ES2877569T3 - Procedimientos y sistemas para secuenciación de ácido nucleico por reconocimiento por tunelado - Google Patents

Procedimientos y sistemas para secuenciación de ácido nucleico por reconocimiento por tunelado Download PDF

Info

Publication number
ES2877569T3
ES2877569T3 ES17728490T ES17728490T ES2877569T3 ES 2877569 T3 ES2877569 T3 ES 2877569T3 ES 17728490 T ES17728490 T ES 17728490T ES 17728490 T ES17728490 T ES 17728490T ES 2877569 T3 ES2877569 T3 ES 2877569T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
electrode
nucleic acid
acid molecule
insulator
aperture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17728490T
Other languages
English (en)
Inventor
Yann Astier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2877569T3 publication Critical patent/ES2877569T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un procedimiento de análisis de una molécula de ácido nucleico, comprendiendo el procedimiento: unir la molécula de ácido nucleico a una proteína motora y una partícula que tiene un primer diámetro; aplicar un campo eléctrico para mover una primera porción de la molécula de ácido nucleico en una abertura, la abertura definida por un primer electrodo, un primer aislante y un segundo electrodo, y teniendo la abertura un segundo diámetro menor que el primer diámetro; enlazar el primer electrodo y el segundo electrodo dentro de la abertura por una porción de dicha molécula de ácido nucleico, comprendiendo la primera porción un primer nucleótido; aplicar un voltaje a través del primer electrodo y el segundo electrodo; medir una corriente a través del primer electrodo, la primera porción de la molécula de ácido nucleico, y el segundo electrodo; e identificar el primer nucleótido de la primera porción de la molécula de ácido nucleico en base a la corriente.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos y sistemas para secuenciación de ácido nucleico por reconocimiento por tunelado
Antecedentes
Los dispositivos que contienen nanoporos se han dirigido al desarrollo de nuevos procedimientos analíticos. Los nanoporos pueden tener la capacidad de detectar moléculas individuales, lo que puede ser una tecnología prometedora en el campo de detección química y biológica. Por ejemplo, se pueden usar nanoporos para diagnóstico y secuenciación de ácido nucleico y se describen en los documentos DE102013214341A1 y US2015/344945 A1.
La biodetección de nanoporos de estado sólido puede ser una técnica de detección de moléculas individuales rápida. En algunos casos, los nanoporos de estado sólido forman un canal en un líquido iónico entre dos electrodos. Los dos electrodos pueden no ser parte del propio nanoporo sino que se pueden situar en el líquido iónico. A medida que una molécula pasa a través del canal de nanoporos, la corriente y otras características eléctricas a través del canal cambian. Estas características eléctricas pueden proporcionar información sobre la molécula, pero los problemas de fabricación pueden dificultar la identificación de nucleótidos individuales en una molécula de ácido nucleico. Pueden estar presentes múltiples nucleótidos en la abertura al mismo tiempo o pueden pasar a través de la abertura rápidamente, lo que puede no proporcionar una señal suficientemente fuerte para diferenciar nucleótidos.
Se pueden usar dispositivos de nanoporos con reconocimiento por tunelado. El reconocimiento por tunelado se basa en colocar una entidad química entre electrodos, que puede estar en el propio dispositivo de nanoporo. Los orbitales de la entidad química permitirán que los electrones se transfieran de un electrodo al otro, creando una corriente de tunelado. Las dimensiones y otras propiedades de nanoporos de estado sólido pueden ser difíciles de adaptar a un procedimiento de producción en masa. Para secuenciar moléculas de ácido nucleico con corriente iónica, se puede necesitar que las dimensiones de nanoporos sean del orden de nanómetros, que pueden ser menores que 2 nm. La creación de un canal de este tamaño puede requerir técnicas precisas y costosas. Sin embargo, la reducción de las dimensiones del nanoporo puede dar como resultado una humectación incompleta o deficiente necesaria para que el nanoporo funcione como un dispositivo sensor. Todavía se necesitan mejoras en el diseño y la capacidad de fabricación de los dispositivos que contienen nanoporos usados en detección química y biológica y procedimientos que implican los dispositivos. Las mejoras de diseño y capacidad de fabricación no se deben realizar a expensas de un análisis exacto y preciso. Estos y otros problemas se tratan por la tecnología descrita en el presente documento.
Breve sumario
Los modos de realización de la presente tecnología pueden permitir la secuenciación de moléculas de ácido nucleico por reconocimiento por tunelado. Una molécula de ácido nucleico se puede impulsar en un canal por un campo eléctrico o un gradiente de presión. En el canal, una porción de la molécula de ácido nucleico puede entrar en un espacio entre dos electrodos. Los electrodos con un espacio pequeño entre ellos pueden permitir el reconocimiento por tunelado, pero las moléculas de ácido nucleico pueden no difundirse con frecuencia suficiente en espacios pequeños para obtener una señal de tunelado adecuada. El campo eléctrico o gradiente de presión puede introducir moléculas de ácido nucleico en el espacio entre electrodos de forma más fácil y frecuente. Los espacios pequeños, que pueden ser de 1-2 nm de ancho, pueden ser difíciles o costosos de fabricar. En algunos casos, el espacio puede estar entre dos electrodos alineados paralelos entre sí pero no en el mismo plano, lo que puede ser más fácil de fabricar que un espacio entre los extremos de dos electrodos coplanares. La molécula de ácido nucleico se puede adherir a una proteína motora, que se puede unir a una partícula o una microesfera. La partícula puede ser más grande que el canal. La partícula puede anclar un extremo de la molécula de ácido nucleico mientras que un campo eléctrico o un flujo tira de la molécula de ácido nucleico a través del canal. De esta manera, la molécula de ácido nucleico se puede estirar a lo largo del canal y puede oscilar en el canal como resultado del movimiento browniano. La molécula de ácido nucleico puede interactuar estocásticamente con los electrodos de tunelado para proporcionar una señal de tunelado.
Se puede aplicar un voltaje a los electrodos. Cuando una porción de la molécula de ácido nucleico está dentro del espacio entre los electrodos y la molécula de ácido nucleico enlaza dos electrodos, los electrones pueden atravesar la molécula de ácido nucleico de un electrodo al otro, generando una corriente. Se puede medir la corriente. La molécula de ácido nucleico puede oscilar en el espacio y la corriente medida puede tener una amplitud y frecuencia. La amplitud y frecuencia pueden ser variables. Las características de la corriente pueden ayudar a identificar un nucleótido o base particular presente en la molécula de ácido nucleico. Las características eléctricas pueden servir casi como una huella genética para identificar un nucleótido de la molécula de ácido nucleico. La proteína motora puede alimentar a través o tirar de la molécula de ácido nucleico de modo que esté un nucleótido diferente en el espacio entre electrodos y se pueda medir una señal de corriente diferente. Como resultado, se puede identificar un nucleótido adicional. Se pueden mover más nucleótidos al espacio entre electrodos, de modo que se pueden identificar múltiples nucleótidos del ácido nucleico y se puede secuenciar el ácido nucleico.
Los modos de realización pueden incluir un procedimiento de análisis de una molécula de ácido nucleico. El procedimiento puede incluir unir una molécula de ácido nucleico a una proteína. La proteína se puede unir a una partícula con un primer diámetro. El procedimiento también puede incluir aplicar un campo eléctrico para mover una primera porción de la molécula de ácido nucleico al interior de una abertura. La abertura se puede definir por un primer electrodo, un primer aislante y un segundo electrodo. La abertura puede tener un segundo diámetro menor que el primer diámetro. El procedimiento puede incluir además poner en contacto la primera porción de la molécula de ácido nucleico tanto con el primer electrodo como con el segundo electrodo. Además, el procedimiento puede incluir aplicar un voltaje a través del primer electrodo y el segundo electrodo. Se puede medir la corriente a través del primer electrodo, la molécula de ácido nucleico y el segundo electrodo. En base a la corriente, se puede identificar un nucleótido de la molécula de ácido nucleico.
Algunos modos de realización pueden incluir un sistema de análisis de moléculas de ácido nucleico. El sistema puede incluir una molécula de ácido nucleico unida a una proteína. La proteína se puede unir a una partícula con un diámetro. El sistema también puede incluir una abertura definida por un primer electrodo, un primer aislante y un segundo electrodo. La abertura puede tener un diámetro menor que el diámetro de la partícula. El sistema puede incluir además una primera fuente de alimentación en comunicación eléctrica con el primer electrodo y el segundo electrodo. Además, el sistema puede incluir una segunda fuente de alimentación configurada para aplicar un campo eléctrico a través de la abertura.
Los modos de realización adicionales pueden incluir un procedimiento de análisis de una molécula de ácido nucleico. El procedimiento puede incluir unir una molécula de ácido nucleico a una proteína. La proteína se puede unir a una partícula con un primer diámetro. El procedimiento también puede incluir mover una primera porción de la molécula de ácido nucleico a una abertura definida por un aislante. La abertura puede tener un segundo diámetro menor que el primer diámetro. El procedimiento incluye además mover una segunda porción de la molécula de ácido nucleico a un espacio entre un primer electrodo y un segundo electrodo. El espacio puede incluir una línea que representa la distancia más corta entre los electrodos. Además, el procedimiento puede incluir poner en contacto la molécula de ácido nucleico tanto con el primer electrodo como con el segundo electrodo. Además, se puede medir una corriente a través del primer electrodo, la molécula de ácido nucleico y el segundo electrodo. En base a la corriente, se puede identificar un nucleótido de la molécula de ácido nucleico.
Los modos de realización pueden incluir un sistema de análisis de ácido nucleico. El sistema puede incluir una molécula de ácido nucleico unida a una proteína. La proteína se puede unir a una partícula con un primer diámetro. El sistema también puede incluir una abertura definida por un primer aislante. La abertura puede tener un segundo diámetro menor que el primer diámetro. La abertura puede tener un eje longitudinal perpendicular al diámetro. El sistema puede incluir además un primer electrodo. Una porción del primer electrodo se puede extender en la abertura. El sistema también puede incluir un segundo electrodo, extendiéndose una porción del segundo electrodo en la abertura. Un plano que incluye la porción del primer electrodo y la porción del segundo electrodo puede ser ortogonal al eje longitudinal. Además, el sistema puede incluir una primera fuente de alimentación en comunicación eléctrica con el primer electrodo y el segundo electrodo.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de análisis de una molécula de ácido nucleico, comprendiendo el procedimiento las etapas de (i) unir la molécula de ácido nucleico a una proteína y una partícula, tal como una microesfera que tiene un primer diámetro; (ii) aplicar un campo eléctrico para mover una primera porción de la molécula de ácido nucleico a una abertura, la abertura definida por un primer electrodo, un primer aislante y un segundo electrodo, y teniendo la abertura un segundo diámetro menor que el primer diámetro; (iii) poner en contacto la primera porción de la molécula de ácido nucleico tanto con el primer electrodo como con el segundo electrodo, comprendiendo la primera porción un primer nucleótido; (iv) aplicar un voltaje a través del primer electrodo y el segundo electrodo; (v) medir una corriente a través del primer electrodo, la primera porción de la molécula de ácido nucleico y el segundo electrodo; y (vi) identificar el primer nucleótido de la primera porción de la molécula de ácido nucleico en base a la corriente.
El primer diámetro puede ser de 10 nm o más. El segundo diámetro puede estar en un intervalo de 10 nm a 15 nm. El primer aislante puede tener un grosor de 2 nm o menos y/o puede comprender una fotoprotección. La abertura se define por una pared lateral, y dicha pared lateral puede comprender entonces un segundo aislante, el primer electrodo, el primer aislante, el segundo electrodo y un tercer aislante, en la que el segundo aislante está en contacto con el primer electrodo, el primer electrodo está en contacto con el primer aislante, el primer aislante está en contacto con el segundo electrodo y el segundo electrodo está en contacto con el tercer aislante.
El procedimiento puede comprender además una etapa de mover, usando la proteína, la molécula de ácido nucleico de modo que una segunda porción de la molécula de ácido nucleico está en contacto tanto con el primer electrodo como con el segundo electrodo, en el que la segunda porción de la molécula de ácido nucleico está en una localización diferente de la primera porción de la molécula de ácido nucleico, y la segunda porción de la molécula de ácido nucleico comprende un segundo nucleótido. La segunda porción de la molécula de ácido nucleico se puede situar más cerca o más lejos de la proteína de lo que la primera porción se sitúa de la proteína.
La proteína puede ser una proteína motora molecular seleccionada del grupo que consiste en polimerasas, helicasas, ribosomas y exonucleasas. La molécula de ácido nucleico puede ser ARN, ADN monocatenario o ADN circular monocatenario o bicatenario. Dicho primer nucleótido puede comprender un nucleótido marcado con un compuesto químico que proporciona un incremento en la corriente de tunelado con respecto al nucleótido no marcado.
Además, es posible medir una amplitud y una frecuencia de la corriente mientras la molécula de ácido nucleico oscila en la abertura. También es posible medir un ancho de pulso de la corriente mientras la molécula de ácido nucleico oscila en la abertura. La corriente se puede comparar con una corriente de calibración medida a partir de un nucleótido conocido. El primer electrodo y el segundo electrodo se recubren cada uno con una molécula adaptadora, y la molécula adaptadora puede tener una interacción química de fuerza débil con la molécula de ácido nucleico.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un sistema o dispositivo de análisis de moléculas de ácido nucleico que comprende (i) una proteína unida a una partícula, teniendo la partícula un primer diámetro; (ii) una abertura definida por un primer electrodo, un primer aislante y un segundo electrodo, teniendo la abertura un segundo diámetro menor que el primer diámetro; (iii) una primera fuente de alimentación en comunicación eléctrica con el primer electrodo y el segundo electrodo, (iv) una segunda fuente de alimentación configurada para aplicar un campo eléctrico a través de la abertura para mover la proteína unida a la partícula a la abertura; y (v) un dispositivo medidor configurado para medir una corriente a través del primer electrodo y el segundo electrodo cuando una primera porción de una molécula de ácido nucleico unida a la proteína está en contacto con el primer electrodo y el segundo electrodo.
El primer aislante puede comprender una fotoprotección. La abertura se puede definir además por una pared lateral, y la pared lateral comprende entonces un segundo aislante, el primer electrodo, el primer aislante, el segundo electrodo y un tercer aislante. En un modo de realización, el segundo aislante y el tercer aislante comprenden una fotoprotección. En otro modo de realización, el primer electrodo se dispone entre el segundo aislante y el primer aislante, y el segundo electrodo se dispone entre el primer aislante y el tercer aislante.
Al menos uno del primer electrodo y el segundo electrodo se puede recubrir con una molécula adaptadora, en el que la molécula adaptadora experimenta interacciones químicas de fuerzas débiles con la molécula de ácido nucleico. Además, al menos uno del primer electrodo y el segundo electrodo comprende paladio.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de análisis de una molécula de ácido nucleico que comprende (i) unir la molécula de ácido nucleico a una proteína y una partícula que tiene un primer diámetro; (ii) mover una porción de la molécula de ácido nucleico a una abertura definida por un primer aislante, teniendo la abertura un segundo diámetro menor que el primer diámetro y comprendiendo la porción un nucleótido; (iii) mover la porción de la molécula de ácido nucleico a un espacio entre un primer electrodo y un segundo electrodo, comprendiendo el espacio una línea que representa la distancia más corta entre el primer electrodo y el segundo electrodo; (iv) poner en contacto la porción de la molécula de ácido nucleico tanto con el primer electrodo como con el segundo electrodo; (v) medir una corriente a través del primer electrodo, la molécula de ácido nucleico y el segundo electrodo; y (vi) identificar el nucleótido de la molécula de ácido nucleico en base a la corriente.
Mover la porción de la molécula de ácido nucleico a la abertura puede comprender mover la porción de la molécula de ácido nucleico con un campo eléctrico aplicado. Mover la porción de la molécula de ácido nucleico a la abertura puede comprender mover la porción de la molécula de ácido nucleico con un flujo de líquido impulsado por presión. La distancia más corta entre el primer electrodo y el segundo electrodo puede ser de 2 nm o menos. La abertura puede tener un eje longitudinal perpendicular al segundo diámetro de modo que una porción del primer electrodo se extiende en la abertura, una porción del segundo electrodo se extiende en la abertura y un plano que comprende la porción del primer electrodo y la porción del segundo electrodo es ortogonal al eje longitudinal.
La abertura se puede definir por una pared lateral que comprende un segundo aislante, el primer electrodo, el primer aislante, el segundo electrodo y un tercer aislante, de modo que el segundo aislante está en contacto con el primer electrodo, el primer electrodo está en contacto con el primer aislante, el primer aislante está en contacto con el segundo electrodo y el segundo electrodo está en contacto con el tercer aislante.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo o sistema de análisis de ácido nucleico que comprende (i) una proteína unida a una partícula, teniendo la partícula un primer diámetro; (ii) una abertura definida por un primer aislante, teniendo la abertura un segundo diámetro más pequeño que el primer diámetro, y teniendo la abertura un eje longitudinal perpendicular al segundo diámetro; (iii) un primer electrodo, en el que una porción del primer electrodo se extiende en la abertura; (iv) un segundo electrodo, en el que una porción del segundo electrodo se extiende en la abertura y en el que un plano que comprende la porción del primer electrodo y la porción del segundo electrodo es ortogonal al eje longitudinal; (v) una primera fuente de alimentación en comunicación eléctrica con el primer electrodo y el segundo electrodo; y (vi) un dispositivo medidor configurado para medir una corriente a través del primer electrodo y el segundo electrodo cuando una primera porción de una molécula de ácido nucleico unida a la proteína está en contacto con el primer electrodo y el segundo electrodo.
El dispositivo o sistema puede comprender además una segunda fuente de alimentación configurada para aplicar un campo eléctrico a través de la abertura. El primer electrodo se puede disponer entre el primer aislante y un segundo aislante. El segundo electrodo se puede disponer entre el primer aislante y un segundo aislante. El primer electrodo y el segundo electrodo pueden definir un espacio que comprende la distancia más corta de 2 nm o menos entre el primer electrodo y el segundo electrodo. Dicho espacio se puede formar rompiendo un nanohilo en el primer electrodo y el segundo electrodo. Todo el sistema o dispositivo se puede unir a un chip de silicio microfluídico.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1A muestra una vista lateral de un sistema de análisis de moléculas de ácido nucleico 100 de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
La FIG. 1B muestra una vista superior de un sistema de análisis de moléculas de ácido nucleico 100 de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
La FIG. 2 es un diagrama de flujo de un procedimiento 200 de análisis de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
La FIG. 3A muestra una molécula de ácido nucleico en contacto con electrodos para permitir el reconocimiento por tunelado en un sistema de análisis de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
La FIG. 3B muestra una molécula de ácido nucleico no en contacto con electrodos en un sistema de análisis de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
La FIG. 4A muestra una molécula de ácido nucleico en contacto con dos electrodos antes de moverse por una proteína motora molecular de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
La FIG. 4B muestra una molécula de ácido nucleico en contacto con dos electrodos después de moverse por una proteína motora molecular de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
La FIG. 5A muestra características de corriente de diferentes moléculas de ácido nucleico en flujo libre de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
La FIG. 5B muestra características de corriente de diferentes moléculas de ácido nucleico cuando se adhieren a una microesfera de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
La FIG. 6A muestra una vista superior de un sistema de análisis de moléculas de ácido nucleico 600 de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
La FIG. 6B muestra una vista lateral de un sistema de análisis de moléculas de ácido nucleico 600 de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
La FIG. 7 muestra un diagrama de flujo de un procedimiento 700 de análisis de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
La FIG. 8A muestra una molécula de ácido nucleico en contacto con dos electrodos en un sistema de análisis de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
La FIG. 8B muestra una molécula de ácido nucleico no en contacto con dos electrodos en un sistema de análisis de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con modos de realización de la presente invención.
Definiciones
El término "poner en contacto" se puede referir a acercar un objeto en proximidad a otro objeto de modo que los electrones pueden atravesar de un objeto al otro objeto. A nivel subatómico, dos objetos pueden no tocarse nunca físicamente ya que las fuerzas repulsivas de las nubes de electrones en los objetos pueden evitar que los objetos se acerquen en estrecha proximidad.
El término "proteína motora" puede ser una molécula que puede mover una molécula de ácido nucleico con respecto a la molécula. Por ejemplo, la proteína motora puede permanecer estacionaria y la molécula de ácido nucleico se puede mover, o la molécula de ácido nucleico puede permanecer estacionaria y la proteína motora se puede mover. Una proteína motora puede incluir polimerasas, helicasas, ribosomas, exonucleasas, junto con otras enzimas.
"Ácido nucleico" se puede referir a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bien bicatenaria. El término puede englobar ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de cadena principal modificados, que son sintéticos, naturales y no naturales, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de dichos análogos pueden incluir, sin limitación, fosforotioatos, fosforamiditas, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metilrribonucleótidos, ácidos peptidonucleicos (PNA).
A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico particular también engloba implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). El término ácido nucleico se usa de manera intercambiable con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido y polinucleótido.
El término "nucleótido", además de referirse a los monómeros de ribonucleótido o desoxirribonucleótido naturales, se puede entender que se refiere a variantes estructurales relacionadas del mismo, incluyendo derivados y análogos, que son funcionalmente equivalentes con respecto al contexto particular en el que se usa el nucleótido (por ejemplo, hibridación a una base complementaria), a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.
El término "oscilar" se puede referir al movimiento de un objeto en un fluido como resultado del movimiento browniano u otras fuerzas. Un objeto puede oscilar sin la intervención activa de una persona o una máquina. En algunos casos, un objeto puede oscilar como resultado de un campo eléctrico aplicado o un flujo impulsado por presión.
El término "fuerza débil" se puede referir a una de las fuerzas fundamentales en física.
Descripción detallada
Los dispositivos basados en nanoporos convencionales actualmente en el mercado pueden contener nanoporos de proteínas insertados en bicapas lipídicas metaestables. Las bicapas lipídicas pueden ser frágiles y pueden debilitar la estabilidad de los dispositivos. Las capas de nanoporos a escala atómica de estado sólido pueden ser menos frágiles que los nanoporos de proteínas y tienen el potencial de mejorar la capacidad de fabricación. Los posibles procedimientos que implican estos dispositivos incluyen confinar moléculas de ácido nucleico en un espacio de 2 nm o menos entre electrodos y reconocer nucleótidos y secuencias de nucleótidos usando electrones que atraviesan los electrodos y la molécula de ácido nucleico. Se pueden formar nanoporos de estado sólido próximos a esta dimensión enfocando un haz de electrones o iones sobre un material fino. Este procedimiento es difícil de adaptar a la producción en masa de nanoporos, dispositivos que contienen nanoporos e instrumentos analíticos. Adicionalmente, puede resultar difícil forzar una molécula de ácido nucleico en un espacio tan pequeño entre electrodos. Los canales más anchos pueden permitir que una molécula de ácido nucleico se difunda más fácilmente en un canal de nanoporos. Sin embargo, la molécula de ácido nucleico puede pasar a través de un canal más ancho demasiado rápido o sin que la molécula de ácido nucleico esté en contacto con los electrodos de tunelado. Como resultado, se puede medir poca o ninguna corriente de tunelado, y la molécula de ácido nucleico puede no secuenciarse fácilmente por el dispositivo.
El reconocimiento por tunelado se puede realizar en geometrías que no incluyen necesariamente nanoporos. Por ejemplo, se pueden usar electrones de tunelado en microscopía de tunelado de barrido (STM), que se ha usado para obtener imágenes de átomos individuales. En teoría, se puede usar STM también para leer una secuencia de ADN, pero STM puede depender de una sonda de electrodo móvil, y mover el electrodo de sonda puede mover una muestra de ADN, lo que hace difícil obtener una señal de tunelado de calidad. Fijar la muestra de ADN y evitar que el ADN se mueva puede mejorar el reconocimiento por tunelado.
Los dispositivos y procedimientos descritos en el presente documento pueden permitir que una molécula de ácido nucleico se secuencie sin forzar la molécula de ácido nucleico en un canal de nanoporos con un diámetro de 2 nm o menos. En cambio, un canal de nanoporos puede ser de 10 nm o más de diámetro. Una molécula de ácido nucleico puede entrar en el canal de nanoporos más fácilmente. Los espacios entre electrodos pueden ser de 2 nm o menos, mientras que el canal de nanoporos puede ser de un diámetro grande. Por ejemplo, los electrodos se pueden apilar uno encima de otro como capas con una capa resistiva entre los dos electrodos. La capa resistiva puede tener un grosor del orden de 2 nm. Los electrodos y la capa resistiva pueden estar expuestos en un canal de nanoporos, sin que la distancia entre los electrodos esté relacionada con el diámetro del canal de nanoporos. En algunos otros modos de realización, un nanohilo puede residir en un canal de nanoporos con un diámetro de 10 nm o más. El nanohilo se puede separar para formar un espacio de 2 nm o menos, y las dos partes separadas del nanohilo pueden servir como electrodos. De esta manera, el espacio entre electrodos puede no estar relacionado con el diámetro del canal de nanoporos.
En algunos modos de realización, una molécula de ácido nucleico se puede unir a al menos una de una microesfera y una proteína motora molecular. La microesfera puede ser en al menos una dimensión mayor que una dimensión del canal de nanoporos de modo que la microesfera puede no pasar fácil o rápidamente a través del canal de nanoporos. La microesfera puede anclar un extremo de la molécula de ácido nucleico en el canal de nanoporos, lo que puede permitir que la molécula de ácido nucleico oscile y esté en contacto aleatoriamente con los electrodos para proporcionar una señal de tunelado. La molécula de ácido nucleico se puede impulsar por un campo eléctrico o un flujo impulsado por presión, y la microesfera puede reducir la posibilidad de que la molécula de ácido nucleico se amontone. La proteína motora molecular puede alimentar (o extraer) la molécula de ácido nucleico en el canal, permitir que porciones adicionales de la molécula de ácido nucleico proporcionen una señal de tunelado y por lo tanto secuenciarse.
En algunos modos de realización, los dispositivos de nanoporos y procedimientos pueden permitir que se analice una molécula de polímero biológico, no solo moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, se puede analizar una proteína para determinar los aminoácidos en la proteína. Las longitudes y diámetros de nanoporos se pueden ajustar al tamaño de un aminoácido en lugar de al tamaño de una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, la distancia entre electrodos puede ser del orden de 1-2 nm. Los dispositivos de nanoporos y procedimientos de reconocimiento por tunelado se analizan a continuación adicionalmente.
I. Reconocimiento por tunelado de pilas de electrodos
El reconocimiento por tunelado se puede llevar a cabo en un sándwich o pila de electrodos. Dos electrodos pueden estar en capas e intercalar un aislante. La distancia entre los electrodos, que también puede ser el grosor del aislante, puede ser del orden del tamaño de un nucleótido dentro de un ácido nucleico, o aproximadamente 2 nm. La distancia entre los electrodos puede ser independiente de cualquier diámetro de abertura, lo que puede permitir una capacidad de fabricación más fácil. Los modos de realización descritos en el presente documento también se pueden modificar para analizar moléculas de polímero biológico distintas de las moléculas de ácido nucleico, incluyendo proteínas.
A. Sistema
Como se muestra en la FIG. 1A y FIG. 1B, algunos modos de realización pueden incluir un sistema de análisis de moléculas de ácido nucleico 100. La FIG. 1A muestra una vista lateral del sistema 100, y la FIG. 1B muestra una vista superior del sistema 100. "Lateral" y "superior" se usan para describir el sistema 100 en las figuras, pero el sistema 100 se puede girar de modo que cualquier parte del sistema 100 pueda apuntar en cualquier dirección. El sistema 100 puede incluir una proteína 104 unida a una partícula 106 que tiene un diámetro. Si la partícula 106 no es esférica, la partícula 106 puede tener una dimensión característica. La partícula 106 puede tener un diámetro o dimensión característica en un intervalo de 10 nm a 15 nm, de 15 nm a 20 nm, de 20 nm a 30 nm, de 30 nm a 40 nm, de 40 nm a 50 nm o 50 nm o más en los modos de realización. La partícula puede ser una microesfera. La proteína 104 puede ser una proteína motora molecular. Una proteína motora molecular puede incluir polimerasas, helicasas, ribosomas y exonucleasas.
La proteína 104 se puede unir covalentemente a la partícula 106. Por ejemplo, la superficie de la partícula 106 se puede modificar con estreptavidina y la proteína 104 se puede modificar con biotina. En algunos modos de realización, la superficie de la partícula 106 se puede modificar con biotina y la proteína 104 se puede modificar con biotina. La estreptavidina se puede unir a la biotina, que a continuación puede unir la proteína 104 a la partícula 106. De forma similar, en otros ejemplos, la superficie de la partícula 106 se puede modificar con el péptido SpyTag y la proteína 104 se puede modificar con la proteína SpyCatcher. De forma alternativa, la superficie de la partícula 106 se puede modificar con SpyCatcher y la proteína 104 se puede modificar con SpyTag. La unión covalente entre SpyTag y SpyCatcher puede unir la proteína 104 a la partícula 106. (Véase B. Zakeri et al., "Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin", Proc. Natl. Acad. Sci., 109 (2012), pp. E690-97).
Se puede introducir una molécula de ácido nucleico 102 en el sistema con la proteína 104 unida a la partícula 106. La molécula de ácido nucleico 102 puede incluir ADN o ARN monocatenario. La molécula de ácido nucleico 102 se puede unir a la proteína 104.
El sistema 100 también puede incluir una abertura 108 definida por un primer electrodo 110, un primer aislante 112 y un segundo electrodo 114. El primer electrodo y el segundo electrodo pueden incluir paladio, platino, oro u otro metal noble. Al menos uno del primer electrodo y el segundo electrodo se puede recubrir con una molécula adaptadora. La molécula adaptadora puede experimentar interacciones químicas de fuerza débil con la molécula de ácido nucleico. Como resultado, la molécula adaptadora puede ayudar a la molécula de ácido nucleico a enlazar o poner en contacto los dos electrodos. Una molécula adaptadora puede ser orgánica u organometálica.
El primer aislante 112 puede incluir una fotoprotección. El grosor del primer aislante 112 (es decir, la distancia que separa el primer electrodo 110 y el segundo electrodo 114) puede ser de 1 nm o menos, 2 nm o menos, 3 nm o menos, 4 nm o menos, o 5 nm o menos en los modos de realización. La abertura 108 se puede definir por una pared lateral. La pared lateral puede incluir un segundo aislante 118, un primer electrodo 110, un primer aislante 112, un segundo electrodo 114 y un tercer aislante 120. El segundo aislante 118 y el tercer aislante 120 pueden incluir una fotoprotección, vidrio y/o nitruro de silicio. Como se muestra en la FIG. 1A, el primer electrodo 110 puede estar entre el segundo aislante 118 y el primer aislante 112. El segundo electrodo 114 puede estar entre el primer aislante 112 y el tercer aislante 120. El sistema 100 puede incluir un sándwich de capas en el siguiente orden: segundo aislante 118, primer electrodo 110, primer aislante 112, segundo electrodo 114 y tercer aislante 120. Las capas en el sándwich pueden estar en contacto con una capa vecina.
La abertura 108 puede tener un diámetro menor que el diámetro de la partícula 106. Si la abertura 108 no es circular o cilíndrica, la abertura 108 puede tener una dimensión característica menor que la dimensión característica de la partícula 106. La abertura puede incluir un orificio biselado o incluir geometrías similares a un cono. Si la partícula 106 no es circular, la partícula 106 se puede describir por una dimensión característica. La dimensión característica puede describir una longitud, un ancho, una longitud de un eje mayor o una longitud de un eje menor. El diámetro o la dimensión característica de la abertura puede estar en un intervalo de 10 nm a 15 nm, de 15 nm a 20 nm, de 20 nm a 30 nm, de 30 nm a 40 nm o de 40 nm a 50 nm en los modos de realización. El diámetro o la dimensión característica de la abertura 108 puede ser más de 1 nm, más de 5 nm o más de 10 nm más corto que el diámetro o la dimensión característica de la partícula 106. El diámetro o dimensión característica de la partícula 106 puede ser un valor que sea suficientemente grande para evitar que la partícula 106 pase demasiado rápido a través de la abertura 108 con un diámetro o dimensión característica.
El sistema 100 puede incluir además una primera fuente de alimentación 116 en comunicación eléctrica con el primer electrodo 110 y el segundo electrodo 114. La corriente que pasa a través de ambos electrodos se puede medir por un dispositivo medidor 122. La corriente que pasa a través de ambos electrodos puede incluir una corriente que atraviesa la molécula de ácido nucleico 102. El dispositivo medidor 122 puede incluir un medidor de corriente, un osciloscopio u otros medidores de corriente. Además, el sistema 100 puede incluir una segunda fuente de alimentación 124 configurada para aplicar un campo eléctrico a través de la abertura 108. Este campo eléctrico puede impulsar la molécula de ácido nucleico 102 a través de la abertura 108. Se puede disponer un líquido en la abertura 108. El líquido puede ser una solución eléctricamente conductora y permitir que la molécula de ácido nucleico 102 fluya a través de la abertura 108. La segunda fuente de alimentación 124 puede estar en comunicación eléctrica con un tercer electrodo 126 y un cuarto electrodo 128. El tercer electrodo 126 y el cuarto electrodo 128 se pueden disponer en un líquido y disponer en extremos opuestos de la abertura 108.
El sistema 100 puede ser uno de una pluralidad de sistemas de análisis, lo que permite el análisis de miles a millones de moléculas de ácido nucleico. Una pluralidad de sistemas de análisis pueden compartir la misma segunda fuente de alimentación usada para impulsar moléculas de ácido nucleico a través de la abertura. En el caso de una pluralidad de sistemas de análisis, los diámetros y dimensiones características pueden ser la media o mediana del diámetro o dimensión característica de la pluralidad. El uso de una pluralidad de sistemas de análisis puede permitir la multiplexación, lo que puede ser una ventaja sobre otros sistemas de reconocimiento por tunelado.
Los sistemas también pueden incluir un sistema de análisis de polímeros biológicos, donde se analiza una molécula de polímero biológico, en lugar de una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, se puede usar un sistema similar al sistema 100 para analizar una proteína y los aminoácidos de la proteína.
B. Procedimiento
Como se muestra en la FIG. 2 , los modos de realización pueden incluir un procedimiento 200 de análisis de una molécula de ácido nucleico.
En el bloque 202, el procedimiento 200 puede incluir unir una molécula de ácido nucleico a una proteína. La proteína puede tener típicamente un sitio de unión para un ácido nucleico, similar a un sitio de unión de una enzima para un sustrato. La proteína y el ácido nucleico pueden formar un enlace no covalente, con una fuerza que depende de la proteína o enzima implicada. La proteína se puede unir a una partícula con un primer diámetro. La molécula de ácido nucleico, proteína y partícula pueden ser cualquiera descrita en el presente documento.
En el bloque 204, el procedimiento 200 también puede incluir la aplicación de un campo eléctrico para mover una primera porción de la molécula de ácido nucleico al interior de una abertura. La primera porción de la molécula de ácido nucleico puede incluir un nucleótido. La abertura se puede definir por un primer electrodo, un primer aislante y un segundo electrodo. La abertura puede tener un segundo diámetro menor que el primer diámetro. La molécula de ácido nucleico puede estar en un fluido y el campo eléctrico se puede aplicar a través de electrodos en el fluido, donde los electrodos se pueden localizar en extremos opuestos de la abertura.
En el bloque 206, el procedimiento 200 puede incluir además poner en contacto la primera porción de la molécula de ácido nucleico tanto con el primer electrodo como con el segundo electrodo (bloque 206).
La FIG. 3A muestra una porción de la molécula de ácido nucleico 302 en contacto con el primer electrodo 304 y el segundo electrodo 306 a través del aislante 308. Cuando una porción de la molécula de ácido nucleico 302 está en contacto con ambos electrodos, también se puede considerar que la molécula enlaza ambos electrodos. Cuando una porción de la molécula de ácido nucleico 302 está en contacto con ambos electrodos, los electrones pueden atravesar de un electrodo al otro. Se puede medir la corriente generada por los electrodos de tunelado. Como se muestra en la FIG. 3B, si la molécula de ácido nucleico 302 no está en contacto con el primer electrodo 304 o el segundo electrodo 306, entonces los electrones pueden no atravesar los electrodos y no se puede medir corriente.
En el bloque 208, el procedimiento 200 puede incluir aplicar un voltaje a través del primer electrodo y el segundo electrodo. Los electrodos se pueden considerar electrodos de tunelado y pueden ser cualquier electrodo descrito en el presente documento. El voltaje puede ser voltaje de corriente continua o de corriente alterna. El voltaje se puede aplicar en pulsos. El procedimiento 200 también puede incluir aplicar una corriente a través del primer electrodo y el segundo electrodo.
En el bloque 210, el procedimiento 200 puede incluir mover la molécula de ácido nucleico de modo que una segunda porción de la molécula de ácido nucleico está en contacto tanto con el primer electrodo como con el segundo electrodo. La segunda porción de la molécula de ácido nucleico puede estar en una localización diferente a la primera porción de la molécula de ácido nucleico. La segunda porción de la molécula de ácido nucleico puede incluir un nucleótido. La molécula de ácido nucleico se puede mover usando la proteína. En algunos casos, la segunda porción de la molécula de ácido nucleico se puede situar más cerca de la proteína de lo que la primera porción de la molécula de ácido nucleico se sitúa de la proteína. En otros casos, la segunda porción de la molécula de ácido nucleico se puede situar más lejos de la proteína de lo que la primera porción se sitúa de la proteína.
La FIG. 4A y FIG. 4B muestran diagramas de cómo una molécula de ácido nucleico 402 se puede mover por una proteína 404. En la FIG. 4A, la molécula de ácido nucleico 402 está en contacto con un primer electrodo 406 y un segundo electrodo 408 a través del aislante 410. La molécula de ácido nucleico 402 puede estar en contacto con los electrodos de tal forma que los electrones atraviesan un nucleótido 412. El nucleótido 412 puede ser cualquiera de las bases nucleotídicas, incluyendo A, C, G, T y U, y puede ser un nucleótido marcado, artificial o metilado. Un nucleótido 414 puede estar más cerca de la proteína 404 de lo que el nucleótido 412 está de la proteína 404, mientras que un nucleótido 416 puede estar más lejos. Los electrones pueden no atravesar el nucleótido 414 o bien 416 porque estos nucleótidos no se sitúan entre los electrodos. La proteína 404 puede mover la molécula de ácido nucleico 402 lejos de o hacia una partícula 420. La FIG. 4B muestra un ejemplo de la molécula de ácido nucleico 402 de la FIG. 4A alejándose de la partícula 420. La proteína 404 puede mover la molécula de ácido nucleico 402 de modo que el nucleótido 412 ya no está alineado de modo que los electrones pueden atravesar el nucleótido 412. En cambio, el nucleótido 414 se puede alinear de modo que los electrones atraviesan el nucleótido 414. Los electrones que atraviesan un nucleótido diferente pueden generar diferentes características de corriente.
La molécula de ácido nucleico puede oscilar en la abertura. La molécula de ácido nucleico puede oscilar como resultado del movimiento browniano. En algunos modos de realización, la oscilación puede ser en parte el resultado de un campo eléctrico aplicado, flujo impulsado por presión o un cambio en un flujo o campo eléctrico. La oscilación de la molécula de ácido nucleico puede cambiar la porción de la molécula de ácido nucleico que está en contacto con o enlaza los electrodos. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico puede oscilar entre una configuración similar a la FIG. 3A, donde una porción de la molécula de ácido nucleico está en contacto con ambos electrodos, y una configuración similar a la FIG. 3B, donde una molécula de ácido nucleico no está en contacto con ambos electrodos. En algunas configuraciones, una porción de la molécula de ácido nucleico todavía puede estar en contacto con ambos electrodos pero de manera que permite que los electrones atraviesen más o menos fácilmente. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede no hacer contacto completo con uno de los electrodos. Como resultado, la oscilación puede afectar a la corriente que pasa a través de los electrodos y el ácido nucleico.
En el bloque 212, se puede medir la corriente a través del primer electrodo, la primera porción de la molécula de ácido nucleico y el segundo electrodo mientras la molécula de ácido nucleico oscila en la abertura. El ácido nucleico oscilante puede afectar al menos a uno de la amplitud, ancho de pulso y frecuencia de la corriente. El ancho de pulso también se puede considerar un tiempo de permanencia, que se puede relacionar con la duración de una determinada porción de la molécula de ácido nucleico que permanece en contacto con ambos electrodos. En algunos modos de realización, el voltaje o resistencia se puede medir en lugar de o además de la corriente. En algunos modos de realización, la característica eléctrica se puede transformar por una operación matemática, tal como una transformada de Fourier, y la transformada se puede analizar.
En el bloque 214, en base a la corriente, se puede identificar el nucleótido de la primera porción de la molécula de ácido nucleico. La corriente se puede comparar con una corriente de calibración medida a partir de un nucleótido conocido o una secuencia conocida. Los nucleótidos o secuencias pueden tener un patrón de corriente que sirve como huella genética para identificar el nucleótido o secuencia. La amplitud, frecuencia y/o ancho de pulso de la corriente medida se pueden usar para identificar el nucleótido o secuencia desconocido en base a un nucleótido o secuencia conocido. La amplitud puede depender del nucleótido individual y la resistencia del nucleótido. La frecuencia puede depender de cómo oscilan el nucleótido y/o los nucleótidos vecinos en la abertura. Por ejemplo, un patrón se puede reconocer y emparejar con un nucleótido o secuencia conocido. Puede no ser necesaria una coincidencia exacta. En cambio, si una corriente medida a partir de un nucleótido o secuencia desconocido tiene un determinado nivel umbral de amplitud, frecuencia y/o ancho de pulso, se puede identificar el nucleótido o secuencia. El análisis de las características de corriente puede ser similar a analizar las características eléctricas de diodos de tunelado resonantes. El reconocimiento por tunelado de nucleótidos puede ser similar al reconocimiento por tunelado de aminoácidos como se describe por Zhao et al., "Single-molecule spectroscopy of amino acids and peptides by recognition tunneling", Nature Nanotech. 9, (2014) 466-73.
En modos de realización, se pueden marcar uno o más nucleótidos. Un nucleótido se puede marcar con un compuesto químico que proporciona corrientes de tunelado que son más fuertes que el nucleótido sin el compuesto químico. El marcador puede ser específico para el tipo de nucleótido al que se une. Los marcadores pueden incluir moléculas orgánicas conjugadas, compuestos organometálicos o grupos de metales. Los nucleótidos marcados se pueden incluir como nucleótidos trifosfatos marcados en el sistema de análisis.
En algunos modos de realización, la molécula de ácido nucleico puede ser un ADN circular o un ADN formado con secuencias repetidas. En modos de realización con ADN circular, la proteína 104 puede ser una polimerasa. La polimerasa puede copiar el ADN circular y, a medida que la polimerasa realiza un círculo completo, el ADN monocatenario recién sintetizado se puede mover a la abertura. El "enhebrado" de la abertura por el ADN monocatenario se puede controlar por la cinética de la polimerasa y la disponibilidad de nucleótido trifosfato. Como resultado del molde de ADN circular, el ADN monocatenario puede incluir secuencias repetidas. Las secuencias repetidas pueden girar a través de los electrodos, lo que puede permitir una mejor señal para identificar nucleótidos.
En otros modos de realización, se pueden usar procedimientos para analizar un polímero biológico distinto de una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, los aminoácidos, en lugar de los nucleótidos, de una proteína, en lugar de una molécula de ácido nucleico, se pueden analizar por procedimientos similares al procedimiento 200.
C. Ejemplo
La FIG. 5A y FIG. 5B muestran cómo las características de corriente de una molécula de ácido nucleico 502 a la que se le permite fluir libremente se comparan con una molécula de ácido nucleico 504 adherida a una microesfera 506. La molécula de ácido nucleico 502 puede encajar en un canal definido por vidrio, electrodos de paladio, una capa aislante y nitruro de silicio, pero la molécula de ácido nucleico 502 puede fluir a través del canal demasiado rápido. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico 502 puede residir durante algún tiempo en el canal, pero se puede amontonar en lugar de ser una hebra lineal o en su mayor parte lineal. Amontonar puede significar que la molécula de ácido nucleico se dobla sobre sí misma en algunas áreas, lo que puede provocar que la molécula de ácido nucleico no enlace los electrodos. Por el contrario, la molécula de ácido nucleico 504 adherida a la microesfera 506 puede no fluir a través del canal debido a que la microesfera 506 tiene un diámetro mayor que la dimensión más pequeña del orificio de canal. Además, la microesfera 506 puede anclar la molécula de ácido nucleico 504 en el canal mientras que un campo eléctrico tira de la molécula de ácido nucleico a través del canal. Como resultado, la molécula de ácido nucleico 504 puede ser lineal o en su mayor parte lineal y puede no amontonarse. Aunque la molécula de ácido nucleico 504 puede no amontonarse, el movimiento browniano puede mover la molécula de ácido nucleico 504 de modo que los electrones pueden atravesar la molécula de ácido nucleico 504.
Ambas FIG. 5A y FIG. 5B muestran una abertura con un bisel en el aislante de vidrio. Este bisel puede ser el resultado de un procedimiento de nanofabricación. En muchos casos, las paredes laterales de la abertura pueden no ser completamente rectas y pueden estar biseladas o inclinadas como se esperaría del control y exactitud de las técnicas de fabricación, incluyendo grabado. No se usó una proteína motora molecular con el modo de realización de la FIG. 5B para simplificar la configuración experimental.
Los gráficos 508, 510, 512, 514 muestran las medidas de corriente que resultan de los electrones que atraviesan las moléculas de ácido nucleico. El gráfico 508 muestra medidas de corriente de una molécula de ácido nucleico, "Oligo A", que no está adherida a una microesfera, mientras que el gráfico 510 muestra medidas de corriente del mismo tipo de molécula de ácido nucleico pero adherida a una microesfera. El gráfico 512 muestra medidas de corriente de una molécula de ácido nucleico diferente, "Oligo C", que no está adherida a una microesfera, mientras que el gráfico 514 muestra medidas de corriente de Oligo C adherida a una microesfera. Los gráficos 508 y 512 en general muestran menos tiempo con una corriente distinta de cero, en comparación con los gráficos homólogos 510 y 514. En el gráfico 510, durante la mayor parte del tiempo, la corriente es distinta de cero, mientras que en el gráfico 508, la corriente es cero o casi cero durante la mayor parte del tiempo. Además, el gráfico 510 muestra un patrón mucho más repetitivo o periódico de fluctuaciones de corriente en comparación con el gráfico 508. Una corriente entre la corriente mínima y máxima puede indicar un mal contacto, un nucleótido más resistivo o el nucleótido en el procedimiento de formar o deshacer el contacto con los electrodos, ya que estos motivos pueden afectar a la calidad del efecto túnel.
Las diferencias adicionales en las características de corriente entre las moléculas de ácido nucleico adheridas y no adheridas se pueden ver en los gráficos 512 y 514. En el gráfico 512, la corriente es cero casi todo el tiempo, con la excepción de algunos picos de corriente. Este patrón indica que la molécula de ácido nucleico no está en contacto con los electrodos con frecuencia. En contraste, el gráfico 514 muestra muchos picos en la corriente, que se producen en un patrón periódico o bastante periódico. El patrón en el gráfico 514 indica que la molécula de ácido nucleico está en contacto con los electrodos con frecuencia.
Los gráficos 508, 510, 512 y 514 muestran que las moléculas de ácido nucleico adheridas a una microesfera proporcionan señales de corriente más fuertes que las moléculas de ácido nucleico a las que se les permite fluir libremente a través de un canal. Las señales pueden ser más claras con moléculas de ácido nucleico adheridas y pueden permitir una identificación más fácil y más exacta de los nucleótidos.
II. Electrodos coplanares en un punto de unión de rotura de túnel
En algunos modos de realización, el reconocimiento por tunelado se puede llevar a cabo entre dos electrodos que son sustancialmente coplanares. Los electrodos se pueden separar por una distancia del orden de 2 nm, lo que puede permitir el reconocimiento por tunelado de un nucleótido. Los electrodos se pueden extender en una abertura, que tiene un diámetro mayor que 2 nm. La distancia entre los electrodos entonces puede ser independiente del diámetro de la abertura.
En algunos modos de realización, los dispositivos de nanoporos y procedimientos pueden permitir que se analice una molécula de polímero biológico, no solo moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, se puede analizar una proteína para determinar los aminoácidos en la proteína. Las longitudes y diámetros de nanoporos se pueden ajustar al tamaño de un aminoácido en lugar de al tamaño de una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, la distancia entre electrodos puede ser del orden de 1-2 nm. Los dispositivos de nanoporos y procedimientos de reconocimiento por tunelado se analizan a continuación adicionalmente.
A. Sistema
Como se muestra en la FIG. 6A y FIG. 6B, los modos de realización pueden incluir un sistema de análisis de ácido nucleico 600. La FIG. 6A es una vista superior y la FIG. 6B es una vista lateral. La vista superior puede estar en una superficie de una oblea de silicio o un chip microfluídico. El sistema 600 puede incluir una proteína 604 unida a una partícula 606 con un primer diámetro. La proteína 604 puede ser cualquier proteína descrita en el presente documento, y la partícula 606 puede ser cualquier partícula descrita en el presente documento.
Se puede introducir una molécula de ácido nucleico 602 en el sistema con la proteína 104 ya unida a la partícula 606. La molécula de ácido nucleico 602 puede incluir cualquier molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento. La molécula de ácido nucleico 602 se puede unir a la proteína 604.
El sistema 600 también puede incluir una abertura 608 definida por un primer aislante 610. El primer aislante puede incluir Si3N4, aislantes de óxido (por ejemplo, SiO2, AhO3, silicatos de óxido), vidrio, cuarzo o cualquier material aislante descrito en el presente documento. La abertura 608 puede tener un segundo diámetro más pequeño que el primer diámetro. El segundo diámetro de la abertura 608 puede ser mayor que el diámetro de la abertura 108 en la FIG. 1A y 1B. El segundo diámetro puede ser de hasta 50 nm. La abertura 608 puede tener un eje longitudinal 612 perpendicular al diámetro.
El sistema 600 puede incluir además un primer electrodo 614. Una porción del primer electrodo 614 se puede extender en la abertura 608. El primer electrodo incluye oro, paladio, platino o cualquier material de electrodo descrito en el presente documento.
El sistema 600 también puede incluir un segundo electrodo 616, extendiéndose una porción del segundo electrodo 616 en la abertura. Un plano que incluye la porción del primer electrodo 614 y la porción del segundo electrodo 616 puede ser ortogonal al eje longitudinal. El primer electrodo 614 y el segundo electrodo 616 pueden definir un espacio, que incluye la distancia más corta entre los dos electrodos. La distancia más corta entre el primer electrodo 614 y el segundo electrodo 616 puede ser menor de 1 nm, de 1 nm a 2 nm, de 2 nm a 3 nm, de 3 nm a 5 nm o de 5 nm a 10 nm en los modos de realización.
El primer electrodo 614 y el segundo electrodo 616 se pueden formar rompiendo un único nanohilo en los dos electrodos. La rotura puede implicar diferentes técnicas para separar un nanohilo en dos piezas que no estén en contacto con la otra pieza. La rotura del único nanohilo puede ser doblando físicamente un chip semiconductor con el nanohilo en él. La rotura del chip puede romper a continuación el hilo y puede crear un espacio entre las dos partes del nanohilo roto. El segundo diámetro de la abertura 608 puede ser suficientemente grande para alojar el plegado mecánico del chip. El electrodo también se puede romper cortándolo con un haz o aplicando un potencial eléctrico alto. El segundo electrodo puede ser cualquier material de electrodo descrito en el presente documento.
Las FIGS. 6A y 6B muestran el primer electrodo 614 y el segundo electrodo 616 que tienen una conformación triangular o cónica en la abertura. La conformación de los electrodos se puede formar doblando repetidamente hacia adelante y hacia atrás el chip hasta que se tocan los electrodos. A continuación, un potencial eléctrico aplicado puede ayudar a conformar las puntas de los electrodos. En otros modos de realización, la porción del primer electrodo 614 más próxima al segundo electrodo 616 puede no llegar a un punto. En cambio, los extremos de los electrodos pueden ser planos o hemisféricos.
Además, el sistema 600 puede incluir una primera fuente de alimentación 618 en comunicación eléctrica con el primer electrodo 614 y el segundo electrodo 616. La corriente que pasa a través de los electrodos se puede medir por un dispositivo medidor 622. El dispositivo medidor 622 se puede configurar para medir la corriente a través de los electrodos a lo largo y a través de una porción de la molécula de ácido nucleico que enlaza los electrodos. El dispositivo medidor 622 puede ser cualquier dispositivo medidor descrito en el presente documento.
El primer electrodo 614 puede estar entre el primer aislante 610 y un segundo aislante 620. De forma similar, el segundo electrodo 616 puede estar entre el primer aislante 610 y el segundo aislante 620. El primer aislante 610 y el segundo aislante 620 pueden incluir nitruro de silicio, dióxido de silicio, vidrio, cuarzo y otros materiales aislantes descritos en el presente documento. La fotoprotección puede ser difícil de conformar a la escala necesaria para el primer aislante en un punto de unión de rotura de túnel. El material aislante se puede extender más de lo que se muestra en las FIGS. 6A y 6B, ya que el material aislante puede ser el material mayoritario de un chip microfluídico.
En algunos modos de realización, el sistema 600 puede incluir una segunda fuente de alimentación (no mostrado). La segunda fuente de alimentación se puede configurar para aplicar un campo eléctrico que movería una molécula de ácido nucleico a través de la abertura 608. El campo eléctrico se puede aplicar a través de las capas que forman la abertura. Al igual que con el sistema 100 en la FIG. 1, el sistema 600 puede tener un líquido dispuesto en la abertura 608. La fuente de alimentación puede estar en comunicación eléctrica con un tercer electrodo y un cuarto electrodo. El tercer electrodo y el cuarto electrodo se pueden disponer en un líquido y disponer en extremos opuestos de la abertura 608.
El primer aislante 610 y el segundo aislante 620 se pueden unir a un chip microfluídico, que incluye un chip de silicio. Los aislantes se pueden depositar o formar en la parte superior de un material semiconductor o se pueden modelar a partir del material semiconductor. El material semiconductor puede incluir una oblea de silicio.
Los sistemas también pueden incluir un sistema de análisis de polímeros biológicos, donde se analiza una molécula de polímero biológico, en lugar de una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, se puede usar un sistema similar al sistema 600 para analizar una proteína y los aminoácidos de la proteína.
B. Procedimiento
Como se muestra en la FIG. 7 , los modos de realización adicionales pueden incluir un procedimiento 700 de análisis de una molécula de ácido nucleico.
En el bloque 702, el procedimiento 700 puede incluir unir una molécula de ácido nucleico a una proteína. La proteína se puede unir a una partícula con un primer diámetro.
En el bloque 704, el procedimiento 700 también puede incluir mover una porción de la molécula de ácido nucleico a una abertura definida por un aislante. La porción de la molécula de ácido nucleico puede incluir un nucleótido. La abertura puede tener un segundo diámetro menor que el primer diámetro. Mover la porción de la molécula de ácido nucleico puede incluir aplicar un campo eléctrico para impulsar la molécula de ácido nucleico a través de la abertura. En estos y otros modos de realización, mover la porción puede incluir mover la molécula de ácido nucleico con un flujo de líquido impulsado por presión. Se puede usar un flujo de líquido convectivo para empujar la molécula de ácido nucleico a través de la abertura. Un líquido que fluye para mover moléculas de ácido nucleico puede ser más eficaz con un sistema similar al sistema 600 de la FIG. 6A y 6B en comparación con el sistema 100 en la FIG.
1A y 1B. El sistema 100 puede ser solo de aproximadamente 10 a 20 nm de grosor, y un flujo de líquido puede romper el sándwich de diversas capas. Por otra parte, el sistema 600 se puede fabricar para que sea más grueso que el sistema 100. Adicionalmente, las partes del sistema 600, incluyendo el aislante, se pueden unir fuertemente a una oblea u otro material, lo que puede proporcionar una mayor estabilidad en un líquido que fluye.
En el bloque 706, el procedimiento 700 incluye además mover la porción de la molécula de ácido nucleico a un espacio entre un primer electrodo y un segundo electrodo. El espacio puede incluir una línea que representa la distancia más corta entre los electrodos. Mover la porción de la molécula de ácido nucleico puede incluir el uso de las mismas fuerzas que movieron la porción hacia la abertura.
En el bloque 708, el procedimiento 700 puede incluir poner en contacto la porción de la molécula de ácido nucleico tanto con el primer electrodo como con el segundo electrodo.
La FIG. 8A muestra una molécula de ácido nucleico 802 en contacto con el primer electrodo 804 y el segundo electrodo 806, con ambos electrodos aislados eléctricamente en los aislantes 808 y 810. Cuando la molécula de ácido nucleico 802 está en contacto con ambos electrodos, también se puede considerar que la molécula enlaza ambos electrodos. Durante este contacto, los electrones pueden atravesar de un electrodo al otro. Se puede medir la corriente generada por los electrodos de tunelado. Como se muestra en la FIG. 8B, si la molécula de ácido nucleico no está en contacto con el primer electrodo 804 o el segundo electrodo 806, entonces ningún electrón puede atravesar los electrodos y no se puede medir corriente. Como se muestra en la FIG. 8B, la molécula de ácido nucleico 802 puede estar en contacto solo con el primer electrodo 804 y no con el segundo electrodo 806.
En el bloque 710, se puede medir una corriente a través del primer electrodo, la molécula de ácido nucleico y el segundo electrodo mientras la molécula de ácido nucleico oscila en la abertura.
En el bloque 712, en base a la corriente, se puede identificar el nucleótido de la porción de la molécula de ácido nucleico, similar a los procedimientos descritos en el presente documento.
En otros modos de realización, se pueden usar procedimientos para analizar un polímero biológico distinto de una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, los aminoácidos, en lugar de los nucleótidos, de una proteína, en lugar de una molécula de ácido nucleico, se pueden analizar por procedimientos similares al procedimiento 700.
En la descripción precedente, para los propósitos explicativos, se han establecido numerosos detalles para proporcionar una comprensión de diversos modos de realización de la presente tecnología.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo, entre los límites superior e inferior de ese intervalo también se divulga específicamente. Se engloba cada intervalo más pequeño entre cualquier valor establecido o valor intermedio en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños se pueden incluir o excluir independientemente en el intervalo, y cada intervalo donde cualquiera, ninguno o ambos límites se incluyen en los intervalos más pequeños también se engloba dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido.
Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de dichos límites incluidos también están incluidos.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de análisis de una molécula de ácido nucleico, comprendiendo el procedimiento: unir la molécula de ácido nucleico a una proteína motora y una partícula que tiene un primer diámetro; aplicar un campo eléctrico para mover una primera porción de la molécula de ácido nucleico en una abertura, la abertura definida por un primer electrodo, un primer aislante y un segundo electrodo, y teniendo la abertura un segundo diámetro menor que el primer diámetro;
enlazar el primer electrodo y el segundo electrodo dentro de la abertura por una porción de dicha molécula de ácido nucleico,
comprendiendo la primera porción un primer nucleótido;
aplicar un voltaje a través del primer electrodo y el segundo electrodo;
medir una corriente a través del primer electrodo, la primera porción de la molécula de ácido nucleico, y el segundo electrodo; e
identificar el primer nucleótido de la primera porción de la molécula de ácido nucleico en base a la corriente.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:
la abertura se define por una pared lateral,
la pared lateral comprende un segundo aislante, el primer electrodo, el primer aislante, el segundo electrodo y un tercer aislante,
el segundo aislante está en contacto con el primer electrodo,
el primer electrodo está en contacto con el primer aislante,
el primer aislante está en contacto con el segundo electrodo, y
el segundo electrodo está en contacto con el tercer aislante.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además:
medir una amplitud y una frecuencia de la corriente mientras la molécula de ácido nucleico oscila en la abertura.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además:
medir un ancho de pulso de la corriente mientras la molécula de ácido nucleico oscila en la abertura.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:
el primer electrodo y el segundo electrodo se recubren cada uno con una molécula adaptadora, y
la molécula adaptadora tiene una interacción química de fuerza débil con la molécula de ácido nucleico.
6. Un dispositivo de análisis de moléculas de ácido nucleico, comprendiendo el dispositivo:
una proteína motora unida a una partícula, teniendo la partícula un primer diámetro;
una abertura definida por un primer electrodo, un primer aislante y un segundo electrodo, teniendo la abertura un segundo diámetro menor que el primer diámetro;
una primera fuente de alimentación en comunicación eléctrica con el primer electrodo y el segundo electrodo; una segunda fuente de alimentación configurada para aplicar un campo eléctrico a través de la abertura para mover la proteína unida a la partícula a la abertura; y
un dispositivo medidor configurado para medir una corriente a través del primer electrodo y el segundo electrodo cuando una primera porción de una molécula de ácido nucleico unida a la proteína está en contacto con el primer electrodo y el segundo electrodo.
7. El dispositivo de la reivindicación 6, en el que el dispositivo comprende además la molécula de ácido nucleico unida a la proteína.
8. El dispositivo de la reivindicación 6, en el que el primer aislante comprende una fotoprotección.
9. El dispositivo de la reivindicación 6, en el que:
la abertura se define además por una pared lateral, y
la pared lateral comprende un segundo aislante, el primer electrodo, el primer aislante, el segundo electrodo y un tercer aislante.
10. El dispositivo de la reivindicación 6, en el que al menos uno del primer electrodo y el segundo electrodo comprende paladio.
11. Un procedimiento de análisis de una molécula de ácido nucleico, comprendiendo el procedimiento: unir la molécula de ácido nucleico a una proteína motora y una partícula que tiene un primer diámetro; mover una porción de la molécula de ácido nucleico a la abertura definida por un primer aislante, teniendo la abertura un segundo diámetro menor que el primer diámetro, y comprendiendo la porción un nucleótido; mover la porción de la molécula de ácido nucleico a un espacio entre un primer electrodo y un segundo electrodo, comprendiendo el espacio una línea que representa la distancia más corta entre el primer electrodo y el segundo electrodo;
enlazar el primer electrodo y el segundo electrodo dentro de la abertura por una porción de dicha molécula de ácido nucleico;
medir una corriente a través del primer electrodo, la molécula de ácido nucleico y el segundo electrodo; e identificar el nucleótido de la molécula de ácido nucleico en base a la corriente.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que:
la abertura tiene un eje longitudinal perpendicular al segundo diámetro,
una porción del primer electrodo se extiende en la abertura,
una porción del segundo electrodo se extiende en la abertura,
un plano que comprende la porción del primer electrodo y la porción del segundo electrodo es ortogonal al eje longitudinal.
13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que:
la abertura se define por una pared lateral,
la pared lateral comprende un segundo aislante, el primer electrodo, el primer aislante, el segundo electrodo y un tercer aislante,
el segundo aislante está en contacto con el primer electrodo,
el primer electrodo está en contacto con el primer aislante,
el primer aislante está en contacto con el segundo electrodo, y
el segundo electrodo está en contacto con el tercer aislante.
14. Un dispositivo de análisis de ácido nucleico, comprendiendo el dispositivo:
una proteína motora unida a una partícula, teniendo la partícula un primer diámetro;
una abertura definida por un primer aislante, teniendo la abertura un segundo diámetro más pequeño que el primer diámetro, y teniendo la abertura un eje longitudinal perpendicular al segundo diámetro;
un primer electrodo, en el que una porción del primer electrodo se extiende en la abertura;
un segundo electrodo, en el que una porción del segundo electrodo se extiende en la abertura y en el que un plano que comprende la porción del primer electrodo y la porción del segundo electrodo es ortogonal al eje longitudinal; una primera fuente de alimentación en comunicación eléctrica con el primer electrodo y el segundo electrodo; y un dispositivo medidor configurado para medir una corriente a través del primer electrodo y el segundo electrodo cuando una primera porción de una molécula de ácido nucleico unida a la proteína está en contacto con el primer electrodo y el segundo electrodo.
15. El dispositivo de la reivindicación 14, que comprende además la molécula de ácido nucleico unida a la proteína.
16. El dispositivo de la reivindicación 14, que comprende además una segunda fuente de alimentación configurada para aplicar un campo eléctrico a través de la abertura.
17. El dispositivo de la reivindicación 14, en el que el primer electrodo se dispone entre el primer aislante y un segundo aislante.
18. El dispositivo de la reivindicación 14, en el que el segundo electrodo se dispone entre el primer aislante y un segundo aislante.
19. El dispositivo de la reivindicación 14, en el que:
el primer electrodo y el segundo electrodo definen un espacio,
el espacio comprende la distancia más corta entre el primer electrodo y el segundo electrodo, y
la distancia más corta entre el primer electrodo y el segundo electrodo es de 2 nm o menos.
ES17728490T 2016-05-31 2017-05-31 Procedimientos y sistemas para secuenciación de ácido nucleico por reconocimiento por tunelado Active ES2877569T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662343715P 2016-05-31 2016-05-31
PCT/EP2017/063125 WO2017207613A1 (en) 2016-05-31 2017-05-31 Methods and systems for nucleic acid sequencing by tunneling recognition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2877569T3 true ES2877569T3 (es) 2021-11-17

Family

ID=59021475

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17728490T Active ES2877569T3 (es) 2016-05-31 2017-05-31 Procedimientos y sistemas para secuenciación de ácido nucleico por reconocimiento por tunelado

Country Status (6)

Country Link
US (4) US10190159B2 (es)
EP (1) EP3464622B1 (es)
JP (1) JP7108548B2 (es)
CN (1) CN109196117B (es)
ES (1) ES2877569T3 (es)
WO (1) WO2017207613A1 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170299571A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Compositions and methods for determining mechanical properties of cells
WO2017207613A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and systems for nucleic acid sequencing by tunneling recognition
US11143618B2 (en) 2018-04-09 2021-10-12 Roche Sequencing Solutions, Inc. Fabrication of tunneling junctions with nanopores for molecular recognition
EP3810803B1 (en) * 2018-06-21 2024-01-24 F. Hoffmann-La Roche AG Tunneling junctions for sequencing
JP2020031557A (ja) * 2018-08-28 2020-03-05 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体分子分析装置
US20210381997A1 (en) * 2018-10-19 2021-12-09 Roche Sequencing Solutions, Inc. Electric field-assisted junctions for sequencing
JP2021188910A (ja) * 2020-05-25 2021-12-13 ティーイーアイソリューションズ株式会社 ナノギャップ電極構造体、およびその製造方法、分析装置、分析方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006028508A2 (en) 2004-03-23 2006-03-16 President And Fellows Of Harvard College Methods and apparatus for characterizing polynucleotides
EP2014761B1 (en) * 2007-06-22 2016-09-28 Sony Deutschland GmbH A device for processing an analyte and a method of processing and/or detecting an analyte using said device
JP5372570B2 (ja) 2009-03-30 2013-12-18 株式会社日立ハイテクノロジーズ ナノポアを用いたバイオポリマー決定方法、システム、及びキット
WO2010117470A2 (en) * 2009-04-10 2010-10-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing devices and methods
US8969090B2 (en) * 2010-01-04 2015-03-03 Life Technologies Corporation DNA sequencing methods and detectors and systems for carrying out the same
US20120193231A1 (en) 2011-01-28 2012-08-02 International Business Machines Corporation Dna sequencing using multiple metal layer structure with organic coatings forming transient bonding to dna bases
JP5670278B2 (ja) 2011-08-09 2015-02-18 株式会社日立ハイテクノロジーズ ナノポア式分析装置
KR20130020402A (ko) 2011-08-19 2013-02-27 건국대학교 산학협력단 금속산화물의 절연막을 이용한 바이오 칩
KR101882865B1 (ko) * 2012-07-03 2018-07-27 삼성전자주식회사 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법
KR102245192B1 (ko) * 2013-05-06 2021-04-29 온테라 인크. 나노포어를 이용한 표적 검출
DE102013214341A1 (de) 2013-07-23 2015-01-29 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zum Herstellen einer Nanopore zum Sequenzieren eines Biopolymers
US9708655B2 (en) * 2014-06-03 2017-07-18 Illumina, Inc. Compositions, systems, and methods for detecting events using tethers anchored to or adjacent to nanopores
GB201418469D0 (en) 2014-10-17 2014-12-03 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
US20170159115A1 (en) * 2015-08-10 2017-06-08 Stratos Genomics, Inc. Single molecule nucleic acid sequencing with molecular sensor complexes
WO2017207613A1 (en) * 2016-05-31 2017-12-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and systems for nucleic acid sequencing by tunneling recognition

Also Published As

Publication number Publication date
CN109196117B (zh) 2022-12-30
US10190159B2 (en) 2019-01-29
US10648029B2 (en) 2020-05-12
US20170342480A1 (en) 2017-11-30
EP3464622A1 (en) 2019-04-10
WO2017207613A1 (en) 2017-12-07
US11981963B2 (en) 2024-05-14
US20230250475A1 (en) 2023-08-10
EP3464622B1 (en) 2021-04-28
US20200239951A1 (en) 2020-07-30
US11624091B2 (en) 2023-04-11
CN109196117A (zh) 2019-01-11
US20190112652A1 (en) 2019-04-18
JP2019518954A (ja) 2019-07-04
JP7108548B2 (ja) 2022-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2877569T3 (es) Procedimientos y sistemas para secuenciación de ácido nucleico por reconocimiento por tunelado
US20220236251A1 (en) Nanopore Sensor Having A Fluidic Passage For Local Electrical Potential Measurement
RU2681822C2 (ru) Детекция целевой последовательности путем нанопорового сенсорного обнаружения синтетических зондов
CN102186989B (zh) 用于流体通道中生物分子和其它分析物的电压感测的纵向移位纳米级电极的使用
US20200150084A1 (en) Two-Chamber Dual-Pore Device
CN104774757B (zh) 双孔装置
KR20160086335A (ko) 나노-갭 전극 쌍 및 이를 제조하는 방법
EP2521796B1 (en) Dna sequencing methods and detectors and systems for carrying out the same
JP2013090576A (ja) 核酸分析デバイス及びそれを用いた核酸分析装置
CA2517216A1 (en) Nanopores, methods for using same, methods for making same and methods for characterizing biomolecules using same
CN103203256A (zh) 纳米口装置阵列：它们的制备以及在大分子分析中的应用
WO2017087908A1 (en) Nanochannel devices and methods for analysis of molecules
US20170016877A1 (en) Apparatus and method for electrical detection of oligonucleotides through pore blockades
US20130203608A1 (en) Structure with nanopore and apparatus for determining sequences of nucleic acids including the same
US11703476B2 (en) Method and apparatus for sensing a molecule
JP7232433B2 (ja) 配列決定のための電場補助型接合部
EP3349005A1 (en) Sensors for translocating analytes comprising nanometer or sub-nanometer thick heterostructured functional layers and a method for sensing translocating analytes
WO2022115873A1 (en) Semiconductor nanosensing device with multilayer graphene sheet for sequencing or sensing nucleic acids
CN116867906A (zh) 用于测序或感测核酸的具有多层石墨烯片的半导体纳米传感装置
US20130082722A1 (en) Method of forming nanopore and structure formed with nanopore
Iqbal An electrical framework for detection and characterization of DNA using nanoscale silicon based sensors
Yemenicioglu Stability and bandwidth investigation of alternative structures for nanopore sensors