CN109196117A - 用于通过隧穿识别进行核酸测序的方法和系统 - Google Patents

用于通过隧穿识别进行核酸测序的方法和系统 Download PDF

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Abstract

实施方式可包括分析核酸分子的方法。该方法可包括将核酸分子附着于蛋白。蛋白可附着于具有第一直径的颗粒。该方法也可包括施加电场以将核酸分子的第一部分移动到孔中。孔可由第一电极、绝缘体和第二电极限定。孔可具有小于第一直径的第二直径。该方法可进一步包括将核酸分子的第一部分与第一电极和第二电极二者接触。该方法可包括跨越第一电极和第二电极施加电压。可测量穿过电极和核酸分子的该部分的电流，并且可鉴定核酸分子的核苷酸。

Description

用于通过隧穿识别进行核酸测序的方法和系统
背景
含纳米孔的设备已成为开发新分析方法的目标。纳米孔可具有检测单一分子的能力，其可为化学和生物学检测领域中有前景的技术。例如，纳米孔可用于诊断学和核酸测序。固态纳米孔生物传感可为快速的单一分子传感技术。在一些情况下，固态纳米孔在两个电极之间的离子液体中形成通道。两个电极可不为纳米孔本身的一部分，而是可位于离子液体中。当分子通过纳米孔通道时，穿过通道的电流和其它电学特性改变。这些电学特性可以提供关于分子的信息，但制造问题可使得难以鉴定核酸分子中的个别核苷酸。多个核苷酸可同时存在于孔中或可快速通过孔，其可不提供足够强的信号用于区分核苷酸。
纳米孔设备可与隧穿识别(tunneling recognition)一起使用。隧穿识别基于在电极之间放置化学实体，所述电极可在纳米孔设备本身中。化学实体的轨道将允许电子从一个电极转移到另一个电极，建立隧穿电流。固态纳米孔的尺寸和其它性质可难以适应大规模生产工艺。为了用离子电流对核酸分子进行测序，纳米孔尺寸可需要大约为纳米，其可小于2nm。建立这种大小的通道可需要精确且昂贵的技术。但是，减少纳米孔的尺寸可导致不完全或不良的润湿，所述润湿是纳米孔用作传感设备所需的。仍然需要在用于化学和生物学检测的含纳米孔的设备的设计和可制造性、以及牵涉该设备的工艺中的改进。设计和可制造性改进不应以牺牲准确和精确的分析为代价。这些和其它问题通过本文件中描述的技术得以解决。
简述
本技术的实施方式可允许通过隧穿识别对核酸分子进行测序。核酸分子可通过电场或压力梯度驱动到通道中。在通道中，核酸分子的一部分可进入两个电极之间的间隙。它们之间具有小间隙的电极可允许隧穿识别，但核酸分子可不足够频繁地扩散到小间隙中以获得足够的隧穿信号。电场或压力梯度可更容易且频繁地将核酸分子驱动到电极间隙中。可为1-2nm宽的小间隙可难以制造或制造昂贵。在一些情况下，间隙可在彼此平行排列但不在同一平面中的两个电极之间，其可比两个共面电极的端部之间的间隙更容易制造。核酸分子可拴系至(tethered to)动力蛋白，动力蛋白可附着于颗粒或珠。颗粒可大于通道。颗粒可锚定核酸分子的一端，而电场或流动将核酸分子拉过通道。以此方式，核酸分子可沿着通道拉伸，并且可由于布朗运动而在通道中振荡。核酸分子可随机地与隧穿电极相互作用以产生隧穿信号。
可将电压施加到电极。当核酸分子的一部分在电极之间的间隙内并且核酸分子桥接两个电极时，电子可从一个电极到另一个电极隧穿(tunnel through)核酸分子，生成电流。可测量电流。核酸分子可在间隙中振荡，并且测量的电流可具有振幅和频率。振幅和频率可为可变的。电流的特性可有助于鉴定核酸分子中存在的特定核苷酸或碱基。电学特性几乎可充当鉴定核酸分子的核苷酸中的指纹。动力蛋白可送入或拉入(feed through orpull in)核酸分子，以致不同的核苷酸在电极间隙中并且可以测量不同的电流信号。作为结果，可以鉴定另外的核苷酸。可以将更多的核苷酸移动到电极间隙中，因而可鉴定核酸的多个核苷酸，并且可对核酸测序。
实施方式可包括分析核酸分子的方法。该方法可包括将核酸分子附着于蛋白。蛋白可附着于具有第一直径的颗粒。该方法也可包括施加电场以将核酸分子的第一部分移动到孔中。孔可由第一电极、第一绝缘体和第二电极限定。孔可具有小于第一直径的第二直径。该方法可进一步包括将核酸分子的第一部分与第一电极和第二电极二者接触。此外，该方法可包括跨越第一电极和第二电极施加电压。可测量穿过第一电极、核酸分子和第二电极的电流。基于该电流，可鉴定核酸分子的核苷酸。
一些实施方式可包括核酸分子分析系统。该系统可包括附着于蛋白的核酸分子。蛋白可附着于具有直径的颗粒。该系统也可包括由第一电极、第一绝缘体和第二电极限定的孔。孔可具有小于颗粒的直径的直径。该系统可进一步包括与第一电极和第二电极电连通的第一电源。此外，该系统可包括配置为施加电场穿过孔的第二电源。
另外的实施方式可包括分析核酸分子的方法。该方法可包括将核酸分子附着于蛋白。蛋白可附着于具有第一直径的颗粒。该方法也可包括将核酸分子的第一部分移动到由绝缘体限定的孔中。孔可具有小于第一直径的第二直径。该方法进一步包括将核酸分子的第二部分移动到第一电极和第二电极之间的间隙中。间隙可包括表示电极之间的最短距离的线。此外，该方法可包括将核酸分子与第一电极和第二电极二者接触。此外，可测量穿过第一电极、核酸分子和第二电极的电流。基于该电流，可鉴定核酸分子的核苷酸。
实施方式可包括核酸分析系统。该系统可包括附着于蛋白的核酸分子。蛋白可附着于具有第一直径的颗粒。该系统也可包括由第一绝缘体限定的孔。孔可具有小于第一直径的第二直径。孔可具有垂直于直径的纵轴。该系统可进一步包括第一电极。第一电极的一部分可延伸到孔中。该系统也可包括第二电极，且第二电极的一部分延伸到孔中。包括第一电极的该一部分和第二电极的该一部分的平面可正交于纵轴。此外，该系统可包括与第一电极和第二电极电连通的第一电源。
在第一方面中，本发明提供分析核酸分子的方法，该方法包括下列步骤：(i)将核酸分子附着于蛋白和颗粒，诸如具有第一直径的珠；(ii)施加电场以将核酸分子的第一部分移动到孔中，该孔由第一电极、第一绝缘体和第二电极限定，并且该孔具有小于第一直径的第二直径；(iii)将核酸分子的第一部分与第一电极和第二电极二者接触，该第一部分包括第一核苷酸；(iv)跨越第一电极和第二电极施加电压；(v)测量穿过第一电极、核酸分子的第一部分和第二电极的电流；和(vi)基于该电流鉴定核酸分子的第一部分的第一核苷酸。
第一直径可为10nm或更大。第二直径可在10nm至15nm的范围内。第一绝缘体可具有2nm或更小的厚度和/或可包括光刻胶(photoresist)。孔由侧壁限定，并且所述侧壁然后可包括第二绝缘体、第一电极、第一绝缘体、第二电极和第三绝缘体，其中第二绝缘体与第一电极接触，第一电极与第一绝缘体接触，第一绝缘体与第二电极接触，并且第二电极与第三绝缘体接触。
该方法可进一步包括使用蛋白移动核酸分子、使得核酸分子的第二部分与第一电极和第二电极二者接触的步骤，其中核酸分子的第二部分位于与核酸分子的第一部分不同的位置，并且核酸分子的第二部分包括第二核苷酸。核酸分子的第二部分可比第一部分对于蛋白定位更近或更远地对于蛋白定位。
蛋白可为选自聚合酶、解旋酶、核糖体和外切核酸酶的分子动力蛋白。核酸分子可为单链DNA、RNA，或单链或双链环状DNA。所述第一核苷酸可包括用化学化合物标记的核苷酸，其相对于未标记的核苷酸产生增加的隧穿电流。
而且，当核酸分子在孔中振荡时测量电流的幅度和频率是可能的。当核酸分子在孔中振荡时测量电流的脉冲宽度也是可能的。可将电流与从已知核苷酸测量的校准电流比较。第一电极和第二电极各自涂覆有衔接子分子，并且衔接子分子可与核酸分子具有弱力化学相互作用。
在第二方面中，本发明提供核酸分子分析系统或设备，其包括：(i)附着于颗粒的蛋白，该颗粒具有第一直径；(ii)由第一电极、第一绝缘体和第二电极限定的孔，该孔具有小于第一直径的第二直径；(iii)与第一电极和第二电极电连通的第一电源；(iv)第二电源，其配置为施加电场穿过孔以将附着于颗粒的蛋白移动到孔中；和(v)仪表设备，其配置为，当附着于蛋白的核酸分子的第一部分与第一电极和第二电极接触时，测量穿过第一电极和第二电极的电流。
第一绝缘体可包括光刻胶。孔可进一步由侧壁限定，并且侧壁然后包括第二绝缘体、第一电极、第一绝缘体、第二电极和第三绝缘体。在一个实施方式中，第二绝缘体和第三绝缘体包括光刻胶。在另一实施方式中，第一电极布置在第二绝缘体和第一绝缘体之间，并且第二电极布置在第一绝缘体和第三绝缘体之间。
第一电极和第二电极中的至少一个可涂覆有衔接子分子，其中衔接子分子经受与核酸分子的弱力化学相互作用。而且，第一电极和第二电极中的至少一个包括钯。
在第三方面中，本发明提供分析核酸分子的方法，其包括：(i)将核酸分子附着于蛋白和具有第一直径的颗粒；(ii)将核酸分子的一部分移动到由第一绝缘体限定的孔中，该孔具有小于第一直径的第二直径，并且该一部分包括核苷酸；(iii)将核酸分子的该一部分移动到第一电极和第二电极之间的间隙中，该间隙包括表示第一电极和第二电极之间的最短距离的线；(iv)将核酸分子的该一部分与第一电极和第二电极二者接触；(v)测量穿过第一电极、核酸分子和第二电极的电流；和(vi)基于该电流鉴定核酸分子的核苷酸。
将核酸分子的该一部分移动到孔中可包括用施加的电场来移动核酸分子的该一部分。将核酸分子的该一部分移动到孔中可包括用压力驱动的液体流动来移动核酸分子的该一部分。第一电极和第二电极之间的最短距离可为2nm或更小。孔可具有垂直于第二直径的纵轴，使得第一电极的一部分延伸到孔中，第二电极的一部分延伸到孔中，并且包括第一电极的该一部分和第二电极的该一部分的平面正交于纵轴。
孔可由包括第二绝缘体、第一电极、第一绝缘体、第二电极和第三绝缘体的侧壁限定，使得第二绝缘体与第一电极接触，第一电极与第一绝缘体接触，第一绝缘体与第二电极接触，并且第二电极与第三绝缘体接触。
在第四方面中，本发明提供核酸分析设备或系统，其包括：(i)附着于颗粒的蛋白，该颗粒具有第一直径；(ii)由第一绝缘体限定的孔，该孔具有小于第一直径的第二直径，和该孔具有垂直于第二直径的纵轴；(iii)第一电极，其中第一电极的一部分延伸到孔中；(iv)第二电极，其中第二电极的一部分延伸到孔中，并且其中包括第一电极的该一部分和第二电极的该一部分的平面正交于纵轴；(v)与第一电极和第二电极电连通的第一电源；和(vi)仪表设备，其配置为，当附着于蛋白的核酸分子的第一部分与第一电极和第二电极接触时，测量穿过第一电极和第二电极的电流。
该设备或系统可进一步包括第二电源，其配置为施加电场穿过孔。第一电极可布置在第一绝缘体和第二绝缘体之间。第二电极可布置在第一绝缘体和第二绝缘体之间。第一电极和第二电极可限定间隙，该间隙包括第一电极和第二电极之间的2nm或更小的最短距离。所述间隙可通过将纳米线断裂成第一电极和第二电极而形成。整个系统或设备可附着于微流体硅芯片(silicon chip)。
附图简述
图1A显示根据本发明实施方式的核酸分子分析系统100的侧视图。
图1B显示根据本发明实施方式的核酸分子分析系统100的顶视图。
图2是根据本发明实施方式分析核酸分子的方法200的流程图。
图3A显示在根据本发明实施方式的核酸分子分析系统中，与电极接触以允许隧穿识别的核酸分子。
图3B显示在根据本发明实施方式的核酸分子分析系统中，不与电极接触的核酸分子。
图4A显示根据本发明实施方式，在被分子动力蛋白移动前，与两个电极接触的核酸分子。
图4B显示根据本发明实施方式，在被分子动力蛋白移动后，与两个电极接触的核酸分子。
图5A显示根据本发明实施方式，在自由流动中的不同核酸分子的电流特性。
图5B显示根据本发明实施方式，当拴系至珠时不同核酸分子的电流特性。
图6A显示根据本发明实施方式的核酸分子分析系统600的顶视图。
图6B显示根据本发明实施方式的核酸分子分析系统600的侧视图。
图7显示根据本发明实施方式分析核酸分子的方法700的流程图。
图8A显示在根据本发明实施方式的核酸分子分析系统中，与两个电极接触的核酸分子。
图8B显示在根据本发明实施方式的核酸分子分析系统中，不与两个电极接触的核酸分子。
定义
术语“接触”可指代将一个物体接近另一个物体，使得电子可从一个物体隧穿另一物体。在亚原子水平上，两个物体可从不彼此物理接触，因为来自物体中的电子云的排斥力可阻止物体更接近。
术语“动力蛋白(motor protein)”可为这样的分子，其可相对于该分子移动核酸分子。例如，动力蛋白可保持静止并且核酸分子可移动，或核酸分子可保持静止并且动力蛋白可移动。动力蛋白可包括聚合酶、解旋酶、核糖体、外切核酸酶以及其它酶。
“核酸”可指代单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语可包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸类似的结合特性，并且其以类似于参考核苷酸的方式代谢。这样的类似物的实例可包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酰胺、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外指出，特定核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，简并密码子置换可通过生成这样的序列实现，在所述序列中，一个或多个选择的（或所有）密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19：5081 (1991)；Ohtsuka et al.,J. Biol. Chem. 260：2605-2608 (1985)；Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8：91-98 (1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
除了指代天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体之外，术语“核苷酸”还可理解为指代其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其在其中应用核苷酸的特定背景下(例如，与互补碱基杂交)在功能上是等同的，除非上下文另有明确指出。
术语“振荡”可指代由布朗运动或其它力引起的物体在流体中的运动。物体可在没有被人或机器主动干预的情况下振荡。在一些情况下，物体可由于施加的电场或压力驱动的流动而振荡。
术语“弱力(weak force)”可指代物理学中的基本力之一。
详述
目前市场上常规的基于纳米孔的设备可包含插入亚稳脂质双层的蛋白纳米孔。脂质双层可为易碎的并且可破坏设备的稳定性。固态原子级纳米孔层可比蛋白纳米孔更不易碎，并且具有用于改善的可制造性的潜力。牵涉这些设备的可能方法包括将核酸分子限制在电极之间2nm或更小的间隙中，并使用隧穿电极和核酸分子的电子识别核苷酸和核苷酸序列。通过将一束电子或离子聚焦在薄材料上，可形成接近这一尺寸的固态纳米孔。这一方法难以适应纳米孔、含纳米孔的设备和分析仪器的大规模生产。另外，核酸分子可难以强制进入电极之间的这种小间隙。更宽的通道可允许核酸分子更容易地扩散到纳米孔通道中。但是，核酸分子可过快地通过较宽的通道或核酸分子不与隧穿电极接触。作为结果，可测量少或无的隧穿电流，并且核酸分子可不容易通过设备测序。
隧穿识别可在不一定包括纳米孔的几何形状中完成。例如，隧穿电子可用于扫描隧穿显微镜(STM)，其已被用于成像个别原子。理论上，STM也可用于读取DNA序列，但STM可依赖于移动电极探针，并且移动探针电极可移动DNA样品，使得难以获得高质量的隧穿信号。固定DNA样品和阻止DNA移动可改善隧穿识别。
本文所述的设备和方法可允许核酸分子被测序，而不强制核酸分子进入具有2nm或更小的直径的纳米孔通道。相反，纳米孔通道的直径可为10nm或更大。核酸分子可更容易地进入纳米孔通道。电极间隙可为2nm或更小，而纳米孔通道可为大直径。例如，电极可作为在两个电极之间具有电阻层的层在彼此之上堆叠。电阻层可具有大约2 nm的厚度。电极和电阻层可暴露在纳米孔通道中，且电极之间的距离与纳米孔通道的直径无关。在一些其它实施方式中，纳米线可驻留在具有10nm或更大的直径的纳米孔通道中。纳米线可分离以形成2nm或更小的间隙，并且纳米线的两个分离部分可充当电极。以此方式，电极之间的间隙可不与纳米孔通道的直径相关。
在一些实施方式中，核酸分子可附着于珠和分子动力蛋白中的至少一个。珠可在至少一个尺寸中大于纳米孔通道的尺寸，以致珠可不容易或快速地通过纳米孔通道。珠可将核酸分子的一端锚定在纳米孔通道中，其可允许核酸分子振荡并与电极随机接触以产生隧穿信号。核酸分子可由电场或压力驱动的流动来驱动，并且珠可减少核酸分子聚集的可能性。分子动力蛋白可向通道送入(或拉出)核酸分子，允许核酸分子的另外部分产生隧穿信号和因此被测序。
在一些实施方式中，纳米孔设备和方法可允许分析生物聚合物分子，而不仅仅是核酸分子。例如，可分析蛋白以确定蛋白中的氨基酸。纳米孔长度和直径可针对氨基酸的大小而不是核酸分子的大小调整。例如，电极之间的距离可为大约1-2 nm。纳米孔设备和隧穿识别的方法在下文进一步论述。
I. 电极堆叠隧穿识别
隧穿识别可在电极堆叠或夹层(electrode stack or sandwich)中进行。两个电极可在层中和夹入绝缘体。电极之间的距离(其也可为绝缘体的厚度)可为大约核酸内核苷酸的大小、或约2nm。电极之间的距离可与任何孔直径无关，其可允许更容易的可制造性。也可修改本文所述的实施方式以分析核酸分子之外的生物聚合物分子，包括蛋白。
A. 系统
如图1A和图1B中所示，一些实施方式可包括核酸分子分析系统100。图1A显示系统100的侧视图，并且图1B显示系统100的顶视图。“侧”和“顶”用于描述图中的系统100，但系统100可旋转，以致系统100的任何部分可指向任何方向。系统100可包括附着于具有直径的颗粒106的蛋白104。如果颗粒106不是球形的，则颗粒106可具有特征尺寸。在实施方式中，颗粒106可具有10nm至15nm、15nm至20nm、20nm至30nm、30nm至40nm、40nm至50nm、或50nm或更大的范围的直径或特征尺寸。颗粒可为珠。蛋白104可为分子动力蛋白。分子动力蛋白可包括聚合酶、解旋酶、核糖体和外切核酸酶。
蛋白104可共价地附着于颗粒106。例如，可用链霉抗生物素修饰颗粒106的表面，并且可用生物素修饰蛋白104。在一些实施方式中，可用生物素修饰颗粒106的表面，并且可用生物素修饰蛋白104。链霉抗生物素可以与生物素结合，其然后可将蛋白104结合至颗粒106。类似地，在其它实例中，可用SpyTag肽修饰颗粒106的表面，并且可用SpyCatcher蛋白修饰蛋白104。可选地，可用SpyCatcher修饰颗粒106的表面，并且可用SpyTag修饰蛋白104。SpyTag和SpyCatcher之间的共价结合可将蛋白104结合至颗粒106。(参见，B. Zakeri etal., “Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, throughengineering a bacterial adhesin,” Proc. Natl. Acad. Sci., 109 (2012), pp.E690-97，其内容通过引用并入本文，用于所有目的)。
可将核酸分子102引入系统，且蛋白104附着于颗粒106。核酸分子102可包括单链DNA或RNA。核酸分子102可附着于蛋白104。
系统100也可包括由第一电极110、第一绝缘体112和第二电极114限定的孔108。第一电极和第二电极可包括钯、铂、金或另一贵金属。第一电极和第二电极中的至少一个可涂覆有衔接子分子。衔接子分子可经受与核酸分子的弱力化学相互作用。作为结果，衔接子分子可帮助核酸分子桥接或接触两个电极。衔接子分子可为有机的或有机金属的。
第一绝缘体112可包括光刻胶。在实施方式中，第一绝缘体112的厚度(即，分开第一电极110和第二电极114的距离）可为1nm或更小、2nm或更小、3nm或更小、4nm或更小、或5nm或更小。孔108可由侧壁限定。侧壁可包括第二绝缘体118、第一电极110、第一绝缘体112、第二电极114和第三绝缘体120。第二绝缘体118和第三绝缘体120可包括光刻胶、玻璃和/或氮化硅。如图1A中所示，第一电极110可在第二绝缘体118和第一绝缘体112之间。第二电极114可在第一绝缘体112和第三绝缘体120之间。系统100可包括处于下列顺序的层的夹层：第二绝缘体118、第一电极110、第一绝缘体112、第二电极114、和第三绝缘体120。夹层中的层可与邻近层接触。
孔108可具有小于颗粒106的直径的直径。如果孔108不是圆形或圆柱形，则孔108可具有小于颗粒106的特征尺寸的特征尺寸。孔可包括斜面的开口或包括类似于圆锥体的几何形状。如果颗粒106不是圆形的，则颗粒106可通过特征尺寸描述。特征尺寸可描述长度、宽度、长轴的长度或短轴的长度。在实施方式中，孔的直径或特征尺寸可在10nm至15nm、15nm至20nm、20nm至30nm、30nm至40nm、或40nm至50nm的范围。孔108的直径或特征尺寸可比颗粒106的直径或特征尺寸短多于1nm、多于5nm、或多于10nm。颗粒106的直径或特征尺寸可为足够大的值，以防止颗粒106过快地穿过具有直径或特征尺寸的孔108。
系统100可进一步包括与第一电极110和第二电极114电连通的第一电源116。通过两个电极的电流可由仪表设备122测量。通过两个电极的电流可包括隧穿核酸分子102的电流。仪表设备122可包括电流仪表、示波器、或其它电流测量仪表。此外，系统100可包括配置为施加电场穿过孔108的第二电源124。这一电场可驱动核酸分子102穿过孔108。液体可布置在孔108中。液体可为导电溶液并允许核酸分子102流过孔108。第二电源124可与第三电极126和第四电极128电连通。第三电极126和第四电极128可布置在液体中并且布置在孔108的相对端上。
系统100可为多个分析系统之一，允许分析数千至数百万个核酸分子。多个分析系统可共享用于驱动核酸分子穿过孔的相同的第二电源。在多个分析系统的情况下，直径和特征尺寸可为多个分析系统的平均或中值直径或特征尺寸。应用多个分析系统可允许多路复用(multiplexing)，其可为优于其它隧穿识别系统的优点。
系统也可包括生物聚合物分析系统，其中分析生物聚合物分子而不是核酸分子。例如，类似于系统100的系统可用于分析蛋白和蛋白的氨基酸。
B. 方法
如图2中所示，实施方式可包括分析核酸分子的方法200。
在框202，方法200可包括将核酸分子附着于蛋白。蛋白通常可具有对核酸的结合位点，类似于酶对底物的结合位点。蛋白和核酸可形成非共价键，其强度取决于所牵涉的蛋白或酶。蛋白可附着于具有第一直径的颗粒。核酸分子、蛋白和颗粒可为本文所述的任一种。
在框204，方法200也可包括施加电场以将核酸分子的第一部分移动到孔中。核酸分子的第一部分可包括核苷酸。孔可由第一电极、第一绝缘体和第二电极限定。孔可具有小于第一直径的第二直径。核酸分子可在流体中，并且电场可通过流体中的电极施加，其中电极可位于孔的相对端上。
在框206，方法200可进一步包括将核酸分子的第一部分与第一电极和第二电极二者接触(框206)。
图3A显示核酸分子302的一部分，其跨越绝缘体308与第一电极304和第二电极306接触。当核酸分子302的一部分与两个电极接触时，也可认为该分子桥接两个电极。当核酸分子302的一部分与两个电极接触时，电子可从一个电极隧穿到另一个电极。可测量由隧穿电极生成的电流。如图3B中所示，如果核酸分子302不与第一电极304或第二电极306接触，则电子可不隧穿电极并且没有电流可被测量。
在框208，方法200可包括跨越第一电极和第二电极施加电压。电极可被认为是隧穿电极并且可为本文所述的任何电极。电压可为直流或交流电压。电压可以脉冲施加。方法200也可包括施加电流穿过第一电极和第二电极。
在框210，方法200可包括移动核酸分子，使得核酸分子的第二部分与第一电极和第二电极二者接触。核酸分子的第二部分可在与核酸分子的第一部分不同的位置。核酸分子的第二部分可包括核苷酸。可应用蛋白移动核酸分子。在一些情况下，核酸分子的第二部分可比核酸分子的第一部分对于蛋白定位更近地对于蛋白定位。在其它情况下，核酸分子的第二部分可比第一部分距蛋白定位更远地距蛋白定位。
图4A和图4B显示核酸分子402可如何被蛋白404移动的图。在图4A中，核酸分子402跨越绝缘体410与第一电极406和第二电极408接触。核酸分子402可以使得电子隧穿核苷酸412的方式与电极接触。核苷酸412可为核苷酸碱基中的任一种，包括A、C、G、T和U，并且可为标记的、人工的或甲基化的核苷酸。与核苷酸412对于蛋白404相比，核苷酸414可更接近蛋白404，而核苷酸416可更远。电子可不隧穿核苷酸414或416，因为这些核苷酸不位于电极之间。蛋白404可移动核酸分子402远离或朝向颗粒420。图4B显示核酸分子402从图4A移动远离颗粒420的实例。蛋白404可移动核酸分子402，以致核苷酸412不再对齐以致电子可隧穿核苷酸412。相反，核苷酸414可对齐，以致电子隧穿核苷酸414。隧穿不同的核苷酸的电子可生成不同的电流特性。
核酸分子可在孔中振荡。核酸分子可由于布朗运动而振荡。在一些实施方式中，振荡可部分地是施加的电场、压力驱动的流动、或电场或流动中的改变的结果。核酸分子的振荡可改变接触或桥接电极的核酸分子的一部分。在一些情况下，核酸分子可在类似于图3A的构造和类似于图3B的构造之间振荡，在类似于图3A的构造中，核酸分子的一部分与两个电极接触，在类似于图3B的构造中，核酸分子不与两个电极接触。在一些构造中，核酸分子的一部分可仍然与两个电极进行接触，但以允许电子更容易或更不容易隧穿的方式。例如，核酸分子可不与电极之一进行完全接触。作为结果，振荡可影响通过电极和核酸的电流。
在框212，当核酸分子在孔中振荡时，可测量穿过第一电极、核酸分子的第一部分和第二电极的电流。振荡的核酸可影响电流的振幅、脉冲宽度和频率中的至少一个。脉冲宽度也可被认为是停留时间，其可与核酸分子的特定部分保持与两个电极接触的持续时间有关。在一些实施方式中，代替电流或除电流之外，可测量电压或电阻。在一些实施方式中，可通过数学运算诸如傅立叶变换来变换电学特性，并且可分析该变换。
在框214，基于电流，可鉴定核酸分子的第一部分的核苷酸。可将电流与从已知核苷酸或已知序列测量的校准电流比较。核苷酸或序列可具有充当鉴定核苷酸或序列的指纹的电流模式。测量的电流的振幅、频率和/或脉冲宽度可用于基于已知核苷酸或序列鉴定未知核苷酸或序列。振幅可取决于个别核苷酸和核苷酸的电阻。频率可取决于核苷酸和/或邻近核苷酸如何在孔中振荡。例如，可识别模式并将其与已知核苷酸或序列匹配。可不需要精确的匹配。相反，如果从未知核苷酸或序列测量的电流具有振幅、频率和/或脉冲宽度的特定阈值水平，则可鉴定核苷酸或序列。分析电流特性可类似于分析来自共振隧穿二极管的电学特性。核苷酸的隧穿识别可类似于如Zhao et al., “Single-molecule spectroscopyof amino acids and peptides by recognition tunneling,” Nature Nanotech. 9,(2014) 466-73所述的氨基酸的隧穿识别，其内容通过引用并入本文，用于所有目的。
在实施方式中，可标记一种或多种核苷酸。核苷酸可用化学化合物标记，其产生比没有化学化合物的核苷酸强的隧穿电流。标记可特异于其附着的核苷酸的类型。标记可包括缀合的有机分子、有机金属化合物或金属簇。标记的核苷酸可作为标记的三磷酸核苷酸包括在分析系统中。
在一些实施方式中，核酸分子可为环状DNA或用重复序列形成的DNA。在具有环状DNA的实施方式中，蛋白104可为聚合酶。聚合酶可复制环状DNA，并且当聚合酶完成完整的环时，刚合成的单链DNA可移动到孔中。单链DNA对孔的“穿行(threading)”可通过聚合酶的动力学和三磷酸核苷酸的可用性来控制。作为环状DNA模板的结果，单链DNA可包括重复序列。重复序列可旋转穿过电极，其可允许更好的信号来鉴定核苷酸。
在其它实施方式中，方法可用于分析核酸分子之外的生物聚合物。例如，通过类似于方法200的方法，可分析蛋白而不是核酸分子的氨基酸而不是核苷酸。
C. 实例
图5A和图5B显示与拴系至珠506的核酸分子504相比、允许自由流动的核酸分子502的电流特性如何。核酸分子502可安置在由玻璃、钯电极、绝缘层和氮化硅限定的通道中，但核酸分子502可过快地流过通道。在一些情况下，核酸分子502可在通道中驻留一段时间，但可聚集而不是直的或大部分是直的链。聚集(Bunching up)可意味着核酸分子在一些区域中对自身加倍，其可引起核酸分子不桥接电极。相反，拴系至珠506的核酸分子504可不流过通道，因为珠506具有大于通道开口的最小尺寸的直径。此外，珠506可将核酸分子504锚定在通道中，而电场将核酸分子拉过通道。作为结果，核酸分子504可为直的或大部分直的，并且可不聚集。即使核酸分子504可不聚集，布朗运动也可移动核酸分子504，以致电子可隧穿核酸分子504。
图5A和图5B都显示在玻璃绝缘体中具有斜面的孔。这一斜面可为纳米制造工艺的结果。在许多情况下，孔的侧壁可不是完全直的，并且可为斜面的或倾斜的，如根据包括蚀刻的制造技术的控制和精确性会预期的。分子动力蛋白不连同图5B中的实施方式应用以简化实验设置。
图508、510、512、514显示隧穿核酸分子的电子产生的电流测量结果。图508显示来自不拴系至珠的核酸分子“Oligo A”的电流测量结果，而图510显示来自相同类型的核酸分子但拴系至珠的电流测量结果。图512显示来自不拴系至珠的不同核酸分子“Oligo C”的电流测量结果，而图514显示来自拴系至珠的Oligo C的电流测量结果。当与对应图510和514比较时，图508和512一般性地显示具有非零电流的较少时间。在图510中，对于大多数时间，电流是非零，而在图508中，电流对于大多数时间是零或接近零。此外，图510显示与图508相比更多重复或周期性的电流波动模式。最小和最大电流之间的电流可指示不良接触、电阻更高的核苷酸、或者在形成或取消与电极的接触的过程中的核苷酸，因为这些原因可影响隧穿效应的质量。
拴系和未拴系的核酸分子之间的电流特征中的另外差异可见于图512和514。在图512中，除了电流中的少数尖峰之外，电流几乎在所有时间都是零。这一模式指示，核酸分子不经常与电极接触。相反，图514显示以周期性或相当周期性的模式发生的、电流中的许多尖峰。图514中的模式指示，核酸分子经常与电极接触。
图508、510、512和514显示，拴系至珠的核酸分子提供比允许自由流过通道的核酸分子强的电流信号。用拴系的核酸分子信号可更清楚，并且可允许核苷酸的更容易和更准确的鉴定。
II. 隧穿断裂结(Tunneling Break Junction)中的共面电极
在一些实施方式中，隧穿识别可在基本上共面的两个电极之间进行。电极可分开大约2nm的距离，其可允许核苷酸的隧穿识别。电极可延伸到孔中，该孔具有大于2nm的直径。然后，电极之间的距离可与孔直径无关。
在一些实施方式中，纳米孔设备和方法可允许分析生物聚合物分子，而不仅仅是核酸分子。例如，可分析蛋白以确定蛋白中的氨基酸。纳米孔长度和直径可针对氨基酸的大小而不是核酸分子的大小调整。例如，电极之间的距离可为大约1-2nm。纳米孔设备和隧穿识别方法在下文进一步论述。
A. 系统
如图6A和图6B中所示，实施方式可包括核酸分析系统600。图6A是顶视图，并且图6B是侧视图。顶视图可在硅晶片(silicon wafer)或微流体芯片的表面上。系统600可包括附着于具有第一直径的颗粒606的蛋白604。蛋白604可为本文所述的任何蛋白，并且颗粒606可为本文所述的任何颗粒。
可将核酸分子602引入系统，且蛋白104已经附着于颗粒606。核酸分子602可包括本文所述的任何核酸分子。核酸分子602可附着于蛋白604。
系统600也可包括由第一绝缘体610限定的孔608。第一绝缘体可包括Si3N4、氧化物绝缘体(例如，SiO2、Al2O3、氧化硅酸盐(oxide silicates))、玻璃、石英或本文所述的任何绝缘体材料。孔608可具有小于第一直径的第二直径。孔608的第二直径可大于图1A和1B中孔108的直径。第二直径可为至多50nm。孔608可具有垂直于直径的纵轴612。
系统600可进一步包括第一电极614。第一电极614的一部分可延伸到孔608中。第一电极包括金、钯、铂或本文所述的任何电极材料。
系统600也可包括第二电极616，且第二电极616的一部分延伸到孔中。包括第一电极614的该一部分和第二电极616的该一部分的平面可正交于纵轴。第一电极614和第二电极616可限定间隙，该间隙包括两个电极之间的最短距离。在实施方式中，第一电极614和第二电极616之间的最短距离可为小于1nm、1nm至2nm、2nm至3nm、3nm至5nm、或5nm至10nm。
第一电极614和第二电极616可通过将单一纳米线断裂成两个电极而形成。断裂可牵涉将纳米线分成不与另一段(piece)接触的两段的不同技术。断裂单一纳米线可通过物理地弯曲其上具有纳米线的半导体芯片。然后弯曲芯片可使线断裂，并且可在断裂的纳米线的两个部分之间建立间隙。孔608的第二直径可足够大以适应芯片的机械弯曲。也可通过用束(beam)切割或通过施加高电势来断裂电极。第二电极可为本文所述的任何电极材料。
图6A和6B显示在孔中具有三角或圆锥形状的第一电极614和第二电极616。可通过芯片的反复前后弯曲来形成电极的形状，直到电极接触。然后施加的电势可帮助塑造电极的尖端。在其它实施方式中，第一电极614的最靠近第二电极616的部分可不变尖。相反，电极的末端可为平的或半球形的。
此外，系统600可包括与第一电极614和第二电极616电连通的第一电源618。通过电极的电流可由仪表设备622测量。仪表设备622可配置为，沿着并穿过桥接电极的核酸分子的一部分测量穿过电极的电流。仪表设备622可为本文所述的任何仪表设备。
第一电极614可在第一绝缘体610和第二绝缘体620之间。类似地，第二电极616可在第一绝缘体610和第二绝缘体620之间。第一绝缘体610和第二绝缘体620可包括氮化硅、二氧化硅、玻璃、石英和本文所述的其它绝缘材料。光刻胶可难以在隧穿断裂结中的第一绝缘体所需的级别上成形。绝缘体材料可比图6A和6B中所示更远地延伸，因为绝缘体材料可为微流体芯片的主要材料。
在一些实施方式中，系统600可包括第二电源(未示出)。第二电源可配置为，施加会移动核酸分子穿过孔608的电场。可跨越构成孔的层施加电场。如应用图1中的系统100，系统600可具有布置在孔608中的液体。电源可与第三电极和第四电极电连通。第三电极和第四电极可布置在液体中且布置在孔608的相对端上。
第一绝缘体610和第二绝缘体620可附着于包括硅芯片的微流体芯片。绝缘体可沉积或形成在半导体材料的顶部上，或可由半导体材料图案化(patterned)。半导体材料可包括硅晶片。
系统也可包括生物聚合物分析系统，其中分析生物聚合物分子而不是核酸分子。例如，类似于系统600的系统可用于分析蛋白和蛋白的氨基酸。
B. 方法
如图7中所示，另外的实施方式可包括分析核酸分子的方法700。
在框702，方法700可包括将核酸分子附着于蛋白。蛋白可附着于具有第一直径的颗粒。
在框704，方法700也可包括将核酸分子的一部分移动到由绝缘体限定的孔中。核酸分子的该一部分可包括核苷酸。孔可具有小于第一直径的第二直径。移动核酸分子的该一部分可包括施加电场以驱动核酸分子穿过孔。在这些和其它实施方式中，移动该一部分可包括用压力驱动的液体流动来移动核酸分子。对流液体流动可用于推动核酸分子穿过孔。与图1A和1B中的系统100相比较，用类似于图6A和6B中的系统600的系统，用于移动核酸分子的流动液体可更有效。系统100可仅约10至20nm厚，并且液体流动可破坏各层的夹层。另一方面，系统600可制造成比系统100厚。另外，包括绝缘体的系统600的部分可牢固地附着于晶片或其它材料，其可提供在流动液体中更大的稳定性。
在框706，方法700进一步包括将核酸分子的该一部分移动到第一电极和第二电极之间的间隙中。间隙可包括表示电极之间的最短距离的线。移动核酸分子的该一部分可包括应用将该一部分移动到孔中的相同力。
在框708，方法700可包括将核酸分子的该一部分与第一电极和第二电极二者接触。
图8A显示与第一电极804和第二电极806接触的核酸分子802，且两个电极在绝缘体808和810中电隔离。当核酸分子802与两个电极接触时，也可认为该分子桥接两个电极。在这种接触期间，电子可从一个电极隧穿到另一电极。可测量由隧穿电极生成的电流。如图8B中所示，如果核酸分子不与第一电极804或第二电极806接触，则没有电子可隧穿电极并且没有电流可被测量。如图8B中所示，核酸分子802可仅与第一电极804接触且不与第二电极806接触。
在框710，当核酸分子在孔中振荡时，可测量穿过第一电极、核酸分子和第二电极的电流。
在框712，类似于本文所述的方法，基于电流，可鉴定核酸分子的该一部分的核苷酸。
在其它实施方式中，方法可用于分析核酸分子之外的生物聚合物。例如，可通过类似于方法700的方法，分析蛋白而不是核酸分子的氨基酸而不是核苷酸。
在前面的描述中，出于解释的目的，已经阐述了众多细节以便提供对本技术的各种实施方式的理解。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，某些实施方式可在没有这些细节中的一些或者具有另外细节的情况下实施。
已经描述了若干实施方式，本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神的情况下，可应用各种修改、替代构造和等同物。另外，没有描述许多众所周知的工艺和元件，以便避免不必要地模糊本发明。另外，任何特定实施方式的细节可不总是存在于该实施方式的变型中，或可添加到其它实施方式中。
在提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确指示，否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一。包括在陈述范围内的任何规定值或中间值与该陈述范围内的任何其它规定值或中间值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可独立地在该范围内包括或排除，并且在较小范围中包括任一个限值、不包括任一个限值或包括两个限值的每个范围也包括在本发明内，受制于陈述范围内任何特别排除的限值。在陈述范围包括限值中的一个或两个的情况下，还包括排除这些包括的限值中的任一个或两个的范围。

Claims (19)

1.分析核酸分子的方法，所述方法包括：
将所述核酸分子附着于蛋白和具有第一直径的颗粒；
施加电场以将所述核酸分子的第一部分移动到孔中，所述孔由第一电极、第一绝缘体和第二电极限定，并且所述孔具有小于所述第一直径的第二直径；
将所述核酸分子的所述第一部分与所述第一电极和所述第二电极二者接触，所述第一部分包括第一核苷酸；
跨越所述第一电极和所述第二电极施加电压；
测量穿过所述第一电极、所述核酸分子的所述第一部分和所述第二电极的电流；和
基于所述电流，鉴定所述核酸分子的所述第一部分的所述第一核苷酸。
2.权利要求1的方法，其中：
所述孔由侧壁限定，
所述侧壁包括第二绝缘体、所述第一电极、所述第一绝缘体、所述第二电极和第三绝缘体，
所述第二绝缘体与所述第一电极接触，
所述第一电极与所述第一绝缘体接触，
所述第一绝缘体与所述第二电极接触，和
所述第二电极与所述第三绝缘体接触。
3.权利要求1所述的方法，其进一步包括：
当所述核酸分子在所述孔中振荡时，测量所述电流的振幅和频率。
4.权利要求1所述的方法，其进一步包括：
当所述核酸分子在所述孔中振荡时，测量所述电流的脉冲宽度。
5.权利要求1所述的方法，其中：
所述第一电极和所述第二电极各自涂覆有衔接子分子，和
所述衔接子分子与所述核酸分子具有弱力化学相互作用。
6.核酸分子分析设备，所述设备包括：
附着于颗粒的蛋白，所述颗粒具有第一直径；
由第一电极、第一绝缘体和第二电极限定的孔，所述孔具有小于所述第一直径的第二直径；
第一电源，其与所述第一电极和所述第二电极电连通；
第二电源，其配置为，施加电场穿过所述孔以将附着于所述颗粒的所述蛋白移动到所述孔中；和
仪表设备，其配置为，当附着于所述蛋白的核酸分子的第一部分与所述第一电极和所述第二电极接触时，测量穿过所述第一电极和所述第二电极的电流。
7.权利要求6所述的设备，其中所述设备进一步包括附着于所述蛋白的所述核酸分子。
8.权利要求6所述的设备，其中所述第一绝缘体包括光刻胶。
9.权利要求6所述的设备，其中：
所述孔进一步由侧壁限定，和
所述侧壁包括第二绝缘体、所述第一电极、所述第一绝缘体、所述第二电极和第三绝缘体。
10.权利要求6所述的设备，其中所述第一电极和所述第二电极中的至少一个包括钯。
11.分析核酸分子的方法，所述方法包括：
将所述核酸分子附着于蛋白和具有第一直径的颗粒；
将所述核酸分子的一部分移动到由第一绝缘体限定的孔中，所述孔具有小于所述第一直径的第二直径，并且所述一部分包括核苷酸；
将所述核酸分子的所述一部分移动到第一电极和第二电极之间的间隙中，所述间隙包括表示所述第一电极和所述第二电极之间的最短距离的线；
将所述核酸分子的所述一部分与所述第一电极和所述第二电极二者接触；
测量穿过所述第一电极、所述核酸分子和所述第二电极的电流；和
基于所述电流，鉴定所述核酸分子的所述核苷酸。
12.权利要求11所述的方法，其中：
所述孔具有垂直于所述第二直径的纵轴，
所述第一电极的一部分延伸到所述孔中，
所述第二电极的一部分延伸到所述孔中，
包括所述第一电极的所述一部分和所述第二电极的所述一部分的平面正交于所述纵轴。
13.权利要求11所述的方法，其中：
所述孔由侧壁限定，
所述侧壁包括第二绝缘体、所述第一电极、所述第一绝缘体、所述第二电极和第三绝缘体，
所述第二绝缘体与所述第一电极接触，
所述第一电极与所述第一绝缘体接触，
所述第一绝缘体与所述第二电极接触，和
所述第二电极与所述第三绝缘体接触。
14.核酸分析设备，所述设备包括：
附着于颗粒的蛋白，所述颗粒具有第一直径；
由第一绝缘体限定的孔，所述孔具有小于所述第一直径的第二直径，并且所述孔具有垂直于所述第二直径的纵轴；
第一电极，其中所述第一电极的一部分延伸到所述孔中；
第二电极，其中所述第二电极的一部分延伸到所述孔中，并且其中包括所述第一电极的所述一部分和所述第二电极的所述一部分的平面正交于所述纵轴；
第一电源，其与所述第一电极和所述第二电极电连通；和
仪表设备，其配置为，当附着于所述蛋白的核酸分子的第一部分与所述第一电极和所述第二电极接触时，测量穿过所述第一电极和所述第二电极的电流。
15.权利要求14所述的设备，其进一步包括附着于所述蛋白的所述核酸分子。
16.权利要求14所述的设备，其进一步包括配置为施加电场穿过所述孔的第二电源。
17.权利要求14所述的设备，其中所述第一电极布置在所述第一绝缘体和第二绝缘体之间。
18.权利要求14所述的设备，其中所述第二电极布置在所述第一绝缘体和第二绝缘体之间。
19.权利要求14所述的设备，其中：
所述第一电极和所述第二电极限定间隙，
所述间隙包括所述第一电极和所述第二电极之间的最短距离，和
所述第一电极和所述第二电极之间的所述最短距离是2nm或更小。
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