염 농도(<0.4 M KCl, 예를 들어, 100 mM KCl에서)와 일치하는 전류 프로파일을 나타낸다.
도 4는 폴리머 스캐폴드 내 상이한 결합 모티프를 포함함으로서의 본 발명의 다중화 능력을 도시한다. 이러한 다중화는 하나의 나노포어 또는 하나 이상의 나노포어를 이용하여 달성될 수 있다.
도 5a 내지 c는 다수의 챔버를 분리하는 적어도 두 개의 포어를 구비한 나노포어 디바이스를 도시한다.
구체적으로는, 도 5a는 각 포어의 독립적인 전압 제어(V 1 또는 V 2 ) 및 전류 측정(l 1 , 또는 l 2 )에 대한 이중 포어 칩 및 이중-증폭기 구성의 개략도이다. 세 개의 챔버(A 내지 C)가 제시되며, 이는 공통의 포어에 의한 것을 제외하고 용적으로 분리된다.
도 5b는 전기적으로, l 2 및 l 2 를 효과적으로 분리시키도록 모든 접근 저항을 최소화하는 디바이스를 구성함으로써, V 1 및 V 2 가 원칙적으로 각각의 나노포어의 저항에 걸쳐 있는 개략도이다.
도 5c는 각 전압 힘의 방향을 보여주는 화살표를 이용하여, 전압 경쟁이 제어에 사용되는 개략도를 도시한다.
도 6a 내지 6c는 두 개의 챔버를 연결하는 하나의 포어를 가진 나노포어 디바이스 및 그 실시예를 도시한다. 구체적으로, 도 6a는 나노포어 디바이스의 개략도이다. 도 6b는 포어를 통과하는 이중 가닥 DNA의 통로에서 발생하는 봉쇄 이벤트를 나타내는 대표적인 전류 트레이스(trace)를 도시한다. 전류 진폭 시프트의 양(Δl = l 0 - l B ) 및 기간은 통과 이벤트를 정량화하는데 사용된다. 도　6c는 16분 동안 기록된 모든 봉쇄 이벤트에 대하여 전위 시간(t D )에 대한 전류의 양의 변화(Δl)를 보여주는 산점도를 도시한다.
도 7a 및 7b는 본 발명에 따라 제작된 나노포어 디바이스의 한 구체예에서 측정된 전류 트레이스를 도시한다. 제공된 전류 트레이스는 미결합 dsDNA가 0.4 M 이하의 KCl 농도에서 전류 증강 이벤트를 유발한다는 것을 보여준다. 전류 증강은 제공된 실험에서 하향 시프트로서 나타나는데, 이는 전압 및 전류가 둘 다 음수이기 때문이다(도 3c에서와 같음). 구체적으로는, 0.1M KCl 및 -200 mV에서 10 내지 11 nm 직경 포어를 사용하는 DNA 단독 제어 실험에서, 5.6 kb dsDNA 스캐폴드(도 7a)는 진폭이 50 내지 70 pA이고 기간이 10 내지 200 마이크로초인 간략한 전류 증강 이벤트를 유발한다. 유사하게, 48 kb Lambda DNA(도　7b)는 진폭이 50 내지 70 pA이고 기간이 50 내지 2000 마이크로초인 전류 증강 이벤트를 유발한다.
도 8은 폴리머 스캐폴드의 개략도를 도시한다. 구체적으로, 도 8은 5,631 bp dsDNA 스캐폴드 및 총 10개의 VspR 결합 부위의 위치를 보여준다. 10개의 VspR 결합 부위 중에서, 5개는 14개의 염기쌍 서열이고, 3개는 다른 18개의 염기쌍 서열이고, 2개는 27개의 염기쌍 서열이다. 또한, 결합 부위 간의 거리가 도시된다(염기쌍으로).
도 9a 및 9b는 각각 나노포어를 통과하는 스캐폴드를 구비한 나노포어의 구체예의 개략도이다. 각각은 또한 개시된 나노포어 디바이스의 한 구체예에 의해 스캐폴드 통로와 관련하여 측정된 전류 프로파일을 나타낸다. 특히, 도 9(a) 및 9(b)는 DNA 스캐폴드 단독 (a) 및 VspR-결합된 DNA (b)를 이용하는 이벤트를 비교한다. 구체적으로, (a)는 포어를 통과하는 5,631 bp dsDNA 스캐폴드, 및 스캐폴드가 포어를 통과할 때 대표적인 전류 증강 이벤트(100 마이크로초 동안 지속되는 50 pA 하향 시프트)를 도시하는 그래프를 보여준다. (b)는 포어를 통과하는 dsDNA 스캐폴드에 결합된 다수의 VspR, 및 VspR-결합된 스캐폴드가 포어를 통과할 때 대표적인 전류 감쇠 이벤트(1.1 밀리초 동안 지속되는 150 pA 상향 시프트)를 도시하는 그래프를 보여준다. -100 mV의 인가 전압에서, 오픈 채널 전류는 음수이므로, 하향 이벤트는 전류 증강 이벤트에 해당하고, 상향 이벤트는 전류 감쇠 이벤트에 해당한다(도 3c에서와 같음). 베이스라인이 디스플레이 목적을 위해 0에 맞춰지더라도, 시프트 방향은 유지된다.
도 10은 포어를 통과하는 VspR-결합된 스캐폴드와 일치하는 전류 프로파일에서 도시된 10개 이상의 대표적인 전류 감쇠 이벤트를 나타낸다. 모든 시프트는 전류 감쇠와 일치한다; 베이스라인은 디스플레이 목적을 위해 0에 맞춰진다.
도 11은 180 mV 및 1M KCl에서 5.6 kb dsDNA 스캐폴드 및 RecA 단백질과 함께 16 내지 18 nm 직경 나노포어를 사용하는 실험에서 캡쳐된 전류 프로파일에서 도시된 두 개의 대표적인 전류 이벤트를 나타낸다. 첫 번째 이벤트는 70 마이크로초 동안 지속되는 280 pA 평균 전류 감쇠에서 포어를 통과하는 미결합 dsDNA 또는 아마도 유리 RecA(또는 다중 회합된 RecA 단백질)와 일치한다. 두 번째 이벤트는 2.7 밀리초 동안 지속되는 1.1 nA 평균 전류 감쇠에서 포어를 통과하는 RecA-결합된 스캐폴드와 일치한다. RecA-결합된 이벤트는 일반적으로 더 긴 기간과 함께 더 깊은 봉쇄를 나타낸다.
도 12는 4개 이상의 전류 프로파일을 도시하며, 각각 포어를 통과하는 RecA-결합된 스캐폴드와 일치하는 대표적인 전류 이벤트를 나타낸다.
도 13은 본원에서 기술된 방법의 구체예를 사용하여 실시된 한 실험에서 10분 동안 기록된 1385번의 이벤트 모두를 도시하는 산점도 및 막대그래프를 나타낸다. 도시된 그래프에서, 각 이벤트에 대하여 하나의 데이터 포인트가 제공된다. 특히, 도시된 그래프는 (a) 로그-스케일의 지속 기간으로, 초 단위의 지속 기간에 대한 nS 단위의 최대 컨덕턴스(conductance)(mV 단위의 전압으로 나누어진 pA 단위의 최대 전류 시프트), (b) 최대 컨덕턴스 시프트 값의 확률 막대그래프, (c) 로그-스케일의 지속 기간으로, 지속 기간에 대한 평균 컨덕턴스(전압으로 나누어진 평균 전류 시프트), (d) 평균 컨덕턴스 값의 확률 막대그래프 및 (e) 로그-스케일의 지속 기간의 확률 막대그래프를 나타낸다.
도 14(a 내지 c)는 DNA/RecA 복합체 상의 RecA-항체 및 DNA/RecA 복합체를 검출하는 나노포어 디바이스로부터의 결과를 도시하고, 상기 결과는 이 복합체들을 미결합 DNA 및/또한 유리 RecA와 구별한다.
구체적으로, 도 14(a)는 겔 시프트 검정이다. 구체적으로, DNA/RecA/mAb ARM191 겔 시프트 실험(EMSA)은 다음의 레인을 가진다: 1) 래더(Ladder), 최상단 5000 bp; 2) RecA 라벨링 버퍼에서의 DNA 스캐폴드 단독; 3) DNA/RecA 복합체, 1:1 RecA 단백질 대 이론상 RecA 결합 부위; 4) DNA/RecA/Ab 복합체, 단클론성 Ab ARM191의 1:2000 희석액과 함께 배양된 DNA/Rec; 5) Ab 라벨링 버퍼에서의 스캐폴드 DNA 단독; 및 6) mAb(ARM191)와 혼합된 DNA 스캐폴드.
도 14(b)는 DNA(230 pA, 0.1 ms), DNA/RecA(390 pA, 1.1 ms), 및 가능성 있는 DNA/RecA/Ab(860 pA, 1.5 ms)에 대한 대표적인 이벤트를 나타낸다. RecA-결합된 DNA 이벤트 진폭은 앞선 도면들(도 11 내지 13)보다 균일하게 더 작은데, 이는 이벤트를 측정하는데 사용된 포어가 훨씬 더 크기 때문이다(직경이 27 내지 29 nm).
도 14(c)는 (i) t D 에 대한 |Δ/|의 산점도 및 (ii) 중첩된 2번의 별개의 실험에 대한 |Δ/|의 수평 확률 막대그래프를 도시한다. RecA 단독 대조군 실험에서, 0.5 uM RecA (*)는 1M KCl의 180 mV에서 20 nm 직경 포어로 측정되었으며, 10분 동안 767번의 이벤트를 발생시켰다. 이러한 조건 하에서 RecA 이벤트의 단지 0.6%만이 600 pA 및 0.2 ms의 기준을 초과하였다는 것을 유의해야 한다. 또 다른 실험에서, 세 개의 시약들이 순서대로 1M LiCl에 첨가되었다. 먼저, 0.1 uM DNA(□)는 200 mV에서 20 nm 직경 포어로 측정되었으며, 0.1 이벤트/sec로 402번의 이벤트를 발생시켰다. 포어가 27 nm로 커진 후, 1.25 nM DNA/RecA(●)가 첨가되었으며, 1.44 이벤트/sec로 3387번의 이벤트를 발생시켰다. 마지막으로, 1.25 nM DNA/RecA/Ab(○)를 첨가하여 4.49 이벤트/sec로 4953번의 이벤트를 발생시켰다. 600 pA 및 0.2 ms의 기준을 초과하는 이벤트는 DNA 단독으로 0%에서부터, 첨가된 DNA/RecA로 5.2%(176), 및 첨가된 DNA/RecA/Ab로 최대 9.8%(485)까지 단조적으로 성장하였다. RecA는 DNA에 대하여 나타난 바와 같이, LiCl의 증가된 이벤트 기간을 가질 수 있는 한편, 이벤트 진폭은 600 pA 및 0.2 ms의 기준을 향하여 크게 시프트할 가능성이 낮다.
도 15는 본 개시물의 구체예와 일치하는 폴리머 스캐폴드의 개략도를 도시한다. 구체적으로, 도 15(a)는 다양한 실험에서 사용된 5.6 kb dsDNA 스캐폴드를 나타내며, 스캐폴드는 12-mer 펩타이드-핵산(PNA) 분자에 결합하도록 조작되었고, 각각의 PNA는 아비딘(예를 들어, 뉴트라비딘, 및 또는 1가 스트렙타비딘)에 결합하기 위한 세 개의 비오티닐화된 부위를 가진다. 또한 도 15(b)는 최대 75개의 아비딘 바이오마커 결합 부위를 국한시키는 스캐폴드 상의 25개의 별개의 PNA 결합 부위를 나타낸다.
도 16(a) 내지 (d)는 다음을 도시한다: (a) 나노포어를 통과하는 5.6 kb dsDNA 스캐폴드의 개략도; (b) 나노포어를 통과하는 유리 뉴트라비딘의 개략도; (c) 나노포어를 통과하는 뉴트라비딘에 의해 결합된 세 개의 비오틴 부위 모두를 가진 PNA 라벨링된 dsDNA의 개략도; 및 (d) 본 개시물에 따라 제작된 나노포어 디바이스의 포어 상의 챔버에서 측정된 해당 전류 트레이스. 도 16(d)에서, 전류 트레이스는 DNA 단독, 뉴트라비딘 단독 및 DNA/PNA/뉴트라비딘 복합체를 이용한 별개의 나노포어 실험으로부터의 기록된 전류에서 대표적인 전위 이벤트를 도시한다. 실시예에서 상세히 설명되는 바와 같이, D/P/N 실험의 더 깊고 더 긴 이벤트 패턴은 DNA/PNA/뉴트라비딘 이벤트로서 확인되고 DNA 단독 또는 뉴트라비딘 단독 이벤트와 분명하게 구별된다.
도 17(a) 내지 (c)는 다음을 도시한다: (a) 200 mV에서 10 내지 11 nm 직경 포어를 이용한 3번의 별개의 실험에 대하여 기록된 모든 이벤트의 기간에 대한 전류 이동(t D 에 대한 |Δ/|)의 산점도로서, 실험은 다음을 포함한다: (D) 16분 동안 1301건의 이벤트를 수득하는 1 nM의 5.6 kb dsDNA 단독; (N) 11분 동안 2589건의 이벤트를 수득하는 80 nM의 뉴트라비딘 단독; 및 (D/P/N) 7.3분 동안 4198건의 이벤트를 수득하는 60 pM의 DNA/PNA/Neut 복합체. D/P/N 부분집단은 N 및 D 대조군 실험 집단과 중첩되며, DPN 실험에서 대부분의 이벤트는 미결합 N 이벤트 특성과 일치한다; (b) 세 개의 데이터 세트에 대한 |Δ/|의 수평 확률 막대그래프. 삽도는 t D > 0.08 ms인 578개의 DPN 이벤트의 부분집합에 대한 막대그래프를 나타내며, 이것은 D/P/N 데이터 세트로부터 비-DNA 이벤트를 트리밍(trim) 하려고 시도한다(대조군으로부터, N 이벤트의 8% 및 D 이벤트의 54%는 t D > 0.08 ms여야 한다). 이러한 DPN 이벤트는 |Δ/|가 크게 확산되며, 이 더 긴 기간의 이벤트 중 252건(전체의 6%)은 2.4 nA보다 높은 반면에, 대조군으로부터, 단지 18건의 N 이벤트(0.7%) 및 33건의 D 이벤트(2.5%)만이 (|Δ/|, t D ) > (2.4 nA, 0.08 ms)이다; 및 (c) 다음 레인을 이용한 DNA/PNA/뉴트라비딘 겔 시프트 실험(EMSA): 1) 사이징(sizing) 래더, 최상단 5000 bp; 2) 라벨링 버퍼에서의 DNA 단독; 3) DNA/PNA + 비오틴에 대하여 3x 초과 Neut; 4) DNA/PNA + 비오틴에 대하여 7x 초과 Neut; 5) DNA/PNA + 비오틴에 대하여 16x 초과 Neut; 6) DNA/PNA + 비오틴에 대하여 36x 초과 Neut; 및 7) 라벨링 버퍼 중의 DNA/PNA.
도면의 일부 또는 모두는 예시를 위한 개략적인 대표도이므로, 도시된 요소들의 실제의 상대적인 크기 또는 위치를 도시할 필요는 없다. 도면은 하기 청구범위의 범위 또는 의미를 제한할 목적이 아님을 분명하게 이해해야 하며, 하나 이상의 구체예를 도시할 목적을 위해 제공된다.
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 2014년 12월 23일에 작성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 27748-PCT_CRF_sequencelisting.txt이며 크기가 536 바이트이다.
본 출원서 전반에 걸쳐, 디바이스, 조성물, 시스템, 및 방법의 다양한 구체예를 언급한다. 기술된 다양한 구체예는 다양한 예시적인 예를 제공한다는 것을 의미하지만 대안적 설명으로 해석되어서는 안 된다. 오히려, 본원에서 제공된 다양한 구체예의 설명은 중첩되는 범위에 있을 수 있다는 것에 주목해야 할 것이다. 본원에서 논의된 구체예는 단지 예시일 뿐이며 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
또한, 본 명세서에 걸쳐, 다양한 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서들은 식별 인용문에 의해 참조된다. 이 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서의 개시물은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 단수형 "하나", "하나의" 및 "그"는 문맥상 달리 분명하게 지시되지 않으면 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "전극"은 복수의 전극을 포함하며, 이것들의 혼합물을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "포함하는"은 시스템, 디바이스 및 방법이 나열된 구성요소 또는 단계를 포함한다는 의미이지만, 다른 것들을 배제하려는 의도는 아니다. "~로 필수적으로 구성되는"은 시스템, 디바이스 및 방법을 한정하는데 사용될 때, 조합에 필수적인 의미의 어떤 다른 구성요소 또는 단계를 배제한다는 것을 의미할 것이다. "~로 구성되는"은 다른 구성요소 또는 단계를 배제한다는 것을 의미할 것이다. 이 접속어들 각각에 의해 한정된 구체예는 본 발명의 범위 내에 있다.
범위를 포함하는 모든 수치적 한정, 예를 들어 거리, 크기, 온도, 시간, 전압 및 농도는 0.1의 증분만큼의 (+) 또는 (-)로 변화되는 근사치이다. 항상 분명하게 진술되는 것은 아니지만, 모든 수치적 표기는 용어 "약"이 선행하는 것으로 생각되어야 한다. 또한, 항상 분명하게 진술되는 것은 아니지만, 본원에서 기술된 구성요소들은 단지 예시일 뿐이며, 이것들의 등가물은 업계에 공지되어 있다고 생각되어야 한다.
본원에서 사용된 용어 "내부 공간을 분리하는 포어를 포함하는 디바이스"는 구조 내에 개구를 포함하는 포어를 가진 디바이스를 의미하며, 구조는 내부 공간을 하나 이상의 용적 또는 챔버로 분리한다.
분자 검출
본 개시물은 분자의 검출 및 정량 방법 및 시스템을 제공한다. 이에 더하여, 상기 방법 및 시스템은 또한 또 다른 분자와 결합하는 분자의 친화도를 측정하도록 구성될 수 있다. 또한, 이러한 검출, 정량 및 측정은 효율을 크게 증가시킨 다중화된 방식으로 수행될 수 있다.
도 1은 개시된 방법 및 시스템의 한 구체예이다. 더 구체적으로는, 본 시스템은 검출되거나 정량되는 표적 분자(105)에 결합할 수 있는 리간드(104)를 포함한다. 리간드(104)는 폴리머 스캐폴드(109) 상의 특이적 결합 모티프(101)에 결합할 수 있는 결합 모이어티("결합 도메인"으로 불림)(103)의 일부이거나, 이것에 연결될 수 있다. 즉, 리간드(104) 및 결합 도메인(103)은 융합 분자(102)를 형성한다. 다양한 구체예에서, 융합 분자(102)의 두 개의 구성요소(즉, 리간드(104) 및 결합 도메인(103) 둘 다)는 각각의 표적(예를 들어, 각각 표적 분자(105) 및 결합 모티프(101))에 높은 친화도 및 특이성을 가지고 결합한다.
그러므로, 모든 것이 용액에 존재하는 경우, 융합 분자(102)는, 한쪽 끝에서는, 결합 모티프(101) 및 결합 도메인(103) 간의 특이적 인식 및 결합을 통해 폴리머 스캐폴드(또는 간단히, "폴리머")(109)에 결합하고, 다른 쪽 끝에서는, 리간드(104) 및 표적 분자(105) 간의 상호작용에 의해 표적 분자(105)에 결합한다. 이러한 결합은 폴리머(109), 융합 분자(102) 및 표적 분자(105)를 포함하는 복합체의 형성을 유발한다.
형성된 복합체는 나노포어(또는 간단히, 포어)(107), 및 센서를 포함하는 디바이스(108)를 사용하여 검출될 수 있다. 포어(107)는 두 용적을 분리하는 구조에서 나노 규모 또는 마이크로 규모 개구이다. 센서(107)는 포어(107) 내에 또는 인접하게 또는 두 용적 내 어디에도 위치할 수 있다. 센서는 포어(107)를 통과하는 대상을 식별하도록 구성된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 센서는 측정 가능한 파라미터의 변화를 검출함으로써 포어(107)를 통과하는 대상을 식별하며, 상기 변화는 포어(107)를 통과하는 대상을 나타낸다. 이 디바이스는 전반에 걸쳐 "나노포어 디바이스"로 불린다. 일부 구체예에서, 나노포어 디바이스(108)는 폴리머(109)를 포어(107)를 가로질러 한 용적에서 다른 용적으로 이동시키기 위한 수단, 예를 들어 전력원에 연결된 전극을 포함한다. 폴리머(109)는 대전되거나 전하를 함유하도록 변형될 수 있기 때문에, 이러한 수단의 한 예는 폴리머(109)의 이동을 용이하게 하고 제어하기 위해 포어(107)를 가로질러 전위 또는 전압을 발생시킨다. 바람직한 구체예에서, 센서는 한 쌍의 전극을 포함하며, 이것들은 둘 다 포어(107)를 가로질러 대상의 통과를 검출하고, 전압을 제공하도록 구성된다. 이 구체예에서, 전압 클램프 또는 패치 클램프는 동시에 포어를 가로질러 전압을 공급하고 포어를 통해 전류를 측정하는데 사용된다.
형성된 복합체를 포함하는 샘플이 나노포어 디바이스(108)에 적재된 경우, 나노포어 디바이스(108)는 포어(107)를 통해 폴리머(109)를 통과하도록 구성될 수 있다. 결합 모티프(101)가 포어 내에 있거나 포어(107)에 인접할 때, 모티프(101)의 결합 상태는 센서로 측정될 수 있다.
결합 모티프의 "결합 상태"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 결합 모티프가 해당 결합 도메인을 가진 융합 분자에 결합되는지, 융합 분자는 또한 표적 분자에 결합되는지를 말한다. 근본적으로, 결합 상태는 다음의 세 가지 잠재적인 상태 중 하나일 수 있다: (i) 결합 모티프가 없거나 융합 분자에 결합되지 않는다(도 3의 305 참조); (ii) 결합 모티프는 표적 분자에 결합하지 않은 융합 분자에 결합된다(도 3의 306 참조); 또는 (iii) 결합 모티프는 표적 분자에 결합된 융합 분자에 결합된다(도 3의 307 참조).
결합 모티프의 결합 상태의 검출은 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 한 양태에서, 결합 모티프가 포어를 통과할 때, 각각의 상태에서의 결합 모티프의 다른 크기로 인해, 포어를 가로질러 서로 다른 전류가 발생한다. 한 양태에서, 도 3a에서 나타난 바와 같이, 실험 버퍼에서 0.4 M 이상의 KCl 농도를 이용하고 양의 전압을 인가하여 측정된 전류 신호(301)는, 305, 306 및 307이 포어를 통과할 때, 각각 신호(302, 303, 및 304)가 된다. KCl 농도가 0.4 M 초과일 때, 3가지 이벤트 타입 모두 전류를 감쇠시켜, 양전류 흐름의 감소를 유발한다. 세 가지 신호(302, 303 및 304)는 전류 시프트의 양(높이) 및/또는 전류 시프트의 기간(너비)에 의해, 또는 3가지 이벤트 유형을 구별하는 신호의 어떤 다른 특징에 의해 서로 구별될 수 있다. 또한, 304는 보통 302 및 303과 다를 수도 있지만, 302 및 303은 일반적으로 서로 다르지 않으며, 이 경우에, 통과하는 분자에 결합된 바이오마커를 우수하게 검출 할 수 있다. 또 다른 양태에서, 도 3b에서 나타난 바와 같이, 실험 버퍼에서 0.4 M 미만의 KCl 농도를 이용하고 양의 전압을 인가하여 측정된 전류 신호(308)는, 312, 313 및 314가 포어를 통과할 때, 각각 신호(309, 310 및 311)가 된다. dsDNA 단독의 통과는 0.4 M 미만의 KCl 농도에서 전류 증강 이벤트(309)를 유발한다. 이것은 Smeets, Ralph MM, et al. "Salt dependence of ion transport and DNA translocation through solid-state nanopores." Nano Letters 6.1 (2006): 89-95에 의해 공개된 연구에서 나타났다. 따라서, 신호(309)는 보통 다른 전류 시프트의 양(높이) 및/또는 전류 시프트의 기간(너비)을 가지는 세 가지 개의 신호 외에, 오픈 채널 베이스라인 전류 수준(308)에 비해 상대적인 이벤트 진폭 방향(극성)에 의해, 또는 세 개의 이벤트 타입을 구별하는 신호의 어떤 다른 특징에 의해 310 및 311과 구별될 수 있다. 또 다른 양태에서, 도 3c에서 나타난 바와 같이, 실험 버퍼에서 0.4 M 미만의 KCl 농도를 이용하고 음의 전압을 인가하여 측정된 음의 전류 신호(315)는, 319, 320 및 321이 포어를 통과할 때, 각각 신호(316, 317 및 318)가 된다. 양의 전압을 이용한 신호(309, 310, 및 311)와 비교할 때, 신호(316, 317, 및 318)는 반대의 극성을 갖는데, 이는 인가 전압이 반대(음의) 극성을 갖기 때문이다. 도 3 구체예의 모든 양태에서, 센서는 전력원에 연결되는 전극을 포함하며, 전류를 검출할 수 있다. 그러므로 전극 중 하나 또는 둘 다는 센서의 역할을 한다. 이 구체예에서, 전압 클램프 또는 패치 클램프는 동시에 포어를 가로질러 전압을 공급하고 포어를 통해 전류를 측정하는데 사용된다.
일부 양태에서, 도 1에서 나타난 제재(106)는 복합체에 첨가되어 검출을 돕는다. 이 제재는 표적 분자 또는 리간드/표적 분자 복합체에 결합할 수 있다. 한 양태에서, 이 제재는, 양이든 음이든, 전하를 포함하여 검출을 용이하게 한다. 또 다른 양태에서, 이 제재를 크게 해서 검출을 용이하게 한다. 또 다른 양태에서, 이 제재는 검출 가능한 라벨, 예를 들어 형광단을 포함한다.
이와 관련하여, 상태 (iii)의 확인은 폴리머-융합 분자-표적 분자 복합체가 형성되었다는 것을 나타낸다. 다시 말해서, 표적 분자가 검출된 것이다.
입자 검출
일부 양태에서, 본 개시물은 입자, 예를 들어 단백질, 단백질 응집체, 올리고머, 또는 단백질/DNA 복합체, 또는 세포 및 바이러스, 박테리아, 및 세포 응집체를 포함하는 미생물을 검출, 정량, 및 측정하는 방법 및 시스템을 제공한다.
일부 양태에서, 디바이스를 두 용적으로 분리하는 구조에서 포어는 입자, 예를 들어 바이러스, 박테리아, 세포 또는 세포 응집체가 통과하는 것을 허용하는 크기를 가진다. 검출되거나 정량화되는 표적 입자에 결합할 수 있는 리간드는 결합 도메인 및 결합 모티프를 통해 특정 표적 입자 및 폴리머 스캐폴드에 결합하여 복합체를 형성할 수 있도록 나노포어 디바이스 내에서 용액에 포함될 수 있다. 이러한 입자들은 리간드에 의해 특이적으로 인식될 수 있도록 표면 상에 특정 마커를 가진다. 예를 들어, 종양 세포는 세포 표면에서 발현되는 종양 항원을 가질 수 있고, 박테리아 세포는 세포막에 부착된 내독소를 가질 수 있다.
나노포어 디바이스에 적재된 용액에서 형성된 복합체가 폴리머 스캐폴드를 따라 이동하여 포어를 통과할 때, 리간드에 결합된 표적 미생물이 본 개시물에 기술되어 있는 분자 검출 방법과 유사한 방법을 사용하여 식별될 수 있도록 포어 내에 또는 포어에 인접한 복합체의 결합 상태가 검출될 수 있다.
폴리머 스캐폴드
본 발명에서 사용하기에 적합한 폴리머 스캐폴드는 나노포어 디바이스에 적재되어 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 포어를 통과할 수 있는 스캐폴드이다.
폴리머의 비 제한적인 예는 핵산, 예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 또는 펩타이드 핵산(PNA), 덴드리머, 및 선형화된 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 일부 양태에서, DNA 또는 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 또는 DNA/RNA 하이브리드 분자일 수 있다.
한 양태에서, 상기 폴리머는 합성 또는 화학적으로 변형된 것이다. 화학적 변형은 폴리머를 안정화하거나, 폴리머에 전하를 추가하여 이동성을 증가시키거나, 선형성을 유지하거나, 또는 결합 특이성을 추가하거나 변형시키는 것을 도울 수 있다. 일부 양태에서, 화학적 변형은 아세틸화, 메틸화, 서몰레이션, 산화, 인산화, 글리코실화, 또는 비오틴의 첨가이다.
일부 양태에서, 상기 폴리머는 전기적으로 대전된다. DNA, RNA, PNA 및 단백질은 전형적으로 생리학적 조건 하에서 대전된다. 이러한 폴리머는 가지고 있는 전하를 증가시키거나 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 다른 폴리머는 전하를 도입하도록 변형될 수 있다. 폴리머 상의 전하는 나노포어 디바이스의 포어를 통과하도록 폴리머를 구동시키는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 대전된 폴리머는 포어를 가로지르는 전압의 인가에 의해 포어를 가로질러 이동할 수 있다.
일부 양태에서, 전하가 폴리머로 도입될 때, 전하는 폴리머의 단부에 추가될 수 있다. 일부 양태에서, 전하는 폴리머에 퍼져있다.
한 구체예에서, 대전된 폴리머의 각 유닛은 선택된 pH에서 대전된다. 또 다른 구체예에서, 대전된 폴리머는 정전력에 의해 포어로 및 포어를 통해 끌어당겨지는 충분히 대전된 유닛을 포함한다. 예를 들어, 실체물(리신, 아스파르트산, 글루탐산, 등)을 충분히 함유하는 펩타이드는 본원에서 기술된 디바이스 및 방법에서 사용되도록 선택된 pH에서 대전될 수 있다. 유사하게, 메타크릴산 및 에틸렌을 포함하는 코폴리머는 본원에서 기술된 디바이스 및 방법에 사용되는 메타크릴산 잔기의 충분히 대전된 카르복실레이트 기가 있는 경우 본 발명의 목적을 위한 대전된 폴리머이다. 한 구체예에서, 대전된 폴리머는 폴리머의 한 말단에서 또는 말단에 가까이에서 하나 이상의 대전된 유닛을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 대전된 폴리머는 폴리머의 두 말단에서 또는 말단에 가까이에서 하나 이상의 대전된 유닛을 포함한다. 코폴리머의 예는 DNA를 감싸고 있는 단백질이다(예를 들어, DNA/뉴클레오솜). 코폴리머의 또 다른 예는 N- 및 C-말단에서 DNA에 컨쥬게이션된 선형 단백질이다.
결합 모티프 및 결합 도메인
핵산 및 폴리펩타이드, 예를 들어 폴리머 스캐폴드의 결합 모티프는 결합 도메인에 의해 인식 가능한 뉴클레오타이드 또는 펩타이드 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 결합 도메인은 단백질의 기능적 일부를 형성하는 펩타이드 서열이지만, 결합 도메인이 단백질일 필요는 없다. 예를 들어, 핵산의 서열(모티프)을 특이적으로 인식하고 이것에 결합하는 단백질, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 티민-티민 다이머 및 특정 2차 구조, 예를 들어 구부러진 뉴클레오타이드 및 단일 가닥이 파손된 서열이 있다.
일부 양태에서, 결합 모티프는 결합 도메인에 의한 인식 및 결합을 유발하거나 용이하게 하는 화학적 변형을 포함한다. 예를 들어, 메틸화된 DNA 서열은 전사 인자, DNA 메틸트랜스퍼라제 또는 메틸화 수복 효소에 의해 인식될 수 있다. 다른 구체예에서, 비오틴은 아비딘 패밀리 멤버로 통합되어, 이것에 의해 인식될 수 있다. 이러한 구체예에서, 비오틴은 결합 모티프을 형성하고, 아비딘 또는 아비딘 패밀리 멤버는 결합 도메인이다.
뉴클레오타이드 결합 모티프를 특이적으로 인식할 수 있는 분자, 특히 단백질은 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 단백질 도메인(예를 들어, 헬릭스-턴-헬릭스, 징크 핑거, 류신 지퍼, 윙드 헬릭스, 윙드 헬릭스 턴 헬릭스, 헬릭스-루프-헬릭스 및 HMG-박스)은 뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
일부 양태에서, 결합 도메인은 잠금 핵산(LNA), 모든 타입의 단백질 핵산(예를 들어, bisPNA, 감마-PNA), 전사 활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 군집성 주기적인 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복서열(CRISPR), 또는 압타머(예를 들어, DNA, RNA, 단백질, 또는 이것들의 조합)일 수 있다.
일부 양태에서, 결합 도메인은 DNA 결합 단백질(예를 들어, 징크 핑거 단백질), 항체 단편(Fab), 화학적으로 합성된 바인더(예를 들어, PNA, LNA, TALENS, 또는 CRISPR), 또는 합성 폴리머(예를 들어, 티올레이트, 비오틴, 아민, 카르복실레이트)의 화학적 변형(즉, 반응성 모이어티) 중 하나 이상이다.
표적 분자/입자 및 리간드
본 발명에서, 표적 분자 또는 입자는 폴리머 스캐폴드에 결합하는 융합 분자 내 리간드와의 결합에 의해 검출되거나 정량화된다. 표적 분자 또는 입자 및 해당 결합 리간드는 서로 인식하고 결합할 수 있다. 입자는, 리간드가 결합하기에 적합한 표면 분자 또는 마커가 있을 수 있다(그러므로 마커 및 리간드는 결합쌍을 형성한다).
입자 상의 표적 분자 또는 분자와 결합을 가능하게 하는 결합쌍의 예는 항원/항체(또는 항체 단편); 호르몬, 신경전달물질, 사이토카인, 성장 인자 또는 세포 인식 분자/수용체; 및 이온 또는 원소/킬레이트제 또는 이온 결합 단백질, 예를 들어 칼모듈린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 결합쌍은 또한 상보적 서열을 가진 단일 가닥 핵산, 효소 및 기질, 서로 결합하는 단백질 복합체의 멤버, 효소 및 공통인자, 효소 및 그것의 억제자 중 하나 이상(입체성 또는 다른 형식), 핵산/단백질, 또는 시스테인-제한된 펩타이드에 의해 검출 가능한 세포 또는 단백질일 수 있다.
일부 구체예에서, 리간드는 단백질, 단백질 스캐폴드, 펩타이드, 압타머(DNA 또는 단백질), 핵산(DNA 또는 RNA), 항체 단편(Fab), 화학적으로 합성된 분자, 화학적 반응성 작용기 또는 표적 분자와 결합쌍을 형성하는 어떤 다른 적합한 구조이다.
그러므로, 검출 또는 정량을 필요로 하는 표적 분자, 예를 들어 단백질, 펩타이드, 핵산, 화합물, 이온, 및 원소는 해당하는 결합 리간드를 찾을 수 있다. 대부분의 단백질 및 핵산에 대하여, 항체 또는 상보적 서열, 또는 압타머는 쉽게 제조될 수 있다.
유사하게, 결합 리간드(예를 들어, 항체 및 압타머)는 입자, 예를 들어 단백질 복합체 및 단백질 응집체, 단백질/핵산 복합체, 단편화된 또는 완전 조립된 바이러스, 박테리아, 세포, 및 세포 응집체에 대하여 쉽게 발견되거나 제조될 수 있다.
융합 분자
"융합 분자"는 두 개의 기능적 영역, 즉 결합 도메인 및 리간드를 함유하는 분자 또는 복합체를 의미하는 것으로 의도된다. 결합 도메인은 폴리머 스캐폴드 상의 결합 모티프에 결합할 수 있고, 리간드는 표적 분자에 결합할 수 있다.
일부 양태에서, 융합 분자는 결합 또는 물리력으로 두 개의 영역을 연결함으로써 제조된다. 이러한 결합 및 물리력은, 예를 들어 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 금속 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호작용, 또는 평면 적층 상호작용일 수 있다.
일부 양태에서, 융합 분자, 예를 들어 융합 단백질은 재조합 암호화 뉴클레오타이드로부터 단일 분자로서 발현될 수 있다. 일부 양태에서, 융합 분자는 본 기술에서 사용에 적합한 결합 도메인 및 리간드를 가지는 천연 분자이다.
결합 도메인을 리간드에 연결하여 융합 분자를 형성하는 많은 옵션이 존재한다. 예를 들어, 구성요소는 기능화된 링커, 예를 들어 유리 아민을 통한 화학적 커플링, 카르복실레이트 커플링, 티올레이트, 히드라지드, 또는 아지드(클릭(click)) 화학법을 통해 연결될 수 있거나 또는 결합 도메인 및 리간드는 하나의 연속적인 전사물을 형성할 수 있다.
도 2는 도 1에 제시된 시스템의 보다 특이적인 구체예를 예시한다. 도 2에서, 융합 분자는 징크 핑거 단백질 또는 도메인(202) 및 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 외피 단백질(203)을 포함하는 키메라 단백질이다. 징크 핑거 단백질(202)은 폴리머 스캐폴드 상의 적합한 뉴클레오타이드 서열, 이중 가닥 DNA(201)에 결합할 수 있다; HIV 외피 단백질(203)은 검출을 위해 생물학적 샘플(예를 들어, 환자의 혈액 샘플)에 존재할 수 있는 항-HIV 항체(204)에 결합할 수 있다.
이중 가닥 DNA(201)가 나노포어 디바이스(206)의 포어(205)를 통과할 때, 나노포어 디바이스(206)는 융합 분자가 이중 가닥 DNA(201)에 결합하는지 및 결합된 융합 분자가 항-HIV 항체(204)에 결합하는지를 검출할 수 있다.
결합 친화도의 측정
본 발명은 두 분자 간의 결합 친화도를 측정하기 위해 및 다른 결합 역학을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 결합 모티프가 나노포어 디바이스의 포어를 통과한 후, 디바이스는 결합 모티프가 다시 포어를 통과할 수 있도록 폴리머 스캐폴드의 이동 방향을 반전시키도록 재구성될 수 있다(하기 기술됨).
결합 모티프가 다시 포어에 들어가기 전에, 나노포어 디바이스에 적재된 샘플의 조건을 바꿀 수 있다. 예를 들어, 조건의 변화는 샘플로부터의 표적 분자의 제거, 결합에 대하여 표적 분자 또는 리간드와 경쟁하는 시약의 첨가, 및 pH, 염 또는 온도의 변화 중 하나 이상일 수 있다.
변화된 조건 하에서, 결합 모티프는 다시 포어를 통과할 수 있다. 그러므로 표적 분자가 융합 분자에 여전히 결합되는지를 검출하여, 변화된 조건이 어떻게 결합에 영향을 주는지를 결정할 수 있다.
일부 양태에서, 결합 모티프가 일단 포어 내에 있으면, 조건이 변화되는 동안 그 상태가 유지되고, 따라서 변화된 조건의 영향은 제 자리에서(in situ) 측정될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 폴리머 스캐폴드는 다수의 결합 모티프를 포함할 수 있고, 결합 모티프 각각은 하나 이상의 특이적 표적 분자(들) 또는 입자(들)에 결합할 수 있는 융합 분자에 결합할 수 있다. 각각의 결합 모티프가 포어를 통과하는 동안, 샘플의 조건을 변화시키면, 계속해서 리간드 및 표적 분자 또는 입자 간의 변화된 결합을 검출 할 수 있게 된다.
다중화
일부 양태에서, 상기 기술된 바와 같은 종류의 다수의 결합 모티프를 포함하는 대신에, 폴리머 스캐폴드는 여러 유형의 결합 모티프를 포함할 수 있으며, 결합 모티프 각각은 다른 해당 결합 도메인을 가진다. 이러한 구체예에서, 샘플은 여러 유형의 융합 분자를 포함할 수 있으며, 각 유형은 다른 표적 분자 또는 표적 미생물에 대하여 다른 해당 결합 도메인 및 리간드 중 하나를 포함한다.
추가적인 다중화 방법은 테스트 중에 다른 스캐폴드 분자의 수거를 검정하는 단계를 포함하며, 각각의 다른 스캐폴드 분자는 다른 융합 분자(들)과 연관성이 있다. 용액에 어떤 표적 분자가 있는지를 결정하기 위해서, 센서가 어떤 융합 분자가 상기 특정 스캐폴드에 결합하는지를 확인할 수 있도록 같은 유형의 스캐폴드가 라벨링된다. 예를 들어, 각 유형의 스캐폴드를 다양한 길이 또는 크기의 폴리에틸렌 글리콜 분자로 바코딩(barcoding)함으로써 라벨링될 수 있다.
이러한 설정을 이용하여, 단일 폴리머 스캐폴드는 다양한 유형의 표적 분자 또는 표적 미생물(예를 들어, 박테리아 또는 바이러스), 또는 표적 세포(예를 들어, 순환 종양 세포)를 검출하는데 사용될 수 있다. 도 4는 이러한 방법을 예시한다. 본원에서, 이중 가닥 DNA(403)는 폴리머 스캐폴드로서 사용되며, 다수의 결합 모티프, 즉 제1 결합 모티프(404) 2카피, 제2 결합 모티프(405) 2카피, 및 제3 결합 모티프(406) 1카피를 포함한다.
상기 DNA가 두 개의 동축 포어(401 및 402)를 가지고 있는 나노포어 디바이스(407)를 통과할 때, 결합 모티프 각각의 결합 상태가 검출되는데, 여기서는 결합 모티프(404) 2카피 모두는 해당 표적 분자에 결합하고, 결합 모티프(405) 2카피 모두는 해당 표적 분자에 결합하고, 결합 모티프(406)에 결합되는 융합 분자는 해당 표적 분자에 결합하지 않는다.
이러한 방법으로, 단일 폴리머 및 단일 나노포어 디바이스를 이용하여, 본 발명은 동시에 다수의 다른 표적 분자 또는 표적 미세구조(예를 들어, 응집체, 미생물, 또는 세포)를 검출할 수 있다. 또한, 결합 모티프의 많은 카피가 어떻게 표적 분자 또는 표적 미생물에 결합되는지를 결정함으로써, 및 결합에 영향을 주는 조건을 조율함으로써, 시스템은 더 상세한 결합 역학 정보를 얻을 수 있다.
나노포어 디바이스
본 발명의 나노포어 디바이스는 내부 공간을 두 개의 용적으로 분리하는 구조에서 개구를 형성하는 하나 이상의 포어, 및 포어를 통과하는 대상을 식별하도록 구성된(예를 들어, 대상을 나타내는 파라미터의 변화를 검출함으로써) 하나 이상의 센서를 포함한다.
나노포어 디바이스의 포어(들)는 나노 규모 또는 마이크로 규모인 것들이다. 한 양태에서, 각각의 포어는 소분자, 대분자 또는 미생물이 통과할 수 있는 크기를 가진다. 한 양태에서, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 1 nm이다. 또한, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 2 nm, 3 nm, 4 nm, 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm, 11 nm, 12 nm, 13 nm, 14 nm, 15 nm, 16 nm, 17 nm, 18 nm, 19 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm 또는 100 nm이다.
한 양태에서, 포어는 직경이 약 100 nm 이하이다. 또한, 포어는 직경이 약 95 nm, 90 nm, 85 nm, 80 nm, 75 nm, 70 nm, 65 nm, 60 nm, 55 nm, 50 nm, 45 nm, 40 nm, 35 nm, 30 nm, 25 nm, 20 nm, 15 nm 또는 10 nm 이하이다.
일부 양태에서, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 2000 nm, 3000 nm, 5000 nm, 10000 nm, 20000 nm 또는 30000 nm이다. 한 양태에서, 포어는 직경이 약 100000 nm 이하이다. 또한, 포어는 직경이 약 50000 nm, 40000 nm, 30000 nm, 20000 nm, 10000 nm, 9000 nm, 8000 nm, 7000 nm, 6000 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm, 2000 nm 또는 1000 nm 이하이다.
한 양태에서, 포어는 약 1 nm 내지 약 100 nm, 약 2 nm 내지 약 80 nm, 약 3 nm 내지 약 70 nm, 약 4 nm 내지 약 60 nm, 약 5 nm 내지 약 50 nm, 약 10 nm 내지 약 40 nm 또는 약 15 nm 내지 약 30 nm인 직경을 가진다.
일부 양태에서, 나노포어 디바이스의 포어(들)는 큰 미생물 또는 세포를 검출하기 위해 더 큰 규모의 것이다. 한 양태에서, 각각의 포어는 큰 세포 또는 미생물이 통과하게 하는 크기를 가진다. 한 양태에서, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 100 nm이다. 또한, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1000 nm, 1100 nm, 1200 nm, 1300 nm, 1400 nm, 1500 nm, 1600 nm, 1700 nm, 1800 nm, 1900 nm, 2000 nm, 2500 nm, 3000 nm, 3500 nm, 4000 nm, 4500 nm 또는 5000 nm이다.
한 양태에서, 포어는 직경이 약 100,000 nm 이하이다. 또한, 포어는 직경이 약 90000 nm, 80000 nm, 70000 nm, 60000 nm, 50000 nm, 40000 nm, 30000 nm, 20000 nm, 10000 nm, 9000 nm, 8000 nm, 7000 nm, 6000 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm, 2000 nm 또는 1000 nm 이하이다.
한 양태에서, 포어는 약 100 nm 내지 약 10000 nm, 약 200 nm 내지 약 9000 nm, 약 300 nm 내지 약 8000 nm, 약 400 nm 내지 약 7000 nm, 약 500 nm 내지 약 6000 nm, 약 1000 nm 내지 약 5000 nm 또는 약 1500 nm 내지 약 3000 nm인 직경을 가진다.
일부 양태에서, 나노포어 디바이스는 포어를 가로질러 폴리머 스캐폴드를 이동시키는 수단 및/또는 포어를 통과하는 대상을 식별하는 수단을 더 포함한다. 더 상세한 설명은 하기 제공되는데, 2-포어 디바이스를 참조로 서술한다.
단일-포어 디바이스와 비교하여, 2-포어 디바이스는 포어를 가로지르는 폴리머의 이동 속도 및 방향의 우수한 제어를 제공하도록 더 쉽게 구성될 수 있다.
한 구체예에서, 나노포어 디바이스는 복수의 챔버를 포함하며, 각각의 챔버는 적어도 하나의 포어를 통해 인접한 챔버와 교류한다. 이 포어들 중에서, 두 개의 포어, 즉 제1 포어 및 제2 포어는 폴리머의 적어도 일부가 제1 포어의 밖으로 및 제2 포어 내로 이동하는 것을 허용하도록 배치된다. 또한, 디바이스는 이동 중인 폴리머를 식별할 수 있는 센서를 포함한다. 한 양태에서, 상기 식별은 폴리머의 개개의 구성요소의 식별을 수반한다. 또 다른 양태에서, 상기 식별은 폴리머에 결합된 융합 분자 및/또는 표적 분자의 식별을 수반한다. 단일 센서를 이용한 경우, 단일 센서는 포어를 가로지르는 이온 전류를 측정하기 위해 포어의 양 끝에 배치된 두 개의 전극을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 단일 센서는 전극 이외의 구성요소를 포함한다.
한 양태에서, 디바이스는 두 개의 포어를 통해 연결된 세 개의 챔버를 포함한다. 세 개 이상의 챔버를 구비한 디바이스는 3-챔버 디바이스의 한 측면 상에 또는 3-챔버 디바이스의 양 측면 상에 하나 이상의 추가적인 챔버를 포함하도록 쉽게 설계될 수 있다. 유사하게, 둘 이상의 포어가 챔버를 연결하기 위해 디바이스에 포함될 수 있다.
두 개의 인접한 챔버 사이에는 다수의 폴리머가 동시에 한 챔버에서 다음 챔버로 이동하게 하기 위해서 둘 이상의 포어가 있을 수 있다. 이러한 다중-포어 설계는 디바이스에서의 폴리머 분석의 처리량을 향상시킬 수 있다.
일부 양태에서, 디바이스는 폴리머를 한 챔버에서 또 다른 챔버로 이동시키는 수단을 더 포함한다. 한 양태에서, 상기 이동은 동시에 제1 포어 및 제2 포어 둘 다를 가로질러 폴리머를 적재시킨다. 또 다른 양태에서, 상기 수단은, 두 개의 포어를 통해, 같은 방향으로 폴리머를 추가로 이동시킬 수 있다.
예를 들어, 3-챔버 2-포어 디바이스("2-포어" 디바이스)에서, 각각의 챔버는 별개의 전압이 챔버 사이의 각각의 포어에 걸쳐 있을 수 있도록 전원 장치에 연결되는 전극을 함유할 수 있다.
본 개시물의 한 구체예에 따르면, 상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하는 디바이스가 제공되는데, 상부 챔버는 제1 포어를 통해 중간 챔버와 교류하고, 중간 챔버는 제2 포어를 통해 하부 챔버와 교류한다. 이러한 디바이스는 이중-포어 디바이스(Dual-Pore Device)라는 제목으로 미국 공개 번호 2013-0233709에서 이전에 개시된 차원 또는 다른 특성 중 어느 것을 가질 수 있으며, 이 출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
도 5a에서 나타난 바와 같이 일부 구체예에서, 디바이스는 상부 챔버(505)(챔버 A), 중간 챔버(504)(챔버 B), 및 하부 챔버(503)(챔버 C)를 포함한다. 챔버는 각각 별개의 포어(511 또는 512)를 가지는 두 개의 분리층 또는 멤브레인(501 및 502)으로 분리된다. 또한, 각각의 챔버는 전원 장치에 연결되는 전극(521, 522 또는 523)을 함유한다. 상부, 중간 및 하부 챔버의 순서는 상대적인 것으로서, 예를 들어 상부 챔버가 접지에 대하여 중간 또는 하부 챔버보다 위에 배치되거나, 그 반대를 나타내는 것은 아니다.
각각의 포어(511 및 512)는 독립적으로 소분자, 대분자 또는 미생물이 통과하는 크기를 가진다. 한 양태에서, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 1 nm이다. 또한, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 2 nm, 3 nm, 4 nm, 5nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm, 11 nm, 12 nm, 13 nm, 14 nm, 15 nm, 16 nm, 17 nm, 18 nm, 19 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm 또는 100 nm이다.
한 양태에서, 포어는 직경이 약 100 nm 이하이다. 또한, 포어는 직경이 약 95 nm, 90 nm, 85 nm, 80 nm, 75 nm, 70 nm, 65 nm, 60 nm, 55 nm, 50 nm, 45 nm, 40 nm, 35 nm, 30 nm, 25 nm, 20 nm, 15 nm 또는 10 nm 이하이다.
한 양태에서, 포어는 약 1 nm 내지 약 100 nm, 약 2 nm 내지 약 80 nm, 약 3 nm 내지 약 70 nm, 약 4 nm 내지 약 60 nm, 약 5 nm 내지 약 50 nm, 약 10 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 30 nm인 직경을 가진다.
다른 양태에서, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 2000 nm, 3000 nm, 5000 nm, 10000 nm, 20000 nm 또는 30000 nm이다. 한 양태에서, 각각의 포어는 직경이 50000 nm 내지 100000 nm이다. 한 양태에서, 포어는 직경이 약 100000 nm 이하이다. 또한, 포어는 직경이 약 50000 nm, 40000 nm, 30000 nm, 20000 nm, 10000 nm, 9000 nm, 8000 nm, 7000 nm, 6000 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm, 2000 nm 또는 1000 nm 이하이다.
일부 양태에서, 포어는 실질적으로 둥근 모양을 가진다. 본원에서 사용된 용어 "실질적으로 둥근"은 적어도 약 80 또는 90%가 원통 형태인 모양을 말한다. 일부 구체예에서, 포어는 모양이 정사각형, 직사각형, 삼각형, 타원형, 또는 육각형이다.
각각의 포어(511 및 512)는 독립적으로 깊이(즉, 두 개의 인접한 용적 사이에서 연장되는 포어의 길이)를 가진다. 한 양태에서, 각각의 포어는 적어도 약 0.3 nm인 깊이를 가진다. 또한, 각각의 포어는 적어도 약 0.6 nm, 1 nm, 2 nm, 3 nm, 4 nm, 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm, 11 nm, 12 nm, 13 nm, 14 nm, 15 nm, 16 nm, 17 nm, 18 nm, 19 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm 또는 90 nm인 깊이를 가진다.
한 양태에서, 각각의 포어는 약 100 nm 이하인 깊이를 가진다. 또한, 상기 깊이는 약 95 nm, 90 nm, 85 nm, 80 nm, 75 nm, 70 nm, 65 nm, 60 nm, 55 nm, 50 nm, 45 nm, 40 nm, 35 nm, 30 nm, 25 nm, 20 nm, 15 nm, 또는 10 nm 이하이다.
한 양태에서, 포어는 약 1 nm 내지 약 100 nm, 약 2 nm 내지 약 80 nm, 약 3 nm 내지 약 70 nm, 약 4 nm 내지 약 60 nm, 약 5 nm 내지 약 50 nm, 약 10 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 30 nm인 깊이를 가진다.
일부 양태에서, 나노포어는 멤브레인을 통해 연장된다. 예를 들어, 포어는 지질 이중층 멤브레인에 삽입된 단백질 채널일 수 있거나, 또는 포어는 드릴링(drilling), 에칭(etching)에 의해, 고체 상태 기질, 예를 들어 이산화규소, 질화규소, 그라핀, 또는 이러한 또는 다른 재료의 조합으로 형성된 층을 통해 포어를 형성함으로써 조작될 수 있다. 일부 양태에서, 나노포어의 길이 또는 깊이는 두 개의 별개의 용적을 연결하는 채널을 형성할 정도로 충분히 크다. 일부 이러한 양태에서, 각각의 포어의 깊이는 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm 또는 900 nm 이상이다. 일부 양태에서, 각각의 포어의 깊이는 2000 nm 또는 1000 nm 이하이다.
한 양태에서, 포어는 약 10 nm 내지 약 1000 nm인 거리로 이격되어 있다. 일부 양태에서, 포어 간의 거리는 1000 nm, 2000 nm, 3000 nm, 4000 nm, 5000 nm, 6000 nm, 7000 nm, 8000 nm 또는 9000 nm 이상이다. 일부 양태에서, 포어는 30000 nm, 20000 nm 또는 10000 nm 이하로 이격되어 있다. 한 양태에서, 거리는 적어도 약 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm 또는 300 nm이다. 또 다른 양태에서, 거리는 약 1000 nm, 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm 또는 100 nm 이하이다.
또 다른 구체예에서, 포어 간의 거리는 약 20 nm 내지 약 800 nm, 약 30 nm 내지 약 700 nm, 약 40 nm 내지 약 500 nm 또는 약 50 nm 내지 약 300 nm이다.
두 개의 포어는 챔버 간의 액체 교류를 허용하고 규정된 크기 및 포어 간의 규정된 거리를 갖는 한 어떠한 위치에도 배열될 수 있다. 한 양태에서, 포어는 포어 간에 직접적인 막힘이 없도록 배치된다. 한 양태에서, 포어는 도 5a에서 예시된 바와 같이 실질적으로 동축이다.
한 양태에서, 도 5a에서 나타난 바와 같이, 디바이스는, 각각 챔버(503, 504 및 505)의 전극(521, 522 및 523)을 통해, 하나 이상의 전원 장치에 연결된다. 일부 양태에서, 전원 장치는 전압 클램프 또는 패치 클램프를 포함하며, 이것은 각각의 포어를 가로질러 전압을 공급하고 각각의 포어를 통해 독립적으로 전류를 측정할 수 있다. 이러한 관점에서, 전원 장치 및 전극 구성은 중간 챔버를 두 전원 장치에 대한 공통 접지로 설정할 수 있다. 한 양태에서, 전원 장치(들)는 상부 챔버(505)(챔버 A) 및 중간 챔버(504)(챔버 B) 사이에서 제1 전압(V1) 및 중간 챔버(504)(챔버 B) 및 하부 챔버(503)(챔버 C) 사이에서 제2 전압(V2)를 인가하도록 구성된다.
일부 양태에서, 제1 전압(V1) 및 제2 전압(V2)은 독립적으로 조정 가능하다. 한 양태에서, 중간 챔버는 두 전압에 대하여 접지되도록 조정된다. 한 양태에서, 중간 챔버는 중간 챔버의 전극과 각각의 포어 사이에 컨덕턴스를 제공하기 위한 매질을 포함한다. 한 양태에서, 중간 챔버는 중간 챔버의 전극과 각각의 포어 사이에 저항을 제공하기 위한 매질을 포함한다. 나노포어 저항에 비해 이러한 저항을 충분히 작게 유지하는 것은 포어를 가로지르는 두 전압 및 전류를 분리시키는데 유용하며, 이것은 전압의 독립적인 조정에 도움이 된다.
전압의 조정은 챔버에서 대전된 입자의 이동을 제어하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 두 전압이 동일한 극성으로 설정된 경우, 적절하게 대전된 입자는 상부 챔버로부터 중간 챔버로, 그리고 하부 챔버로, 또는 다른 방향으로, 순차적으로 이동될 수 있다. 일부 양태에서, 두 전압이 반대 극성으로 설정된 경우, 대전된 입자는 상부 또는 하부 챔버로부터 중간 챔버로 이동되어 거기에서 유지될 수 있다.
디바이스에서의 전압의 조정은 대분자, 예를 들어 두 포어를 동시에 가로지를 정도로 충분히 큰 대전된 폴리머의 이동을 제어하는데 특히 유용할 수 있다. 이러한 양태에서, 분자의 이동 방향 및 속도는 하기 기술된 전압의 상대적인 크기 및 극성에 의해 제어될 수 있다.
디바이스는 액상 샘플, 특히 생물학적 샘플을 유지하는데 적합한 물질, 및/또는 나노제조에 적합한 물질을 함유할 수 있다. 한 양태에서, 이러한 물질들은 유전체 물질, 예를 들어 실리콘, 질화규소, 이산화규소, 그라핀, 탄소 나노튜브, TiO2, HfO2, Al2O3, 또는 다른 금속층, 또는 이 물질들의 어떠한 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 양태에서, 예를 들어, 약 0.3 nm 두께의 그라핀 멤브레인의 단일 시트는 포어-함유 멤브레인으로 사용될 수 있다.
미세유체이며 2-포어 미세유체 칩 구현을 하우징하는 디바이스는 다양한 수단 및 방법에 의해 제작될 수 있다. 두 개의 평행한 멤브레인으로 구성된 미세유체 칩과 관련하여, 어떤 적합한 정렬 기술과 함께 멤브레인의 각 측면 상에 다른 빔을 사용할 수도 있지만, 단일 빔에 의해 두 멤브레인을 동시에 드릴링하여 두 개의 동심 포어를 형성할 수 있다. 일반적으로, 하우징은 챔버 A 내지 C의 밀봉된 분리를 보장한다. 도 5b에서 나타난 한 양태에서, 하우징은 각 전압이 주로 각각의 포어를 가로질러 인가되는 것을 보장하기 위해, 전압 전극(521, 522, 및 523) 및 나노포어(511 및 512) 사이에 최소의 접근 저항을 제공할 것이다.
한 양태에서, 디바이스는 스페이서로 연결된 두 개의 평행한 멤브레인으로 구성된 미세유체 칩("이중-코어 칩"으로 라벨링됨)을 포함한다. 각 멤브레인은 멤브레인의 중앙을 통해 단일 빔으로 드릴링된 포어를 함유한다. 또한, 디바이스는 바람직하게는 상기 칩을 위한 Teflon® 하우징을 가진다. 하우징은 챔버 A 내지 C의 밀봉된 분리를 보장하고 각각의 전압이 주로 각각의 포어를 가로질러 인가되는 것을 보장하기 위해, 전극에 대하여 최소 접근 저항을 제공한다.
더 구체적으로는, 포어-함유 멤브레인은 5 내지 100 nm 두께의 실리콘, 질화규소, 또는 이산화규소 창을 가지는 투과 전자 현미경(TEM) 격자를 이용하여 제조될 수 있다. 스페이서는 인슐레이터, 예를 들어 SU-8, 포토레지스트, PECVD 산화물, ALD 산화물, ALD 알루미나, 또는 증발된 금속 물질, 예를 들어 Ag, Au, 또는 Pt를 사용하고, 멤브레인 사이의 챔버 B의 수성 부분 내에 작은 용적을 차지함으로써, 멤브레인을 분리하는데 사용될 수 있다. 홀더는 챔버 B의 가장 큰 용적 분획으로 구성된 수성 배스에 놓여진다. 챔버 A 및 C는 멤브레인 밀봉 부분으로 이어지는 더 큰 직경 채널(낮은 접근 저항을 위해)에 의해 접근 가능하다.
집속 전자 또는 이온 빔은 멤브레인을 통해 포어를 드릴링하여, 그것들을 자연스럽게 정렬하는데 사용될 수 있다. 또한, 포어는 각 층에 정확히 집속된 빔을 적용함으로써 더 작은 크기의 형태(축소)로 만들 수 있다. 단일 나노포어 드릴링 방법은 주어진 방법 및 멤브레인의 두께에 대하여 가능한 드릴 깊이를 고려하여, 두 개의 멤브레인의 한 쌍의 포어를 드릴링하는데 사용될 수 있다. 멤브레인 두께를 추가로 개선하기 위해 규정된 깊이로 마이크로포어를 미리 드릴링한 다음 멤브레인의 나머지를 통해 나노포어를 드릴링하는 것도 가능하다.
또 다른 양태에서, 하이브리드 포어를 형성하기 위한 고체 상태 나노포어로의 생물학적 나노포어의 삽입은 2-포어 방법에서의 하나 또는 두 개의 포어에 사용될 수 있다. 생물학적 포어는 이온 전류 측정의 감도를 증가시킬 수 있으며, 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드가, 예를 들어 시퀀싱을 위해 2-포어 디바이스에서 캡쳐되고 제어될 경우 유용하다.
디바이스의 포어에 존재하는 전압에 의해, 대전된 분자는 챔버 사이의 포어를 통해 이동될 수 있다. 이동 속도 및 방향은 전압의 크기 및 극성에 의해 제어될 수 있다. 또한, 두 전압 각각이 독립적으로 조정될 수 있기 때문에, 대전된 분자의 이동 방향 및 속도는 각 챔버에서 정교하게 제어될 수 있다.
한 예는 두 포어 각각의 깊이 및 두 포어 간의 거리를 합한 거리보다 더 긴 길이를 가지는 대전된 폴리머 스캐폴드, 예를 들어 DNA에 관한 것이다. 예를 들어, 1000 bp dsDNA는 길이가 약 340 nm이고, 이는 20 nm 이격되어 있고 각각의 깊이가 10 nm인 두 개의 포어에 걸쳐 있는 40 nm보다 실질적으로 더 길 것이다. 제1 단계에서, 폴리뉴클레오타이드는 상부 또는 하부 챔버로 적재된다. 약 7.4 pH의 생리학적 조건 하에서의 그것의 음 전하로 인해, 폴리뉴클레오타이드는 전압이 인가되는 포어를 가로질러 배열될 수 있다. 그러므로, 제2 단계에서는, 동일한 극성 및 동일하거나 유사한 크기의 두 개의 전압을 포어에 인가하여, 두 포어를 가로질러 폴리뉴클레오타이드를 순차적으로 이동시킨다.
폴리뉴클레오타이드가 제2 포어에 도달할 때쯤, 하나 또는 두 개의 전압을 변화시킬 수 있다. 두 포어 간의 거리가 폴리뉴클레오타이드의 길이보다 더 짧도록 선택되었기 때문에, 폴리뉴클레오타이드가 제2 포어에 도달할 때, 또한 제1 포어에도 도달한다. 그러므로, 도 5c에서 예시된 바와 같이, 제1 포어에서의 전압의 극성의 신속한 변화는 폴리뉴클레오타이드를 제2 포어에서 떨어뜨리는 힘을 발생시킬 것이다.
두 포어가 동일한 전압-힘의 영향하에 있다고 가정하고 |V 1 | = |V 2 | + δV를 사용하면, δV > 0(또는 < 0) 값은 V 1 (또는 V 2 ) 방향으로 조율 가능한 움직임을 위해 조정될 수 있다. 실제로, 각각의 포어에서의 전압-유도된 힘은 V 1 = V 2 와 동일하지는 않지만, 보정 실험을 수행하여 주어진 2-포어 칩에 대하여 동일한 인력을 초래할 적절한 바이어스 전압을 식별한 후; 상기 바이어스 전압 주위의 변이가 방향 제어에 사용될 수 있도록 한다.
여기서, 제1 포어에서 전압-유도된 힘의 크기가 제2 포어에서 전압-유도된 힘의 크기보다 작으면, 폴리뉴클레오타이드는 제2 포어를 향해, 낮은 속도로 두 포어를 가로질러 계속 이동할 것이다. 이런 면에서, 폴리뉴클레오타이드의 이동 속도 및 방향은 두 전압의 극성 및 크기에 의해 제어될 수 있도록 쉽게 인식된다. 하기 추가로 기술되는 바와 같이, 이러한 이동의 정교한 제어는 넓은 분야에 적용 가능하다.
따라서, 한 양태에서, 나노포어 디바이스를 통한 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 상기 구체예 중 어느 것의 디바이스의 상부 챔버, 중간 챔버 또는 하부 챔버 중 하나에 대전된 폴리머를 포함하는 샘플을 적재하는 단계로서, 디바이스는 상부 챔버 및 중간 챔버 사이에서 제1 전압, 및 중간 챔버 및 하부 챔버 사이에서 제2 전압을 제공하는 하나 이상의 전원 장치에 연결되는 단계; (b) 폴리머가 챔버 사이에서 이동하도록 초기 제1 전압 및 초기 제2 전압을 설정하여, 제1 및 제2 포어 둘 다를 가로지르는 폴리머를 위치시키는 단계; 및 (c) 대전된 폴리머를 중간 챔버로부터 떨어뜨리는 힘을 생성하도록 제1 전압 및 제2 전압을 조정하는 단계(전압-경쟁 방식)로서, 두 전압은 제어된 조건하에서 크기가 달라서, 대전된 폴리머가 각 방향으로 및 제어된 방식으로 두 포어를 가로질러 이동하는 단계를 수반한다.
단계 (c)의 상기 전압-경쟁 방식을 확립하기 위해서, 각각의 포어에서 각 전압에 의해 가해진 상대적인 힘은 사용되는 각각의 2-포어 디바이스에 대하여 결정될 것이고, 이는 폴리뉴클레오타이드의 움직임에 대한 다른 전압 값의 영향을 관찰함으로써 보정 실험으로 이루어질 수 있으며, 폴리뉴클레오타이드의 움직임은 본 개시물에서 하기 더 상세히 기술된 특정 예를 이용하여, 폴리뉴클레오타이드에서 공지된 위치 및 검출 가능한 특징을 감지함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 각각의 공통 전압에서의 힘이 동등한 경우, (접지된 중간 챔버에 비해 상부 및 하부 챔버의 공통 극성으로) 각각의 포어에서 동일한 전압 값을 사용하는 것은 열교란(thermal agitation)(브라운 운동(Brownian motion)의 존재 및 영향은 하기 논의됨)의 부재시 제로 네트 움직임을 생성한다. 각각의 공통 전압에서의 힘이 동등하지 않은 경우, 동일한 힘을 달성하는 것은 공통 전압에서 더 약한 힘을 받는 포어에서 더 큰 전압의 식별 및 사용을 수반한다. 전압-경쟁 방식에 대한 보정은 각각의 포어를 통과할 때 힘에 영향을 주는 대전된 특정 폴리머 또는 분자, 및 각각의 2-포어 디바이스에 대하여 실행될 수 있다.
한 양태에서, 대전된 폴리머를 함유하는 샘플은 상부 챔버로 적재되고 초기 제1 전압은 대전된 폴리머를 상부 챔버로부터 중간 챔버로 끌어당기도록 설정되고 초기 제2 전압은 폴리머를 중간 챔버로부터 하부 챔버로 끌어당기도록 설정된다. 유사하게, 샘플은 하부 챔버로 초기에 적재될 수 있고, 대전된 폴리머는 중간 및 상부 챔버로 끌어당겨질 수 있다.
또 다른 양태에서, 대전된 폴리머를 함유하는 샘플은 중간 챔버로 적재되고; 초기 제1 전압은 대전된 폴리머를 중간 챔버로부터 상부 챔버로 끌어당기도록 설정되고; 초기 제2 전압은 대전된 폴리머를 중간 챔버로부터 하부 챔버로 끌어당기도록 설정된다.
한 양태에서, 단계 (c)에서 조정된 제1 전압 및 제2 전압은 크기가 두 전압 간의 차이보다 약 10배 내지 약 10000배 높다. 예를 들어, 두 전압은 각각 90 mV 및 100 mV일 수 있다. 두 전압의 크기(약 100 mV)는 전압 간의 차이(약 10 mV)의 약 10배이다. 일부 양태에서, 전압의 크기는 전압 간의 차이보다 적어도 약 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 400배, 500배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배 또는 9000배 높다. 일부 양태에서, 전압의 크기는 전압 간의 차이보다 약 10000배, 9000배, 8000배, 7000배, 6000배, 5000배, 4000배, 3000배, 2000배, 1000배, 500배, 400배, 300배, 200배, 또는 100배 이하로 높다.
한 양태에서, 단계 (c)에서 제1 전압 및 제2 전압에 대한 실시간 또는 온라인 조정은 수백 메가헤르츠까지의 클록(clock)에서 전용 하드웨어 및 소프트웨어를 사용하여 능동 제어 또는 피드백 제어에 의해 수행된다. 제1 또는 제2, 또는 두 전압의 자동화된 제어는 제1 또는 제2, 또는 둘 다의 이온 전류 측정의 피드백에 기초한다.
센서
상기 논의된 바와 같이, 다양한 양태에서, 나노포어 디바이스는 결합 모티프의 결합 상태의 식별을 수행하기 위해 하나 이상의 센서를 더 포함한다.
디바이스에 사용된 센서는 분자 또는 입자, 예를 들어 폴리머를 식별하는데 적합한 어떠한 센서도 될 수 있다. 예를 들어, 센서는 폴리머와 관련된 전류, 전압, pH 값, 광학적 특징 또는 체류 시간을 측정함으로써 폴리머를 식별하도록 구성될 수 있다. 다른 양태에서, 센서는 폴리머의 하나 이상의 개개의 구성요소 또는 폴리머에 결합된 하나 이상의 구성요소를 식별하도록 구성될 수 있다. 센서는 변화가 폴리머, 폴리머의 구성요소, 바람직하게는 폴리머에 결합된 구성요소를 나타내는 경우 측정 가능한 파라미터의 변화를 검출하도록 구성된 어떠한 구성요소로 형성될 수 있다. 한 양태에서, 센서는 분자 또는 입자, 특히 폴리머가 포어를 통해 이동할 때, 포어를 가로지르는 이온 전류를 측정하기 위해 포어의 두 측면에 배치된 전극의 쌍을 포함한다. 특정 양태에서, 포어를 가로지르는 이온 전류는 포어를 통과하는 폴리머 세그먼트가 융합 분자 및/또는 융합 분자-표적 분자 복합체에 결합될 때 측정 가능하게 변화한다. 이러한 전류의 변화는, 예를 들어 융합 분자의 존재, 부재, 및/또는 크기 및 존재하는 표적 분자에 해당하는 예측 가능하고 측정 가능한 방식으로 달라질 수 있다.
한 구체예에서, 센서는 폴리머의 광학적 특징, 폴리머의 구성요소(또는 유닛), 또는 폴리머에 결합된 구성요소를 측정한다. 이러한 측정의 한 예는 적외선(또는 자외선) 분광학에 의한 특정 유닛에 독특한 흡수 밴드의 식별을 포함한다.
체류 시간 측정이 사용될 경우, 구성요소의 크기는 감지 디바이스를 통과하는데 걸린 시간의 길이에 기초한 특이적 구성요소와 연관성이 있을 수 있다.
또한, 폴리머의 검출 유닛과 관련된 구체예에서, 센서는 감지 디바이스의 말단에 효소를 포함할 수 있으며, 효소가 끝에서 두 번째의 유닛으로부터 폴리머의 말단 유닛을 분리하여, 폴리머의 단일 분자 유닛을 제공할 수 있다. 그 이후 단일 분자, 예를 들어 단일 뉴클레오타이드 또는 아미노산은 포어를 통해 전위시킬 수 있고 검출되거나 검출되지 않을 수 있다. 하지만, 효소가 결합된 표적 분자와 회합할 경우, 효소는 끝에서 두 번째 유닛을 분열시킬 수 없을 것이므로, 정체되거나 그 다음의 이용 가능한 분열 부위로 건너뛸 것이고, 따라서 단일 유닛과 비슷한 크기 차이를 가지고 검출 가능한 단편을 방출시킨다. 상기 검출은 본 출원에서 기술된 바와 같이 센서를 이용하여 실행되거나, 질량 분석법과 같은 방법으로 검출된다. 이러한 유닛을 측정하는 방법은 업계에 공지되어 있으며, 이는 Cal Tech에 의해 개발된 것들을 포함한다(예를 들어, spectrum.ieee.org/tech-tallVat-work/test-and-measurement/a-scale-for-weighing-single-molecules 참조). 이러한 분석의 결과는 분석의 정확성을 확인하기 위해 감지 디바이스의 결과와 비교될 수 있다.
일부 구체예에서, 센서는 각각의 회합 부위 또는 각각의 회합된 표적 분자와 별개의 비-공유 결합을 형성하는 시약으로 기능화된다. 이와 관련하여, 갭은 효과적인 측정을 허용할 정도로 크다. 예를 들어, 센서가 dsDNA 스캐폴드에서 5 nm인 DNA 상에서의 특징을 검출하기 위해 시약으로 기능화된 경우, 7.5 nm 갭이 사용될 수 있으며, 이는 DNA의 폭이 2.5 nm이기 때문이다.
기능화된 센서로 감지하는 터널을 "인식 터널링(recognition tunneling)"이라 칭한다. 현재의 기술을 사용하여, 인식 터널링을 구비한 주사형 터널 현미경(STM)은 짧은 DNA 올리고머에서 다른 염기에 의해 플랭킹된 DNA 염기를 식별한다. 보고된 바와 같이, 인식 터널링은 사용자가 검출되기를 바라는 분자에 대한 독특한 배향의 수소 결합에 대하여 설계된 "보편적 판독기"를 제공할 수 있다. 핵산의 식별과 관련하여 많은 보고가 있지만, 본원에서는 스캐폴드 상에서의 표적 분자를 검출하는데 이용되도록 이를 개질하였다.
통상적인 인식 터널링이 가진 한계는 갭에서 무작위로 결합하거나 현미경 움직임 중에 갭에서 일어나는 자유 확산 분자만을 검출할 수 있다는 것이며, 갭에서의 분명한 캡쳐 방법은 없다. 하지만, STM 설정과 관련된 이러한 결점은 나노포어 채널의 전극 터널링 갭 내에 감도에 최적화된 인식 시약을 포함함으로써 해결할 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 센서는 시약에 의한 표면 변형을 포함한다. 한 양태에서, 상기 시약은 회합 부위 또는 부착된 표적 분자와 비-공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 결합은 수소 결합이다. 상기 시약의 비-제한 예는 4-메르캅토벤즈아미드 및 1-H-이미다졸-2-카르복사미드를 포함한다.
또한, 본 발명의 방법은 각각 나노포어 채널 중 하나 또는 둘 다에 위치하는 하나 이상의 인식 터널링 부위에서의 DNA 전달 속도를 제어할 수 있으며, 전압 제어는 각각의 표적 분자가 강력한 식별을 위해 충분한 기간 동안 각각의 부위에 잔류하도록 한다.
디바이스의 센서 및 본 개시물의 방법은 금, 백금, 그라핀 또는 탄소, 또는 다른 적합한 물질을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 센서는 그라핀으로 만들어진 부분을 포함한다. 그라핀은 도체 및 인슐레이터의 역할을 할 수 있으므로, 그라핀을 통해 및 나노포어를 가로지르는 터널링 전류는 전위 DNA를 시퀀싱할 수 있다.
일부 구체예에서, 터널 갭은 약 1 nm 내지 약 20 nm의 너비를 가진다. 한 양태에서, 갭의 너비는 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 또는 15 nm이다. 또 다른 양태에서, 갭의 너비는 약 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2 nm 이하이다. 일부 양태에서, 너비는 약 1 nm 내지 약 15 nm, 약 1 nm 내지 약 10 nm, 약 2 nm 내지 약 10 nm, 약 2.5 nm 내지 약 10 nm 또는 약 2.5 nm 내지 약 5 nm이다.
다른 구체예에서, 터널 갭은 마이크로 크기의 입자(예를 들어, 바이러스, 박테리아 및/또는 세포)를 검출하는데 적합하고 약 1000 nm 내지 약 100000 nm의 너비를 가진다. 일부 구체예에서, 갭의 너비는 약 10000 nm 내지 80000 nm 또는 약 20000 nm 내지 50000 nm이다. 또 다른 구체예에서, 갭의 너비는 약 50000 nm 내지 100000 nm이다. 일부 구체예에서, 갭의 너비는 약 100000 nm, 90000 nm, 80000 nm, 70000 nm, 60000 nm, 50000 nm, 40000 nm, 30000 nm, 20000 nm, 10000 nm, 9000 nm, 8000 nm, 7000 nm, 6000 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm, 2000 nm 또는 1000 nm 이하이다.
일부 구체예에서, 센서는 전기 센서이다. 일부 구체예에서, 통과하는 표적 분자 또는 검출 가능한 라벨이 독특한 형광 신호를 가질 경우, 센서는 형광 검출 수단을 검출한다. 포어의 유출구에서의 방사선원이 상기 신호를 검출하는데 사용될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예 및 실험을 참조하여 더 설명된다. 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서 많은 변형이 실시될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 섹션은 먼저 바이오마커 검출시 폴리머 스캐폴드 및 융합 분자를 사용하게 된 주된 이유를 지적함으로써 시작한다. 주된 원인은 바이오마커 단독이, 특정 크기의 역가 아래에서는, 나노포어로 검출 불가능하다는 것이며, 이는 Calin Plesa, Stefan W. Kowalczyk, Ruben Zinsmeester, Alexander Y. Grosberg, Yitzhak Rabin, 및 Cees Dekker에서 다양한 크기의 단백질에 대하여 나타난 바와 같다("Fast translocation of proteins through solid state nanopores." Nano letters 13, no. 2 (2013): 658-663). 더욱이, 검출 가능한 상기 바이오마커도 구별할 수 없을 수 있다. 바이오마커는 비슷한 크기/전하의 모든 다른 분자와 동일한 나노포어 신호를 수득하여 차별을 방지할 것이다. 본 발명자들은 스캐폴드 및 융합 분자를 사용함으로써 이 문제를 둘 다 해결할 수 있다. 특히, 본 발명자들은 스캐폴드 상에서의 대표적인 융합 분자의 검출을 입증하고, 스캐폴드 상에서의 융합 분자에 대한 표적 분자의 검출을 또한 확인한 것을 예시들로 보여준다. 이와 함께, 융합 분자의 리간드 도메인을 적절히 조작하여 상기 차별을 달성함으로써, 원하는 표적 분자에 대한 특이성을 달성할 수 있다.
실시예 1 ― 고체 상태 나노포어 실험에서의 DNA 단독
나노포어 기기는 오픈 포어를 흐르는 이온 전류(l 0 )를 측정하면서 포어를 가로지르는 전압(V)을 인가하기 위해서 민감도의 전압 클램프 증폭기를 사용한다(도 6a). 단일 대전된 분자, 예를 들어 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 전기영동에 의해 포어를 통해 캡쳐하여 구동하고, l 0 에서 l B 로의 측정된 전류 시프트, 및 시프트량(Δ/ = l 0 - l B ) 및 기간(t D )을 사용하여 이벤트를 특성화한다(도 6b). 실험 중에 많은 이벤트를 기록한 후, 이벤트의 분포(도 6c)를 분석하여 해당 분자를 특성화한다. 이러한 방식으로, 나노포어는 생체 분자 감지를 위한 단순하고, 무라벨의, 순수하게 전기적 단일 분자 방법을 제공한다.
도 6에서 나타난 DNA 실험에서, 질화규소(SiN) 기질에서 제작된 단일 나노포어의 직경은 100 nm 두께의 SiN 멤브레인 내에 40 nm이다(도 6a). 도 6b에서, 대표적인 전류 추적은 200 mV 및 1M KCl에서 10 nm 두께의 SiN 내의 11 nm 직경 나노포어를 통해 단일 파일 방식(언폴딩됨)으로 통과하는 5.6 kb dsDNA에 의해 유발된 봉쇄 이벤트를 나타낸다. 평균 오픈 채널 전류는 l 0 = 9.6 nA이며, 평균 이벤트 진폭은 l B = 9.1 nA이고, 기간 t D = 0.064 ms이다. 진폭 시프트는 Δ/ = l 0 - l B = 0.5 nA이다. 도 6c에서, 산점도는 16분 동안 기록된 1301개의 이벤트 모두와 관련하여 t D 에 대한 |Δ/|를 나타낸다.
도 7에서 나타난 DNA 실험에서, dsDNA 단독은 100 mM KCl에서 전류 증강 이벤트를 유발한다. 이것은 Smeets, Ralph MM, et al. "Salt dependence of ion transport and DNA translocation through solid-state nanopores." Nano Letters 6.1 (2006): 89-95)의 공개된 연구에서 확인되었다. 상기 연구는 0.4 M 이상의 KCl 농도에 대하여 진폭 시프트 Δ/ = l 0 - l B > 0인 한편, 진폭 시프트는 0.4 M 이하의 KCl 농도에 대하여 반대 극성 (Δ/ < 0)을 가진다. 이것은 0.4 M 이하의 KCl 농도를 이용하는 음의 전압 실험(-200 mV)이기 때문에, 본 발명자들은 DNA 이벤트가 도 3c에서 나타난 바와 같이 베이스라인(315)에 관하여 같은 극성(316)을 가진다는 것을 확인할 수 있다.
실시예 2 ― DNA 스캐폴드에 결합하는 VspR 단백질 및 나노포어 검출
VspR 단백질은 높은 마이크로몰 친화도로 dsDNA에 직접적으로 결합하는 콜레라균(V. cholerae)의 90 kDa 단백질이다(참고문헌: Yildiz, Fitnat H., Nadia A. Dolganov, and Gary K. Schoolnik. "VpsR, a Member of the Response Regulators of the Two-Component Regulatory Systems, Is Required for Expression of Biosynthesis Genes and EPSETr-Associated Phenotypes in Vibrio cholerae 01 El Tor." Journal of bacteriology 183, no. 5 (2001): 1716-1726 참조). 나노포어 기술을 사용하는 표적 검출의 이 예에서, VspR은 부위-특이적 DNA 결합 도메인, 및 항체 또는 당을 포함하는 다양한 표적을 검출할 목적을 위해 조작될 수 있는 리간드 특이적 결합 부위를 가진 융합 분자의 역할을 한다. 이 입증에서, 본 발명자들은 모델 융합 분자로서 DNA 스캐폴드 상에서의 VspR의 검출을 보여준다. 상기 스캐폴드는 10개의 VspR 특이적 결합 부위를 함유한다(도 8). dsDNA 결합에 대한 VspR의 친화도를 보존하기 위해서, 본 발명자들은 실시예 1 및 도 7에서 나타난 바와 같이, DNA 단독의 전위가 전류 증강을 유발하는 염 농도인 0.1 M KCl을 사용한다. 5.631 kb DNA 스캐폴드는 다음과 같은 총 10개의 VspR 결합 부위를 함유한다: 한 서열(14개의 염기쌍) 중 5개, 다른 서열(18개의 염기쌍) 중 3개, 및 또 다른 서열(27 bp) 중 2개. 세 개의 다른 서열들은 동일한 친화도로 VspR에 결합하지 않을 수 있다. 본 실험에서, VspR 단백질 농도는 기록 버퍼에서 18 nM이고, 라벨링 중(결합 단계)에는 180 nM이다. 이것은 DNA 상의 결합 부위에서의 VspR 단백질의 18x 초과량에 해당한다. 실험을 pH 8.0에서 실행하였다(VspR 단백질의 pI는 5.8이다). Kd 및 DNA 농도를 고려하면, 0.1 내지 1%의 DNA만이 VspR에 의해 완전히 차지되어야 하며, 더 큰 퍼센트는 부분적으로 차지되고, DNA의 일부 미지의 나머지 퍼센트는 완전히 결합되지 않는다. 또한, 나노포어 실험 중에 용액에는 유리 VspR 단백질이 있다.
두 번의 대표적인 이벤트를 도 9에서 나타낸다. VspR를 이용한 실험에서, VspR 농도는 18 nM(1.6 mg/L)였고, 결합 부위는 10 nM였다. 스캐폴드 농도는 1 nM이었으며 6.6초마다 캡쳐를 발생시켰다. 이것으로부터, 10 uL 샘플을 사용하는 이론상의 감도는 116 pM(0.01 mg/mL)이었다. 포어 크기는 직경 및 길이가 15 nm이다. 전압은 -100 mV이고, 음의 전압은 음의 전류를 생성하므로, 상향 시프트는 VspR-결합된 DNA 이벤트에 대하여 나타난 바와 같이 감쇠 이벤트에 해당하는 반면에(도 9b), 하향 시프트는 미결합 DNA 스캐폴드 이벤트에 대하여 나타난 바와 같이 양성 시프트를 생성한다(도 9a). 이것은 도 3c에서 이상화된 신호 패턴 및 조건과 일치하며, DNA 이벤트(316)는 융합 분자-결합된 DNA 이벤트(320)와 비교하여 더 빠른 기간 및 반대의 극성을 가진다. 따라서, 이 도면의 주요 관찰점은 VspR-결합된 이벤트가 미결합 DNA 이벤트와 비교하여 반대의 신호 극성을 가진다는 것이다. 도 10은 포어를 통과하는 VspR-결합된 스캐폴드와 일치하는 10개 이상의 대표적인 전류 감쇠 이벤트를 나타낸다. 기록한 10분 동안 90개의 이러한 이벤트가 있었으며, 이는 6.6초 마다 1개의 VspR-결합된 이벤트에 해당한다. 이벤트는 50 내지 150 pA의 진폭 감쇠 및 0.2 내지 2 밀리초의 기간이었다. 진술된 바와 같이, 도 9 및 10에서 하향 이벤트는 전류 증강 이벤트에 해당하고 상향 이벤트는 전류 감쇠 이벤트에 해당하며, 베이스라인이 디스플레이 목적을 위해서 0에 맞춰지더라도 이러한 시프트 방향은 유지된다.
실시예 3 ― DNA 스캐폴드에 결합하는 RecA 단백질 및 나노포어 검출
RecA는 융합 분자의 원소를 포함하고, 이 실시예는 표적 바이오마커를 검출하기 위해 이 원소들을 사용하는 능력을 입증한다. 구체적으로는, 융합 분자는 DNA에 결합하는 RecA의 일부(즉, DNA 결합 도메인) 및 바이오마커에 결합하는 RecA (에피토프)의 일부(항-RecA 항체)로 구성된다. DNA 및 RecA 관련 실험을 먼저 항-RecA 항체의 부재시에 수행한 후, 이어서 이 항체의 존재시에 수행하였다.
시약 DNA/RecA는 RecA로 코팅된 5.6 kb dsDNA 스캐폴드 분자로 구성된다. RecA는 DNA 수복에 수반되는 38 kDa 박테리아 단백질이며, 이것은 dsDNA를 따라 폴리머화할 수 있다([C Bell. Structure and mechanism of Escherichia coli RecA ATPase. Molecular microbiology, 58(2):358-366, Jan 2005] 참조). 이 시약은 10 mM 감마-S-ATP, 70 mM Tris pH 7.6, 10 mM MgCl, 및 5 mM DTT(New England Biolabs)에서 112 uM RecA 단백질과 함께 60 nM 스캐폴드를 배양함으로써 생성된다. RecA가 결합된 ATP를 가지면 RecA는 더 큰 친화도로 dsDNA에 결합하기 때문에 감마-S-ATP가 포함된다. RecA는 ATP를 ADP로 가수분해하고, 이로 인해 DNA에 대한 그것의 친화도를 감소시킬 수 있기 때문에, 비-가수분해 가능한 감마-S ATP 유사체는 ADP로의 이 전이를 방지하고 따라서 더 높은 친화도 상태가 유지된다. DNA에 대한 RecA의 비율이 모든 가능한 3-bp 결합 부위에 대하여 하나의 RecA 분자일지라도, 다른 나노포어 연구에서 관찰된 바와 같이, 본 발명자들은 모든 RecA 단백질이 결합하는 것은 아니므로 용액에는 유리 RecA가 존재한다고 예상한다(Smeets, R. M. M., S. W. Kowalczyk, A. R. Hall, N. H. Dekker, and C. Dekker. "Translocation of RecA coated double-stranded DNA through solid- state nanopores." Nano letters 9, no. 9 (2008): 3089-3095, and Kowalczyk, Stefan W., Adam R. Hall, and Cees Dekker. "Detection of local protein structures along DNA using solid-state nanopores." Nano letters 10, no. 1 (2009): 324-328 참조). 그 이후, DNA/RecA 샘플을 1M KCl 또는 LiCl, 10 mM EDTA로 조정하고 나노포어 실험에서 테스트하거나 또는 초과량의 RecA 단백질을 겔 여과(ThermoScientific Spin Columns)를 사용하여 제거한다.
한 세트의 실험에서, 본 발명자들은 30 nm 두께의 SiN 멤브레인에서 형성된 16 내지 18 nm 직경 포어를 사용하였으며, pH 8의 1M KCl에서 180 mV를 인가한다. 별개의 대조군 실험에서, 미결합 5.6 kb dsDNA 스캐폴드는 2100 내지 400 pA 및 530 내지 500 마이크로초의 범위에서 이벤트의 95%를 발생시킨다. 또한, 유리 RecA 이벤트는 2100 내지 600 pA 및 20 내지 200 usec이다. 마지막으로, RecA-결합된 DNA 이벤트는 전형적으로 0.51 내지 3 nA 범위에서, 더 긴 기간 동안(0.200 내지 3 밀리초) 훨씬 더 깊은 봉쇄이다. RecA-결합된 DNA에 대한 대표적인 이벤트는 도 11 및 도 12에서 나타난다. 이 이벤트들은 흥미로운 패턴을 가지고 있는데, Kowalczyk et al.의 논문["Detection of local protein structures along DNA using solid-state nanopores." Nano letters 10, no. 1 (2009): 324-328)]에서 저자들은 각각의 DNA에 결합된 RecA 필라멘트의 위치 및 길이를 추론하려고 시도하였다; 하지만, 이 논문에서는 포어를 통해 균일한 통과 속도를 가정하지만 또 다른 연구는 dsDNA가 균일한 속도로 포어를 통과하지 않는다는 것을 보고하였기 때문에 상기 논문의 결과는 추론일 뿐이다[Lu, Bo, et al. "Origins and consequences of velocity fluctuations during DNA passage through a nanopore." Biophysical journal 101.1 (2011): 70-79]. 도 13a 및 도 13c에서 세로축은 각각 전압에 의해 표준화된 최대 및 평균 전류 시프트를 나타내며, 가로축은 이벤트 기간을 나타낸다. 두 이벤트 플롯은 10분 동안 기록된 총 1385개의 이벤트를 가지고 있다. 진폭은 이벤트 컨덕턴스 시프트 값을 제공하기 위해 전압에 의해 표준화되며, 이것은 나노포어 연구 논문에서 일반적이다. 예를 들어, 200 mV에서 14 nS의 평균 컨덕턴스는 2.8 nA의 평균 전류 진폭과 동등하다. 진폭(또는 동등하게, 컨덕턴스) 및 기간에서 두 개의 관찰 가능한 부분집단이 있으며, 더 깊고 더 긴 기간 이벤트는 RecA-결합된 DNA에 기인하고 더 빠르고 더 얕은 이벤트는 용액 중 유리 RecA에 기인한다. 본 발명자들은 RecA 단독 대조군 실험을 실행하여 유리 RecA로서 더 빠르고 더 얕은 부분집단의 정체성을 검증하였다. 이것은 또한 선행 연구에서 검증되었다[Smeets, R. M. M., S. W. Kowalczyk, A. R. Hall, N. H. Dekker, and C. Dekker. "Translocation of RecA coated double-stranded DNA through solid-state nanopores." Nano letters 9, no. 9 (2008): 3089-3095]. 평균 값(도 13c 및 d) 대신에 최대 전류 시프트 값(도 13a 및 b)을 살펴보는 것은 부분집단 이벤트를 더 분명하게 만든다. 미결합 DNA 이벤트 패턴에 대한 RecA-결합된 DNA는 도 3a의 모델 신호 패턴과 일치한다.
별개의 실험에서, 표적 항체의 검출을 입증하기 위해서, RecA 항체를 사용하였다. DNA/RecA 시약은 항체 바이오마커에 결합하여 1:10000 희석배수로 항-RecA 단클론성 항체(ARM191, Fisher Scientific) 또는 다클론성 RecA 항-혈청(Prof. Ken Knight, Ph. D., UMass Medical School 제공)와 함께 30분 동안 1 나노몰(nanomolar) DNA/RecA를 배양함으로써 DNA/RecA/Ab 복합체를 생성한다. 전기영동 이동도 시프트 검정(1 x TBE 버퍼 중의 5% TBE 폴리아크릴아미드 겔)을 사용하여 복합체의 이동을 DNA 단독 또는 적절한 대조군과 비교함으로써 DNA/RecA 및 DNA/RecA/Ab 복합체를 테스트하였다.
나노포어 실험을 200 mV, 1M LiCl에서 다음과 같은 직경을 가진 포어로 실행하였다: DNA 단독 대조군에서 20 nm의 직경, RecA-결합된 DNA 복합체가 첨가된 이후에는 27 nm로 커진 직경. 겔 시프트 실험에서, 도 14a는 DNA/RecA보다 DNA/RecA/mAb에 대하여 분명한 시프트를 나타내며, 이것은 차례로 미결합 5.6 kb dsDNA 스캐폴드보다 훨씬 더 높다. 이 복합체를 나노포어를 이용하는 실험으로 테스트하였다. 구체적으로, 0.1 nM DNA를 포어 상의 챔버에 첨가하여, 10분 동안 기록한 후, 1.25 nM DNA/RecA를 첨가하였다. 또 다른 기록 기간 후, 1.25 nM DNA/RecA/mAb를 첨가하였다. 용액 중의 AB-결합된 복합체를 이용하여, 새로운 다중 수준의 이벤트 유형을 관찰하였으며(도 14b), 이것은 두 개의 다른 복합체 유형 (DNA, DNA/RecA)의 이벤트 패턴 특성과 일치하지 않는다. 실험의 각 단계 중에 기록된 이벤트의 t D 에 대한 Δ/ 분포는 RecA-결합된 DNA 이벤트는 더 긴 기간 t D 를 가지고, DNA/RecA/mAb가 첨가된 후 3배 많은 이벤트가 0.6 nA 이상의 평균 진폭 시프트(Al)을 가진다는 것을 보여준다(도 14c). 또한, 이 데이터 세트에서의 표지 이벤트에 대한 단순한 기준은 Ab-결합된 바와 같이 (Δ/, t D ) > (0.6 nA, 0.2 ms)이다. 미결합 DNA 이벤트에는 거의 존재하지 않지만 RecA-결합된 이벤트의 유의한 분획에는 존재하는(DNA/RecA에 결합된 항체가 있거나 없는) 우수한 신호를 식별하는 것은 나노포어 상의 용액 내 RecA-결합된 DNA 복합체의 존재를 검출하는데 유용하다. 항체를 검출할 목적으로, 본 발명자들은 이 단계를 추가로 취하였으며, 이는 미결합 DNA 및 RecA-결합된 DNA 이벤트 유형에는 거의 존재하지 않지만, DNA/RecA에 결합된 항체와 함께 RecA-결합된 이벤트의 유의한 분획에는 존재하는 우수한 신호를 식별하는 것을 목적으로 한다. 이것은 나노포어 상의 용액 내 RecA-결합된 DNA 복합체의 존재를 검출하는 것에 대한 기준을 제공한다. 이 DNA 및 RecA 및 RecA-항체 실험은 0.4 M 이상의 KCl 농도와 함께 양의 전압으로 실행되기 때문에, 본 발명자들은 도 14b의 이벤트 패턴이 도 3a에서 이상화된 패턴과 비슷하다는 것을 확인할 수 있다.
실시예 4 ― 표적 단백질 검출을 위한 PNA 및 비오틴을 포함하는 융합 분자
상기 실시예는 RecA-코팅된 dsDNA 복합체에 결합된 RecA-항체의 검출을 조사하는 것에 관한 것이다. RecA가 3bp 영역에 비-특이적으로 결합하므로, RecA-항체가 dsDNA 상의 어떤 RecA에도 결합할 수 있기 때문에, 표적이 특정 부위에 결합하게 하는 접근법을 입증하는 것이 또한 바람직하다. 특히, 본 발명자들은 12-mer 펩타이드-핵산(PNA) 분자에 결합하도록 조작된 5.6 kb dsDNA 스캐폴드를 사용하며, 여기서 각각의 PNA는 아비딘 패밀리 멤버(예를 들어, 뉴트라비딘, 및/또는 1가 스트렙타비딘)에 결합하기 위한 세 개의 비오티닐화된 부위를 가진다(도 15a). 상기 스캐폴드는 최대 75개의 아비딘 바이오마커 결합 부위에 국한되는 25개의 별개의 부위를 가진다(도 15b). 본 발명의 데이터는 DNA/PNA/Neut 복합체가 다른 백그라운드 이벤트 유형(미결합 DNA 단독, 뉴트라비딘 단독, PNA/뉴트라비딘 단독)보다 검출 가능한 이벤트 신호를 유발하므로 완전 조립된(즉, DNA/PNA/뉴트라비딘) 이벤트로서 태그될 수 있다는 것을 나타낸다(도 16). 이러한 설정에서, 스캐폴드+융합 분자의 역할을 하는 것은 완전 조립된 DNA/PNA/뉴트라비딘 복합체이다. 이하, DNA/PNA/뉴트라비딘 복합체가 나노포어로 검출될 수 있다는 것을 상세히 설명한다.
이러한 설정에서, 융합 분자는 두 가지 별개의 도메인을 함유하는데, 하나는 독특한 DNA 서열에 결합하고 또 다른 하나는 항-뉴트라비딘 항체에 결합한다. DNA 결합 도메인은 스캐폴드에 걸쳐 25번 반복되는 독특한 서열(GAAAGTGAAAGT, (SEQ ID NO:1))에 결합하는 단백질 핵산 분자(PNA)이다(도 15b). PNA 분자는 상보적 서열과 쌍을 이루는 A,T,C,G 염기를 가진 올리고뉴클레오타이드와 유사하지만, 전형적인 올리고뉴클레오타이드와 유사한 포스페이트 백본 대신에, 그 백본은 단백질이다. 따라서 포스페이트 백본에 의해 제공된 음전하가 제거되므로, PNA 분자는 상보적 DNA 가닥을 대체하여, PNA 분자를 포함하는 짧은 스트레치(stretch)에 대한 새로운 DNA/PNA 하이브리드를 형성함으로써 dsDNA로 통합될 수 있다. 본 실험에 사용된 PNA는 서열 GAA*AGT*GAA*AGT(SEQ ID NO:1)를 가지고 있는데, *는 비오틴이 리신 아미노산에 커플링함으로써 감마 위치에서 PNA 백본으로 통합되므로, 각각의 PNA는 세 개의 비오틴 분자를 가진다는 것을 나타낸다(PNABio). 스캐폴드에 결합된 융합 분자를 생성하기 위해서, 60 nM 스캐폴드를 2분 동안 95℃로 가열하고, 60℃로 냉각시키고 15 mM NaCl에서 가능한 결합 부위에 대한 PNA의 10x 초과량과 함께 1시간 동안 배양한 다음 4℃로 냉각시킨다. 초과량의 PNA를 10 mM Tris pH 8.0에 대하여 2시간 동안 투석한다(20k MWCO, Thermo Scientific). 그 이후 이 DNA/PNA 복합체를 10배 초과량의 뉴트라비딘 단백질(Pierce/Thermo Scientific)로 가능한 비오틴 부위에 라벨링한다(투석 중에 PNA의 60% 감소를 가정). 상기 기술된 바와 같이 전기영동을 수행하여 순도, 농도 및 잠재적 응집을 평가한다. 이 시약, DNA/PNA/뉴트라비딘(D/P/N)을 사용할 때까지 -20℃에 저장한다.
도 17a 및 b는 다음의 세 번의 별개의 실험으로부터 tD에 대한 Δ| 분포를 비교하는 데이터를 나타낸다: DNA 단독, 뉴트라비딘 단독 및 D/P/N 시약. D/P/N 실험에서 가장 큰 |Δ|| 이벤트는 D/P/N 복합체에 기인할 가능성이 가장 크며 (도 16d), 이는 결합된 융합 분자(즉, PNA 및 뉴트라비딘이 결합된 스캐폴드)로서 이벤트를 태그하는 단순한 기준을 제공한다. 구체적으로, 본 발명자들은 상기 이벤트에 대하여 |Δ||> 4nA이면, 그 이벤트를 "결합된 융합-분자"로서 표시할 수 있다. 도 17의 데이터 세트에 대하여, D/P/N 실험군에서의 이벤트의 9.3%(390)가 |Δ||> 4nA인데 반해, 대조군에서의 D 이벤트의 0.46% 및 N 이벤트의 0.16%만이 4 nA를 초과한다. 1M KCl 및 인가된 200 mV에서 7 nm 직경 포어를 이용하는 별개의 실험(데이터 미도시)에서, 0.4 nM 농도로 단지 PNA 및 뉴트라비딘을 가지고 있는 대조군에서는, 어떠한 이벤트도 4 nA를 초과하지 않았다(0%). 본 발명자들의 수학적 기준을 적용하면, 확률 변수 Q = {표시된 이벤트의 분획}는 이항 분포를 가지며, 이 기준 및 다른 통계학적 모델링 도구를 사용하여, 본 발명자들은 Q = 9.29 ± 1.15%로서 이 데이터 세트에 대한 99% 신뢰 구간을 산출할 수 있다. 9.29% > 0.46%(최대 허위양상 %)는 Q에 대한 99% 신뢰 구간 내에서 잘 만족되기 때문에, 본 발명자들은 양의 테스트 결과를 가지고, 8분 이하의 데이터를 수집한다. 사실, 같은 99% 신뢰도는 단지 데이터의 처음 60초만을 이용하는 데이터 세트에 대해서 달성된다. 겔 시프트(도 17c)는 스캐폴드 DNA 이동이 뉴트라비딘 의존적 방식으로 지연된다는 것을 나타낸다; 본 발명자들은 모든 DNA가 라벨링되고 거의 균질한 집단이 생성된다는 것을 확인한바, 이 예비 실험에서는 10x 농도를 사용하였다. 더 짧은 DNA를 사용하는 또 다른 DNA/PNA 나노포어 연구(Alon Singer, Meni Wanunu, Will Morrison, Heiko Kuhn, Maxim Frank-Kamenetskii, and Amit Meller. "Nanopore based sequence specific detection of duplex DNA for genomic profiling." Nano letters 10, no. 2 (2010): 738-742)에서 관찰되긴 하지만, 본 발명자들은 DNA/PNA 복합체를 이용한 시프트를 확인하지 못했다.
본 발명은 상기 구체예와 함께 기술되는 한편, 상기 언급된 설명 및 실시예는 본 발명을 예시하지만 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다. 본 발명의 범위 내에 있는 다른 양태, 이점 및 변형은 본 발명과 관련된 업계의 당업자에게 자명할 것이다.
<110> TWO PORE GUYS, INC. <120> TARGET DETECTION WITH NANOPORE <130> IF16P238/US <150> PCT/US 2014/036861 <151> 2014-05-05 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 gaaagtgaaa gt 12

Claims (23)

  1. 샘플에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 입자를 검출하는 방법으로서,
    (a) 표적 분자 또는 입자가 리간드에 결합하게 하고 결합 도메인이 결합 모티프에 결합하게 하는 조건 하에서, (i) 표적 분자 또는 입자에 결합할 수 있는 리간드 및 결합 도메인을 포함하는 융합 분자, 및 (ii) 결합 도메인이 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 모티프를 포함하는 폴리머 스캐폴드와 샘플을 접촉시키는 단계;
    (b) 디바이스의 내부 공간을 두 개의 용적으로 분리하는 포어를 포함하는 디바이스에 폴리머 스캐폴드를 로딩하고, 상기 융합 분자에 결합된 폴리머 스캐폴드를 포어를 통해 한 용적에서 다른 용적으로 통과시키도록 디바이스를 구성하는 단계로서, 상기 디바이스는 포어를 통과하는 대상을 식별하도록 구성된 센서를 포함하는 단계; 및
    (c) 센서를 이용하여, 결합 모티프에 결합된 융합 분자가 표적 분자 또는 입자에 결합되는지를 결정하고, 이로 인해 샘플에 표적 분자 또는 입자가 존재하는지를 검출하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 표적 분자는 단백질, 펩타이드, 핵산, 화합물, 이온, 및 원소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1 항에 있어서, 표적 입자는 단백질 복합체 또는 응집체, 단백질/핵산 복합체, 단편화된 또는 완전 조립된 바이러스, 박테리아, 세포 및 세포 응집체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 단계 (b) 전에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 단계 (a) 전에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분자 또는 입자 및 리간드 간의 결합을 변화시키는 조건을 적용하여, 다시 상기 결정을 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6 항에 있어서, 상기 조건은, 샘플로부터의 표적 분자 또는 입자의 제거; 결합에 대하여 표적 분자 또는 입자, 또는 리간드와 경쟁하는 시약의 첨가; 및 pH, 염 또는 온도의 변화로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모티프는 결합 도메인으로의 결합을 위한 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8 항에 있어서, 화학적 변형은 아세틸화, 메틸화, 서몰레이션(summolation), 글리코실화, 인산화 및 산화로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 펩타이드 핵산(PNA), DNA/RNA 하이브리드 및 폴리펩타이드 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인은 헬릭스-턴-헬릭스, 징크 핑거, 류신 지퍼, 윙드 헬릭스, 윙드 헬릭스 턴 헬릭스, 헬릭스-루프-헬릭스 및 고 이동성 군 박스(HMG-박스)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인은 잠금 핵산(locked nucleic acid; LNA), 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid; PNA), 전사 활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease; TALEN), 군집성 주기적인 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeat; CRISPR), 덴드리머, 펩타이드 및 압타머로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드는 항체, 항체 단편, 에피토프, 호르몬, 신경전달물질, 사이토카인, 성장 인자, 세포 인식 분자, 핵산, 펩타이드, 압타머 및 수용체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 및 리간드는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 금속 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호작용 및 평면 적층 상호작용으로 구성된 군으로부터 선택된 상호작용을 통해 연결되거나, 또는 연속적 폴리펩타이드로 번역되어 융합 분자를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분자 또는 입자, 또는 표적 분자 또는 입자 / 리간드 복합체에 결합할 수 있는 검출 가능한 라벨과 샘플을 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머 스캐폴드는 결합 모티프의 적어도 두 개의 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머 스캐폴드는 적어도 두 개의 다른 결합 모티프를 포함하고; 샘플은 적어도 두 개의 융합 분자와 접촉되어 있으며, 융합 분자 각각은 적어도 두 개의 다른 결합 모티프 중 다른 하나에 결합할 수 있는 다른 결합 도메인 및 다른 표적 분자 또는 입자에 결합할 수 있는 다른 리간드를 포함하고; 센서는 각각의 결합 모티프에 결합된 융합 분자가 표적 분자 또는 입자에 결합되는지 여부를 식별하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 센서는 두 용적 사이에서 차등적인 전압을 인가하고 포어를 통해 전류 흐름을 측정하도록 구성된 전극을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 디바이스는 상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하며,
    상부 챔버는 제1 포어를 통해 중간 챔버와 교류하고, 중간 챔버는 제2 포어를 통해 하부 챔버와 교류하고;
    제1 포어 및 제2 포어는 직경이 1 nm 내지 100 nm이고, 서로 10 nm 내지 1,000 nm 이격되어 있고;
    각각의 챔버는 전원 장치에 연결되는 전극을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모티프가 포어를 통과한 후 역방향으로 폴리머 스캐폴드를 이동시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 표적 분자 또는 입자의 존재를 검출하기 위한 키트로서,
    (a) 표적 분자 또는 입자에 결합할 수 있는 리간드 및 결합 도메인을 포함하는 융합 분자;
    (b) 결합 도메인이 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 모티프를 포함하는 폴리머 스캐폴드; 및
    (c) 디바이스의 내부 공간을 두 개의 용적으로 분리하는 포어를 포함하는 디바이스로서, 상기 디바이스는 상기 융합 분자에 결합된 폴리머 스캐폴드가 한 용적으로부터 다른 용적으로 통과하게 하도록 구성되고, 결합 모티프가 (i) 융합 분자에 결합되는 한편 리간드는 표적 분자 또는 입자에 결합되거나, (ii) 융합 분자에 결합되는 한편 리간드는 표적 분자 또는 입자에 결합되지 않거나, 또는 (iii) 융합 분자에 결합되지 않는지 여부를 식별하도록 구성된 포어에 인접한 센서를 더 포함하는 것인, 디바이스
    를 포함하는 키트.
  22. 제21 항에 있어서, 표적 분자 또는 입자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 제22 항에 있어서, 샘플은 표적 분자 또는 입자, 또는 표적 분자 또는 입자와 리간드의 복합체에 결합할 수 있는 검출 가능한 라벨을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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