CN106687574A - 使用对纳米颗粒或纳米颗粒附近锚定的系链检测事件的组合物，系统和方法 - Google Patents

使用对纳米颗粒或纳米颗粒附近锚定的系链检测事件的组合物，系统和方法 Download PDF

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Abstract

提供了用于检测事件的组合物，系统和方法。组合物可包含纳米孔，所述纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过所述第一侧和第二侧的孔径；和永久性系链，包含头部区和尾部区以及布置在它们之间的伸长体。头部区可锚定到所述纳米孔的第一或第二侧或所述纳米孔的第一或第二侧附近。包含报告物区的伸长体可以响应在邻近所述纳米孔的第一侧发生的第一事件而能在孔径内移动。例如，报告物区响应第一事件向第一侧，然后向第二侧，然后响应第二事件向第一侧能平移移动。第一事件可以包含将第一核苷酸添加到多核苷酸。第二事件可以包含将第二核苷酸添加到多核苷酸。

Description

使用对纳米颗粒或纳米颗粒附近锚定的系链检测事件的组合 物，系统和方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求以下申请的权益，每个申请的全部内容通过引用并入本文：
于2014年6月3日提交的题为“Compositions,Systems,and Methods forDetecting Events Using Tethers Anchored to or Adjacent to Nanopores”的美国临时专利申请No.62/007,248，和
2015年5月5日提交的题为“Compositions,Systems,and Methods for DetectingEvents Using Tethers Anchored to or Adjacent to Nanopores”的美国临时专利申请No.62/157,371。
发明领域
本申请一般涉及检测分子事件，如分子或该分子的一部分的移动。
背景技术
已经投入大量的学术和公司时间和精力来检测事件，如分子或该分子的一部分的移动，特别是在分子是DNA或结合DNA的酶，如聚合酶的情况下。例如，Olsen等人的“Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I(Klenow Fragment)”，JACS 135:7855-7860(2013)(其全部内容通过引用并入本文)公开了将DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)的单个分子生物缀合到电子纳米电路中，从而允许具有单个核苷酸掺入事件的分辨率的酶促功能和动态变异性的电记录。或者，例如，Hurt等人，“Specific Nucleotide Binding and Rebinding to Individual DNA PolymeraseComplexes Captured on a Nanopore”，JACS 131:3772-3778(2009)(其全部内容通过引用并入本文)公开了在施加的电场中测量DNA与纳米孔顶上的KF的复合物的采样时间(dwelltime)。或者，例如，Kim等人，“Detecting single-abasic residues within a DNA strandimmobilized in a biological nanopore using an integrated CMOS sensor，”Sens.Actuators B Chem.177:1075-1082(2012)(其全部内容通过引用并入本文)公开了在涉及在α-溶血素纳米孔中捕获的DNA的实验中使用电流或通量测量传感器。或者，例如，Garalde等人，“Distinct Complexes of DNA Polymerase I(Klenow Fragment)for Basedand Sugar Discrimination during Nucleotide Substrate Selection”，J.Biol.Chem.286:14480-14492(2011)(其全部内容通过引用并入本文)公开了当在α-溶血素孔顶部的电场中捕获时基于它们的性质区分KF-DNA复合物。公开了涉及α-溶血素的测量的其它参考文献包含均为Howorka等人的下列各项，其全部内容通过引用并入本文：“Kinetics of duplex formation for individual DNA strand within a singleprotein nanopore,”PNAS 98:12996-13301(2001)；“Probing Distance and ElectricalPotential In a Protein Pore with Tethered DNA”，Biophysical Journal 83:3202-3210(2002)；和“Sequence-specific detection of individual DNA strand usingengineered nanopores,”Nature Biotechnology 19:636-639(2001)。
Turner等人的美国专利号8,652,779(其全部内容通过引用并入本文)公开了使用单一聚合酶酶复合物和溶液中的核苷酸类似物的核酸测序的组合物和方法，聚合酶复合物包含聚合酶和纳米孔近端附着的模板核酸。核苷酸类似物包含附着到核苷酸类似物的多磷酸部分的电荷阻断标记物，使得当核苷酸类似物掺入生长的核酸中时，电荷阻断标记物被切割。根据Turner，通过纳米孔检测电荷阻断标记物以确定掺入的核苷酸的存在和身份，从而确定模板核酸的序列。Jayasinghe等人的美国专利公开号2014/0051069(其全部内容通过引用并入本文)涉及包含跨膜蛋白孔亚基和核酸操作酶的构建体。
然而，诸如由Olsen，Hurt，Kim，Garalde，Howorka，Turner和Jayasinghe描述的先前已知的组合物，系统和方法可能不一定足够稳健，可再现或敏感，并且可能不具有足够高的通量用于实际实施，例如，需要商业应用，如临床和其它需要成本有效和高度精确操作的基因组测序。因此，需要改进的用于检测事件的组合物，系统和方法。
发明概述
本发明的实施方案提供了使用对纳米颗粒或纳米颗粒附近锚定的系链(tethersanchored to or adjacent to nanopores)检测事件的组合物，系统和方法。
在一个方面下，组合物包含纳米孔，纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一侧和第二侧的孔径(aperture)；和永久性系链(permanent tether)，永久性系链包含头部区(head region)，尾部区(tail region)和布置在它们之间的伸长体(elongated body)。头部区可以锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近。包含报告物区的伸长体可以响应在邻近纳米孔的第一侧发生的第一事件而能在孔径内移动。在一个非限制性实例中，头部区域可锚定于布置在纳米孔的第一侧或第二侧上的分子，如蛋白质。
在一些实施方案中，报告物区响应第一事件而在孔径内能平移移动。另外/或者，报告物区可以响应第一事件而能在孔径内旋转移动。另外/或者，报告物区可以响应第一事件而能在孔径内构象性移动。
在一些实施方案中，头部区通过共价键锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近。头部区可以锚定到纳米孔的第一侧。尾部区可以向纳米孔的第二侧自由延伸。
在一些实施方案中，报告物区响应第一事件而能向纳米孔的第一侧平移移动。报告物区可以在第一事件后能向第二侧平移移动。报告物区还可以响应邻近纳米孔的第一侧发生的第二事件而向能第一侧平移移动，第二事件在第一事件后。报告物区还可以在第二事件后能向第二侧平移移动。在一些实施方案中，第一事件包含向多核苷酸添加第一核苷酸。在包含第二事件的实施方案中，第二事件可以包含向多核苷酸添加第二核苷酸。
报告物区的电或通量阻断特征(electrical or flux blockade characteristicof the reporter region)可以不同于伸长体的另一区域的电或通量阻断特征。
系统可以包含组合物和测量电路，测量电路配置为在报告物区响应第一事件而移动时测量通过孔径的第一电流或通量(current or flux through the aperture)或测量第一光学信号(optical signal)。
在一些实施方案中，组合物还包含邻近纳米孔的第一侧布置的蛋白质，并且第一事件包含蛋白质的第一构象变化。蛋白质一般不是纳米孔的天然组分。
在一些实施方案中，头部区锚定到蛋白质。第一构象变化可以移动头部区，并且头部区的移动可以平移移动报告物区。
在一些实施方案中，蛋白质与纳米孔的第一侧接触。在一些实施方案中，蛋白质可以锚定到纳米孔的第一侧或纳米孔的第一侧附近。
在一些实施方案中，蛋白质包括酶。例如，酶可以包括聚合酶。第一构象变化可以响应作用于第一核苷酸的聚合酶而发生。在一些实施方案中，第一构象变化移动头部区，并且头部区的移动平移移动报告物区。第一核苷酸可以基于响应报告物区的平移移动的通过孔径的电流或通量的变化或第一光学信号的测量幅度或时间持续或两者能鉴定(Thefirst nucleotide can be identifiable based on a measured magnitude or timeduration,or both,of a change in a current or flux through the aperture or afirst optical signal responsive to the translational movement of the reporterregion)。
报告物区还可以响应聚合酶的第二构象变化而能平移移动，第二构象变化响应作用于第二核苷酸的聚合酶而发生。在一些实施方案中，第一核苷酸基于响应报告物区的平移移动的通过孔径的电流或通量的第一变化或第一光学信号的测量幅度或时间持续或两者能鉴定，所述平移移动响应第一构象变化。第二核苷酸可以基于响应报告物区的平移移动的通过孔径的电流或通量的第二变化或第二光学信号的测量幅度或时间持续或两者能鉴定，所述平移移动响应第二构象变化。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸基于电流或通量的第一和第二变化或基于第一和第二光学信号彼此单独能区分。
在一些实施方案中，组合物还包含邻近纳米孔的第一侧布置的聚合酶，并且第一事件包含作用于第一核苷酸的聚合酶。第一核苷酸可以包含伸长标签(elongated tag)，伸长标签包含与系链相互作用的部分(moiety)。部分与系链的相互作用可以平移移动报告物区。
在一些实施方案中，系链的伸长体可以包含合成聚合物。在一些实施方案中，系链包含第一寡核苷酸。第一寡核苷酸的无碱基核苷酸可以限定报告物区。另外/或者，部分可以包含与第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的杂交可以使系链缩短第一量。在一些实施方案中，第一核苷酸能基于响应系链缩短第一量的通过孔径的电流或通量的变化或光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定。在一些实施方案中，报告物区还响应作用于第二核苷酸的聚合酶而向第一侧能平移移动。第二核苷酸可以包含与第一寡核苷酸杂交的第三寡核苷酸。第三寡核苷酸与第一寡核苷酸的杂交使系链缩短第二量。在一些实施方案中，第一核苷酸能基于响应系链缩短第一量的通过孔径的电流或通量的第一变化或第一光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定。在包括第二核苷酸的实施方案中，第二核苷酸能基于响应系链缩短第二量的通过孔径的电流或通量的第二变化或第二光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸基于电流或通量的第一和第二变化或基于第一和第二光学信号彼此单独能区分。
在一些实施方案中，头部区锚定到纳米孔的第一侧。在一些实施方案中，聚合酶与纳米孔的第一侧接触。在一些实施方案中，聚合酶锚定到纳米孔的第一侧或纳米孔的第一侧附近。
一些实施方案进一步包括布置在第一侧上的聚合酶，头部区锚定到聚合酶。一些实施方案进一步包括各自与聚合酶接触的第一核苷酸和第一和第二多核苷酸，聚合酶配置为基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。在一些实施方案中，聚合酶经修饰而响应将第一核苷酸添加到第一多核苷酸来延迟焦磷酸盐的释放。在一些实施方案中，聚合酶包含经修饰的重组Ф29，B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，G1，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5，Cp-7，PR4，PR5，PR722或L17聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：在位置484的氨基酸取代，在位置198的氨基酸取代和在位置381的氨基酸取代。在一些实施方案中，聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：E375Y，K512Y，T368F，A484E，A484Y，N387L，T372Q，T372L，K478Y，1370W，F198W和L381A。
在一些实施方案中，组合物进一步包含布置在第一侧上的聚合酶，头部区锚定到聚合酶。一些实施方案进一步包括各自与聚合酶接触的第一核苷酸和第一和第二多核苷酸，聚合酶配置为基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。在一些实施方案中，第一核苷酸与可逆终止剂(terminator)偶联，可逆终止剂抑制聚合酶向第一多核苷酸添加第二核苷酸。在一些实施方案中，可逆终止剂通过暴露于光或热能切割。在一些实施方案中，可逆终止剂通过吸收来自光的热能切割。在一些实施方案中，可逆终止剂通过由光诱导的光化学反应能切割。在一些实施方案中，可逆终止剂通过与化学剂的反应能切割。在一些实施方案中，组合物进一步包含化学剂的来源。在一些实施方案中，可逆终止剂布置在第一侧上，并且化学剂的来源布置在第二侧上，使得化学剂通过孔径从第二侧移动到第一侧。在一些实施方案中，可逆终止剂包含叠氮基甲基(CH2N3)，并且化学剂包含THP。
在一些实施方案中，装置包含此类组合物，其中组合物存在于流动池中，并且流动池配置为补充与聚合酶接触的试剂。
在另一个方面下，方法包括提供纳米孔，纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一侧和第二侧的孔径；并且提供永久性系链，永久性系链包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体。头部区可以锚定到纳米孔的第一或第二侧或纳米孔的第一或第二侧附近，并且伸长体可以包含报告物区。方法可以包括响应与纳米孔的第一侧相邻发生的第一事件而在孔径内移动报告物。
在一些实施方案中，响应第一事件而在孔径内平移移动报告物区。另外/或者，可以响应第一事件在孔径内旋转移动报告物区。另外/或者，响应第一事件在孔径内构象性移动报告物区。
在一些实施方案中，头部区通过共价键锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近。在一些实施方案中，头部区锚定到纳米孔的第一侧。在一些实施方案中，尾部区向纳米孔的第二侧自由延伸。
在一些实施方案中，响应第一事件向纳米孔的第一侧平移移动报告物区。一些实施方案进一步包括在第一事件后向第二侧平移移动报告物区。一些实施方案进一步包括响应邻近纳米孔的第一侧发生的第二事件将报告物区向第一侧平移移动，第二事件在第一事件后。一些实施方案进一步包括在第二事件后向第二侧平移移动报告物区。在一些实施方案中，第一事件包含向多核苷酸添加第一核苷酸。在一些实施方案中，第二事件包含向多核苷酸添加第二核苷酸。
在一些实施方案中，报告物区的电或通量阻断特征不同于伸长体的另一区域的电或通量阻断特征。
方法进一步可以包括在响应第一事件移动报告体区时测量通过孔径的第一电流或通量或第一光学信号。
在一些实施方案中，蛋白质邻近纳米孔的第一侧布置，并且第一事件包含蛋白质的第一构象变化。头部区可以锚定到蛋白质。第一构象变化可以移动头部区，并且头部区的移动可以平移移动报告物区。
在一些实施方案中，蛋白质与纳米孔的第一侧接触。在一些实施方案中，蛋白质锚定到纳米孔的第一侧或纳米孔的第一侧附近。
在一些实施方案中，蛋白质包括酶。例如，酶可以包括聚合酶。第一构象变化可以响应作用于第一核苷酸的聚合酶而发生。在一些实施方案中，第一构象变化移动头部区，并且头部区的移动平移移动报告物区。一些实施方案进一步包括基于响应报告物区的平移移动的通过孔径的电流或通量的变化或光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定第一核苷酸。
一些实施方案进一步包括响应聚合酶的第二构象变化平移移动报告物区，聚合酶的第二构象变化响应作用于第二核苷酸的聚合酶而发生。一些实施方案进一步包括基于响应报告物区的平移移动的通过孔径的电流或通量的第一变化或第一光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定第一核苷酸，所述平移移动响应第一构象变化。一些实施方案进一步包括基于响应报告物区的平移移动的通过孔径的电流或通量的第二变化或第二光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定第二核苷酸，所述平移移动响应第二构象变化。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸基于电流或通量的第一和第二变化或基于第一和第二光学信号彼此单独能区分。
一些实施方案包括邻近纳米孔的第一侧布置聚合酶，并且第一事件可以包含作用于第一核苷酸的聚合酶。第一核苷酸可以包括包含伸长标签(elongated tag)，伸长标签包含与系链相互作用的部分。部分与系链的相互作用可以平移移动报告物区。
在一些实施方案中，系链的伸长体包含合成聚合物。在一些实施方案中，系链包含第一寡核苷酸。在一些实施方案中，第一寡核苷酸的无碱基核苷酸限定报告物区。在一些实施方案中，部分包含与第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的杂交可以使系链缩短第一量。一些实施方案进一步包括基于响应系链缩短第一量的通过孔径的电流或通量的变化或光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定第一核苷酸。一些实施方案还包括响应作用于第二核苷酸的聚合酶向第一侧平移移动报告物区。第二核苷酸可以包含与第一寡核苷酸杂交的第三寡核苷酸。第三寡核苷酸与第一寡核苷酸的杂交使系链缩短第二量。一些实施方案进一步包括基于响应系链缩短第一量的通过孔径的电流或通量的第一变化或第一光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定第一核苷酸。一些实施方案还包括基于响应系链缩短第二量的通过孔径的电流或通量的第二变化或第二光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定第二寡核苷酸。第一和第二核苷酸可以基于电流或通量的第一和第二变化或基于第一和第二光学信号彼此单独能区分。
在一些实施方案中，头部区锚定到纳米孔的第一侧。在一些实施方案中，聚合酶与纳米孔的第一侧接触。在一些实施方案中，聚合酶锚定到纳米孔的第一侧或纳米孔的第一侧附近。
在一些实施方案中，方法包括在第一侧上布置聚合酶，头部区锚定到聚合酶。在一些实施方案中，方法进一步包括使聚合酶与第一核苷酸以及与第一和第二多核苷酸接触，聚合酶基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。在一些实施方案中，聚合酶经修饰而响应将第一核苷酸添加到第一多核苷酸来延迟焦磷酸盐的释放。在一些实施方案中，聚合酶包含经修饰的重组Ф29，B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，G1，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5，Cp-7，PR4，PR5，PR722或L17聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：在位置484的氨基酸取代，在位置198的氨基酸取代和在位置381的氨基酸取代。在一些实施方案中，聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：E375Y，K512Y，T368F，A484E，A484Y，N387L，T372Q，T372L，K478Y，1370W，F198W和L381A。
在一些实施方案中，在第一侧上布置聚合酶，头部区锚定到聚合酶。在一些实施方案中，方法进一步包括使聚合酶与第一核苷酸以及与第一和第二多核苷酸接触，聚合酶基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。在一些实施方案中，第一核苷酸与可逆终止剂偶联，方法还包含通过可逆终止剂抑制聚合酶向第一多核苷酸添加第二核苷酸。在一些实施方案中，方法还包括通过暴露于光或热来切割可逆终止剂。一些实施方案包括通过吸收来自光的热切割可逆终止剂。一些实施方案包括通过由光诱导的光化学反应切割可逆终止剂。一些实施方案包括通过与化学剂反应切割可逆终止剂。一些实施方案包括提供化学剂来源。一些实施方案包括使流体流过聚合酶以除去化学剂。一些实施方案包括通过流体流向聚合酶提供新试剂。在一些实施方案中，可逆终止剂布置在第一侧上，并且化学剂来源布置在第二侧上，方法包括通过孔径将化学剂从第二侧移动到第一侧。在一些实施方案中，可逆终止剂包含叠氮基甲基(CH2N3)，并且化学剂包含THP。
在又一个方面下，组合物包含纳米孔，纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一侧和第二侧的孔径；和永久性系链，永久性系链包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体。头部区可以锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近，并且伸长体可以包含部分。可以邻近纳米孔的第一侧布置聚合酶。组合物还可以包含第一核苷酸，第一核苷酸包含第一伸长标签。第一伸长标签可以包含响应作用于第一核苷酸的聚合酶而与系链的部分相互作用的第一部分。
在一些实施方案中，头部区通过共价键锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近。例如，在一些实施方案中，头部区锚定到纳米孔的第一侧。在一些实施方案中，尾部区向纳米孔的第二侧自由延伸。在一些实施方案中，尾部区响应施加的电压在纳米孔的第一和第二侧之间能移动。或者，例如，在一些实施方案中，头部区锚定到纳米孔的第二侧。在一些实施方案中，尾部区向纳米孔的第一侧自由延伸。在一些实施方案中，尾部区响应施加的电压在纳米孔的第一和第二侧之间能移动。
聚合酶可以与纳米孔的第一侧接触。聚合酶可以锚定到纳米孔的第一侧或纳米孔的第一侧附近。
在一些实施方案中，第一部分和系链的部分之间的相互作用限定双链体(duplex)。纳米孔还可以包含布置在第一和第二侧之间的收缩部(constriction)。对纳米孔的第一或第二侧或在纳米孔的第一或第二侧附近锚定头部区可以抑制双链体通过收缩部的移动。或者/另外，双链体可以足够大，从而抑制双链体通过收缩部的移动。
在一些实施方案中，第一核苷酸的第一伸长标签还包含第一报告物区。任选地，第一报告物区可以配置为响应第一部分与系链的部分的相互作用而布置在孔径内。系统可以包含任何此类组合物和测量电路，测量电路配置为在第一报告物区布置在孔径内时测量通过孔径的电流或通量或光学信号。电流或通量或光学信号可以基于第一报告物区的电或通量阻断特征，并且第一核苷酸可以基于电流或通量或光学信号能鉴定。
在一些实施方案中，组合物还包括包含第二伸长标签的第二核苷酸，第二伸长标签包含响应作用于第二核苷酸的聚合酶而与系链的部分相互作用的第二部分。第二伸长标签还可以包含第二报告物区。在一些实施方案中，第二报告物区配置为响应第二部分与系链的部分相互作用而布置在孔径内。系统包含组合物和测量电路，测量电路配置为在第一报告物区布置在孔径内时测量通过孔径的第一电流或通量或第一光学信号，并且在第二报告物区布置在孔径内时测量通过孔的第二电流或通量或第二光学信号。第一电流或通量或第一光学信号可以基于第一报告物区的第一电或通量阻断特征。第一核苷酸可以基于第一电流或通量或第一光学信号能鉴定。第二电流或通量或第二光学信号可以基于第二报告物区的第二电或通量阻断特征。第二核苷酸可以基于第二电流或通量或第二光学信号能鉴定。第一和第二核苷酸可以基于第一电流或通量和第二电流或通量或基于第一和第二光学信号彼此单独能区分。
在本组合物的一些实施方案中，第一伸长标签响应作用于第一核苷酸的聚合酶而从第一核苷酸能切割，并且第二伸长标签响应作用于第二核苷酸的聚合酶而从第二核苷酸能切割。
在一些实施方案中，系链的伸长体包含合成聚合物。在一些实施方案中，系链的部分包含第一寡核苷酸。在一些实施方案中，第一部分包含与第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。第二寡核苷酸的无碱基核苷酸可以限定报告物区。在一些实施方案中，第二部分包含与第一寡核苷酸杂交的第三寡核苷酸。在一些实施方案中，第一部分和第二部分彼此相同。
在一些实施方案中，系链的伸长体还包含报告物区。报告物区可以响应第一部分与系链的部分的相互作用而布置在相对于第一部分的预定位置处。报告物区可以响应第一施加电压而在孔径内能平移移动。在一些实施方案中，纳米孔还包含布置在第一和第二侧之间的收缩部。报告物区可以响应第一施加电压能平移移动到相对于收缩部的第一预定位置。
报告物区的电或通量阻断特征可以不同于伸长体的另一区域的电或通量阻断特征。
系统包含此类组合物和测量电路，测量电路配置为在报告物区布置在第一预定位置时测量通过孔径的电流或通量或光学信号。电流或通量或光学信号可以基于报告物区的电或通量阻断特征和报告物区的第一预定位置，并且第一核苷酸可以基于电流或通量或光学信号能鉴定。
在一些实施方案中，第一部分和系链的部分响应第一施加电压能解离。系链的部分可以响应第一部分和系链的部分的解离而通过收缩部能平移移动。在一些实施方案中，第一部分响应在第一施加电压后的第二施加电压而与系链的部分相互作用。在一些实施方案中，组合物还包括包含第二伸长标签的第二核苷酸，第二伸长标签包含响应作用于第二核苷酸的聚合酶而与系链的部分相互作用的第二部分。报告物区可以响应第二部分与系链的部分的相互作用而布置在相对于第二部分的预定位置。在一些实施方案中，报告物区响应第二施加电压而在孔径内能平移移动。在一些实施方案中，纳米孔进一步包含布置在第一和第二侧之间的收缩部。报告物区可以响应第二施加电压而能平移移动到相对于收缩部的第二位置。
报告物区的电或通量阻断特征可以不同于伸长体的另一区域的电或通量阻断特征。
系统可以包含此类组合物和测量电路，测量电路配置为在报告物区响应第一施加电压而布置在第一位置时测量通过孔径的第一电流或通量或第一光学信号，并且在报告物区响应第二施加电压而布置在第二位置时测量通过孔的第二电流或通量或第二光学信号。第一电流或通量或第一光学信号可以基于报告物区的电或通量阻断特征和报告物区的第一预定位置。第一核苷酸可以基于第一电流或通量或第一光学信号能鉴定。第二电流或通量或第二光学信号可以基于报告物区的电或通量阻断特征和报告物区的第二预定位置。第二核苷酸可以基于第二电流或通量或第二光学信号能鉴定。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸基于第一电流或通量和第二电流或通量或基于第一和第二光学信号彼此单独能区分。在一些实施方案中，第一和第二电压具有彼此相同的幅度，并且第二电压在第一电压后。
在本组合物的一些实施方案中，第一伸长标签响应作用于第一核苷酸的聚合酶而从第一核苷酸能切割，并且第二伸长标签响应作用于第二核苷酸的聚合酶而从第二核苷酸能切割。
在一些实施方案中，系链的伸长体包含合成聚合物。在一些实施方案中，系链的部分包含第一寡核苷酸。第一寡核苷酸的无碱基核苷酸可以限定报告物区。第一部分可以包含与第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。第二部分可以包含与第一寡核苷酸杂交的第三寡核苷酸。第一部分和第二部分可以彼此不同。报告物区可以响应作用于第一核苷酸的聚合酶而在孔径内能平移移动。或者/另外，报告物区可以响应作用于第一核苷酸的聚合酶而在孔径内能旋转移动。或者/另外，报告物区可以响应作用于第一核苷酸的聚合酶而在孔径内能构象性移动。
在一些实施方案中，系链的伸长体包含合成聚合物。在一些实施方案中，系链的部分包含第一寡核苷酸。第一寡核苷酸的无碱基核苷酸可以限定报告物区。第一部分可以包含与第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的杂交可以使系链缩短第一量。第一核苷酸可以基于响应将系链缩短第一量的通过孔径的电流或通量的变化或光学信号的测量幅度或时间持续或两者能鉴定。
在一些实施方案中，第一核苷酸的第一伸长标签进一步包含第一荧光共振能量转移(FRET)对配偶体，并且系链还包含第二FRET对配偶体。第一FRET对配偶体和第二FRET对配体可以响应作用于第一核苷酸的聚合酶而彼此相互作用。响应第一FRET对配偶体和第二FRET对配体之间的相互作用发射的第一波长是可检测的。组合物还包括包含第二伸长标签的第二核苷酸，第二伸长标签包含第三荧光共振能量转移(FRET)对配偶体。系统可以包含此类组合物。第三FRET对配偶体和第二FRET对配偶体可以响应作用于第二核苷酸的聚合酶而彼此相互作用。系统可以包含光学检测系统，其配置为检测响应第三FRET对配偶体和第二FRET对配偶体之间的相互作用发射的第二波长。第一和第二核苷酸可以基于第一和第二波长彼此单独能区分。
在一些实施方案中，组合物还包含与聚合酶接触的第一和第二多核苷酸，聚合酶配置为基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。在一些实施方案中，聚合酶经修饰而响应将第一核苷酸添加到第一多核苷酸来延迟焦磷酸盐的释放。在一些实施方案中，聚合酶包含经修饰的重组Ф29，B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，G1，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5，Cp-7，PR4，PR5，PR722或L17聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：在位置484的氨基酸取代，在位置198的氨基酸取代和在位置381的氨基酸取代。在一些实施方案中，聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：E375Y，K512Y，T368F，A484E，A484Y，N387L，T372Q，T372L，K478Y，1370W，F198W和L381A。
在一些实施方案中，第一部分和系链的部分配置为彼此杂交，以形成发夹结构。系统可以包含此类组合物和电压源，电压源配置为在第一侧和第二侧间施加电压。第一部分和系链的部分可以配置为在两步过程(two-step process)中响应电压而彼此去杂交(dehybridize)。
在一些实施方案中，第一伸长标签还包含第二部分，组合物还包含锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近的第三部分，第二部分和第三部分响应将第一核苷酸添加到第一多核苷酸而相互作用。系统可以包含此类组合物和电压源，电压源配置为在第一侧和第二侧间施加电压。在一些实施方案中，第一部分和系链的部分配置为响应第一过程中的电压而彼此分开，并且第二部分和第三部分配置为响应第二过程中的电压而彼此分开。
在一些实施方案中，组合物还包含与聚合酶接触的第一和第二多核苷酸，聚合酶配置为基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。在一些实施方案中，第一伸长标签还包含可逆终止剂，其抑制聚合酶向第一多核苷酸添加第二核苷酸。在一些实施方案中，可逆终止剂通过暴露于光或热能切割。在一些实施方案中，可逆终止剂通过吸收来自光的热能切割。在一些实施方案中，可逆终止剂通过由光诱导的光化学反应能切割。在一些实施方案中，可逆终止剂通过与化学剂的反应能切割。一些实施方案进一步包括化学剂的来源。在一些实施方案中，可逆终止剂布置在第一侧上，并且化学剂来源布置在第二侧上，使得化学剂通过孔径从第二侧移动到第一侧。在一些实施方案中，可逆终止剂包含叠氮基甲基(CH2N3)，并且化学剂包含THP。
在一些实施方案中，装置包含此类组合物，其中组合物存在于流动池中，并且流动池配置为补充与聚合酶接触的试剂。
在又一个方面下，方法包括提供纳米孔，纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一侧和第二侧的孔径；并且提供永久性系链，永久性系链包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体。头部区可以锚定到纳米孔的第一或第二侧或纳米孔的第一或第二侧附近，并且伸长体可以包含部分。方法进一步可以包括提供邻近纳米孔的第一侧布置的聚合酶，并且提供包含第一伸长标签的第一核苷酸，第一伸长标签包含部分。方法进一步可以包括用聚合酶作用于第一核苷酸；并且响应作用于第一核苷酸的聚合酶使第一部分与系链的部分相互作用。
在一些实施方案中，头部区通过共价键锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近。例如，在一些实施方案中，头部区锚定到纳米孔的第一侧。在一些实施方案中，尾部区向纳米孔的第二侧自由延伸。一些实施方案包括响应施加的电压在纳米孔的第一和第二侧之间移动尾部区。或者，例如，在一些实施方案中，头部区锚定到纳米孔的第二侧。在一些实施方案中，尾部区向纳米孔的第一侧自由延伸。一些实施方案包括响应施加的电压在纳米孔的第一和第二侧之间移动尾部区。
在一些实施方案中，聚合酶与纳米孔的第一侧接触。在一些实施方案中，聚合酶锚定到纳米孔的第一侧或纳米孔的第一侧附近。
在一些实施方案中，第一部分和系链的部分之间的相互作用限定双链体。纳米孔还可以包含布置在第一侧和第二侧之间的收缩部。方法进一步可以包括通过对纳米孔的第一或第二侧或在纳米孔的第一或第二侧附近锚定头部区抑制双链体通过收缩部的移动。另外/或者，双链体可以足够大，从而抑制双链体通过收缩部的移动。
在一些实施方案中，第一核苷酸的第一伸长标签还包含第一报告物区。一些实施方案包括响应第一部分与系链的部分相互作用而将第一报告物区布置在孔径内。一些实施方案进一步包括在第一报告物区布置在孔径内时，测量通过孔径的电流或通量或光学信号。在一些实施方案中，电流或通量或光学信号基于第一报告物区的电或通量阻断特征，并且第一核苷酸基于电流或通量或基于光学信号能鉴定。一些实施方案进一步包括提供包含第二伸长标签的第二核苷酸，第二伸长标签包含第二部分，用聚合酶作用于第二核苷酸，并且响应作用于第二核苷酸的聚合酶使第二部分与系链的部分相互作用。第二伸长标签还可以包含第二报告物区。一些实施方案包括响应第二部分与系链的部分相互作用而将第二报告物区布置在孔径内。一些实施方案包括在第一报告物区布置在孔径内时测量通过孔径的第一电流或通量或第一光学信号，并且在第二报告物区布置在孔径内时测量通过孔的第二电流或通量或第二光学信号。在一些实施方案中，第一电流或通量或第一光学信号基于第一报告物区的第一电或通量阻断特征，第一核苷酸基于第一电流或通量或第一光学信号能鉴定，第二电流或通量或第二光学信号基于第二报告物区的第二电或通量阻断特征，并且第二核苷酸基于第二电流或通量或第二光学信号能鉴定。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸基于第一电流或通量和第二电流或通量或基于第一和第二光学信号彼此单独能区分。一些实施方案进一步包括响应作用于第一核苷酸的聚合酶从第一核苷酸切割第一伸长标签，并且响应作用于第二核苷酸的聚合酶从第二核苷酸切割第二伸长标签。
在一些实施方案中，系链的伸长体包含合成聚合物。在一些实施方案中，系链的部分包含第一寡核苷酸。在一些实施方案中，第一部分包含与第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。在一些实施方案中，第二寡核苷酸的无碱基核苷酸限定报告物区。在一些实施方案中，第二部分包含与第一寡核苷酸杂交的第三寡核苷酸。在一些实施方案中，第一部分和第二部分彼此相同。在一些实施方案中，系链的伸长体还包含报告物区。一些实施方案进一步包括响应第一部分与系链的部分的相互作用，将报告物相对于第一部分布置在预定位置。一些实施方案进一步包括响应第一施加的电压在孔径内平移移动报告物区。纳米孔还可以包含布置在第一侧和第二侧之间的收缩部。可以响应第一施加电压将报告物区平移移动到相对于收缩部的第一预定位置。报告物区的电或通量阻断特征可以不同于伸长体的另一区域的电或通量阻断特征。一些实施方案进一步包括在报告物区布置在第一预定位置时测量通过孔径的电流或通量或光学信号。在一些实施方案中，电流或通量或光学信号基于报告物区的电或通量阻断特征和报告物区的第一预定位置，并且第一核苷酸基于电流或通量或光学信号能鉴定。一些实施方案进一步包括响应第一施加电压而解离第一部分和系链的部分。一些实施方案包括响应第一部分和系链的部分的解离通过收缩部平移移动系链的部分。一些实施方案包括响应在第一施加电压后的第二施加电压使第一部分与系链的部分相互作用。
在一些实施方案中，方法还包括提供包含第二伸长标签的第二核苷酸，第二伸长标签包含响应作用于第二核苷酸的聚合酶而与系链的部分相互作用的第二部分。方法可以包括响应第二部分与系链的部分的相互作用将报告物区布置在相对于第二部分的预定位置。方法可以包括响应第二施加电压在孔径内平移移动报告物区。纳米孔还可以包含布置在第一侧和第二侧之间的收缩部。可以响应第二施加电压将报告物区平移移动到相对于收缩部的第二位置。报告物区的电或通量阻断特征可以不同于伸长体的另一区域的电或通量阻断特征。一些实施方案进一步包括在报告物区响应第一施加电压而布置在第一位置时测量通过孔径的第一电流或通量或第一光学信号，以及在报告物区响应第二施加电压而布置在第二位置时测量通过孔的第二电流或通量或第二光学信号。在一些实施方案中，第一电流或通量或第一光学信号基于报告物区的电或通量阻断特征和报告物区的第一预定位置。第一核苷酸可以基于第一电流或通量或第一光学信号能鉴定。第二电流或通量或第二光学信号可以基于报告物区的电或通量阻断特征和报告物区的第二预定位置。第二核苷酸可以基于第二电流或通量或第二光学信号能鉴定。在一些实施方案中，第一和第二核苷酸基于第一电流或通量和第二电流或通量或基于第一和第二光学信号彼此单独能区分。第一电压和第二电压可以具有彼此相同的幅度，并且第二电压在第一电压后。在一些实施方案中，第一伸长标签响应作用于第一核苷酸的聚合酶而从第一核苷酸能切割，并且第二伸长标签响应作用于第二核苷酸的聚合酶而从第二核苷酸能切割。
在一些实施方案中，系链的伸长体包含合成聚合物。在一些实施方案中，系链的部分包含第一寡核苷酸。第一寡核苷酸的无碱基核苷酸可以限定报告物区。第一部分可以包含与第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。第二部分可以包含与第一寡核苷酸杂交的第三寡核苷酸。第一部分和第二部分可以彼此不同。
在一些实施方案中，报告物区响应作用于第一核苷酸的聚合酶而在孔径内能平移移动。另外/或者，报告物区可以响应作用于第一核苷酸的聚合酶而在孔径内能旋转移动。另外/或者，报告物区可以响应作用于第一核苷酸的聚合酶而在孔径内能构象性移动。
系链的伸长体可以包含合成聚合物。系链的部分可以包含第一寡核苷酸。第一寡核苷酸的无碱基核苷酸可以限定报告物区。第一部分可以包含与第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的杂交可以使系链缩短第一量。第一核苷酸可以基于响应将系链缩短第一量的通过孔径的电流或通量的变化或光学信号的测量幅度或时间持续或两者能鉴定。
在一些实施方案中，第一核苷酸的第一伸长标签进一步包含第一荧光共振能量转移(FRET)对配偶体，并且系链还包含第二FRET对配偶体。第一FRET对配偶体和第二FRET对配体可以响应作用于第一核苷酸的聚合酶而彼此相互作用。方法进一步可以包括检测响应第一FRET对配偶体和第二FRET对配体之间的相互作用发射的第一波长。方法进一步可以包括提供包含第二伸长标签的第二核苷酸，第二伸长标签包含第三荧光共振能量转移(FRET)对配偶体。第三FRET对配偶体和第二FRET对配体可以响应作用于第二核苷酸的聚合酶而彼此相互作用。方法进一步可以包括检测响应第三FRET对配偶体和第二FRET对配体之间的相互作用发射的第二波长。第一和第二核苷酸可以基于第一和第二波长彼此单独能区分。
在一些实施方案中，方法进一步包括在第一侧上布置聚合酶，头部区锚定到聚合酶。在一些实施方案中，方法进一步包括使聚合酶与第一核苷酸以及与第一和第二多核苷酸接触，聚合酶基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。在一些实施方案中，聚合酶经修饰而响应将第一核苷酸添加到第一多核苷酸来延迟焦磷酸盐的释放。在一些实施方案中，聚合酶包含经修饰的重组Ф29，B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，G1，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5，Cp-7，PR4，PR5，PR722或L17聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：在位置484的氨基酸取代，在位置198的氨基酸取代和在位置381的氨基酸取代。在一些实施方案中，聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：E375Y，K512Y，T368F，A484E，A484Y，N387L，T372Q，T372L，K478Y，1370W，F198W和L381A。
在一些实施方案中，第一部分和系链的部分彼此杂交，以形成发夹结构。在一些实施方案中，方法还包括在第一侧和第二侧间施加电压。在一些实施方案中，第一部分和系链的部分响应两步过程中的电压而彼此去杂交。
在一些实施方案中，第一伸长标签进一步包含第二部分，第三部分，锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近，第二部分和第三部分响应将第一核苷酸添加到第一多核苷酸而相互作用。在一些实施方案中，方法还包括在第一侧和第二侧间施加电压。在一些实施方案中，第一部分和系链的部分响应第一过程中的电压而彼此分开，并且第二部分和第三部分响应第二过程中的电压而彼此分开。
在一些实施方案中，方法进一步包括在第一侧上布置聚合酶，头部区锚定到聚合酶。一些实施方案包括使聚合酶与第一核苷酸以及与第一和第二多核苷酸接触，聚合酶基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。在一些实施方案中，第一伸长标签包含可逆终止剂，方法还包含通过可逆终止剂抑制聚合酶向第一多核苷酸添加第二核苷酸。一些实施方案包括通过暴露于光或热来切割可逆终止剂。一些实施方案包括通过吸收来自光的热来切割可逆终止剂。一些实施方案包括通过由光诱导的光化学反应切割可逆终止剂。一些实施方案包括通过与化学剂反应切割可逆终止剂。一些实施方案包括提供化学剂的来源。在一些实施方案中，可逆终止剂布置在第一侧上，并且化学剂来源布置在第二侧上，方法包括通过孔径将化学剂从第二侧移动到第一侧。在一些实施方案中，可逆终止剂包含叠氮基甲基(CH2N3)，并且化学剂包含THP。
一些实施方案包括使流体流过聚合酶以除去化学剂。一些实施方案进一步包括通过流体流向聚合酶提供新试剂。
在另一个方面下，组合物包含纳米孔，纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一侧和第二侧的孔径。组合物还可以包含永久性系链，永久性系链包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体，头部区锚定到聚合酶，伸长体包含部分。聚合酶可以邻近纳米孔的第一侧布置；组合物还包含包括第一伸长标签的第一核苷酸，第一伸长标签包含响应作用于第一核苷酸的聚合酶而与系链的部分相互作用的第一部分。
在一些实施方案中，尾部区包含第一核酸。一些实施方案进一步包括与第一核酸杂交的第二核酸。在一些实施方案中，头部区布置在纳米孔的第一侧上，并且尾部区布置在第二侧上。在一些实施方案中，头部区锚定到聚合酶。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸之间的相互作用限定双链体。在一些实施方案中，纳米孔还包含布置在第一和第二侧之间的收缩部。在一些实施方案中，双链体足够大，从而抑制双链体通过收缩部的移动。在一些实施方案中，包含双链体的系链抑制聚合酶与纳米孔分开。
在另一个方面下，系统包含此类组合物和测量电路，测量电路配置为测量通过收缩部的电流或通量或光学信号。在一些实施方案中，电流或通量基于第一部分，并且第一核苷酸基于电流或通量或基于光学信号能鉴定。在一些实施方案中，第一伸长标签或伸长体还包含报告物区，电流或通量或光学信号基于布置在孔径内的报告物区，并且第一核苷酸基于电流或通量或基于光学信号能鉴定。
在另一个方面下，方法包含提供纳米孔，纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一侧和第二侧的孔径。方法还可以包括提供永久性系链，永久性系链包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体，头部区锚定到聚合酶，伸长体包含部分。方法还可以包括提供邻近纳米孔的第一侧布置的聚合酶。方法还可以提供包含第一伸长标签的第一核苷酸，第一伸长标签包含部分，方法还可以包括用聚合酶作用于第一核苷酸，方法还可以包括响应作用于第一核苷酸的聚合酶，使第一部分与系链的部分相互作用。
在一些实施方案中，尾部区包含第一核酸。一些实施方案进一步包括将第二核酸与第一核酸杂交。一些实施方案进一步包括将头部区布置在纳米孔的第一侧上，并且将尾部区布置在第二侧上。一些实施方案进一步包括将头部区锚定到聚合酶。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸之间的相互作用限定双链体。在一些实施方案中，纳米孔还包含布置在第一侧和第二侧之间的收缩部。一些实施方案进一步包括通过双链体的尺寸抑制双链体通过收缩部的移动。一些实施方案进一步包括通过包含双链体的系链抑制聚合酶与纳米孔分开。一些实施方案进一步包括测量通过收缩部的电流或通量或光学信号。在一些实施方案中，电流或通量或光学信号基于第一部分，方法还包括基于电流或通量或基于光学信号鉴定第一核苷酸。在一些实施方案中，第一伸长标签或伸长体还包含报告物区，其中电流或通量或光学信号基于布置在孔径内的报告物区，方法还包括基于电流或通量或基于光学信号鉴定第一个核苷酸。
在另一个方面下，制备纳米孔测序装置的方法包括提供腔室，腔室包含通过纳米孔与第二液体介质分开的第一液体介质，纳米孔包含与第一液体介质接触的第一侧，与第二液体介质接触的第二侧，以及延伸穿过第一和第二侧的孔径。方法还可以包括对第一液体培养基提供聚合酶，其中聚合酶包含系链，系链包含头部区，尾部区和置于它们之间的伸长体，头部区锚定于聚合酶。方法还包括向第二液体介质提供捕获部分。方法还可以包括施加电流或通量通过纳米孔以使系链的尾部区移位通过纳米孔。方法还可以包括将捕获部分结合到系链的尾部区，从而将系链保持在纳米孔中。
在一些实施方案中，系链包含核酸。在一些实施方案中，尾部区包含核酸。在一些实施方案中，捕获部分包含与尾部区的核酸互补的核酸。在一些实施方案中，捕获部分共价结合到尾部区。在一些实施方案中，捕获部分非共价结合到尾部区。
附图简述
图1A-1M示意性显示根据本发明的一些实施方案的组合物，其包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的各种构造。
图2A示意性显示根据本发明的一些实施方案的系统，包含配置为测量纳米孔的孔径内的报告物区的移动的测量电路。
图2B是根据本发明的一些实施方案的示例性信号的图，所述信号可以在图2A的系统的使用期间产生。
图2C示意性显示根据本发明的一些实施方案的系统的平面图，该系统包含配置为测量纳米孔阵列的相应孔径内的相应报告物区的移动的测量电路。
图3A显示了根据本发明的一些实施方案的用于检测事件的方法，其使用包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的组合物进行。
图3B显示根据本发明的一些实施方案的用于制备组合物的方法，所述组合物包含邻近纳米孔的聚合酶和系链。
图4A显示根据本发明的一些实施方案的用于检测分子的构象变化的方法，其使用包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的组合物进行。
图4B显示了根据本发明的一些实施方案的用于检测聚合酶对核苷酸的作用的方法，其使用包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的组合物来进行。
图5A-5B示意性显示根据本发明的一些实施方案的组合物，其包含纳米孔附近锚定的系链并且配置用于检测纳米孔附近布置的分子的构象变化。
图6A-6B示意性显示了聚合酶的示例性构象变化。
图6C-6D示意性显示了根据本发明的一些实施方案的组合物，其包含锚定于邻近纳米孔布置的聚合酶的系链并且配置用于检测响应聚合酶对核苷酸的作用的聚合酶的构象变化。
图7A-7B示意性显示根据本发明的一些实施方案的组合物，其包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链并且配置用于检测蛋白质对核苷酸的作用。
图8A示意性显示根据本发明的一些实施方案的组合物，其包含锚定到纳米孔的系链并且配置用于检测聚合酶对核苷酸的作用。
图8B示意性显示了根据本发明的一些实施方案的包含伸长标签的示例性核苷酸，所述伸长标签包含在用于检测聚合酶对核苷酸的作用期间与图8A的系链相互作用的部分。
图9A-9B示意性显示根据本发明的一些实施方案，在用于检测聚合酶对核苷酸的作用期间，响应与示例性核苷酸的伸长标签的部分杂交的示例性系链的移动。
图10A-10B示意性显示根据本发明的一些实施方案的示例性核苷酸，其包括伸长标签，所述伸长标签包含相应部分，所述相应部分可以在用于检测聚合酶对核苷酸的作用期间与示例性系链相互作用。
图10C示意性显示了根据本发明的一些实施方案的示例性系链和部分，所述部分可以在用于检测聚合酶对核苷酸的作用期间与系链相互作用。
图11A-11D显示了根据本发明的一些实施方案的系链和部分之间的相互作用的示例性计算。
图12A显示了根据本发明的一些实施方案的可用于计算系链和部分之间的相互作用的模型。
图12B显示了根据本发明的一些实施方案的系链和部分之间的相互作用的示例性计算。
图12C显示了基于图12A的模型计算的稳定结构。
图13A-13E示意性显示根据本发明的一些实施方案的示例性系链和相应核苷酸的部分之间的相互作用。
图14是根据本发明的一些实施方案的可以在诸如图13A-13E中所示的相互作用期间生成的示例性信号的图。
图15显示了根据本发明的一些实施方案，使用包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的组合物来检测聚合酶对核苷酸的作用的替代方法。
图16示意性显示了根据本发明的一些实施方案的替代组合物，其包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链并且配置用于检测聚合酶对核苷酸的作用。
图17A-17B示意性显示了根据本发明的一些实施方案的组合物，其包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链并且配置用于检测聚合酶对包括包含报告物区的伸长标签的核苷酸的作用。
图18A-18D示意性显示了根据本发明的一些实施方案的组合物，其包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链并且配置用于检测聚合酶对核苷酸的作用，其使用纳米孔间的电或通量阻断电位的变化进行。
图18E显示了根据本发明的一些实施方案的可以在组合物(如图18A-18D中显示)的使用期间产生的示例性信号。
图19A-19B示意性显示了根据本发明的一些实施方案的组合物，组合物包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链并且配置用于检测聚合酶对包括包含报告物区的伸长标签的核苷酸的作用。
图19C示意性显示了根据本发明的一些实施方案的示例性核苷酸，其包含伸长标签，所述伸长标签包含相应报告物区和部分，所述部分可以在用于检测聚合酶对核苷酸的作用期间结合示例性系链。
图20A-20D示意性显示根据本发明的一些实施方案的组合物，所述组合物包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链并且配置用于使用纳米孔间施加的电压的变化检测聚合酶对第一核苷酸的作用。
图20E显示了根据本发明的一些实施方案的可以在组合物(如图20A-20D中显示)的使用期间产生的示例性信号。
图21A-21D示意性显示了根据本发明的一些实施方案的图20A-20D的组合物，其配置为用于使用纳米孔间施加的电压的第二变化来检测聚合酶对第二核苷酸的作用。
图21E显示了根据本发明的一些实施方案的示例性信号，其可以在组合物(如图21A-21D所示)的使用期间产生。
图22A-22F示意性显示根据本发明的一些实施方案的组合物，其包含邻近纳米孔锚定的系链并且配置为用于使用纳米孔间施加的电压的变化来检测聚合酶对第一核苷酸的作用。
图23A示意性显示了根据本发明的一些实施方案的包含伸长标签的示例性核苷酸，所述伸长标签包含相应报告物区和部分，所述部分可以在检测聚合酶对核苷酸的作用期间结合示例性系链。
图23B示意性显示了根据本发明的一些实施方案的组合物，其包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链，并且配置用于基于系链和核苷酸的报告物区之间的相互作用来检测聚合酶对第一核苷酸的作用。
图23C示意性显示了根据本发明的一些实施方案，在聚合酶对第一核苷酸的作用期间图23A的报告物区之一与图23B的系链之间的可检测相互作用。
图24A-24C显示了在MspA纳米孔中捕获并使用反侧锁寡核苷酸(trans-side lockoligonucleotide)锁定到位置的示例性蛋白质-DNA系链缀合物，并且图24D显示了根据本发明的一些实施方案的示例性双链体信号相对时间，其可以使用图24A-24C中所示的缀合物产生。然后将与DNA系链的区域互补的寡核苷酸加入到顺侧(cis side)。电压在120mV和-60mV之间循环，以大约200msec的周期。(A)施加正向电压时的缀合物。看到信号(D-2402)。(B).施加负电压时的缀合物。看到信号(D-2400)。(C)寡核苷酸缀合物的杂交时，其被向上拉到孔收缩部(pore constriction)。在剥离之前观察到示例性信号(D-2401)。在剥离后，系统返回到图24A所示的状态，同时电压仍然在120mV，导致信号D-2402。图24D中的数据用2KHz低通滤器过滤，目视清晰。
图25显示了其中由聚合酶作用的核苷酸分别是匹配或错配的反应方案的示例性反应参数，例如速率常数和停留时间(改编自Johnson，“The kinetic and chemicalmechanism of high-fidelity DNA polymerases“Biochim Biophys Acta 1804(5):1041-1048(2010)，其全部内容通过引用并入本文)。
图26A-26D显示了根据本发明的一些实施方案，用于修饰核苷酸被聚合酶作用的反应方案中的动力学常数的示例性结构。
详细说明
本发明的实施方案提供了使用锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链来检测事件的组合物，系统和方法。
更具体地，本组合物，系统和方法可以适合用于以稳健，可重复，灵敏且具有高通量的方式检测事件，如分子或其一部分的移动。例如，本发明的组合物可以包含纳米孔和锚定到纳米孔或纳米孔附近的永久性系链。纳米孔可以包含第一和第二侧以及延伸穿过第一和第二侧的孔径。永久性系链可以包含头部和尾部区以及布置在它们之间的伸长体。系链的头部和尾部区中的至少一个锚定到纳米孔的第一或第二侧或纳米孔的第一或第二侧附近。系链可以包含一个或多个特征，其有助于检测纳米孔附近，例如在纳米孔的第一侧或第二侧上发生的事件。
例如，在一些实施方案中，系链的伸长体可以包含报告物区，例如使用合适的检测技术或装置促进系链的检测或表征的区。响应与纳米孔的第一侧附近发生的事件，报告物区可以在孔径内能移动(例如，能平移，构象或旋转移动或其组合)。报告物区的移动是可测量的，并且关于事件的信息可基于移动的测量来解释。另外，报告物区可以配置为可重复移动，例如响应不同事件。此类事件可以彼此不同，并且可以以任何顺序发生。在具体实施方案中，事件发生在一系列循环中，如在通过顺序添加单体合成聚合物，或通过顺序移除单体而降解聚合物中发生。特别有用的聚合物是含有核苷酸单体的核酸。关于每个事件的信息可基于响应该事件的报告物区的移动的测量而单独确定。例如，基于报告物区的移动的信号的幅度或时间持续或两者可以单独地与每个事件相关。
可以使用本发明的组合物，系统和方法检测的事件的一个实例是与纳米孔的第一侧相邻布置的分子的构象变化。可以使用本发明的组合物，系统和方法检测的事件的另一个实例是一个分子与另一个分子的相互作用。应当理解，分子与另一种分子的相互作用可以引起但不一定引起一种或两种分子的构象变化。另外，分子的构象变化可以但不一定是响应该分子与另一分子的相互作用。本发明的组合物，系统和方法可以适当地配置，以便检测任何此类相互作用，或任何此类构象变化，或相互作用和构象变化的组合。
具有其它特征的系链也可以适当地用于检测事件。例如，系链的伸长体可以包含与第一分子相互作用的部分。事件可以包含通过第二分子对第一分子的作用。系链可以包含响应系链的部分和第一分子之间的相互作用而能移动(例如，能平移，构象或旋转移动或其组合)的报告物区。或者，系链的报告物区可以布置在基于系链的部分和第一分子之间的相互作用的孔径内的位置。作为另一个替代方案，第一分子而不是系链可以包含报告物区。此类报告物区的存在可以响应系链的部分和第一分子之间的相互作用而检测，或响应任何其它合适的刺激而可检测。另外，本发明的组合物可用于稳定其它分子。例如，系链与另一种分子的相互作用可以稳定该分子，例如将该分子或其一部分暂时保留在纳米孔内或附近。
基于本文提供的教导，可以容易地设想其它构造。
首先，将简要解释本文中使用的一些术语。然后，将描述一些示例性组合物，包含可以与本发明组合物一起使用的测量电路(例如，电或光学测量电路)的示例性系统，可以与本发明组合物一起使用的示例性方法，以及可以在此类方法期间使用的组合物的一些具体实例。
示例性术语
如本文所使用的，术语“孔(pore)”旨在表示包含允许分子从孔的第一侧穿过其到达孔的第二侧的孔径的结构。也就是说，孔径延伸穿过孔的第一和第二侧。能够穿过孔的孔径的分子可以包含例如离子或水溶性分子，如核酸，蛋白质，核苷酸和氨基酸。孔可以布置在屏障内。当孔的孔径的至少一部分具有100nm或更小，例如10nm或更小，或2nm或更小的宽度时，孔可以但不必被称为“纳米孔(nanopore)”。可选地，孔径的一部分可以比孔的第一和第二侧中的一个或两个更窄，在此类情况下，孔径的一部分可以被称为“收缩部”。或者/另外，孔的孔径或孔的收缩部(如果存在)或两者可以大于0.1nm，0.5nm，1nm，10nm或更大。孔可以包含多个收缩部，例如至少两个，三个，或四个，或五个，或多于五个收缩部。
如本文所使用的，“屏障”旨在表示通常抑制分子从屏障的一侧到屏障的另一侧的通过的结构。抑制通过的分子可包含例如离子或水溶性分子，如核酸，蛋白质，核苷酸和氨基酸。孔可以布置在屏障内，并且孔的孔径可以允许分子从屏障的一侧通到屏障的另一侧。屏障包含生物来源的膜和非生物屏障，如固态膜。
如本文所使用的，“系链”旨在表示具有头部区，尾部区和它们之间的伸长体的伸长成员。系链可以包含分子。系链可以是但不一定是处于伸长状态，例如可以包含伸长的分子。例如，系链的伸长体可具有二级或三级构造，例如发夹，折叠，螺旋构造等。系链可以包含聚合物，如多核苷酸或合成聚合物。系链可以具有例如从约5nm至约500nm，例如从约10nm至约100nm的长度(例如，以拉伸或最大延伸状态测量)。系链可以具有例如范围为约1nm至约50nm，例如从约2nm至约20nm的宽度。系链可以是直链或支链的。当在使用组合物的条件下，例如在检测方法中，当其不从本文中列出的组合物中移出时，可以认为系链是“永久性的”。当系链的位置从一个循环到下一个循环或从一个反应到重复反应没有净变化时，用于循环或重复反应中的系链也可以被认为是“永久的”。应当理解，即使在整个循环或反应中位置没有净变化，在单个循环或反应期间，永久性系链的位置可能改变。
如本文所使用的，系链的“头部区”旨在表示附着到另一个成员的系链的官能团。此类附着可以通过化学键，例如通过共价键，氢键，离子键，偶极-偶极键，伦敦分散力(london dispersion force)或其任何合适的组合形成。在一个实施方案中，此类附着可以通过头部区的第一寡核苷酸与另一成员的第二寡核苷酸的杂交来形成。或者，可以使用物理或生物相互作用形成此类附着，例如头部区的第一蛋白质结构与抑制头部区与另一成员分开的另一成员的第二蛋白质结构之间的相互作用。系链的头部区可以附着的示例性成员包含孔，例如孔的第一或第二侧，其中布置孔的屏障，以及布置在孔的第一或第二侧上的分子，如蛋白质。如果系链的头部区附着到布置在孔的第一或第二侧上的另一成员，则可以说系链的头部区与孔相邻。头部区可以但不一定位于系链的末端。
如本文所使用的，“锚定”旨在表示第一成员和第二成员之间的附着，其是永久的，例如足够稳定以用于检测事件或者例如是能移动的但在使用附着成员的条件下不经历净移动。在一些实施方案中，此类永久性附着在使用附着的成员的条件下通常是不可逆的，例如在检测方法中。在其它实施方案中，此类永久性附着是可逆的，但是至少持续其用于检测事件的时间段。例如，系链可以在系链使用期间永久附着到孔或孔附近以检测事件，并且随后可以是能除去或能用另一个系链替换。共价键仅是适合地可用于将第一成员锚定到第二成员的附着的一个实例。其它实例包含寡核苷酸之间的双链体，肽-肽相互作用和链霉亲合素-生物素或链霉亲合素-脱硫生物素。
如本文所使用的，系链的“尾部区”旨在表示远离头部区布置的系链的一部分。尾部区可以远离头部区自由地延伸，例如，可以不附着到任何其它成员。或者，尾部区可以是附着的。此类附着可以通过化学键，例如通过共价键，氢键，离子键，偶极-偶极键，伦敦分散力或其任何合适的组合形成。在一个实施方案中，此类附着可通过尾部区的第一寡核苷酸与另一成员的第二核苷酸的杂交形成。或者，可以使用物理或生物相互作用形成此类附着，例如尾部区的第一蛋白结构与抑制尾部区与另一成员分开的另一成员的第二蛋白结构之间的相互作用。尾部区附着的任何成员可以是但不必是头部区附着的相同成员。尾部区可以但不需要必然位于系链的末端。
如本文所使用的，“伸长体”旨在表示成员如系链的一部分，其足够长和窄以布置在孔的孔径的至少一部分内。当伸长体附着到受到作用的核苷酸时，此类伸长体可以称为“伸长标签”，以便于与系链的伸长体区分开。伸长体可以由生物来源或非生物来源的任何合适材料或其组合形成。在一个实例中，伸长体包含聚合物。聚合物可以是生物或合成聚合物。适合地包含在伸长体内的示例性生物聚合物包含多核苷酸，多肽，多糖，多核苷酸类似物和多肽类似物。适用于伸长体的示例性多核苷酸和多核苷酸类似物包含DNA，对映异构体DNA，RNA，PNA(肽-核酸)，吗啉代和LNA(锁定核酸)。示例性的合成多肽可以包含带电荷的氨基酸以及亲水和中性残基。适合地可以包含在伸长体内的示例性合成聚合物包含PEG(聚乙二醇)，PPG(聚丙二醇)，PVA(聚乙烯醇)，PE(聚乙烯)，LDPE(低密度聚乙烯)，HDPE(高密度聚乙烯)聚丙烯，PVC(聚氯乙烯)，PS(聚苯乙烯)，NYLON(脂肪族聚酰胺)，(四氟乙烯)，热塑性聚氨酯，聚醛，聚烯烃，聚(环氧乙烷)，聚(ω-烯酸酯)，聚(甲基丙烯酸烷基酯)和其它聚合化学和生物接头，例如描述于Hermanson，Bioconjugate Techniques，第三版，Academic Press，London(2013)中。另外，伸长体可任选地包含可与另一部分相互作用的部分。此类部分可以包含例如生物聚合物DNA，RNA，PNA，LNA，吗啉代或对映异构体DNA。伸长体的区域可以是带电的或中性的，这取决于报告物读出(reporter readout)的具体实施。
如本文所使用的，“报告物区”意指在相对小的移动时，使用合适的检测方法或系统可检测的部分。此类移动可以是约10nm或更小，或约5nm或更小，或约2nm或更小，或约1nm或更小，或约0.5nm或更小，或约0.2nm或更小，或甚至约0.1nm或更小，并且可以使用报告物区和合适的检测方法或系统检测。该部分可以具有可检测的物理，化学，电学，光学或生物学性质或其它合适的通量阻断性质。例如，部分可以具有促进光学检测或表征的光学性质。光学性质包含荧光和拉曼信号的产生。在一个例示性实例中，部分是与相应的FRET受体或供体相互作用以发射可检测的特定波长的光的荧光共振能量转移(FRET)供体或受体。供体和受体可以被认为是FRET对配偶体。或者，例如，该部分可以具有电或通量阻断性质。电或通量阻断性质包含静电电荷，例如正电荷或负电荷。或者，例如，该部分可以具有物理性质。物理性质包含部分的体积和形状。在一个例示性示例中，通过调节通过孔或收缩部的阻断电流或通量，在孔径内的部分的移动引起通过孔径或其中的可选的收缩部的电流或通量的可测量的变化。或者，例如，部分可以具有促进化学或生物检测的化学或生物学性质。化学或生物学性质包含化学或生物基团的存在，例如放射性基团或具有酶活性的基团。部分的一个或多个电学，物理，化学，生物或其它通量阻断性质可以提供通过孔径或收缩部的电流的可测量的变化，通过孔径或收缩部的分子的通量的可测量变化，或光学信号。在一个例示性实例中，在孔径内的部分的移动引起通过孔径或收缩部的电流的可测量的变化，或引起通过孔径或收缩部的分子的通量的可测量的变化，所述通量的变化可以以电学，化学，生物学或光学方式可检测。无碱基核苷酸是部分的非限制性实例，所述部分的移动可引起通过孔径或收缩部的电流的可测量变化或通过孔径或收缩部的分子通量的可测量变化。
如本文所使用的，“事件”旨在表示具有相关联的效果的动作。在本上下文中，动作可以包含但不限于分子或该分子的一部分的移动，并且效果可以是此类移动的任何结果。“运动”或“移动”可以是平移的，旋转的或构象的，或其组合。此类移动的示例性效果可以包含纳米孔孔或收缩部内的报告物区的移动。例如，事件可以包含分子的平移移动，或分子的旋转变化，或分子的构象变化。或者，例如，事件可以包含第一分子和第二分子之间的相互作用。与此类事件相关的示例性效应可以是第一分子，第二分子或第一和第二分子二者的构象变化。事件还可以包含多个分子的协同动作，或此类协调动作的任何部分。例如，事件可以包含进入蛋白质上的活性位点的分子，并且当作用于分子时经历构象变化的蛋白质。事件还可以包含但不限于分子或该分子的一部分的化学变化，并且效果可以是此类化学变化的任何相关结果。化学变化可以包含去除分子的一部分，将分子添加到另一分子，第一分子与另一分子结合或脱离(debinding)，修饰分子或其部分，以及形成或切割化学键，例如在多核苷酸合成期间，等等。例如，事件可以包含将核苷酸添加到多核苷酸，或杂交或去杂交两个寡核苷酸。事件可任选地包含一个或多个分子的移动和化学变化两者。任何此类事件的示例性效果可以包含报告物区在孔孔径或收缩部内的移动或报告物区被布置在纳米孔孔径或收缩部内的特定位置。作为非限制性的纯粹例示性的实例，事件可以包含以下的一个或多个：聚合酶测试核苷酸，聚合酶排斥核苷酸(如果核苷酸是与正在测序的多核苷酸中的下一个核苷酸的错配)，聚合酶使用外切核酸酶活性从多核苷酸切除核苷酸，和聚合酶使用焦磷酸水解从多核苷酸切除核苷酸。图25显示了其中分别由聚合酶作用的核苷酸是匹配或错配的反应方案的示例性反应参数，例如速率常数和停留时间(改编自Johnson，“Thekinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases“BiochimBiophys Acta1804(5):1041-1048(2010)，其全部内容通过引用并入本文)。聚合酶如T7Pol通常基于对正确匹配核苷酸的增加的结合亲和力(例如，正确对错配大约10倍的偏好)，错配核苷酸的大大降低的催化速率(例如，对于错配大约减慢1000倍)，和错配核苷酸从闭合催化状态的解离速率大大增加(例如，对于错配大约快300倍)的组合区分匹配和错配核苷酸。
如本文所使用的，“构象变化”意指分子形状的变化(例如，分子的相对原子坐标的变化)。此类构象变化可以包含相对于分子的另一部分移动的分子的一部分。分子的一部分的化学反应性可以响应分子的该部分或另一部分的相对移动而变化。分子可以经历响应刺激的构象变化。此类刺激可以包含但不限于施加于分子的变化或力，与其它分子的相互作用或环境因素。对分子的变化或施加的力可包含施加于分子或其一部分的物理力，施加于分子的电场，或与分子或其部分的化学反应，或其组合，例如底物的结合，催化和/或产物的释放。与其它分子的相互作用可包含另一分子的存在，另一分子的浓度，另一分子的作用或对另一分子的作用，或其组合。与另一种分子的示例性相互作用包含两种寡核苷酸的杂交或作用于核苷酸的聚合酶。环境因素可以包含pH的变化或温度的变化，或其组合。
如本文所使用的，术语“核苷酸”意指包含糖和至少一个磷酸基团并任选还包含核碱基的分子。缺乏核碱基的核苷酸可称为“无碱基(absic)”。核苷酸包含脱氧核糖核苷酸，经修饰的脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，经修饰的核糖核苷酸，肽核苷酸，经修饰的肽核苷酸，经修饰的磷酸糖主链核苷酸及其混合物。核苷酸的实例包含一磷酸腺苷(AMP)，二磷酸腺苷(ADP)，三磷酸腺苷(ATP)，一磷酸胸苷(TMP)，二磷酸胸苷(TDP)，三磷酸胸苷(TTP)，一磷酸胞苷(CMP)，二磷酸胞苷(CDP)，三磷酸胞苷(CTP)，一磷酸鸟苷(GMP)，二磷酸鸟苷(GDP)，三磷酸鸟苷(GTP)，一磷酸尿苷(UMP)，二磷酸尿苷(UDP)，三磷酸尿苷(UTP)，一磷酸脱氧腺苷(dAMP)，二磷酸脱氧腺苷(dADP)，三磷酸脱氧腺苷(dATP)，一磷酸脱氧胸苷(dTMP)，二磷酸脱氧胸苷(dTDP)，三磷酸脱氧胸苷(dTTP)，二磷酸脱氧胞苷(dCDP)，三磷酸脱氧胞苷(dCTP)，一磷酸脱氧鸟苷(dGMP)，二磷酸脱氧鸟苷(dGDP)，三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)，一磷酸脱氧尿苷(dUMP)，二磷酸脱氧尿苷(dUDP)和三磷酸脱氧尿苷(dUTP)。
术语“核苷酸”还意在包含与天然存在的核苷酸相比，包含修饰的核碱基，糖和/或磷酸部分的一类核苷酸的任何“核苷酸类似物”。可以包含在多核苷酸中的示例性修饰的核碱基，无论是否具有天然主链或类似物结构，包含肌苷，黄嘌呤，次黄嘌呤，异胞嘧啶，异鸟嘌呤，2-氨基嘌呤，5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，2-氨基腺嘌呤，6-甲基腺嘌呤，6-甲基鸟嘌呤，2-丙基鸟嘌呤，2-丙基腺嘌呤，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶，2-硫代胞嘧啶，15-卤代尿嘧啶，15-卤代胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，6-偶氮胞嘧啶，6-偶氮胸腺嘧啶，5-尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤，8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤，8-巯基腺嘌呤或鸟嘌呤，8-硫代烷基腺嘌呤或鸟嘌呤，8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤，5-卤素取代的尿嘧啶或胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤，7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤，8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，3-脱氮鸟嘌呤，3-脱氮腺嘌呤等。如本领域已知的，某些核苷酸类似物不能并入多核苷酸中，例如核苷酸类似物，如腺苷5'-磷酸硫酸盐。
在磷酸部分修饰的示例性核苷酸包含例如Lee等人，“Synthesis and reactivityof novelγ-phosphate modified ATP analogues,”Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters 19:3804-3807(2009)；Kumar等人，“PEG-labeled nucleotides and nanoporedetection for single molecule DNA sequencing by synthesis”，Scientific Reports2:684(2012)；Kumar等人，“Terminal phosphate labeled nucleotides：synthesis，applications，and linker effect on incorporation by DNA polymeraseases”，Nucleosides,Nucleotides,and Nucleic Acids 24:401-408(2005)和Mulder等人，“Nucleotide modification in theγ-phosphate leads to the improved fidelity ofHIV-1reverse transcriptase”，Nucleic Acids Research33:4865-4873(2005)中描述的核苷酸类似物，其全部内容通过引用并入本文。Lee等人描述了具有以下结构的某些示例性γ-磷酸修饰的ATP类似物：
Kumar等人(2012)公开了可以附着到dNTP或NTP(dNTP/NTP)的末端磷酸或四磷酸核苷酸(dN4P/N4P)的末端磷酸的不同长度的PEG-香豆素标签。示例性长度包含例如香豆素-PEG16-dN4P/N4P，香豆素-PEG20-dN4P/N4P，香豆素-PEG24-dN4P/N4P和香豆素-PEG36-dN4P/N4P。Kumar等人(2005)公开了四和五磷酸修饰的核苷酸，包含用或不用接头附着的染料。如Kumar等人(2005)中描述，不用接头的示例性染料包含DDAO，RESORUFIN，COUMARINS，烷基-XANTHENES，硝基酚，羟基吲哚，ELF和BBT；通过接头附着的示例性染料包含R110，REG，TAMRA，ROX，Cy染料和ET染料；并且示例性接头包含二氨基丙烷，二氨基庚烷，二氨基十二烷，EEA，PAP，二氨基环己烷，二氨基二甲苯和五赖氨酸。Mulder等人公开了化学修饰的核苷酸，包含附着到核苷酸的γ-磷酸的1-氨基萘-5-磺酸盐(ANS)，例如γ-P-氨基萘-5-磺酸脱氧，或核糖核苷酸(dNTP或NTP)，如ANS-ATP，ANS-CTP，ANS-GTP和ANS-TTP和/或这些或其它核苷酸的脱氧形式。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”是指包含彼此键合的核苷酸序列的分子。多核苷酸的实例包含脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)及其类似物。多核苷酸可以是核苷酸的单链序列，如RNA或单链DNA，核苷酸的双链序列，如双链DNA，或可以包含单链和双链核苷酸序列的混合物。双链DNA(dsDNA)包含基因组DNA，以及PCR和扩增产物。单链DNA(ssDNA)可以转化为dsDNA，反之亦然。多核苷酸中核苷酸的精确序列可以是已知的或未知的。以下是多核苷酸的示例性实例：基因或基因片段(例如探针，引物，表达序列标签(EST)或基因表达系列分析(SAGE)标签)，基因组DNA，基因组DNA片段，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转移RNA，核糖体RNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，合成多核苷酸，分支多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的DNA，任何序列的分离的RNA，核酸探针，引物或任何上述物质的扩增拷贝。
如本文所使用的，“杂交”意指非共价结合第一多核苷酸与第二多核苷酸。第一和第二多核苷酸之间的结合强度随那些多核苷酸之间的互补性而增加。
如本文所使用的，术语“蛋白质”旨在表示包含折叠成三维结构的多肽或由折叠成三维结构的多肽组成的分子。多肽包含当折叠成三维结构时赋予蛋白质以生物活性的部分。
如本文所使用的，术语“酶”意指催化修饰另一分子的分子。酶可包含蛋白质，以及某些其它类型的分子，如多核苷酸。也作为蛋白质的酶的实例包含聚合酶，核酸外切酶和解旋酶。
如本文所使用的，“聚合酶”意指具有通过将核苷酸聚合成多核苷酸而组装多核苷酸的活性位点的酶。聚合酶可以结合引发的单链多核苷酸模板，并且可以向生长的引物顺序添加核苷酸以形成具有与模板序列互补的序列的多核苷酸。
示例性组合物
现在将参考图1A-1M描述一些示例性组合物，其包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的各种构造。在一个方面，组合物包含纳米孔，所述纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一侧和第二侧的孔径；和包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链。头部区可锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近。
例如，图1A示意性显示了包含纳米孔100和永久性系链110的示例性组合物的横截面。纳米孔100包含第一侧101，第二侧102，孔径103和任选的收缩部104。永久性系链110包含头部区111，尾部区112，以及伸长体113。在如图1A所示的实施方案中，头部区111锚定在纳米孔100的第一侧101，尾部区112布置在纳米孔100的第一侧101上，并且向纳米孔100的第二侧102自由延伸，并且伸长体113可在纳米孔100的孔径103内移动。然而，纳米孔100或系链110或两者可具有与图1A所示不同的构造，如本文中例示。
系链110的头部区111，尾部区112和伸长体113可以包含任何合适的材料或材料的组合。例如，头部区111可以配置为经由化学键(例如，通过共价键，氢键，离子键，偶极-偶极键，伦敦分散力或其任何合适的组合)锚定到第一侧101。例如，头部区111可以包含例如共价键合到第一侧101的第二部分的第一部分。可以将头部区111锚定到第一侧101的示例性共价键包含碳-碳键，碳-氮键，碳-氧键，氧-氧键，硫-硫键，磷-氧键，磷-硫键，酰胺键，硫醚键，酰肼键，碳-硫键，以及由羟基胺(oxyamine)与羰基(醛和酮)，Staudinger试剂对(如膦和叠氮化物)或点击化学对(如叠氮化物和炔)反应产生的键。然而，附着不需要是共价的。例如，此类附着可以通过头部区的第一寡核苷酸与另一成员的第二核苷酸的杂交来形成。或者，可以使用物理或生物相互作用形成此类附着，例如头部区的第一蛋白质结构与抑制头部区与另一成员分开的另一成员的第二蛋白质结构之间的相互作用。例如，头部区111可以包含第一α螺旋，并且第一侧101可以包含锁定到头部区111以便抑制头部区111从第一侧101解离的第二α螺旋。受体和配体之间的相互作用也是有用的，其实例包含亲合素-生物素或其类似物；抗体-表位；凝集素-碳水化合物等。
伸长体113可以附着(例如共价键合)到头部区111，并且尾部区112可以限定伸长体113的远离头部区111的末端。伸长体113可以包含生物来源或非生物来源的任何合适材料，或其组合。如下文更详细描述的，伸长体113可任选地包含一个或多个促进伸长体的检测或移动的报告物区，或可包含与其它分子相互作用的一个或多个部分，或者可包含一个或多个此类报告物区和一个或多个此类部分。伸长体113的其它区域可以是基本上惰性的，以便抑制此类区与其它分子以原本可导致伸长体113相对于此类分子或相对于纳米孔100移动的方式相互作用。可以包含在伸长体113内的示例性生物材料包含生物聚合物，如多核苷酸，多肽，多糖和上述物质的类似物。适合地可包含在伸长体113内的示例性合成聚合物包含PEG(聚乙二醇)，PPG(聚丙二醇)，PVA(聚乙烯醇)，PE(聚乙烯)，LDPE(低密度聚乙烯)，HDPE(高密度聚乙烯)，聚丙烯，PVC(聚氯乙烯)，PS(聚苯乙烯)，NYLON(脂肪族聚酰胺)，(四氟乙烯)，热塑性聚氨酯，聚醛，聚烯烃，聚环氧乙烷，聚(ω-烯酸酯)，聚(甲基丙烯酸烷基酯)和其它聚合化学和生物接头，如在上文进一步提及的Hermanson等人中描述的。
纳米孔100可以具有允许头部区111锚定到纳米孔100的第一侧101的任何合适的构造。在一些实施方案中，纳米孔100可以是生物孔，固态孔或生物和固态杂合孔。生物孔旨在表示由一种或多种生物来源的材料制成的孔。“生物来源”是指衍生自或分离自生物环境(如生物体或细胞)的材料，或生物学可用结构的合成制造的形式。生物孔包含例如多肽孔和多核苷酸孔。
多肽孔意指由一种或多种多肽制成的孔。一种或多种多肽可以包含单体，均聚物或杂聚物。多肽孔的结构包含例如α-螺旋束孔和β-桶孔以及本领域熟知的所有其它孔。示例性的多肽孔包含α-溶血素，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白A，短杆菌肽A(gramicidin A)，麦芽孢菌素(maltoporin)，OmpF，OmpC，PhoE，Tsx，F-pilus，SP1，线粒体孔蛋白(VDAC)，Tom40，外膜磷脂酶A和奈瑟氏菌(Neisseria)自转运蛋白脂蛋白(NaIP)。“耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)”是由分枝杆菌产生的膜孔蛋白，允许亲水性分子进入细菌。MspA形成紧密相连的八聚体和跨膜β桶，其类似于杯状物并且包含中心收缩部。关于α-溶血素的更多细节，参见美国专利号6,015,714，其全部内容通过引用并入本文。关于SP1的更多细节，参见Wang等，Chem.Commun.，49:1741-1743，2013，其全部内容通过引用并入本文。关于MspA的进一步细节，参见Butler等人，“Single-molecule DNA detection with anengineered MspA protein nanopore,”Proc.Natl.Acad.Sci.105:20647-20652(2008)和Derrington等人，“Nanopore DNA sequencing with MspA,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，107:16060-16065(2010)，两者的全部内容通过引用并入本文。其它孔包含例如来自Norcadia farcinica的MspA同源物和lysenin。关于lysenin的更多细节，参见PCT公开号WO2013/153359，其全部内容通过引用并入本文。
多核苷酸孔旨在表示由一种或多种核酸聚合物制成的孔。多核苷酸孔可包含例如多核苷酸纸折物(polynucleotide origami)。
固态孔旨在表示由一种或多种非生物来源的材料制成的孔。“固态”是指不是生物来源的材料。固态孔可以由无机或有机材料制成。固态孔包含例如氮化硅孔，二氧化硅孔和石墨烯孔。
生物和固态杂合孔旨在表示由生物和非生物来源二者的材料制成的杂合孔。生物来源的材料如上所限定，并且包含例如多肽和多核苷酸。生物和固态杂合孔包含例如多肽-固态杂合孔和多核苷酸-固态孔。
应当理解，不同类型的纳米孔在多个方面可以具有彼此不同的尺寸。例如，如图1A所示，纳米孔100可以表征为具有限定邻近孔径103的纳米孔100的厚度的第一尺寸H1，例如，第一侧101的外表面105和第二侧102的外表面106之间的厚度。在纳米孔100包含任选的收缩部104的实施方案中，纳米孔100还可以表征为具有限定邻近孔径103的收缩部深度的第二尺寸H2，例如，第一侧101的外表面105和收缩部104的最窄部分之间的深度。纳米孔100还可以表征为具有限定孔径103的直径的第一直径D1，例如在孔径的最宽点处的孔径103的直径。在纳米孔100包含任选的收缩部104的实施方案中，纳米孔100还可以表征为具有限定收缩部直径的第二直径D2，例如收缩部的最窄点处的收缩部104的直径。应当理解，纳米孔100的此类尺寸不应被解释为限制性的，并且可以适当地限定纳米孔100的其它尺寸。例如，纳米孔100的第一尺寸H1可以沿着横向尺寸变化，例如，如果纳米孔100包含相对薄的屏障，其中布置相对厚的孔，例如图1K所示。或者，例如，在纳米孔100包含任选的收缩部104的实施方案中，纳米孔100的第二尺寸H2可以根据收缩部104与第一侧101的外表面105的相对位置而变化。也就是说，可选的收缩部104可以位于布置在纳米孔100内的任何合适的位置，并且实际上甚至可以布置在第一外表面105或第二侧面102的外表面106的远侧。下面更详细讨论的图1J和1K显示了可选收缩部104的非限制性示例性位置。孔径103和可选收缩部104不需要一定是完全圆形的，并且仍然可以表征为具有近似直径或使用任何其它合适的尺寸。此外，纳米孔100可以包含多个收缩部，其中每个收缩部适当地可以使用适当的尺寸来表征。
在一些实施方案中，纳米孔100的第一尺寸H1为约100nm或更小，或约50nm或更小，或约20nm或更小，或约10nm或更小，或约5nm或更小，或约2nm以下。例如，H1可以在约2nm和约100nm之间，或者在约5nm和约50nm之间，或者在约10nm和约20nm之间。在包含任选的收缩部104的实施方案中，纳米孔100的第二尺寸H2为约100nm或更小，或约50nm或更小，或约20nm或更小，或约10nm或更小，或约5nm或更小，约2nm或更小，或约1nm或更小。例如，H2可以在约1nm至约100nm之间，或约2nm至约50nm之间，或约5nm至约20nm之间。示例性地，H1可以在约5nm和约50nm之间，并且H2(如果适用)可以在约1nm和约5nm之间。在一个示例性实施方案中，H1约为10nm，并且H2约为5nm。在另一示例性实施方案中，H1为约10nm，并且H2为约6nm。在另一示例性实施方案中，H1为约10nm，并且H2为约7nm。在另一示例性实施方案中，H1约为10nm，并且H2约为8nm。在另一示例性实施方案中，H1约为10nm，并且H2约为9nm。在另一示例性实施方案中，H1约为10nm，并且H2约为10nm。在另一示例性实施方案中，H1为约5nm，并且H2为约2nm。在另一示例性实施方案中，H1为约5nm，并且H2为约3nm。在另一示例性实施方案中，H1为约5nm，并且H2为约4nm。在另一示例性实施方案中，H1为约5nm，并且H2为约5nm。术语“约”和“大约”旨在表示高于或低于叙述数值的10％以内。
在一些实施方案中，纳米孔100的孔径103的第一直径D1为约100nm或更小，或约50nm或更小，或约20nm或更小，或约10nm或更小，或约5nm或更小，或约2nm或更小。例如，D1可以在约2nm和约100nm之间，或者在约5nm和约50nm之间，或者在约10nm和约20nm之间。在包含任选的收缩部104的实施方案中，纳米孔100的收缩部104的第二直径D2为约100nm或更小，或约50nm或更小，或约20nm或更小，或约10nm或更小，或约5nm或更小，或约2nm或更小，或约1nm或更小。例如，D2可以在约1nm和约100nm之间，或者在约2nm和约50nm之间，或者在约5nm和约20nm之间。示例性地，D1可以在约5nm和约50nm之间，并且D2(如果适用)可以在约1nm和约5nm之间。
在一个例示性实施方案中，D1为约5至10nm，且D2为约1至1.2nm。在另一个例示性实施方案中，D1为约5至10nm，且D2为约1.2至1.4nm。在另一个例示性实施方案中，D1为约5至10nm，且D2为约1.4至1.6nm。在另一个例示性实施方案中，D1为约5至10nm，且D2为约1.6至1.8nm。在另一个例示性实施方案中，D1为约5至10nm，且D2为约1.8至2.0nm。在其中孔是MspA的示例性实施方案中，D1可以是例如约4.8nm，D2可以是例如约1.1至1.2nm，H1可以是例如约9.6nm，且H2可以是例如约7.9至8.1nm。在其中孔是α-溶血素的示例性实施方案中，D1可以是例如约2.6nm，D2可以是例如约1.4至1.5nm，H1可以是例如约10nm，H2可以是例如约5nm。对于其它类型的孔，可以适当地选择其它合适的尺寸组合。
永久性系链110的特征可以基于纳米孔100的尺寸中的一个或多个适当地选择。例如，系链110的伸长体113可以具有基于D1或D2(如果适用)，或者D1和D2二者(如果适用)选择的宽度。例如，伸长体113的宽度可以选择为使得伸长体113响应事件或其它刺激而在孔径103内可移动(例如，伸长体113具有小于孔径103的第一直径D1的宽度)。在包含任选的收缩部104的实施方案中，也可以选择伸长体113的宽度，使得伸长体113的至少一部分可以邻近收缩部104移动，例如具有等于或小于第二直径D2的宽度。可选地，在包含收缩部104的实施方案中，伸长体113的宽度也可以选择为使得伸长体113的至少一部分能通过收缩部104移动，例如具有足够小于第二直径D2的宽度，以允许伸长体113通过收缩部104的移动，例如响应事件或其它刺激。如果纳米孔100包含多个收缩部(未具体显示)，则可以选择伸长体113的宽度，使得伸长体113可通过这些收缩部中的一些或全部在适当时移动。
系链110的伸长体113的长度可基于H1或H2(如果适用)或H1和H2二者(如果适用)来选择。例如，伸长体113的长度可以选择为短于H1，使得即使伸长体113通过收缩部104向第二侧102完全延伸，尾部区112也不会延伸超过纳米孔100的第二侧102的外表面106。或者，例如，在包含任选的收缩部104的实施方案中，伸长体113的长度可以选择为短于H2，使得即使如果伸长体113完全向第二侧103延伸，尾部区112不会延伸超过纳米孔100的收缩部104。在其它实施方案中，伸长体113的长度可以选择为长于H1，使得如果伸长体113通过收缩部104向第二侧102完全延伸，尾部区112将延伸超过纳米孔100的第二侧102的外表面106。或者例如，在包含任选的收缩部104的实施方案中，伸长体113的长度可以选择为长于H2，使得如果伸长体113完全向第二侧103延伸，则尾部区112将延伸超过纳米孔100的收缩部104。
可以选择伸长体113的长度，以便允许伸长体113在孔径103内，至少在纳米孔100的第一侧101上的相对自由移动，基本上没有由伸长体本身引起的空间位阻或其它干扰。也就是说，伸长体113可以配置为使得仅占据纳米孔100的第一侧101上的孔径103的体积的一部分，例如，以便占据纳米孔100的第一侧101上的孔径103的体积的小于50％，纳米孔100的第一侧101上的孔径103的体积的小于20％，或纳米孔100的第一侧101上的孔径103的体积的小于10％，或纳米孔100的第一侧101上的孔径103的体积的小于5％，或纳米孔100的第一侧101上的孔径103的体积的小于1％。另外，在图1A所示的实施方案中，系链110的尾部区112可以不附着到纳米孔100或任何其它成员，从而允许整个伸长体113相对于头部区111的相对自由移动。
虽然图1A显示了纳米孔100和永久性系链110的组件的一个示例性排列，应当理解，可以适当地使用其它排列。例如，替代地，永久性系链110的头部区111可以锚定到第二侧102。或者，例如，永久性系链110的头部区111可以替代地锚定在纳米孔100的第一侧101或第二侧102附近。或者，例如，永久性系链110的尾部区112可以替代地布置在纳米孔100的第二侧102上。或者，例如，永久性系链110的尾部区112可以替代地以锚定到纳米孔100的第一侧101或第二侧102。或者，例如，永久性系链110的伸长体113可以包含报告物区或可以与另一分子结合的部分，或者报告物区和可以与另一分子结合的部分二者。本文描述了特征的这些组合中的一些，但是应当理解，所有这些特征的组合是预期的，并且可以基于本文的教导容易地设想。
例如，图1B显示了替代组合物，其包含纳米孔100和具有头部区111’，尾部区112’和伸长体113’的替代系链110’。头部区111’锚定到纳米孔100的第一侧101。尾部区112’以类似于图1所示的方式朝纳米孔100的第二侧102自由延伸，只是伸长体113’足够长，使得尾部区112'可以布置在纳米孔100的第二侧102上。收缩部104是可选的。
在另一方面，组合物包含纳米孔，纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一侧和第二侧的孔径；和包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链。头部区可锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近。响应在邻近纳米孔的第一侧发生的第一事件，包含报告物区的伸长体可以在孔径内移动。响应第一事件，报告物区可以在孔径内能平移移动。另外或可选地，响应第一事件，报告物区可以在孔径内旋转移动。另外或可选地，响应第一事件，报告物区可以在孔径内能构象性移动。
例如，图1C显示了包含纳米孔100和具有头部区111”，尾部区112”和伸长体113”的替代系链110”的替代组合物。头部区111”锚定到纳米孔100的第一侧101。尾部区112”向纳米孔100的第二侧102自由延伸，并且伸长体113”足够长，使得尾部区112”可布置在纳米孔100的第二侧102。另外，伸长体113”包含第一报告物区114”，其便于测量伸长体113”的平移，旋转或构象移动，例如在包含此类收缩部的实施方案中相对于可选的收缩部104的移动。例如，第一报告物区114”可以具有与伸长体113”的一个或多个其它区域不同的物理，化学，光学，电学，生物学或其它合适的通量阻断特性。第一报告物区114”的平移，旋转或构象移动(如图1C中通过虚线箭头显示)可使用本文中描述，本领域已知或尚待开发的一种或多种技术检测。任选地，伸长体113”可以包含多于一个报告物区，例如可以包含第二报告物区114”’。伸长体113”可以包含任何合适数量的报告物区，例如一个，或两个，或三个，或四个，或五个，或多于五个报告物区。每个此类报告物区可以与每个其它报告物区相同。或者，每个此类报告物区可以与每个其它报告物区不同。或者，一些报告物区可以彼此相同，而其它报告物区可以彼此不同。
在某些实施方案中，响应第一事件，第一报告物区114”和任选的第二报告物区114”’可向着纳米孔100的第一侧101平移移动。在第一事件后，第一报告物区114”和任选的第二报告物区114”’也可以向纳米孔100的第二侧102平移移动。响应在第一事件后的第二事件，第一报告物区114”和任选的第二报告物区114”’也可向纳米孔100的第一侧101平移移动，并且在第二事件后再次可向纳米孔100的第二侧102平移移动。第一或第二事件或两者可发生在邻近纳米孔的第一侧。在包含任选的收缩部104的实施方案中，第一报告物区114”可以布置在沿着伸长体113”的位置，其选择为使得基于被完全或部分延伸的伸长体113”，第一报告物区114”可位于收缩部104附近或之内。另外，任选的第二报告物区114”’可以布置在沿着伸长体113”的位置，其选择为使得基于被完全或部分延伸的伸长体113”，第二报告物区114”可位于收缩部104附近或之内。在一些实施方案中，响应第一事件，第一报告物区114”’可位于收缩部104附近或之内，并且响应第二事件，第二报告物区114”’可位于收缩部104附近或之内，并且基于检测第一报告物区114”或第二报告物区114”’是否在收缩部104附近或之内布置，第一和第二事件是彼此可区分的。在一个例示性非限制性实例中，伸长体113”包含多核苷酸，其包含沿着伸长体113”的长度的一部分限定第一报告物区114”和任选的第二报告物区114”’的一个或多个无碱基核苷酸。可以在纳米孔的孔径内检测无碱基核苷酸，如在例如Wilson,“Electronic Control of DNA Polymerase Binding andUnbinding to Single DNA Molecules Tethered in a Nanopore”，Ph.D.Thesis，University of California Santa Cruz(2009)中描述，其全部内容通过引用并入本文。例示性地，一个或多个无碱基核苷酸或其它合适的报告物区114”，114”’的移动或存在可以引起通过孔径103或收缩部104的电流的可测量的变化，通过孔径103或收缩部104的分子通量的可测量变化，或光学信号。例如，通过孔径103或收缩部104的分子通量的变化可以电学，化学，生物学或光学方式检测。
作为另一个实例，图1D显示了替代组合物，其包含纳米孔100和具有头部区121，尾部区122和伸长体123的备选系链120。头部区121锚定在纳米孔100的第二侧102上。尾部区122向纳米孔100的第一侧101自由延伸，并且伸长体123足够长，使得尾部区122可以布置在纳米孔100的第一侧101上。然而，应当理解，尾部区122可以替代地布置在纳米孔100的第二侧102上，例如，伸长体123具有使得尾部区122布置在纳米孔100的第二侧102上的长度，即使伸长体123完全伸展。另外，伸长体123包含报告物区124，其有助于测量伸长体124的平移，旋转或构象移动(或其组合)，例如，如图1D中通过虚线箭头表示。在某些实施方案中，报告物区124响应第一事件或其它刺激，可以向纳米孔100的第一侧101平移移动，并且在第一事件或其它刺激后可向纳米孔100的第二侧102平移移动。响应在第一事件或其它刺激后的第二事件或其它刺激，报告物区124还可以向纳米孔100的第一侧101能平移移动，并且在第二事件或其它刺激后再次向纳米孔100的第二侧102能移动。第一或第二事件或两者可发生在邻近纳米孔的第一侧。刺激可以包含例如施加在纳米孔100间的电压。在包含任选的收缩部104的实施方案中，在一些实施方案中，例如响应事件或其它刺激，报告体区124可以邻近收缩部104或甚至通过收缩部104能移动。应当理解，伸长体123不需要必然包含报告物区124。
作为另一个实例，图1E显示了包含纳米孔100和具有头部区121’，尾部区122’和伸长体123’的替代系链120’的替代组合物。头部区121’邻近纳米孔100的第一侧101锚定，例如锚定到另一个成员150’，其可具有但不需要一定具有相对于纳米孔100的基本上固定的位置，并且可邻近纳米孔布置。尾部区122’以类似于图1A所示的方式向纳米孔100的第二侧102自由地延伸。在如图1E所示的实施方案中，尾部区122’布置在纳米孔100的第一侧101上，例如，伸长体123’具有选定的长度，使得尾部区122’布置在纳米孔100的第一侧101上，即使伸长体123’完全延伸。应当理解，伸长体123’取而代之可以足够长，使得尾部区122’可以布置在纳米孔100的第二侧102上。收缩部104是可选的。头部区121取而代之可以锚定到邻近纳米孔100的第二侧102布置的另一成员(未显示)。
作为另一个实例，图1F显示了包含纳米孔100和具有头部区121”，尾部区122”和伸长体123“的替代系链120”的替代组合物。头部区121”锚定在纳米孔100的第一侧101附近，例如锚定到另一个成员150”，该另一个成员150”可以具有但不需要一定具有相对于纳米孔100的基本上固定的位置，并且可以邻近纳米孔100布置。尾部区122”向纳米孔100的第二侧102自由地延伸，并且伸长体123”足够长，使得尾部区122”可以布置在纳米孔100的第二侧102上。另外，伸长体123”包含报告体区124”，其有助于测量伸长体113”的平移，旋转或构象移动，例如，如图1F中通过虚线箭头所示。在某些实施方案中，报告物区124”响应第一事件而可向纳米孔100的第一侧101平移移动，并且在第一事件后可向纳米孔100的第二侧102平移移动。响应第一事件后的第二事件，报告物区124”也可以向纳米孔100的第一侧101平移移动，并且在第二事件后再次可向纳米孔100的第二侧102平移移动。第一或第二事件或两者可发生在邻近纳米孔的第一侧。在包含收缩部104的实施方案中，报告体区124”可以邻近或甚至通过收缩部104能平移移动，例如响应事件或其它刺激。头部区121”取而代之可以锚定到邻近纳米孔100的第二侧102布置的另一成员(未显示)。
本发明的伸长体的长度可以适当地改变，使得本尾部区可以相对于纳米孔100布置在任何合适的位置。例如，图1G显示了包含纳米孔100和具有头部区131，尾部区132和伸长体133的替代系链130的替代组合物。头部区131锚定在纳米孔100的第一侧101。尾部区132向纳米孔100的第二侧102自由延伸，并且伸长体133足够长，使得尾部区132可以布置得超过纳米孔100的第二侧102，例如超过第二侧102的外表面106。可选地，伸长体133还包含报告物区134。取而代之，头部区131可以锚定到纳米孔100的第二侧102，或者邻近纳米孔100的第一侧101或第二侧102。
此外，本尾部区不需要一定自由延伸，而是取而代之可以附着到任何合适的成员。例如，图1H显示了包含纳米孔100和具有头部区131’，尾部区132’和伸长体133’的替代系链130’的替代组合物。头部区131’锚定到纳米孔100的第一侧101，尽管头部区131’可以替代地锚定在纳米孔100的第一侧101附近。尾部区132’延伸通过纳米孔100的孔径103，并且锚定在纳米孔100的第二侧102，例如，锚定到第二侧102的外表面106，尽管尾部区132’可以替代地锚定在纳米孔100的第二侧102附近。伸长体133’足够长，以允许头部区131’附着到纳米孔100的第一侧101或纳米孔100的第一侧101附近，以及将尾部区132’附着到纳米孔100的第二侧102或纳米孔100的第二侧102附近。任选地，伸长体133还包含报告物区134’。或者，头部区131’可附着到纳米孔100的第二侧102或纳米孔100的第二侧102附近，并且尾部区132’可附着到纳米孔100的第一侧101或纳米孔100的第一侧101附近。
作为另一实例，图1I显示了包含纳米孔100和具有头部区131”，尾部区132”和伸长体133”的替代系链130”的替代组合物。头部区131”锚定到纳米孔100的第一侧101，尽管头部区131”可以替代地锚定在纳米孔100的第一侧101附近。尾部区132”延伸通过纳米孔100的孔径103，并且邻近或超出纳米孔100的第二侧102附着，例如锚定到邻近或超出第二侧102的外表面106布置的另一成员150”。或者，成员150”’可以完全或部分地布置在孔径103内。伸长体133”足够长，以允许将头部区131”附着到纳米孔100的第一侧101或附近，并且附着尾部区132”到成员150”’，例如邻近或超出纳米孔100的第二侧102，或在孔径103内。可选地，伸长体133还包含报告物区134”。或者，头部区131”可附着到纳米孔100的第二侧102或附近，并且尾部区132”可邻近或超出纳米孔100的第一侧101附着，例如可锚定到另一成员(未显示)，其布置成邻近或超过第一侧101的外表面105。
应当理解，任何合适类型的纳米孔和任何合适类型的永久性系链可以用于图1A-1I所示的实施方案中。例如，如上进一步所述，纳米孔可以包含生物孔，固态孔或生物和固态杂合孔。图1J显示了示例性组合物，其包含固态纳米孔100’和具有头部区141，尾部区142和伸长体143的的系链140。纳米孔100’包含第一侧101’和第二侧102’，其可以包含任何合适的固态材料或固态材料的组合。第一侧101’可以由包含一种或多种固态材料的层107’限定，并且布置在第二侧102’上，其可以包含一种或多种固态材料。适用于第一侧101’或第二侧102’或两者的示例性固态材料包含硅(Si)，氮化硅(SiN或SiNx)，石墨烯和氧化硅(SiO2或SiOx)。在所示实施方案中，孔径103’可以经由第二侧102’限定，并且收缩部104’可以经由层107’限定。然而，应当理解，层107’和第二侧102’可以具有任何合适的构造，以限定孔径和收缩区。头部区141锚定到纳米孔100’的第一侧101’的外表面105’，尽管头部区141可替代地锚定在纳米孔100’的第一侧101’附近，或者可锚定到纳米孔101’的第二侧102’或附近。在图1J所示的实施方案中，尾部区142向纳米孔100’的第二侧102’自由延伸，并且伸长体143足够长，使得尾部区142可以布置在纳米孔100’的第二侧102’上。或者，尾部区142可以向纳米孔100’的第一侧101’或第二侧102’自由地延伸或者可以附着到纳米孔100’的第一侧101’或第二侧102’，纳米孔100’的第一侧101’或第二侧102’附近或超出纳米孔100’的第一侧101’或第二侧102’。任选地，伸长体143还包含报告物区144。关于固态纳米孔的更多细节，参见以下参考文献，每篇的全部内容通过引用并入本文：Dekker，“Solid-statenanopores，”Nature Nanotechnology 2:209-215(2007)；Schneider等人，“DNATranslocation through Graphene Nanopores”，Nano Letters 10:3163-3167(2010)；Merchant等人Nano Letters 10：2915-2921(2010)；和Garaj等人，“Graphene as asubnanometre trans-electrode membrane，”Nature 467:190-193(2010)。
作为另一个实例，图1K显示了包含生物或生物和固态杂合纳米孔100”和具有头部区141’，尾部区142’和伸长体143’的系链140’的示例性组合物。纳米孔100”包含屏障107”和布置在屏障107”内的生物孔108”。生物孔108”包含通过其限定的孔径103”和一个或多个收缩部104”。生物孔包含例如多肽孔和多核苷酸孔。屏障107”可以包含生物来源的膜或固态膜。生物来源的膜包含脂质双层。固态膜包含硅和石墨烯。系链140’的头部区141’锚定到纳米孔100”的第一侧101”或附近。例如，在图1K所示的实施方案中，头部区141’锚定到纳米孔100”的第一侧101”上的生物孔108”，例如共价键合到第一侧101”上的生物孔108”上的部分。头部区141’可以替代地锚定在纳米孔100”的第一侧101”附近，例如，可锚定到在第一侧101”上生物孔108”附近的成员，或者可锚定到纳米孔100”的第二侧102”或附近。尾部区142’向纳米孔100”的第二侧102”自由延伸，并且伸长体143’足够长，使得尾部区142’可以布置在纳米孔100”的第二侧102”上或超出纳米孔100”的第二侧102”，例如超过屏障107”的外表面106”。或者，尾部区142’可向纳米孔100”的第一侧101”或第二侧102”的任一侧自由地延伸，或可以邻近或超出纳米孔100”的第一侧101”或第二侧102”附着。可选地，伸长体143’还包含报告物区144’。关于示例性杂合纳米孔及其制备的更多细节，参见以下参考文献，其各自的全部内容通过引用并入本文：Hall等人，“Hybrid pore formation bydirected insertion of alpha hemolysin into solid-state nanopore”，NatureNanotechnology 5:874-877(2010)和Cabello-Aguilar等人，“Slow translocation ofpolynucleotides and their discrimination byα-hemolysin inside a single track-etched nanopore designed by atomic layer deposition,”Nanoscale 5:9582-9586(2013)。
注意，在本文中描述的任何实施方案中，纳米孔不需要一定包含任选的收缩部。例如，图1L显示了示例性组合物，其包含替代纳米孔100”’和具有头部区141”，尾部区142”和伸长体143”的系链140”。纳米孔100”’包含可以包含任何合适的固态材料或固态材料的组合的第一侧101”’和第二侧102”’。第一侧101”’和第二侧102”’可以由包含一种或多种固态材料的层107”’限定。适用于层107”’中的示例性固态材料包含硅(Si)，氮化硅(SiN或SiNx)，石墨烯，氧化硅(SiO2或SiOx)或其组合。在例示的实施方案中，孔径103”’可以通过第一和第二侧101”’，102”’限定，并且可以没有收缩区。系链140”的头部区141”锚定到纳米孔100”’的第一侧101”’的外表面105”’，但是头部区141”可替代地锚定到纳米孔100”’的第一侧101’”附近，或可锚定到纳米孔100’的第二侧102”’或附近。在图1L所示的实施方案中，尾部区142”向纳米孔100”’的第二侧102”’自由延伸，并且伸长体143”足够长，使得尾部区142”可布置在纳米孔100”’的第二侧102”’上。或者，尾部区142”可向纳米孔100”’的第一侧101”’或第二侧102”’的任一侧自由地延伸或邻近或超出纳米孔100”’的第一侧101”’或第二侧102”’的任一侧附着。
可选地，伸长体143”还包含报告物区144”。报告物区144”可以便于测量伸长体143”的平移，旋转或构象移动。在一个示例性实施方案中，孔径103”的尺寸D1适当地选择成便于使用报告体区来测量伸长体143”的移动。例如，孔径103”可以足够窄，以便响应报告物区144”的移动可测量地与报告物区144”相互作用。作为一个实例，报告物区144”具有电或通量阻断特征，并且孔径103”具有选定的宽度，使得在纳米孔100”’间施加的电压下报告物区144”的移动引起通过孔径103”的电流或通量的可检测变化。例如，与较小的T相比，较大的核苷酸(如A和G)当它们布置在孔径中时可导致更多的阻断，例如布置在MspA的收缩部中。阻断电流或通量的示例性范围(以开孔电流或通量的％计)包含0至10％，10％至20％，20％至30％，30％至40％，40％至50％，60％至70％，70％至80％，80％至90％和90％至100％。在一个示例性实施方案中，对于MspA，在300mM KCL中在180mV偏压和110pA的开孔电流的情况下，该范围在20％至70％之间。
在另一个实例中，图1M显示了包含纳米孔100和具有头部区171，尾部区172和伸长体173的替代系链170的替代组合物。头部区171锚定在纳米孔100的第一侧101附近，例如锚定到另一个成员180，其任选地可以具有，但不需要一定具有相对于纳米孔100的基本上固定的位置。尾部区172延伸通过纳米孔100的孔径103，并且邻近或超出纳米孔100的第二侧102附着，例如锚定到另一个成员180’，其布置在孔径103内或邻近或超出第二侧102的外表面布置。伸长体173足够长，以允许头部区171附着到成员180，并且尾部区172附着到成员180’。可选地，成员180足够大，以致不能物理上通过整个孔径103。此外/或者，成员180’足够大，以致不能物理通过孔径203的整体。因此，将尾部区171附着到成员180并且将尾部区172附着到成员180’可以将系链170保持在纳米孔100中，可以将成员180保持在纳米孔100的第一侧101上，并且可以将成员180’保持在纳米孔100的第二侧102上，即使成员180和180’没有分别附着到纳米孔100的第一侧101或第二侧102。因此，头部区171可以被认为邻近第一侧101锚定，而不管成员180是否附着到第一侧。在一个实例中，可以通过将头部区171附着到成员180，随后在第二侧102上布置尾部区172，然后将尾部区172附着到成员180’来制备图1M所示的组合物。在另一个实例中，可以通过将尾部区172附着到成员180’，随后在第一侧101上布置头部区171，然后将头部区171附着到成员180来制备图1M所示的组合物。可以使用任何合适的附着，包含本文中别处描述的附着。在一个非限制性的纯例示性实施方案中，第一成员180可以包含聚合酶，并且第二成员180’可以包含与尾部区172的核酸杂交的核酸。在一个实例中，此类组合物的示例性制备，以及此类组合物检测聚合酶对核苷酸的作用的示例性用途，在本文中参照图22A-22D更详细地描述。
另外，伸长体173任选地包含报告物区174，其有助于测量伸长体173的平移，旋转或构象移动，例如如图1M中通过虚线箭头表示。在某些实施方案中，响应第一事件，报告物区174可向纳米孔100的第一侧101移动，并且在第一事件后可向纳米孔100的第二侧102平移移动。响应第一事件后的第二事件，报告物区174也可以向纳米孔100的第一侧101偏移移动，并且在第二事件后再次可向纳米孔100的第二侧102平移移动。第一或第二事件或两者可发生在邻近纳米孔的第一侧。在包含收缩部104的实施方案中，报告物区174可以邻近收缩部104或甚至通过收缩部104能平移移动，例如响应事件或其它刺激。
另外，注意，在任何前述实例，以及未具体显示的其它组合物中，系链的伸长体任选地可以包含与分子相互作用的部分。此类相互作用可以例如引起报告物区的相对位置的变化，从而可测量地指示分子的存在，或者可以相对于纳米孔的收缩部在特定位置稳定分子。本文进一步提供了此类部分及其用途的一些非限制性实例。
此外，应当理解，系链的首基(head group)可以以任何数目的方式附着到纳米孔。例如，可以使用诸如上述Hermanson描述的公知的生物缀合物化学。在例示性实施方案中，纳米孔包含用于形成附着的化学部分，例如半胱氨酸，或肽接头，如SpyTag。关于spytag及其用于形成附着的用途的其它信息可以参见例如以下参考文献，其各自的全部内容通过引用并入本文：Zakeri等人，“Peptide tag forming a rapid covalent bond to aprotein,through engineering a bacterial adhesin,”Proc.Nat.Acad.Sci.USA 109:E690-E697(2012)，以及Fierer等人,“SpyLigase peptide-peptide ligationpolymerases affibodies to enhance magnetic cancer cell capture,”Proc.Nat.Acad.Sci.USA 111:E1176-E1181(2014)。
此外，应当理解，另一个成员(可以对该成员附着系链的首基)可以以多种方式附着到纳米孔或附近。例如，系链的首基可以附着到另一个成员，然后另一个成员可以加载到纳米孔上或纳米孔附近，然后可以使用合适的附着将另一个成员附着到纳米孔或附近。在一个非限制性的纯例示性实例中，系链的头基可以附着到聚合酶，然后聚合酶可以加载到纳米孔上或纳米孔附近，然后聚合酶可以使用合适的附着，如在系链和纳米孔之间的共价生物缀合物接头附着到纳米孔或纳米孔附近。以此类方式，系链可以附着到聚合酶，并且系链和聚合酶二者可以通过系链上的连接附着到纳米孔。此类接头的实例包含：NHS-酯，异氰酸酯和异硫氰酸酯与胺的缀合，马来酰亚胺与半胱氨酸的缀合，使用叠氮化物与炔的点击化学，使用融合标签例如Halotag，Spycatcher-Spytag和其它类似的蛋白质-蛋白质生物缀合方法。关于可以使用的示例性连接的更多信息，参见以下参考文献，其各自的全部内容通过引用并入本文：Hermanson，Bioconjugate Techniques，第2版，Elsevier，2008；Zakeri等人，“Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein，throughengineering a bacterial adhesin，”PNAS 109(12):E691-E697(2012)；和Liu等人，“Specific Enzyme Immobilization Approaches and Their Application withNanomaterials，”Topics in Catalysis 55(16-18):1146-1156(2012)。
示例性系统
现在将参照图2A-2C描述用于使用锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链来检测事件的示例性系统。图2A示意性显示了系统，其包含配置为测量纳米孔的孔径内的报告物区的移动或存在的测量电路(例如，电或光学测量电路)。系统220包含纳米孔200，永久性系链210和测量电路230。纳米孔200包含第一侧201，第二侧202，孔径203，并且任选地还包含收缩部204。永久性系链210包含头部区211，尾部区212和伸长体213。在如图2A所示的实施方案中，头部区211锚定到纳米孔200的第一侧201，尾部区212布置在纳米孔200的第二侧201上，并向纳米孔100的第二侧202自由延伸或附着到另一成员，并且伸长体213能移动通过纳米孔200的孔径203。然而，纳米孔200或系链210或两者可具有与图2A所示不同的构造，诸如本文中例示。例如，头部区211可以例如使用硫醚或酰胺连接锚定到纳米孔200或附近。在一个例示性的非限制性实例中，硫醚连接可通过系链211上的马来酰亚胺基团产生，所述基团与纳米孔200上或附近的半胱氨酸残基中的还原硫醇基团反应。将马来酰亚胺基团引入到系链211中可使用本领域熟知的方法容易地实现。示例性地，头部区211可以以与上文参考图1F和1M描述的方式相似的方式附着到布置在纳米孔200的第一侧201上或附近的另一成员(例如，聚合酶)，或尾部区212可以以与上文参照图1I和1M描述的方式类似的方式附着到布置在纳米孔200的第二侧202上(例如，在孔径203内)的另一成员(例如，核酸)，并且以与上文参考图1M描述的方式相似的方式，既可以将头部区211附着到布置在纳米孔200的第一侧201上或附近的另一成员(例如，聚合酶)又可以将尾部区212附着到布置在纳米孔200的第二侧202上(例如，在孔径203内)的另一成员(例如，核酸)。任选地，这些成员中的一个或两个可以足够大，以致不能完全通过纳米孔200的孔径203。
另外，伸长体213可以包含报告物区214，其有助于使用测量电路230测量伸长体213的平移，旋转或构象移动或存在(或其组合)。例如，报告物区214可以具有与伸长体213的一个或多个其它区域不同的物理，化学，电学，光学，生物或其它合适的通量阻断特性。在一些实施方案中，测量电路230可以配置为光学，电学，化学或生物检测相对于收缩部204的报告物214的移动，例如，如图2A中通过虚线箭头所示。例如，系统可以包含组合物和测量电路，其配置为在响应事件移动系链的报告物区时测量通过孔径的电流或通量或光学信号。在一个例示性实例中，纳米孔200和系链210可以浸入导电流体，例如盐水溶液中。测量电路230可以与第一电极231和第二电极232通信，并且可以配置为在第一电极231和第二电极232之间施加电压，以在纳米孔200间施加电压。可以使用直流(DC)或交流(AC)电压。在一些实施方案中，测量电路230还可以配置为使用第一电极231和第二电极232来测量通过孔径203的电流或通量的幅度。在一些实施方案中，测量电路230还可以包含光学，生物或化学传感器，其分别配置为光学，生物或化学方式感测通过孔径203的分子通量的幅度。示例性的光学传感器包含CCD和光电二极管。在一些实施方案中，测量电路230包含一种或多种通过孔径203的分子通量发生化学或生物反应的试剂，以便产生可光学检测的信号。
例如，报告物区214可以具有与伸长体213的一些或所有其它区不同的物理性质。例如，报告物区214与伸长体213的其它区域相比可以引起通过孔径203的差异阻断电流或通量。另外/或者，报告物区214可以具有与伸长体213的一些或所有其它区域不同的电或通量阻断特性。例如，报告物区214可以包含静电电荷，而伸长体213的一些或所有其它区域可以包含不同的静电电荷，或者可以是不带电的(例如，可以是电中性的)。或者，例如，报告物区214可以是不带电荷的，而伸长体213的一些或所有其它区域可以包含静电电荷。或者，例如，报告物区214可以具有物理性质。物理性质包含报告物区214的体积和形状。在一个例示性实例中，报告物区214在孔径203内的移动通过调节通过孔径或收缩部的阻断电流或通量而引起通过孔径或其中的任选的收缩部204的电流或通量的可测量的变化。或者，例如，报告物区214可以具有促进化学或生物检测的化学或生物学特征。化学或生物学性质包含化学或生物基团的存在，例如放射性基团或具有酶促活性的基团。
报告物区214的一个或多个电学，物理，化学，光学，生物或其它通量阻断特征可以提供通过孔径203或收缩部204的电流的可测量变化，通过孔径203或收缩部204的分子通量的可测量变化，或光学信号。在一个例示性示例中，孔径203内的报告体区214的移动或存在引起通过孔径203或收缩部204的电流的可测量的变化，或引起通过孔径203或收缩部204的分子通量的可测量的变化，所述通量变化可以电学，化学，生物或光学方式可检测。例如，报告物区214在孔径203或收缩部204内的存在或移动可以引起离子电流阻断或分子通量阻断，其可以光学，电学，化学或生物方式检测。示例性地，反侧的分子梯度可以参见可以被报告物区214部分阻断的自然分子流。测量电路230可以配置为使用发光(例如，荧光或化学发光)分子的流量，或在其它试剂存在下变为化学发光的试剂的通量以非电学(例如，光学)测量此类分子通量。例如，Ca2+可以从纳米孔的一侧流通到另一侧，在那里它遇到钙敏感染料，如Fluo-2，Fluo-4，Fluo-8等，以诱导荧光。可以使用的其它试剂对包含但不限于鲁米诺(luminol)和氧化剂，钙和水母发光蛋白(aequorin)，或ATP和萤光素酶，等等。关于通过孔径或收缩部的分子通量的光学检测的更多细节，参见Ivankin等人，“Label-Free OpticalDetection of Biomolecular Translocation Through Nanopore Arrays,”ACSNano 8(10):10774-10781(2014)，其全部内容通过引用并入本文。
示例性地，通过孔径203的电流或通量或光学信号的幅度可响应报告物区214在孔径203内的移动而可测量改变，并且对于电流或通量或光学信号的此类可测量变化的时间段是基于报告物区的位置变化的持续时间。在一个例示性非限制性实例中，伸长体213包含多核苷酸，其包含限定报告物区214的一个或多个无碱基核苷酸。
在一个例示性实施方案中，纳米孔200是使用硫醚连接与系链211附着的生物纳米孔。生物纳米孔的非限制性实例包含MspA和α溶血素。系链211的报告物区214可以包含一个或多个无碱基残基，其配置为位于生物纳米孔的一个或多个收缩部204内或附近。一个或多个适当定位的无碱基残基通过任一孔的收缩部的移动可导致容易可检测的信号，例如通过收缩部204的电流或通量或光学信号的可检测变化。生物纳米孔，如MspA和α溶血素有效地可以包含可以用于聚焦报告物区214的效应的收缩部。例如，MspA包含具有约1.2nm的直径和约0.5nm的长度的单个收缩部，可以提供合适的空间分辨率，因为通过收缩部的离子电流或通量阻断的幅度主要基于穿过纳米孔的狭窄区(收缩部)的伸长体区段。
图2B是在报告物区214随时间平移，旋转或构象移动，例如响应一个或多个事件或其它刺激而移动时图2A中所示的系统220可以产生的示例性信号(例如，光学或电学信号)的图。在时间t0时的信号的值(例如，幅度)可以对应于孔径203内的报告物区214的第一平移，旋转或构象位置。在时间t1，信号的值(例如，幅度)可以改变为第二值，对应于平移，旋转或构造移动到孔径203内的第二位置的报告物区214。t0和t1之间的时间持续对应于报告物区214在第一位置处花费的时间量。在时间t2，信号的值(例如，幅度)可以改变到第三值，对应于平移，旋转或构象移动到第三位置的报告物区214。t1和t2之间的时间持续对应于报告物区214在移动到第三位置之前在第二位置处花费的时间量。在时间t3，信号的值(例如，幅度)可以改变到第一值，对应于平移，旋转或者构象返回到第一位置的报告物区214。t2和t3之间的时间持续对应于报告物区214在返回到第一位置之前花费在第三位置的时间量。应当理解，图2B中所示的信号的特定值和时间段旨在纯粹是示例性的，而不以任何方式进行限制。
在一个例示性实施方案中，报告物区214包含静电电荷，并且由系统220产生的信号包含通过收缩部204的电流或通量或光学信号。然而，应当理解，测量电路230可以包含任何元件或元件组合或与任何元件或元件组合通信，所述元件或元件组合有助于测量任何合适的报告物区，并且不一定基于通过收缩部204的电流或通量或光学信号的测量，或甚至基于报告物区的移动。另外，报告物区214不需要一定附着到系链，而是可以附着到受到作用的核苷酸或其它分子。可以基于测量电路230的特定配置来选择报告物区的特定性质，以便于测量该报告物区。例如，报告物区可以具有光学性质，并且测量电路230可以包含光学传感器或者与光学传感器通信，所述光学传感器配置为测量光学性质并且基于报告物区的存在或者移动产生信号。在一个例示性实施方案中，报告物区可以包含与相应的第二FRET对配偶体(例如FRET受体或供体)相互作用的第一FRET对配偶体，例如FRET供体或受体，以发射测量电路230配置用于检测的特定波长的光。或者，例如，报告物区可以具有化学或生物特征，并且测量电路230可以包含化学或生物传感器或与之通信，所述化学或生物传感器配置为测量化学或生物特性，并且基于报告物区的存在或移动产生信号。作为另一个实例，报告物区可以提供分子通量阻断，其调节通过孔径或收缩部的分子通量，所述通量可以在光学，电学，化学或生物学上检测。
在一个示例性实施方案中，响应第一事件，报告物区214可以向纳米孔200的第一侧201可平移移动。第一事件可以基于由系统220生成的信号(例如，光学或电学信号)的测量幅度或时间持续或两者而单独地鉴定。例如，第一事件可以导致报告物区214平移移动到第一位置，并且在第一位置存在报告物区214使信号具有第一幅度。因此，具有第一幅度的信号与已经发生的第一事件相关。或者，例如，第一事件可以使报告物区平移移动到第一位置达第一时间段，并且报告物区214在第一位置的存在使信号具有第一时间持续。因此，具有第一时间持续的信号与已经发生的第一事件相关。在一个具体实例中，信号具有第一幅度和第一时间持续二者，其中每一个基于在第一位置存在报告物区214，因此增加已经发生构象变化的测定中的信号的置信度。报告物区214可以在第一事件后保持在第一位置。或者，报告物区214可以在第一事件后向纳米孔200的第二侧202可移动。例如，报告物区214可以在第一事件后返回到先前位置或不同位置。
另外，在一些实施方案中，报告物区214还可响应在第一事件后发生的第二事件而向纳米孔200的第一侧201可移动。第二事件可以基于由系统220生成的信号(例如，光学或电学信号)的测量幅度或时间持续或两者而单独地可鉴定。例如，第二事件可以导致报告物区214移动到第二位置，并且在第二位置存在报告物区214使信号具有第二幅度。因此，具有第二幅度的信号与已经发生的第二事件相关。或者，例如，第二事件可以使报告物区移动到第二位置达第二时间段，并且报告物区214在第二位置的存在使信号具有第二时间持续。因此，具有第二时间持续的信号与发生的第二事件相关。在一个具体实例中，信号具有第二幅度和第二时间持续二者，其中每一个基于在第二位置存在报告物区214，因此增加基于已经发生构象变化的信号的测定的置信度。报告物区214可以在第二事件后保持在第二位置。或者，报告物区214可在第二事件后向纳米孔200的第二侧202可移动。例如，报告物区214可以在第二事件后返回到原始位置或返回到不同位置。第一和第二事件可以基于由系统220生成的信号(例如，光学或电学信号)的相应测量幅度或时间持续或两者而彼此单独地可鉴定和可区分。
在一个非限制性实例中，可以测量构象移动。例如，众所周知，延伸的单链DNA(ssDNA)中的碱基之间的距离可以大于双链DNA(dsDNA)中的碱基之间的距离。例如，邻近生物MspA纳米孔的第一侧锚定并由于施加的电场而被拉伸的ssDNA系链可以具有每碱基约4.9埃的碱基间距离。另一方面，双链DNA(dsDNA)具有每碱基约3.32埃的间距。系链211可以包含任意的DNA序列并且可以永久地锚定到MspA纳米孔200，使得在由电场创建的施加的力下，包含一个或多个无碱基残基的报告物区214布置在主要的MspA收缩处。无碱基报告物残基214在侧翼可以有脱氧胸苷残基，其在MspA孔中具有与无碱基位点非常不同的阻断电流或通量。通过互补寡核苷酸与系链的杂交，可以在系链211的伸长体213中诱导构象变化。由于ssDNA和dsDNA之间的碱基间距差异，构象变化源自ssDNA到dsDNA的转化。构象变化发生在伸长体213内，这导致报告物214在收缩部204外向第一侧移动，以及脱氧胸苷残基移动进入收缩区。由于这些部分的不同的阻断电流或通量，发生电流或通量信号的变化，其可以容易地例如电学或光学地检测。关于MspA和ssDNA之间的相互作用的更多细节，参见Manrao等人，“Nucleotide Discrimination with DNA Immobilized in the MspA Nanopore，”PLosONE 6：e25723,7页，(2011)，其全部内容通过引用并入本文。
注意，报告物区214的位置和由系统220产生的所得信号不需要一定只响应事件的发生，而是可以响应任何合适的刺激。例如，测量电路230可以配置为在第一电极231和第二电极232之间施加电压，以便在纳米孔200间施加电压，这使得报告物区214向给定位置平移移动，例如向纳米孔200的第二侧202。在此类移动之前或期间的事件的发生可以限定报告物区214停止(即使瞬时)的位置，其可以限定系统220生成的信号(例如，光学或电学信号)。另外，注意，在诸如上面参考图1所描述的实施方案中，其中系链210的头部区211附着到第一成员，并且系链210的尾部区212附着到第二成员，这两个成员都不需要附着到纳米孔的第一或第二侧，在第一电极231和第二电极232之间施加电压可以引起系链210和第一和第二成员向第一电极231或向第二电极232的相应的净移动。可选地，第一和第二成员中的一个或两个足够大，从而不能完全通过纳米孔200的孔径203。例如，基于在第一电极231和第二电极232之间施加第一适当电压，系链210和附着到其上的第一和第二成员可以向第一电极231移动，该移动可以使第一成员(以与图1M所示的方式类似的方式附着到头部区211)暂时地停留在相对于孔径203的第一位置，例如邻近第一侧201上的孔径203布置，或者完全或部分地布置在第一侧201上的孔径203内，而不完全穿过孔径203，从而抑制系链210和第一和第二成员向第一电极231的进一步移动。或者，例如，基于在第一电极231和第二电极232之间施加第二适当电压，系链210和附着到其上的第一和第二成员可以向第二电极232移动，该移动可以使得第二成员(以与图1M所示的方式类似的方式附着到尾部区212)暂时地停留在相对于孔径203的第二位置，例如邻近第二侧202上的孔径203布置，或者完全或部分地布置在孔径203内，而不完全穿过孔径203，从而抑制系链210和第一和第二成员向第一电极232的进一步移动。因此，即使在第一电极231和第二电极232间施加交流电压，也可以相对于纳米孔200保持系链210和第一和第二成员。
在包含任选的收缩部204的实施方案中，基于报告物区214的相对宽度，伸长体213的长度和收缩部204的直径(例如，图1A中所示的尺寸D2)，在一些实施方案中，报告物区214可以例如响应事件或其它刺激而可移动到收缩部204邻近，进入收缩部204中或甚至通过收缩部204。例如，报告物区214可以布置在收缩部204内，然后响应事件或其它刺激而向第一侧201被拉出收缩部204。或者，例如，报告物区214可以布置在纳米孔200的第二侧202上，然后响应事件或其它刺激而被拉动通过收缩部204并到达纳米孔200的第一侧201上。
另外，注意，系统220适当地可以配置为使得基于除了在永久性系链210上外在成员上布置的报告物区产生信号(例如，光学或电学信号)。例如，系链210可以与报告物区附着的另一个分子相互作用。此类相互作用可以引起另一个分子的报告物区移动到位置，并且在该位置存在报告物区可以使由系统220产生的信号具有幅度，或时间持续，或者幅度和时间持续两者，其与已经发生的相互作用相关。例如，系链210和另一个分子之间的相互作用可以使附着到该分子的报告物区位于报告物区可被电路230检测的位置处。
还应当理解，可以提供纳米孔阵列，以便检测彼此平行发生的多个事件。例如，图2C示意性显示了系统260的平面图，所述系统260包含配置为测量纳米孔阵列的相应孔径内的相应报告物区的移动的测量电路240。多个系统250(可以类似于上面参考图2A-2B描述的系统220来配置)，可以彼此整体布置在公共基底中，或者可以单独地制备并彼此相邻布置。每个系统250可以包含纳米孔200，系链(未具体显示的系链)和可寻址电极241。测量电路240可以类似于测量电路230进行配置，可以经由合适的通信路径，例如导体(显示用于仅单个系统250的通信)与每个系统的每个可寻址电极241以及与共同的电极242为电通信。测量电路240可以配置为通过在所述纳米孔的可寻址电极241间和共同电极242间施加电压在每个纳米孔200间可选择性施加电压，并且可选择地测量通过该纳米孔的电流或通量或在所施加的电压下的光学信号。可以基于此类电流或通量或光学信号来检测事件，例如，诸如本文其它地方所描述的。类似的阵列可以容易地设想用于其它类型的检测系统，例如光，化学或生物检测系统。
在此类方法期间使用的示例性方法和示例性组合物
现在将描述用于检测事件的一些示例性方法，以及可以在这些方法期间使用的示例性组合物。在一个方面，方法包含提供纳米孔，纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一侧和第二侧的孔径；和提供包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链。头部区可以锚定到纳米孔的第一或第二侧或纳米孔的第一或第二侧附近，并且伸长体可以包含报告物区。该方法可以包含响应与纳米孔的第一侧相邻发生的第一事件，在孔径内移动报告物。在一些实施方案中，报告物区响应第一事件在孔径内能平移移动。另外或可替换地，响应第一事件，报告物区可以在孔径内旋转地移动。另外或可选地，响应第一事件，报告物区在孔径内构象移动。
例如，图3A显示了使用包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的组合物检测事件的例示性方法300。方法300包含提供包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一侧和第二侧的孔径的纳米孔(步骤301)。纳米孔可以具有任何合适的构型，例如，如上文参照图1A-1M描述。例如，图1A中所示的纳米孔100包含第一侧101，第二侧102和延伸穿过第一和第二侧的孔径103。或者，例如，图1J中所示的纳米孔100’包含第一侧101’，第二侧102’，由孔径103’和收缩部104’限定的孔径。或者，例如，图1K中所示的纳米孔100”包含第一侧101”，第二侧102”，和延伸通过第一和第二侧的孔径103”，例如由生物孔108”限定。或者，例如，图1L中所示的纳米孔100”’包含第一侧101”’，第二侧102”’和延伸穿过第一和第二侧的孔径103”’，例如通过层107”’限定。
步骤301也可以但不需要必需包括制备纳米孔。例如，步骤301可以包括限定屏障并且在屏障之上或之中布置纳米孔。制备纳米孔的方法是本领域已知的。例如，制备MspA纳米孔的例示性方法可以在Butler等人，“Single-molecule DNA detection with anengineered MspA protein nanopore，”Proc.Natl.Acad.Sci.105:20647-20652(2008)中找到，其全部内容通过引用并入本文。或者，例如，制备α溶血素纳米孔的例示性方法可以在Howorka等人，“Sequence-specific detection of individual DNA strands usingengineered nanopores”，Nature Biotechnology 19:636-639(2001)和Clarke等人，“Continuous base identification for single-molecule nanopore DNA sequencing”，Nature Nanotechnology 4:265-270(2009)中找到，两者的全部内容通过引用并入本文。
图3A中所示的方法300还包含提供包含头部区，尾部区和其间的伸长体的永久性系链，所述伸长体包含报告物区，所述头部区锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近(步骤302)。系链可以具有任何合适的构造，如上面参照图1A-1M所描述。例如，伸长体可以具有比限定纳米孔厚度的第一尺寸H1短的长度，例如，如图1A，1B和1J所示。或者，例如，伸长体可以具有比限定纳米孔厚度的第一尺寸H1长的长度，例如，如图1G和1K所示。或者，例如，在包含收缩部的实施方案中，伸长体可以具有比限定收缩深度的第二尺寸H2更短的长度，例如，如图1A所示。或者，例如，在包含收缩部的实施方案中，伸长体可以具有比限定收缩深度的第二尺寸H2更长的长度，例如，如图1B，1G，1J和1K所示。或者，例如，报告物区可以布置在沿着伸长体的位置，其被选择为使得基于当头部区锚定到纳米孔或纳米孔附近时完全或部分延伸的伸长体，报告物区可定位在纳米孔的孔径内，例如，邻近可选的收缩部或在可选的收缩部内，例如图1C，1J和1K所示。可以使用这些特征的任何合适的组合。
步骤302也可以，但不需要必需包含制备系链。例如，步骤302可以包含限定伸长体，其包含限定头部区，尾部区和一个或多个报告物区的其部分。例如，如本文别处描述，系链可包含DNA。可以使用本领域熟知的方法制备足够长度的DNA寡核苷酸。例如，具有5’或3’伯胺的寡核苷酸可以从诸如Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，Iowa)的供应商商购。寡核苷酸可以是有序的，以便包含一个或多个无碱基部分，其可以用作如本文的一个或多个报告物区。包含胺反应性基团(NHS)和硫醇反应基团(马来酰亚胺)的双官能接头，例如磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)可以容易地从商业来源获得，例如来自Thermo Fisher Scientific，Inc.(Rockford，Illinois)。此类接头可以在本领域熟知的适当反应条件下与寡核苷酸反应，形成稳定的酰胺键。在从未反应的磺基-SMCC纯化寡核苷酸后，修饰的寡核苷酸(其凭借其马来酰亚胺基团现在是硫醇反应性的)可以与纳米孔，例如蛋白质纳米孔反应。蛋白质纳米孔可以预先制备，以便包含至少一种其还原形式的硫醇(SH)基团的溶剂可及的半胱氨酸残基。还原形式可以通过与例如容易获得的市售化合物的5mM三(2-羧基乙基)膦(TCEP)一起温育而获得。修饰的寡核苷酸可以例如以摩尔过量与还原的蛋白质纳米孔在本领域熟知的反应条件下组合，使得马来酰亚胺形成稳定的硫醚键。可以从过量的未反应的寡核苷酸中纯化蛋白质-寡核苷酸缀合物。在另一个实例中，适合包含在基于聚乙二醇(PEG)的系链中的化合物，例如马来酰亚胺-PEG，可容易地从商业来源，如Laysan Bio，Inc.(Arab，Alabama)获得。例如，马来酰亚胺可以以与上述类似的方式与还原的半胱氨酸硫醇缀合。可以在PEG内限定合适的报告物区。在另一个实例中，寡核苷酸和α溶血素纳米孔之间的二硫键可以以如Howorka等人，“Kinetics of duplex formation for individual DNA strand within a singleprotein nanopore”，PNAS 98：12996-13301(2001)(其全部内容通过引用并入本文)描述的方式制备。
另外/或者，步骤302任选地可以包含将系链的头部区锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近。例如，系链的头部区可使用化学键(例如共价键，氢键，离子键，偶极-偶极键，伦敦分散体，或其任何合适的组合)附着到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近。或者，例如，可以使用头部区上的第一蛋白质结构和附着到或邻近于纳米孔的第一侧或第二侧的第二蛋白质结构之间的相互作用将系链的头部区附着到纳米孔的第一侧或第二侧。例如，第一和第二结构可以包含彼此互锁的α螺旋。系链的头部区附着到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近可以是永久的，使得系链的头部基团相对于纳米孔的第一侧或第二侧保持在大致固定的位置。例如，头部区可以锚定到纳米孔的第一侧，例如，如图1A，1J和1K所示。或者，例如，头部区可锚定到纳米孔的第二侧，例如，如图1D所示。或者，例如，头部区可以邻近纳米孔的第一侧锚定，例如锚定到成员，该成员在纳米孔的第一侧附近布置并且任选地附着到纳米孔的第一侧，例如图1E，1F和1M所示。注意，即使此类成员平移或构象邻近纳米孔移动，锚定在其上的系链仍然可以被认为是锚定在纳米孔附近。类似地，头部区可以邻近纳米孔的第二侧锚定，或者锚定到另一成员，该另一成员与纳米孔(未具体显示)的第二侧相邻布置并且任选地附着到纳米孔的第二侧。
在一个例示性实施方案中，半胱氨酸残基的还原硫醇(-SH)基团(也称为巯基)可以与具有巯基反应性基团的系链反应。这些基团的实例包含马来酰亚胺和碘乙酰胺。如在www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/molec ular-probes-the-handbook/thiol-reactive-probes/introduction-to-thiol-modificatio n-and-detection.html#head2中更详细描述的，包含碘乙酰胺，马来酰亚胺，苄基卤化物和溴甲基酮的伯硫醇反应试剂可以通过硫醇的S-烷基化反应，以产生稳定的硫醚产物；芳基化试剂如7-硝基苯-2,1,3-恶二唑(NBD)卤化物可以通过亲核试剂类似取代芳族卤化物与硫醇或胺反应；并且因为硫醇盐阴离子是比中性硫醇更好的亲核体，所以半胱氨酸在其pKa以上更具反应性。此外，如在www.piercenet.com/method/sulfhydryl-reactive-crosslinker-chemistry中更详细描述的，巯基反应性化学基团包含卤代乙酰基，马来酰亚胺，氮丙啶(aziridines)，丙烯酰基(acryloyls)，芳基化试剂，乙烯基砜，吡啶基二硫化物，TNB-硫醇(2-硝基-5-硫代苯甲酸)和二硫化物还原剂；此类基团可以通过烷基化(例如通过硫醚键的形成)或二硫化物交换(例如形成二硫键)与巯基缀合。也可以适当地使用巯基交换反应。或者，可以靶向胺(-NH2)。例如，赖氨酸残基的伯胺和多肽N-末端是相对反应性的。胺残基可以用可以形成稳定的酰胺键的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)或可以与伯胺反应形成脒键的亚氨酸酯交联剂进行靶向。存在许多其它胺反应性化合物。例如，如www.piercenet.c om/method/amine-reactive-crosslinker-chemistry描述，可与伯胺形成化学键的合成化学基团包含异硫氰酸酯，异氰酸酯，酰基叠氮化物，NHS酯，磺酰氯，醛，乙二醛，环氧化物，环氧乙烷，碳酸酯，芳基卤化物，亚氨酸酯，碳二亚胺，酸酐和氟苯基酯；此类基团可以与胺缀合，例如通过酰化或烷基化。在其它实施方案中，修饰的氨基酸残基可以用于引入新颖的功能性，如与点击化学一起使用的叠氮化物或炔。例如，如上描述的硫醇或胺反应性可以与允许添加叠氮化物或炔官能团以进一步用于点击化学反应的接头一起使用。
在图3A所示的实施方案中，方法300包含响应在纳米孔的第一侧附近发生的事件而在纳米孔的孔径内移动报告物区(步骤303)。此类移动可以是平移，旋转或构象的，或其任何合适的组合。例如，事件可以引起头部区向纳米孔的第一侧的平移移动，并且头部区的平移移动可以引起伸长体或其一部分和报告体区向纳米孔的第一侧的移动。或者，例如，事件可以引起伸长体的一部分向纳米孔的第一侧的平移移动，并且伸长体的一部分的平移移动可以引起报告体区向纳米孔的第一侧的平移移动。在一个示例性实施方案中，报告物区最初布置在纳米孔的收缩部中或邻近纳米孔的收缩部，事件使报告物区从收缩部向第一侧移动到第一位置。
任选地，方法300还包含在事件(未具体显示)后将报告物向纳米孔的第二侧移动。例如，在事件后，头部区可以向纳米孔的第二侧平移移动，并且头部区的移动可以引起伸长体或其一部分，和报告物区向纳米孔的第二侧的平移移动。或者，例如，在事件后，伸长体的一部分可以向纳米孔的第二侧平移移动，并且伸长体的该部分的移动可以引起报告物区向纳米孔的第二侧的平移移动。或者，例如，刺激(如施加的电压)可以引起报告物区向纳米孔的第二侧的平移移动。在一个例示性实施方案中，在事件后，报告物区从其响应第一事件已经移动到的第一位置向第二侧并向收缩区平移移动，并且可选地平移移动到收缩区附近或收缩区中。如上所述，报告物区可以响应不同事件在孔径内重复可移动，例如平移，旋转或构象可移动，从而便于检测每个此类事件。
应当理解，可以使用任何合适的步骤组合来进行步骤302，或者可以制备本文提供的任何其它组合物。例如，图3B显示根据本发明的一些实施方案的用于制备包含系链和邻近纳米孔的聚合酶的组合物的方法。方法310包含将系链的头部区附着到纳米孔的第一侧或第二侧中的一个或附着到第一成员(311)。例如，方法310可以包含以与上面参照图1A-1C，1D或1G-1L描述的方式类似的方式将系链的头部区直接附着到纳米孔的第一侧或第二侧，使用本文提供的或本领域已知的任何合适的附着进行。或者，例如，方法310可以包含以与图1E，1F或1M所示的方式类似的方法将系链的头部区直接附着到第一成员，使用本文提供的或本领域另外已知的任何合适的附着进行。
在系链的头部区附着到第一成员的实施方案中，图3B中显示的方法310任选地可以包含将第一成员附着到纳米孔(312)的第一侧或第二侧之一。例如，具有附着到其上的系链的头部区的第一成员，如上面参考图1E，1F或1M描述，可以附着到纳米孔的第一侧或第二侧。或者，具有附着到其上的系链的头部区的第一成员，诸如上面参考图1E，1F或1M描述，可以邻近纳米孔的第一侧或第二侧布置，而不将第一成员附着到其上。
图3B中例示的方法310还可以包含将系链的伸长体布置在纳米孔(313)的孔径内。基于伸长体的长度，伸长体可以但不必需地一直延伸穿过纳米孔的孔径。例如，在诸如上面参考图1A和1E所描述的实施方案中，系链的伸长体可任选地足够短，以使系链的尾部区保持在纳米孔的收缩部(如果存在的话)的同一侧上，系链的头部区亦然。或者，例如，在诸如上面参照图1B-1D，1F，1J或1L描述的实施方案中，系链的伸长体可任选地足够长，使得系链的尾部区保持布置在纳米孔的孔径内，并且任选地足够长，使得系链的尾部区布置在纳米孔的收缩部(如果存在的话)的另一侧上，系链的头部区亦然。或者，例如，在诸如上面参照图1G-1I，1K或1M描述的实施方案中，系链的伸长体可选地可以足够长，使得系链的尾部区可以布置成超过纳米孔的另一侧，系链的头部区亦然。
示例性地，通过向系链的伸长体施加合适的定向力，可以将系链的伸长体布置在纳米孔的孔径内。例如，可以以如本文参考图2A-2C的方式在纳米孔间施加电压，并且系链的伸长体可以包含至少一个带电部分，其基于电压将系链的尾部区吸引到相反的纳米孔侧，对该侧附着系链的头部区或在该侧处将系链的头部区附着到第一成员，并且引起尾部区的移位，以便将系链的伸长体的全部或一部分布置在纳米孔的孔径内。注意，在将系链的头部区附着到第一成员的实施方案中，此类定向力还可以使第一成员以诸如本文中参照图1M描述的方式在纳米孔的孔径附近，或者完全或部分布置在纳米孔的孔径内。例如，尾部区吸引到将系链的头部区附着到第一成员的相反的纳米孔侧还可引起第一成员移位到邻近纳米孔的孔径或完全或部分布置在纳米孔的孔径内。
图3B中所示的方法310任选地还可以包含将系链的尾部区附着到纳米孔的第一侧或第二侧中的另一个或第二成员(314)。可以适当地使用如本文提供的或本领域另外已知的任何合适的附着。例如，方法310任选地可以包含将系链的尾部区附着到与头部区侧相反的纳米孔侧，例如上文参考图1H描述。或者，例如，方法310任选地可以包含将系链的尾部区附着到布置在与头部区侧相反的纳米孔侧上的第二成员，例如上文参考图1I或1M描述。第二成员任选地可以布置在纳米孔的孔径内。或者，不需要执行步骤314，并且方法310可以包含允许系链的尾部区以如上文参考图1A-1F，1J或1L的方式在纳米孔的孔径内自由延伸，或超过纳米孔的孔径，以上文参考图1G或1K描述的方式。
在一些条件下，将定向力施加到系链的伸长体可以引起尾部区的移位，以便将所有系链布置在纳米孔的孔径内。足够大的力可以使附着到系链上的聚合酶(或其它蛋白质)暂时滞留在纳米孔中或纳米孔上。虽然不意图对于物理构造的限制，但是结果可以称为蛋白质对纳米孔的“栓塞(corking)”。可以通过限制系链上的力(例如，在纳米孔间施加小于180mV)，限制施加在系统上的力的时间持续，或使用足够得足以避免栓塞的蛋白质来抑制或避免栓塞。或者/另外，可以向系统施加反向电压以逆转蛋白质和纳米孔之间的相互作用(称为“拔塞(uncorking)”)。抑制或避免栓塞或促进拔塞的另一选择是从纳米孔开口除去带电荷的氨基酸或在蛋白质表面上的互补电荷，以便降低两种组分之间的电荷亲和力。可以进一步有利的是向蛋白质的结构添加交联(例如，用于二硫化物交联的工程化半胱氨酸对或化学交联剂)，以稳定蛋白质的球状结构。
可以基于与由纳米孔系统的其它构造产生的样式不同的特征电流或通量或光学样式来观察栓塞。例如，当对纳米孔系统施加负偏压(negative bias)时，可以观察到不同的样式。因此，可以在装配或使用包含蛋白质的系统的过程中检测电流或通量或光学样式，所述蛋白质通过附着到蛋白质并布置在纳米孔腔中的系链定位于纳米孔。对样式的检测可以用于监测装配(例如，以避免栓塞)，引导拔塞，或以其它方式优化期望的装配。
应当理解，本发明的组合物，系统和方法可以适当地用于检测许多类型的事件。例如，本组合物，系统和方法适当地可用于检测分子或该分子的一部分的移动。在一个例示性实施方案中，移动包含分子的构象变化。在另一个例示性实施方案中，移动包含分子与另一分子的相互作用，如结合另一分子的第一分子，例如结合核苷酸的蛋白质或添加到多核苷酸的核苷酸。可以涵盖其它事件。
用于检测分子构象变化的示例性方法和组合物
图4A显示了使用包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的组合物来检测分子的构象变化的示例性方法400。应当理解，方法400可以适合于检测许多类型的分子(如蛋白质和核酸)的构象变化。
图4A中所示的方法400包含提供包含纳米孔，永久性系链和与纳米孔相邻布置的分子的组合物(步骤401)。组合物可包含纳米孔，所述纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一侧和第二侧的孔径；和包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链。头部区可锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近。响应在邻近纳米孔的第一侧发生的第一事件，包含报告物区的伸长体可在孔径内移动。例如，图5A-5B示意性显示了包含系链的组合物，所述系链锚定在纳米孔附近并且配置用于检测邻近纳米孔布置的分子的构象变化。在图5A所示的示例性实施方案中，该组合物可以包含纳米孔500，永久性系链510和分子550。纳米孔500包含第一侧501，第二侧502，孔径503，并且任选地还包含收缩部504。永久性系链510包含头部区511，尾部区512，和布置在它们之间并包含报告物区514的伸长体513(任选地，可以提供一个或多个另外的报告物区，例如上面参考图1C描述的)。
分子550可以邻近纳米孔500的第一侧501布置。例如，分子550可以与纳米孔500的第一侧501接触，并且任选地可以经由任何合适的化学键，蛋白质-蛋白质相互作用或通常不可逆的任何其它合适的附着锚定到纳米孔500的第一侧或纳米孔500的第一侧附近。在一个例示性实施方案中，分子550包含蛋白质。适用于图4A所示方法400的蛋白质的一个实例是酶。适用于图4A所示方法400的酶的一个实例是聚合酶。可以适当地使用其它类型的分子，蛋白质或酶。在图5A所示的实施方案中，系链510的头部区511通过任何合适的化学键，蛋白质-蛋白质相互作用或任何其它永久性的合适附着而附着至，例如锚定到分子550。头部区511可以附着到分子550的任何合适部分，其经历可以引起报告物区514相对于收缩部504的移动的构象变化。注意，分子550不需要一定被认为是本发明组合物的一部分，而是可被认为与包含纳米孔500和永久性系链510的组合物接触。另外，注意分子550可以但不需要必须附着到纳米孔500或与纳米孔500相邻。另外，注意尾部区512任选地可以以例如上文参考图1I和1M描述的方式附着到第二分子(未具体显示)。
再次参考图4A，方法400包含改变分子的构象(步骤402)。例如，图5B示意性显示了分子550的构象变化，其导致分子550的一个或多个区相对于分子550的一个或多个其它区的移动。在分子550是聚合酶的一个例示性实施方案中，聚合酶的构象变化响应聚合酶结合核苷酸。或者，聚合酶的构象变化可响应聚合酶向多核苷酸添加核苷酸。在其它替代性实施方案中，聚合酶的构象变化可响应聚合酶与核酸模板的结合，释放核酸模板，释放核苷酸而不掺入它，或切除核苷酸或其组合。
再次参考图4A，方法400还包含响应分子的构象变化平移移动系链的头部区(步骤403)。例如，图5B示意性显示了移动头部区511的分子550的构象变化。该区的此类移动可以但不需要必需远离纳米孔500。例如，在图5B所示的实施方案中，头部区511既相对于孔径503横向移动又远离纳米孔500的第一侧501。
再次参考图4A，方法400还包含响应头部区的移动在纳米孔孔径内平移移动报告物区(步骤404)。例如，图5B示意性显示了平移移动头部区511的分子550的构象变化，并且头部区511的移动使得报告物区514向第一侧501平移移动，如虚线箭头所示。例如，报告物区514可以在构象变化之前邻近任选的收缩部504或布置在任选的收缩部504内，如图5A中所示，并且可以响应构象变化而向第一侧501远离可选的收缩部504移动。或者，分子550的构象变化可以以此类方式移动头部区511，使得报告物区514向第二侧502平移移动，或在孔径503内经历任何其它合适的平移，旋转或构象移动或其组合。
返回参考图4A，方法400还包含检测报告物区的移动(步骤405)。例如，组合物可以与测量电路可操作通信，如上面参考图2A或图2C描述。测量电路可以配置为检测孔径内的报告物区的移动。在一个例示性实施方案中，纳米孔500，系链510和分子550可浸入导电流体，例如盐水溶液中。类似于图2A所示的测量电路230配置的测量电路，或图2C中所示的测量电路240可以与第一和第二电极通信，并且可以配置为在那些电极之间施加电压，以便在纳米孔500间施加电压。测量电路还可以配置为使用电极来测量通过孔径503的电流或通量的幅度或可以包含用于测量光学信号的光学传感器。报告物区514可以具有与伸长体513的一些或所有其它区不同的电流或通量阻断特征，例如不同的物理，化学，生物，光学或电性质。例如，报告物区514可以包含静电电荷，而伸长体513的一些或所有其它区可以包含不同的静电电荷，或者可以是不带电的(例如，可以是电中性的)。或者，例如，报告物区可以是不带电的，而伸长体513的一些或所有其它区可以包含静电电荷。响应报告物区214相对于收缩部204的位置的变化，通过孔径503的电流或通量或光学信号的幅度可以可测量地改变，并且电流或通量或光学信号中的此类可测量的变化的时间段是基于报告物区的位置变化的持续时间。在一个例示性非限制性实例中，伸长体513包含多核苷酸，其包含限定报告物区514的一个或多个无碱基核苷酸。
分子550的构象变化可以基于由此类系统产生的信号的测量(例如，光学或电测量)幅度或时间持续或两者而单独地鉴定。例如，构象变化可以使报告物区514移动到第一位置，并且报告物区514在第一位置的存在使得信号(例如，光学或电学信号)具有第一幅度。因此，具有第一幅度的信号与已经发生的构象变化相关。或者，例如，构象变化可以导致报告物区514移动到第一位置达第一时间段，并且报告物区514在第一位置的存在使得信号具有第一时间持续。因此，具有第一时间持续的信号与已经发生的构象变化相关。在一个具体实例中，信号具有第一幅度和第一时间持续二者，其中每一个基于在第一位置存在报告物区514，从而增加基于已经发生构象变化的信号的测定的置信度。
如图4A所示，方法400还可以包含返回到分子的先前构象(步骤406)。方法400还可以包含响应分子返回到先前构象而平移移动系链的头部区(步骤407)。方法400还可以包含响应头部区的移动而在纳米孔孔内平移移动系链的报告物区(步骤408)。例如，在图5B中所示的构象变化后，分子550可以返回到分子的先前构象，例如，如图5A所示。此类返回可以以此类方式移动头部区511，使得报告物区514可以向第二侧502平移移动，例如移动到与收缩部分504相邻或位于收缩部分504内的位置。或者，不同于以返回到先前的构象，分子取而代之可以改变为不同于先前构象的不同构象。方法400还可以包含检测报告物区的移动(步骤409)。此类检测可以类似于上面参考步骤406所描述的那样执行。
应当理解，图4A中所示的方法400可适于检测除构象变化以外的事件，例如以检测平移分子移动，或不同类型的分子移动的组合。另外，应当理解的是，图4A中所示的方法400适当地可适于使用系链的报告物区的平移，旋转或构象变化的任何合适组合来检测此类事件。
使用基于检测聚合酶的构象变化的示例性方法和组合物的合成测序
应当理解的是，图4A中所示的方法400可以适当地用于检测多种构象变化中的任何一种。在下面参照图6A-6D描述的一个非限制性例示性实施方案中，方法400可用于检测与作用于核苷酸的聚合酶相关的聚合酶的构象变化。此类构象变化的检测可用于通过合成与第一核苷酸互补的第二多核苷酸来对第一多核苷酸进行测序，例如使用“合成测序”或SBS。
已经开发了SBS的先前已知的方法。例如，单链DNA(ssDNA)可以响应纳米孔间施加的电势而穿过生物纳米孔，如蛋白质纳米孔，其嵌入在屏障，如脂质双层中。在可以称为“链”测序的事情中，当ssDNA的核苷酸通过孔收缩部时，那些核苷酸的组合可以创建对应于通过收缩部的特定组合中的核苷酸的身份的独特的电流或通量阻断。正在测序的这些链不是永久地附着到孔或聚合酶。相反，这些链移位通过孔，使得链的净位置相对于孔变化。然而，ssDNA的极快速移位速率(约1nt/μsec)以及包含核苷酸组合而不是单核苷酸的收缩部的天然解析可阻碍逐个核苷酸的此类电流或通量阻断的精确测量。酶“发动机(motor)”已经用于将易位速度减慢到与数据采集(每个核苷酸的毫秒数)更相容的速率。然而，当用于链测序构造时，此类发动机可以引入错误模式，如跳跃，滑动和切换，其可以抑制ssDNA中核苷酸的可靠检测。在链测序期间可发生的这些和其它不依赖于发动机的错误模式可以源于位于发动机和纳米孔的收缩部之间的ssDNA的“弹性”或弹力。此类弹性可以是ssDNA的序列的函数，并且如果该组合的不同实例分别被不同的ssDNA序列包围，则可以导致经过收缩部的相同核苷酸组合的不同电流或通量。此外，因为收缩部可以相对小，例如约2nt，并且布朗移动总是存在，孔“读出头”的大小可以有效地为约4个核苷酸，例如，收缩部一次读出约4个核苷酸的组合，因此使得更难以唯一地鉴定每个核苷酸，因为存在需要彼此区分的4^4(256)个电流或通量。
因此，仍然需要改进SBS，例如用于SBS的便宜，精确，长读段，高通量的组合物，系统和方法。使用生物纳米孔的SBS代表此类需要的一种潜在解决方案，因为这些蛋白质的纳米级再现性和易于生产。综合起来，不含发动机的方法(例如使用核酸酶作为检测器，其偶联到纳米孔，而不是作为调节靶链通过纳米孔的发动机)，更耐受布朗移动，并且具有单核苷酸解析，可望大大推进纳米孔DNA测序领域。
如上所述，本发明的方法，组合物和系统可用于检测分子中的构象变化。因此，本发明的方法，组合物和系统可以应用于监测DNA聚合酶在从模板合成DNA时经历的构象变化。例如，聚合酶可以在称为“开放状态”(其中聚合酶不结合核苷酸)与“封闭状态”(其中聚合酶结合核苷酸)之间转换。参见例如Xia等人，“Alteration in the cavity sizeadjacent to the active site of RB69DNA polymerase changes changes itsconstructational dynamics”，Nucl.Acids Res.(2013)，nar.gkt674，其全部内容通过引用并入本文。还参见Santoso等人，“Conformational transitions in DNA polymerase Irevealed by single-molecule FRET，”Proc.Natl.Acad.Sci.Natl.Acad.Sci.U S A，107(2)：715-720(2010)，其全部内容通过引用并入本文。
已知当聚合物从开放状态转变为闭合状态时，或者当聚合酶转换为编辑模式时，在核苷酸掺入的催化循环期间发生几纳米量级的构象变化。例如，图6A-6B示意性显示两种不同聚合酶中相对大的聚合酶构象变化(>1nm)。图。图6A显示了RB69聚合酶，其显示相对较大的构象变化，其导致拇指结构域和指结构域之间的相对移动，在开放和闭合构象之间经历超过3nm的移动，如Xia等人所述。图6B显示了Pol I(Klenow片段或KF)，其在核苷酸掺入期间经历构象变化，如Santoso等人公开。聚合酶的α-碳主链以米色显示。DNA模板链为深灰色，引物链为浅灰色。活性位点处的末端碱基对是品红色。根据Santoso，两个侧链的β碳用作荧光团附着位点，显示为绿色和红色球，以测量聚合酶的构象变化。箭头表示在开放和关闭构象中绿色和红色Cβ位置之间的距离(以埃计)。还有证据表明，聚合酶的构象变化可以取决于所掺入的核苷酸的身份，例如，如Olsen等人，“Electronic Measurements ofSingle-Molecule Processing by DNA Polymerase I(Klenow Fragment)”，JACS135:7855-7860(2013)，其全部内容通过引用并入本文。在本公开的纳米孔实施方案中，当系链附着到拇指结构域时，可以将指结构域锚定到纳米孔。或者，拇指结构域可锚定到纳米孔，同时系链附着到手指结构域。在任一构建体中，在聚合酶活性期间发生在手指和拇指结构域之间的相对移动可以被检测为系链和纳米孔之间的相对移动。用于附着本文引用的参考文献中的光学探针(例如，FRET对)的附着化学物质可用于本文阐述的纳米孔实施方案中。可以在聚合酶-纳米孔构建体中使用其它附着点，只要聚合酶中的构象变化可靠地作为系链和纳米孔之间的相对移动传递。
使用本发明的组合物，纳米孔和永久性系链可用于将SBS期间聚合酶的构象变化转化为电流或通量特征。注意，使用本发明的组合物，系统和方法，根据本发明方法在SBS期间测序的DNA不需要穿过纳米孔，并且可以逐个核苷酸进行测序，从而将该方法与链测序方法区分开，如上文所提及且例如在Jeyasinghe等人的美国专利公开第2014/0051096号中更详细地描述，其全部内容以引用的方式并入本文中。
更具体地，图6C-6D示意性显示了包含永久性系链的示例性组合物，所述永久性系链锚定到邻近纳米孔布置的聚合物，并且配置用于检测响应核苷酸的结合的聚合酶的构象变化。纳米孔包含生物孔605，其可以布置在屏障(未具体显示)中，例如生物来源的膜，如脂质双层或固态膜。生物孔605包含孔径603和收缩部604。永久性系链包含头部区611，尾部区612，伸长体613和报告物区614。任选地，尾部区612可以以类似的方式附着到第二成员(未具体显示)，如参考图1F和1M描述。聚合酶650邻近生物孔605布置，并且任选地可以附着到生物孔605。
聚合酶650配置为接收模板多核苷酸，例如待测序的环状或线性ssDNA，以通过按照ssDNA的序列序贯接收，结合和添加核苷酸至多核苷酸来合成具有与ssDNA序列互补的序列的多核苷酸。永久性系链的头部区611锚定到聚合酶650的位置，其经历构象变化，例如响应接收核苷酸，结合核苷酸或向多核苷酸660添加核苷酸，并且将报告物区614移动到相对于收缩部604的足够不同位置，以便产生信号，从所述信号中可以单独确定该多核苷酸的身份。例如，头部区611可以附着到聚合酶的指区或聚合酶的拇指。在美国专利公开号2011/0312529A1中阐述了聚合酶的手指和拇指区中的示例性附着点和用于将部分附着到这些点的化学物质，其全部内容通过引用并入本文。关于家族A和B聚合酶的结构和功能的更多细节，参见Patel等人，“Getting a grip on how DNA polymeraseases function”，NatureStructural Biology 8：656-659(2001)，其全部内容是通过引用并入本文。关于聚合酶如Pol I的结构和功能的进一步细节，参见以下参考文献，其各自的全部内容通过引用并入本文：Olsen等人，“Electronic measurements of Single-Molecule Processing by DNAPolymerase I(Klenow Fragment，”JACS 135：7855-7860(2013)；Torella等人，“Identifying molecular dynamics in single-molecule FRET experiments withburst variance analysis”，Biophysics J.100：1568-1577(2011)；Santoso等人等人，“Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-moleculeFRET，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，107(2)：715-720(2010)，Markiewicz等人，“Single-molecule microscopy Single-molecule microscopy reveals new insights intonucleotide selection by DNA polymerase I”，Nucleic Acids Res.40：7975-7984(2012)；Gill等人，“DNA Polymerase activity at the single-molecule level”，Biochem.Soc.Trans.39：595-599(2011)和Johnson等人，“Processive DNA synthesisobserved in a polymerase crystal suggested a mechanism for the prevention offrameshift mutations，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：3895-3900(2003)。从上述参考文献(或本文引用的其它参考文献)中已知的在聚合酶活性期间经历相对位置变化的任何两个残基或结构域可以分别充当本发明的实施方案中的纳米孔和系链的附着点。
在一个实例中，可以例如使用测量电路230和电极231，232(如上面参照图2A进一步描述)，或测量电路240和电极241，242(如上面参照图2C进一步描述)在纳米孔605间施加电压。报告物区614或伸长体613包含静电电荷，其响应所施加的电压而引起伸长体613延伸通过收缩部604，使得报告物区614布置在收缩部604部内或收缩部604附近。任选地，所施加的电压可引起伸长体613变得拉紧。随着聚合酶650的蛋白质结构域移动，例如改变构象，此类移动可以对头部区611施加力，该力在伸长体613上施加力，其在报告物区614上施加力，导致在孔径603内报告物区614的平移移动，例如相对于收缩部604的移动。因此，聚合酶650的构象变化可以被转化或转换成通过孔径603的电流或通量的可测量变化，其也可以被称为阻断电流或通量。在一个例示性实施方案中，使用一种或多种修饰的核苷酸构建报告物区614。例如，与包含碱基的残基，如dT残基相比，无碱基核苷酸通常产生70pA封闭电流，所述dT残基在包含10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液pH8.0,300mM KCl，1mMMgCl2，1mM DL-二硫苏糖醇(DTT),MspA M2突变体孔(D90N,D91N,D93N,D118R,D134R&E139K)的条件下仅产生20pA阻断电流，在1,2-二植烷酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DPhPC)双层间180mV。
一个或多个无碱基残基在例如仅几埃的量级上的移动可以引起容易检测到的电流或通量的变化，例如，从一个到几十个pA。由于一些聚合酶在纳米级上移动，并且系链中的单个碱基对应于约0.5纳米，预期可以产生由接受系链锚定的聚合酶中的构象变化引起的系链移动，并且容易转导到电流或流量。由于核苷酸的身份影响构象变化的幅度以及在开放状态中花费的时间两者，可以产生独特的电流或通量特征，其单独鉴定核苷酸，因为它们结合或驻留在聚合酶的活性位点。另外，这些独特的电流或通量特征可以单独指示核苷酸是否与被测序的多核苷酸中的下一个核苷酸互补。关于匹配和错配核苷酸之间的聚合酶构象和动力学的差异的进一步细节，参见以下参考文献，其各自的全部内容通过引用并入本文：Freudenthal等人，“New structural snapshots provides molecular insightsinto the mechanism of high fidelity DNA synthesis，”DNA Repair，doi：10.2016/j.dnarep/2015.04.007(2015年4月30日在线获得)；Freudenthal等人，“Watching a DNApolymerase in action，”Cell Cycle 13：691-692，doi：10.4161/cc.27789(2014)；和Freudenthal等人，“Observing a DNA polymerase choose right from wrong”，Cell154：157-168，doi：10.1016/j.cell.2013.05.048(2013)。
例如，如图6D所示，聚合酶650从开放状态到闭合状态的构象变化可以转化为报告物区614到孔径603内的第一位置的“向上”移动，以及聚合酶650从闭合状态到开放的构象变化状态可以转化为报告物区614到孔径603内的第二位置的“向下”移动，导致可以与单个核苷酸相关的阻断电流或通量的可检测变化。
例如，聚合酶650的第一构象变化可响应聚合酶结合第一核苷酸(例如，图6D中所示的核苷酸661)而发生。第一核苷酸可以基于通过收缩部的第一电流或通量的测量(例如，光学或电测量)幅度或时间或两者而单独能鉴定。例如，报告物区614可以响应第一构象变化而移向聚合酶，从而引起通过收缩部604的电流或通量的变化。另外，聚合酶650的第二构象变化可以响应聚合酶结合第二核苷酸而发生。第二构象变化可以不同于第一构象变化，例如在幅度或时间上。第二核苷酸可以基于通过收缩部的第二电流或通量的测量(例如，光学或电学测量的)幅度或时间或两者而单独地鉴定。例如，报告物区614可以响应第二构象变化向聚合酶移动，引起通过收缩部604的电流或通量的变化。
或者/另外，聚合酶650的第一构象变化可以响应聚合酶添加第一核苷酸(例如图6D中所示的核苷酸661)到多核苷酸，例如多核苷酸660而发生。基于通过收缩部的第一电流或通量的测量(例如，光学或电学测量)幅度或时间或两者，第一核苷酸可以是单独可鉴定的。例如，报告物区614可以响应第一构象变化而向聚合酶650的至少一部分平移移动，引起通过收缩部604的电流或通量的变化。另外，聚合酶650的第二构象变化可以响应聚合酶向多核苷酸添加第二核苷酸而发生。第二构象变化可以不同于第一构象变化，例如在幅度或时间上。基于通过收缩部的第二电流或通量的测量(例如，光学或电学测量)幅度或时间或两者，第二核苷酸可以是单独可鉴定的，并且可与第一核苷酸区分开。例如，报告物区614可以响应第二构象变化向聚合酶650的至少一部分平移移动，引起通过收缩部604的电流或通量的变化。
如上所述，聚合酶构象变化的量值或时间持续或两者可以基于聚合酶接受，结合并添加到多核苷酸的特定核苷酸。表1列出了示例性单分子动力学参数，其使用附着至单一聚合酶的SWNT中的电流变化测量模板的Klenow片段处理，并由Olsen等人报道。在表1中，τlo对应于在聚合酶的闭合构象中花费的时间的持续时间，rlo对应于τlo的平均归一化方差，τhi对应于在聚合酶的开放构象中花费的时间的持续时间，rhi对应于τhi的平均归一化方差，并且速率对应于加工速率，例如聚合酶多么快速将核苷酸加入模板。Olson等人报告了平均幅度H是酶的机械闭合程度的代表。对于本系统，方法和组合物，值H可以被认为是聚合酶上两个参考点之间的构象变化程度，以距离单位测量。
表1
使用本文提供的组合物，方法和系统，与开放状态的时间持续τhi，构象变化的幅度H和处理的速率一起相关的信号可以用于指示每个碱基的独特签名(signature)。掺入率也可以通过选择性使用修饰的核苷酸(例如α-或γ硫醇核苷酸)而大大改变。参见例如He等人的美国专利公开号2011/0312529，其全部内容通过引用并入本文。
在一个例示性实施方案中，模板DNA被环化，并且聚合酶650是链置换聚合酶(如Phi29)。以此类方式，可以以如本领域已知的滚环模式对模板进行多次测序。此类实施方案还可以抑制无意中将模板DNA拉入或通过收缩部604，因为只有ssDNA可以移位。可以通过收缩部604(或者如果使用线性模板)找到其路径的任何杂散ssDNA预期快速转移并且预期表现为信号中的噪声。或者，可以在相反的极性下使用带正电荷的报告物区614，使得只有报告物区被吸入收缩部604中，而带负电荷的DNA将被排斥。
在一些实施方案中，聚合酶650任选地可以附着(例如锚定)到生物孔605的口。这可以例如使用半胱氨酸/硫醇缀合化学完成。此类缀合可以提供聚合酶650锚定在可再现的和稳定的方向上，其可以增强聚合酶650的构象移动转移到报告物区614的平移移动。然而，不需要聚合酶与孔的缀合。例如，响应施加的电压由系链施加的力可足以将聚合酶保持在适当位置。在其它实施方案中，聚合酶650不附着到生物孔605，并且尾部区612可以附着到另一成员(例如寡核苷酸)，以便在孔605处保留聚合酶650。
另外，注意，可以使用快速AC电流代替DC电流，以便产生必要的电场。这具有抑制AgCl电极耗尽和延长器件可以运行的时间的优点。
还应当理解，该方法可以扩展到经历构象变化的任何酶或蛋白质的分析。因此，本系统，方法和组合物可以被认为提供“纳米孔力分光术”，并且代表可以用于阐明单分子水平的酶动力学的工具，并且可以成为生物化学研究，分析检测方法和临床诊断中的重要工具。
用于检测聚合酶在核苷酸上的作用的示例性方法和组合物
或者，可以使用除了构象变化的测量之外的技术来检测事件。例如，即使特定事件可以涉及分子的构象变化，如上所述，或者/另外，可以在另一基础上检测此类事件。例如，一种方法可以包含提供包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一侧和第二侧的孔径的纳米孔；和提供包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链。头部区可以锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近，并且伸长体可以包含部分。方法还可以包含提供邻近纳米孔的第一侧布置的聚合酶，和提供包含第一伸长标签的第一核苷酸，所述第一伸长标签包含部分。该方法还可以包含用聚合酶作用于第一核苷酸；以及响应作用于第一核苷酸的聚合酶，使第一部分与系链的部分相互作用。
在一个例示性示例中，图4B显示了根据本发明的一些实施方案的使用包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的组合物来检测聚合酶对核苷酸的作用的方法。
图4B中所示的方法410包含提供包含纳米孔，永久性系链和邻近纳米孔布置的聚合酶的组合物(步骤411)。例如，图7A-7B示意性显示了包含系链的组合物，所述系链锚定到纳米孔或纳米孔附近并且配置为用于检测核苷酸被邻近纳米孔布置的蛋白质的结合。在图7A所示的示例性实施方案中，组合物可以包含纳米孔700，永久性系链710和聚合酶750。纳米孔700包含第一侧701，第二侧702，孔径703，并且任选地还包含收缩部704。永久性系链710包含头部区711，尾部区712，和布置在它们之间并包含报告物区714的伸长体713(任选地，可以提供如上文参考图1C描述的一个或多个另外的报告物区)。聚合酶750邻近纳米孔700的第一侧701布置。例如，聚合酶750可以与纳米孔700的第一侧701接触，并且任选地可以通过任何合适的化学键，蛋白质-蛋白质相互作用或通常不可逆的任何其它合适的附着锚定在纳米孔700的第一侧或邻近纳米孔700的第一侧。可选地，尾部区712可以以类似于参考图1I和1M描述的方式锚定到另一成员。
在图7A所示的实施方案中，系链710的头部区711通过任何合适的化学键，蛋白质-蛋白质相互作用或通常不可逆的任何其它合适的附着而附着到例如锚定到纳米孔700的第一侧701。头部区711可以附着到纳米孔700的任何合适的部分，其将报告物区714放置在孔径703内，并且将伸长标签713放置得足够接近聚合酶750，以便与可以被聚合酶750作用的核苷酸相互作用，并且任选地还在收缩部704附近或之内放置报告物区714。例如，核苷酸730可以包含伸长标签731，其包含与系链710相互作用的部分732。在例示性实施方案中，系链710的伸长标签713可以包含部分715，标签的部分732可以与所述部分715相互作用。部分715可以位于沿着伸长标签713的任何合适的位置，例如，可以位于邻近头部区711，如图7A所示，或者可以在尾部区712附近，或者在尾部区712和报告区714之间。注意，聚合酶750或核苷酸730或两者可以，但是不需要必须被认为是组合物的一部分，而是可以认为是与包含纳米孔700和永久性系链710的组合物接触。
再次参考图4B，方法410包含用聚合酶作用于核苷酸(步骤412)。例如，图7B示意性显示了通过聚合酶750结合核苷酸730，但是应当理解，聚合酶750可以多种方式作用于核苷酸730，例如通过将核苷酸730添加到多核苷酸，从现有多核苷酸切割核苷酸730(例如经由核酸外切酶活性或焦磷酸化活性)，或取样核苷酸730，例如与核苷酸730短暂相互作用而不结合它。预期聚合酶作用的核苷酸的停留时间可以为约1msec或更长，或10msec或更长，或20msec或更长，或50msec或更长。可以修饰核苷酸以进一步延长此类停留时间，例如至50msec或更长，或100msec或更长。
图4B中所示的方法410还包含使核苷酸的部分与系链相互作用(步骤413)。例如，在图7B所示的实施方案中，作用于核苷酸730的聚合酶750可使核苷酸730的部分732与部分715充分接近，使得各部分彼此相互作用，例如彼此键合。此类相互作用可以是可逆的，例如可以包含氢键，离子键，偶极-偶极键，伦敦分散力，可逆共价键或其任何合适的组合的形成。
再次参考图4B，方法410还包含响应核苷酸部分与系链的相互作用而相对于收缩部移动报告物区(步骤414)。例如，图7B示意性显示核苷酸730的部分732与系链710的部分715之间的相互作用可以使报告物区714向第一侧701平移移动，如虚线箭头所示。例如，报告物区714可以在相互作用之前布置在孔径703内的特定位置，例如，在相互作用之前邻近可选的收缩部704或位于可选收缩部704内布置，诸如图7中所示，并且可以响应部分732和系链710之间的相互作用而在孔径703内平移移动，例如，可以远离收缩部704平移移向第一侧701。或者，部分732和系链710之间的相互作用可以以报告物区714向第二侧702移动的方式移动头部区711。应当理解，部分732和系链710之间的相互作用可以适当地引起报告物区714在孔径703内的任何类型的可检测移动，例如报告物区714的平移，构象，或旋转移动的任何可检测组合。
返回参考图4B，方法410还包含检测纳米孔孔径内的报告物区的移动(步骤415)。例如，组合物可以与测量电路可操作地通信，如上面参考图2A或图2C描述。测量电路可以配置为检测报告物区在纳米孔孔径内的移动，例如相对于收缩部。在一个例示性实施方案中，纳米孔700，系链710和聚合酶750可浸入导电流体，例如盐水溶液中。类似于图2A所示的测量电路230或图2C中所示的测量电路240配置的测量电路可以与第一和第二电极通信，并且可以配置为在那些电极之间施加电压，以便在纳米孔700间施加电压。测量电路还可以配置为使用电极来测量通过孔径703的电流或通量的幅度。报告物区714可具有与伸长体713的一些或所有其它区不同的电性质。例如，报告物区714可包含静电电荷，而伸长体713的一些或所有其它区可包含不同的静电电荷，或可以是不带电的(例如，可以是电中性的)。或者，例如，报告物区714可以是不带电荷的，而伸长体713的一些或所有其它区可以包含静电电荷。通过孔径703的电流或通量的幅度可以响应报告物区714在孔径内的平移，旋转或构象移动(例如响应报告物区714相对于可选收缩部704的平移移动)而可测量地改变，并且电流或通量中的此类可测量的变化的时间段可以基于报告物区的移动的持续时间。在一个例示性非限制性实例中，伸长体713包含多核苷酸，其包含限定报告物区714的一个或多个无碱基核苷酸。
聚合酶750对核苷酸730的作用可以基于由此类系统产生的信号(例如，光学或电学信号)的测量的幅度或时间持续或两者而单独鉴定。例如，聚合酶750对核苷酸730的作用可以使报告物区714平移移动到孔径703内的第一位置，并且报告物区714在第一位置的存在使得信号具有第一幅度。因此，具有第一幅度的信号与已发生聚合酶750对核苷酸730的作用相关。注意，报告物区714的除平移移动之外的移动可以是可检测的，例如构象移动或旋转移动，不同类型的移动的组合。
如图4B所示，方法410还可包含从系链释放核苷酸的部分(步骤416)。例如，如图7B所示的聚合酶750将核苷酸730掺入多核苷酸中，聚合酶750可切割伸长的标签731。此类切割可引起部分732和715的解离。方法410还可包含响应部分从系链释放部分而移动系链的报告物区(步骤417)。例如，响应部分732从图7B所示的部分715释放，报告物区714可以平移移向第二侧702，例如移动到与收缩部704相邻或位于收缩704内的位置。方法410还可以包含检测孔径内的报告物区的移动(步骤418)。此类检测可以类似于上文参考步骤415所述进行。注意，报告物区714的除平移移动之外的移动可以是可检测的，例如构象移动或旋转移动。
使用基于检测聚合酶在核苷酸上的作用的示例性方法和组合物的合成测序
应当理解的是，图4B中显示的方法410适当地可用于检测一种类型的分子对任何其它合适类型的具有附着于其上的部分的分子的作用。
在下面参照图8A-14描述的一个非限制性例示性实施方案中，方法410可用于检测聚合酶对核苷酸的作用。此类作用的检测可以用于通过合成与第一核苷酸互补的第二多核苷酸来对第一多核苷酸进行测序，例如使用“合成测序”(SBS)。
在一个方面下，组合物可包含纳米孔，所述纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一侧和第二侧的孔径；和包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链。头部区可以锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近，并且伸长体可以包含部分。聚合酶可以邻近纳米孔的第一侧布置。组合物还包含包含第一伸长标签的第一核苷酸。第一伸长标签包含响应作用于第一核苷酸上的聚合酶而与系链的部分相互作用的第一部分。
在一个例示性示例中，图8A示意性显示了包含锚定到纳米孔并且配置为用于检测聚合酶对核苷酸的作用的系链的示例性组合物。纳米孔包含生物孔805，其可以布置在屏障(未具体显示)中，例如生物来源的膜，如脂质双层或固态膜。生物孔805包含孔径803和收缩部804，但是应当理解，生物孔805可以适当地不包含收缩部或多个收缩部。聚合酶850邻近生物孔805布置并与生物孔805接触，并且任选地可以通过物理或化学连接(例如，使用点击化学或半胱氨酸-马来酰亚胺键)锚定到生物孔805。聚合酶850配置为接收模板多核苷酸860，例如待测序的环状或线性ssDNA，以具有与ssDNA序列互补的序列的多核苷酸，其通过顺序作用于核苷酸，例如结合核苷酸，根据ssDNA的序列将核苷酸添加到多核苷酸，从现有多核苷酸切除核苷酸，或通过对核苷酸进行取样，例如与核苷酸瞬时相互作用而不结合它们进行。头部区811可锚定到纳米孔800的任何合适部分，其将报告体区814放置在孔径803内，例如邻近收缩部804或在收缩部804内，并且使伸长体813足够靠近聚合酶850，以便与可可以被聚合酶850作用的核苷酸相互作用。例如，核苷酸830可以包含伸长标签831，其包含与系链的部分815相互作用的部分832。待测序的模板DNA和待测序的互补多核苷酸的引物在图8A中用黑线表示(虚线表示较长的距离)。
在一个实例中，可以例如使用测量电路230和电极231，232(如上面参照图2A进一步描述)或测量电路240和电极241，242(如上面参照图2C进一步描述)施加跨纳米孔805的电压。报告物区814或伸长体813包含静电电荷，其响应所施加的电压，使伸长体813延伸通过孔803，任选地使得报告物区814布置在收缩804内或邻近收缩804。任选地，施加电压可以使伸长体813变得拉紧。响应作用于核苷酸830上的聚合酶805，核苷酸830的部分832可以与系链832的部分815相互作用，例如可逆地结合。此类相互作用可以在报告物区814上施加力，导致报告物区814在孔径803内的移动，例如，平移移动。因此，聚合酶850对核苷酸830的作用可以被转变或转换成通过收缩部804的电流或通量的可测量变化，其也可以被称为阻断电流或通量。另外，由施加的电压施加在系链上的力可以预期牵拉孔而不是聚合酶，因此预期不会显著破坏聚合酶活性。
在一个例示性实施方案中，部分815包含第一寡核苷酸，部分832包含与第一寡核苷酸互补的第二寡核苷酸，例如，其响应聚合酶850对核苷酸830的作用与第一寡核苷酸杂交。第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的杂交可以引起系链810的伸长体813的长度的变化，其又可以将报告物区814移动到预定位置。聚合酶850对核苷酸830的作用可以基于通过孔径803的电流或通量的测量(例如，光学或电学测量)幅度或时间持续或两者来单独检测。在一个例示性实施方案中，部分815包含第一寡核苷酸，并且部分832包含与第一寡核苷酸互补的第二寡核苷酸，例如与第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的杂交可以将系链810的伸长体813缩短预定量，这又可以将报告物区814移动到孔径803内的预定位置。核苷酸的结合可以基于通过孔径803的电流或通量的测量(例如，光学或电测量)幅度或时间持续或两者单独检测。
例如，图8B示意性显示了包含伸长标签的示例性核苷酸，所述伸长标签包含在用于检测聚合酶对核苷酸的作用期间与图8A的系链相互作用的部分。如图8B所示，核苷酸830(例如T)的伸长标签831可以包含附着于核苷酸830的γ磷酸的寡核苷酸部分832，例如通过δ磷酸连接。寡核苷酸部分832可以包含选择为与系链部分815内的相应核苷酸序列杂交的任何合适的核苷酸序列。例如，图8B中所示的寡核苷酸部分832可以包含示例性序列5'GCAT3'，并且部分815可以包含互补序列5'ATGC 3'。再次参考图8A，聚合酶805对核苷酸830的作用可将部分832保持在相对接近系链的部分815的位置，导致寡核苷酸部分832的局部浓度的瞬时增加，其可以诱导部分832和815之间优先与附着到目前未被聚合酶805作用的核苷酸的部分杂交。所得杂交引起系链的移动，例如构象移动，导致可相对于收缩部804移动报告物区814的伸长体813的缩短。响应哪个部分832可以从部分815解离，聚合酶850可在将核苷酸830掺入多核苷酸时切割伸长标签831。
可以通过从分别包含在部分815和832内的ssDNA产生双链DNA(dsDNA)来诱导系链中的构象变化。例如，ssDNA比dsDNA长约1.5埃/核苷酸，其在本系统的解析限内，例如，图2A中所示的系统220或图2C中所示的系统250。每个核苷酸可以包含相应的寡核苷酸部分832，其被选择以在部分832与部分815杂交时产生dsDNA的不同长度，从而将系链缩短对应于被聚合酶850作用的核苷酸的距离。在一些实施方案，完全拉紧的系链的缩短量的公式，如响应施加的电压延伸穿过孔的系链可以表示为：
Ds＝N*(Lss-Lds) (1)
其中N是杂交的碱基数，Ds是系链缩短的距离，Lss是ssDNA中核苷酸之间的长度(约5埃)，并且Lds是dsDNA中核苷酸之间的长度(约3.3埃)。
图9A-9B示意性显示在用于检测聚合酶对核苷酸的作用期间，响应与示例性核苷酸的伸长标签的部分杂交的示例性系链的构象变化，例如缩短。系链的头部区911锚定到纳米孔900，可选地包含收缩部904，并且伸长体913延伸通过孔径903，例如，使得报告体区914布置在收缩部914内或邻近收缩部914。在图9A-9B所示的实施方案中，伸长体913包含多核苷酸，如ssDNA，其核苷酸由水平条916表示。报告物区914包含多核苷酸的一个或多个无碱基位点，例如ssDNA。部分915包含核苷酸序列，其选择为使得与被聚合酶900作用的核苷酸的伸长标签的相应部分，例如核苷酸的互补序列杂交(被作用的核苷酸及其伸长标签，在图9A-9B中未具体显示)。
如图9A所示，在部分915与被作用的核苷酸的相应部分结合之前，核苷酸916彼此间隔约5埃。如图9B所示，响应部分915与所作用的核苷酸的相应部分相互作用(例如杂交)，例如响应形成双链DNA双链体的部分，部分915内的核苷酸916之间的间距降低至约3.3埃。图9B中的短黑色垂直线指示5碱基杂交事件，其缩短系链并将报告物区914移动到新位置。6、7或8个碱基的双链体可以比图9B中所示的更短，如下面进一步讨论的。
每种不同类型的核苷酸可以包含以与图8B所示类似的方式附着到其γ磷酸酯或以其它方式适当地附着的相应的伸长标签。例如，图10A-10B示意性显示了示例性核苷酸，其包含伸长标签，所述伸长标签包含在用于检测通过邻近纳米孔布置的聚合酶结合核苷酸期间与示例性系链相互作用的相应部分。如图10A所示，A，T，C和G核苷酸可以分别包含伸长的标签，其包含彼此不同的部分，例如分别由三角形，菱形，正方形和圆形表示。可以适当地选择特定部分以便与永久性系链的相应部分相互作用，例如杂交，并且诱导对系链的不同的相应构象变化。图10B显示了可以包含在图10A中所示的伸长标签中的部分的非限制性实例。每个此类部分可以与永久性系链的相应部分的不同的相应部分相互作用，例如杂交，以便诱导系链的不同的相应的构象变化。
例如，图10C示意性显示了包含头部区1011，尾部区1012和包含报告物区1014和部分1015的伸长体1013的示例性系链。头部区1011可以包含化学接头，如3'马来酰亚胺(“Mal”)基团，用于与孔上的半胱氨酸(Cys)残基缀合。尾部区1012可以包含带电荷的5'磷酸基团(“phos”)，并因此有助于响应施加的电压将系链供应通过孔的孔径。伸长体1013可以包含聚合物，例如如图10C所示的多核苷酸，或任何其它合适的聚合物，如生物聚合物或合成聚合物。报告物区1014包含一个或多个表示为“X”的无碱基核苷酸，并且在一个示例性实施方案中，可位于距马来酰亚胺约14-15个碱基处，其对于某些纳米孔类型可以大约是从孔口到孔收缩部的距离H2。部分1015可以包含核苷酸序列，例如GGGTATAT，附着到待作用的A，T，C和G核苷酸上的每个部分可以彼此不同地与所述核苷酸序列相互作用，例如杂交。
注意，图10A-10C中所示的部分旨在纯粹是示例性的，而不是对本发明的限制。然而，可以选择附着到待作用的核苷酸上的部分，以满足一个或多个以下参数，并且任选地满足以下所有参数：
1.附着到彼此不同类型的核苷酸上的部分可以以可彼此区分的方式与系链的部分相互作用，例如经由测量通过孔收缩部的电流或通量。
2.核苷酸部分和系链的相应部分之间的双链体的稳定性足够低，使得附着到“游离”核苷酸(不被聚合酶作用，因此与系链瞬时相互作用的核苷酸)仅与系链的部分短暂相互作用，例如小于1msec。例如，核苷酸部分和系链部分之间的双链体的稳定性可以表示为双链体的Tm或解链温度。系统工作温度预期为约20℃或室温。预期约5-8个核苷酸长的部分具有Tm<12℃，其可在室温下提供足够低的稳定性，使得附着到“游离”核苷酸的部分将仅与该系链的部分短暂相互作用。
3.核苷酸部分和系链的相应部分之间的双链体的稳定性足够高，使得当在掺入期间核苷酸被聚合酶作用并由聚合酶保持就位几个毫秒(例如1至30msec)时，此类作用增加核苷酸部分相对于系链部分的有效浓度，其驱动部分之间的反应向前并增加稳定性，使得双链体的有效Tm大于20℃(或系统的预期工作温度)，例如大于30℃，或大于40℃，或大于50℃。
4.被作用的核苷酸的伸长标签的长度，例如，部分和γ磷酸之间的长度可以足够长，使得当该部分稳定地杂交到系链的相应部分时，基本上不存在对核苷酸的力。如果该长度太短，则系链可以对核苷酸的伸长标签施加力，这预期导致降低的聚合酶效率。
关于将寡核苷酸彼此杂交的进一步信息，参见Turner等人的美国专利号8,652,779，其全部内容通过引用并入本文。根据Turner等人，在此类大小规模下，寡核苷酸应当比聚合酶可以掺入核苷酸快约100倍对其构造空间取样。将此类原理应用于本组合物，据信被作用的核苷酸的部分可能容易地“发现”系链的相应部分并且与系链的相应部分相互作用，并且还将在从被作用的核苷酸切割部分后从系链解离。
注意，在图10C中所示的示例性部分中，附着于被作用的核苷酸的每个部分仅与包含5至8个碱基的相应的系链部分1015具有仅单一匹配杂交。虽然存在不会导致完全杂交的其它杂交选择，但是此类选项可以预期明显不如全长选项稳定。
图11A-11D显示了系链和部分之间的相互作用的示例性计算。基于在50mM NaCl和2mM Mg2+(二价离子，已知其增加Tm并且可以在该浓度下用于聚合酶活性)存在下的两种自由扩散的寡核苷酸的假设，显示每个部分的杂交选择及其预测的自由能。上文图11A-11D所示的“系链序列”对应于系链的序列，并且图11A-11D中所示的“标签序列”对应于分别可以附着到核苷酸的部分的示例性序列。图11A所示的部分(标签序列)为5个碱基对长，而图11B中所示的部分(标签序列)是6个碱基对长，并且类似于图11A所示的部分,但在3'末端包含一个额外的碱基A。图11C中的部分(标签序列)是7个碱基对长，并且类似于图11B中所示的部分，但在3'端包含一个额外的碱基T。图11D中的部分(标签序列)是8个碱基对长并且类似于图11C中所示的部分，但在3'末端包含一个另外的碱基A。
基于一级序列和相应的二级序列自由扩散的假设，分别为一级序列和不同二级序列之间的最佳匹配(实心框)和第二最佳匹配(虚线框)杂交显示了所计算的自由能差异(ΔG)。更具体地，在图11A中，可以看到框1A中所示的能量最有利的示例性杂交的计算的ΔG是-9.57kcal/摩尔，对应于相应标签序列与系链序列的全部5个碱基对的杂交，而在框1B中所示的能量第二最有利的示例性杂交的计算的ΔG是-3.07kcal/摩尔，对应于该标签序列与系链序列的仅2个碱基对的杂交。在图11B中，可以看出框2A中所示的能量最有利的示例性杂交的计算的ΔG为-10.53kcal/摩尔，对应于相应标签序列与系链序列的所有6个碱基对的杂交，而框2B中所示的能量第二最有利的示例性杂交的计算的ΔG是-3.2kcal/摩尔，对应于该标签序列与系链序列的仅3个碱基对的杂交。在图11C中可以看出，框3A中所示的能量最有利的示例性杂交的计算的ΔG是-12kcal/摩尔，对应于相应标签序列与系链序列的所有7个碱基对的杂交，而框3B中所示的能量第二最有利的示例性杂交的计算的ΔG为-3.2kcal/摩尔，对应于该标签序列与系链序列的仅3个碱基对的杂交。在图11D中，可以看出，框4A中所示的能量最有利的示例性杂交的计算的ΔG是-12.96kcal/摩尔，对应于相应标签序列与系链序列的所有8个碱基对的杂交，而在框4B中所示的能量第二最有利的示例性杂交的计算的ΔG是-3.2kcal摩尔，对应于标签序列与系链序列的仅3个碱基对的杂交。因此，从图11A-11D可以理解，计算的ΔG对于每个二级序列与一级序列的完全杂交显著低于对于那些标签序列与系链序列的部分杂交。从图11A-11D可以进一步理解，预测的解链温度(Tms)都小于约11.4℃，包含具有8个碱基的部分。在150mM盐(适合地可用于配置为测量通过孔径的电流或通量的系统中的浓度)和2mM Mg2+，具有8个碱基的部分具有约15℃的预测的Tm。因此，可以预期遇到系链的自由扩散核苷酸在室温下将没有有意义的稳定性。此外，通过使用例如甲酰胺，可以甚至进一步降低最高Tm，例如降低约5℃。
此外，可以预期被作用的核苷酸上的部分，和系链上的部分之间的双链体的解链温度比自由扩散寡核苷酸的其它方面相同对显著更稳定，因为系链和掺入核苷酸相对于另一个保持在相对固定的位置，导致部分的局部浓度的有效增加。可以发生所得的协同结合，因为核苷酸在一定程度上被聚合酶和杂交相互作用二者同时保持。此类协同结合可以显著增加短的寡核苷酸双链体的有效Tm。图12A显示了可用于计算系链和部分之间的相互作用的模型。此类模型基于分子信标，其中两个约5或6个碱基的短寡核苷酸各自在茎-环结构中彼此稳定杂交。环用来保持两个茎片(寡核苷酸)彼此紧密接近。可以容易地用约5-6个核苷酸的茎和约10个或更多个核苷酸级的环实现Tm>50℃或>60℃。因为寡核苷酸通过环(“探针序列”)保持彼此相对接近，所以它们的有效浓度增加，并且与自由扩散核苷酸相比，可以显著增加那些核苷酸之间的杂交Tm。
图12B基于图12的模型显示了可以附着到由聚合酶作用的核苷酸上的系链和部分之间的相互作用的示例性计算，并且图12C显示了基于图12A的模型计算的稳定结构。更具体地，使用编码图10B的部分(对于核苷酸“A”)的序列的实例，由RNA研究所(College ofArts and Sciences，University of Albany，State University of New York atAlbany)主办的mFold程序用于测定与其反义互补序列杂交的此序列的Tm，假定环是10个核苷酸长的。预期环的此类长度是聚合酶作用的核苷酸的伸长标签的其它部分的长度的合理近似值。如图12B所示，在2mM MgCl2和50mM NaCl存在下的预测Tm为约49℃，表明甚至相对短的5聚体部分(如图12C中所示)可以具有相对高的Tm，如果部分相对于彼此的有效浓度足够高的话。图10B中所示的其它碱基(C，G&T)的例示性部分甚至更长并且在6-8个核苷酸的范围内，并且因此可以预期具有稍高的Tm。例如，基于图12A所示的模型，预测具有8核苷酸部分的“G”在2mM Mg2+和50mM NaCl中的Tm为59℃(数据未显示)。相比之下，图10C显示了在1mM Mg2+和150mM NaCl存在下通过mFold程序预测的各自所示序列的自由扩散形式的各自的Tm。注意，mFold程序不报告＜10℃的值。用于自由扩散形式的所有Tm完全低于在室温(约20℃)下系统的预期工作温度，而使用图12A的模型计算的Tm完全高于系统的预期操作温度。
如上所述，不同长度的寡核苷酸部分可用于改变系链的构象，例如改变系链的长度，例如缩短系链不同的量。将上述等式(1)应用于范围从5至8个核苷酸的部分产生表2中的结果。具有5个核苷酸的部分预期将系链缩短大约8.5埃。具有6个核苷酸的部分预期将系链缩短大约10.2埃。具有7个核苷酸的部分预期将系链缩短大约11.9埃。具有8个核苷酸的部分预期将系链缩短大约13.6埃。因此，部分通过彼此“间隔”约1.7埃的相应量缩短系链。
表2：来自5-8个碱基的标记的差异缩短。
标记物长度 Ds(Ang) 与最短标记物的差异(Ang)
5 8.5 N/A
6 10.2 1.7
7 11.9 1.7
8 13.6 1.7
当聚合酶将此类核苷酸添加到多核苷酸时，例如在通过合成测序期间，响应与附着到被聚合酶作用的核苷酸的部分的相互作用的系链的此类构象移动可以提供便于鉴定不同核苷酸的信号。图13A-13E示意性显示响应与相应核苷酸的示例性部分的相互作用的孔(例如，纳米孔)的孔内的示例性系链的移动，例如图10A-10C所示的部分。注意，在图13A-13E中，没有具体显示聚合酶，但是可以以与上面参照图8A描述的方式类似的方式邻近孔的第一侧定位。另外，在图13B-13E中，被聚合酶作用的核苷酸没有具体说明，但是可以以与上面参照图8A描述的方式类似的方式位于聚合酶内。图13B-13E中的虚线旨在表示作用于将部分连接至核苷酸的核苷酸的伸长标签的部分。另外，在图13A-13E中，没有具体显示配置为测量(例如，光学地或电地测量)孔的孔内的报告物区的移动的测量电路，但是可以以与上面参照图2A或图2C描述的方式类似的方式配置。在一个例示性实施方案中，测量电路配置为在孔两端施加电压并测量通过孔径的电流或通量。
图13A显示了在没有事件的情况下的孔和系链，其可以被称为它们的平衡状态。报告物区，例如一个或多个无碱基残基，由“X”表示，存在于孔的孔内，例如在孔的收缩部内。图14是可以在图13A-13E所示的相互作用期间生成的示例性信号的图。如图14所示，在时间t0和t1之间的信号(例如，光学或电学测量的电流或通量)可以具有对应于图13A中所示的报告物区的位置的第一值(A)。图13B显示了在时间t1处附着到聚合酶作用于“dA”核苷酸的示例性寡核苷酸部分与系链上的相应寡核苷酸部分之间的相互作用。基于等式(1)，预期响应相互作用，系链可以以此类方式改变构型，例如缩短，使得报告物区“X”在孔的孔内移动大约8.5埃向孔的第一侧，例如在聚合酶的方向。如图14所示，在时间t1和t2之间的信号(例如，光学或电学测量的电流或通量)可以具有对应于图13B中所示的报告物区的位置的第二值(B)。在大约时间t2，聚合酶从聚合酶作用的dA核苷酸切割伸长的标签，响应此，dA核苷酸的部分(以前)从系链解离，响应此，报告物区返回到图13A所示的状态。并且信号返回值(A)，直到聚合酶作用于另一个核苷酸。注意，图14中的信号变化，例如电流或磁通变化，尽管步骤被简化为阶梯函数，但是应当理解，电流或通量变化可以基于聚合酶作用于核苷酸的特定方式而具有更复杂的形状，因此报告物区在孔的孔内移动。另外，噪声可以存在于诸如图14所示的信号中。并且可以表现为瞬态尖峰(未显示)。
图13C显示了在时间t3处附着到被聚合酶作用的“dT”核苷酸的示例性寡核苷酸部分与系链上的相应寡核苷酸部分之间的相互作用。基于等式(1)，预期响应相互作用，系链将以此类方式缩短，使得报告物区“X”在孔的孔内向着孔的第一侧移动大约10.2埃孔，例如在聚合酶的方向上。如图所示。如图14所示，在时间t3和t4之间的信号(例如，光学或电学测量的电流或通量)可以具有对应于图13C中所示的报告物区的位置的第三值(C)。在大约时间t4，聚合酶从聚合酶作用的dT核苷酸切割伸长的标签，响应dT核苷酸的部分(之前)从系链上解离，响应此，报告物区返回到所示的状态。并且信号返回到值(A)。
图13D显示了在时间t5处附着到被聚合酶作用的“dC”核苷酸的示例性寡核苷酸部分与系链上的相应寡核苷酸部分之间的相互作用。基于等式(1)，预期响应相互作用，系链将以此类方式缩短，使得报告物区“X”在孔的孔内向着孔的第一侧移动大约11.9埃孔，例如在聚合酶的方向上。如图14所示，在时间t5和t6之间的信号(例如，光学或电学测量的电流或通量)可以具有对应于图13D中所示的报告物区的位置的第四值(D)。在大约时间t6，聚合酶从聚合酶作用的dC核苷酸切割伸长的标签，响应此，dC核苷酸的部分(以前)从系链解离，响应此，报告物区返回到图13A所示的状态。并且信号返回到值(A)。
图13E显示了在时间t7处附着到被聚合酶作用的“dG”核苷酸的示例性寡核苷酸部分与系链上的相应寡核苷酸部分之间的相互作用。基于等式(1)，预期响应相互作用，系链将以此类方式缩短，使得报告物区“X”在孔的孔内向着孔的第一侧移动大约13.6埃孔，例如在聚合酶的方向上。如图14所示，在时间t7开始的信号(例如，光学或电学测量的电流或通量)可以具有对应于图13E中所示的报告物区的位置的第五值(E)。在大约时间t8，聚合酶从聚合酶作用的dG核苷酸切割伸长的标签，响应此，dC核苷酸的部分(以前)从束缚物上解离，响应此，报告物区返回到图13A所示的状态。并且信号返回到值(A)(图14中未具体显示)。
表3列出了可以包含在每个核苷酸的伸长标签中并且沿着系链的伸长体与相应部分相互作用的示例性部分，例如图13A-13E所示的部分。。表3还列出了与系链的相应部分杂交(“连接”)的部分中的核苷酸数目。表3还列出了所产生的系链构象变化的量级，例如，预计系链被缩短的量(以埃计)。表3还列出了系链相对于“dA”的示例性部分的预期差异长度。假设单链DNA在核苷酸之间具有5埃的间隔，以单链DNA测量的等价缩短长度也列在表3中，以及核苷酸之间相对于“dA”的不同距离，以核苷酸(“Delta Bases”)测量。
表3
另外，注意，因为被作用的核苷酸的部分可以具有不同的长度，例如5至8个核苷酸，它们的Tm可以彼此略微不同。给定部分的Tm和ΔG预期参与核苷酸部分从系链部分解离的速率(也称为解离速率)。此类速率或时间持续可以潜在地用作另一个特征以确定每个核苷酸的正确的身份。例如，具有对应于图14中所示的t1和t2之间的差的时间段的信号可以以类似于图13B所示的方式与作用于dA的聚合酶相关，具有对应于t3和t4之间的差的时间周期的信号可以以类似于图13C所示的方式与作用于dT的聚合酶相关，具有对应于t5和t6之间的差异的时间周期的信号可以以类似于图13D所示的方式与作用于dC的聚合酶相关，或者具有对应于t7和t8之间的差异的时间段的信号可以以类似于图13E所示的方式与作用于dG的聚合酶相关。。
注意，在伸长标签的部分和系链的部分之间形成的双链体可以处于热力学平衡。应当理解，热力学平衡中的双链体可以具有基于核酸序列的长度和特征的开启和关闭速率，并且双链体可以随时间解离。对于在双链体状态中所花费的平均时间(解离速率的倒数)比掺入事件期间的聚合酶-核苷酸复合物的平均寿命短，使得在掺入和标签从核苷酸释放后，标签将扩散并且不阻断进入的核苷酸标签。与聚合酶-核苷酸复合物的寿命相比，有效接合速率可以足够高以导致相对快速的重结合，使得检测掺入事件，并且使得在核苷酸掺入期间发生任何解离事件后双链体重组。接合率将是核苷酸的伸长标签的浓度中的伪一级，这可以被认为使得此类布置成为伸长标签的浓度的随机传感器。注意，自由扩散的伸长标签可具有相对低的浓度(例如，10nM至100nM，或100nM至250nM，或250nM至500nM，或500nM至1μM)，而伸长标记物将有效地具有相对高的浓度，因为其结合到在掺入期间由聚合酶保持在适当位置的核苷酸，因此不能自由扩散。
因此，应当理解，本发明系链之一的报告物区在孔径内能移动(例如，能平移移动)不同量，或不同时间量，或两者，响应聚合酶作用于不同核苷酸。此类核苷酸可以基于例如通过孔径的电流或通量的信号的测量(例如，光学或电学测量)幅度或时间持续或两者而单独地鉴定。例如，第一和第二核苷酸可以与彼此不同地与该系链相互作用的部分连接。例如，系链可以包含第一寡核苷酸，并且附着到第一核苷酸的部分可以包含与第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸，以便响应聚合酶作用于第一寡核苷酸而使报告物向第一侧移动，例如，将系链缩短第一量。附着到第二核苷酸的部分可以包含第三寡核苷酸，其与第一寡核苷酸杂交，以便响应聚合酶作用于第二寡核苷酸而使报告物向第一侧移动，例如将系链缩短第二量。第一和第二核苷酸可以彼此区分，例如，第一核苷酸可以基于测量的(例如，光学或电测量的)幅度或时间持续或两者来单独鉴定第一信号，例如第一电流或通量，并且第二核苷酸可以基于例如第二电流或通量的第二信号的测量(例如，光学或电测量)幅度或时间持续或两者而单独鉴定，收缩。
在上面参考图8A-14描述的示例性实施方案中，，系链的伸长体和被聚合酶作用的核苷酸的伸长标签分别可以包含或甚至可以仅由单链DNA(ssDNA)组成。然而，应当理解，可以适当地使用其它类型的分子。例如，可以适当地使用任何系链，其包含具有一个或多个以下特征的伸长体，并且可选地包含所有以下特征：
1.伸长体可包含与部分相互作用的区，部分分别以部分所连接的方式与不同类型的核苷酸连接例如通过测量通过孔收缩部的电流或通量来彼此区分。
2.伸长体可以包含带电区，该带电区响应施加的电压而使其被拉动通过孔的收缩。在此类构造中，伸长体可以被拉紧。该带电区可以位于孔收缩附近以产生净力。
3.伸长体包含报告物区，当移动通过孔时，例如通过孔收缩，产生清晰可辨的信号。报告物区和带电荷区可以彼此相同；也就是说，单个区可以是报告物区和带电荷区。
可以包含在系链的伸长体中的示例性材料或作用于其上的核苷酸的伸长标签，或两者，是聚合物。聚合物包含生物聚合物和合成聚合物。适合用于系链的伸长体或作用于其的核苷酸的伸长标签或两者的示例性生物聚合物包含多核苷酸，多肽，多糖，多核苷酸类似物和多肽类似物。适用于系链的伸长体或作用于其的核苷酸的伸长标签或两者的示例性多核苷酸和多核苷酸类似物包含DNA，对映异构体DNA，RNA，PNA(肽-核酸)，吗啉基和LNA(锁定核酸)。示例性的合成多肽可以包含带电荷的氨基酸以及亲水和中性残基。在一些实施方案中，系链不是核酸或不包含核苷酸。例如，系链可排除天然存在的核苷酸，非天然存在的核苷酸类似物或两者。本文或本领域已知的一种或多种核苷酸可以从系链中排除。
可适用于系链的伸长体或作用于其的核苷酸的伸长标签或两者的其它示例性聚合物包含合成聚合物，例如PEG(聚乙二醇)，PPG(聚丙二醇)，聚乙烯醇，聚乙烯，低密度聚乙烯，HDPE(高密度聚乙烯)，聚丙烯，PVC(聚氯乙烯)，PS(聚苯乙烯)，NYLON(脂肪族聚酰胺)，TEFLON(四氟乙烯)，热塑性聚氨酯，聚醛，聚烯烃，聚(环氧乙烷)，聚(ω-链烯酸酯)，聚(甲基丙烯酸烷基酯)和其它聚合化学和生物接头，如上文进一步提及的Hermanson中描述的。另外，如上，系链的伸长体的部分或作用于其的核苷酸的伸长标签或两者可以是彼此相互作用的单个短核苷酸序列。这些部分可以与聚合酶不相互作用，例如RNA，PNA或LNA标记，吗啉代或对映异构体DNA。该部分不需要由与作用的核苷酸的系链或伸长标签的伸长体的其它部分相同的聚合物形成。如本领域所熟知的，伸长标签可以容易地附着到核苷酸的γ磷酸。另外，在一个例示性实施方案中，isoG和isoC碱基可以用于核苷酸伸长标签或系链或两者上，以抑制伸长标签或系链与待测序DNA杂交。另外，可以使用其它方案诱导系链中的二级结构以缩短其，例如发夹。
另外，注意，系链可以包含多个部分，其中每个部分分别与附着到给定类型的核苷酸的部分相互作用。核苷酸的部分与系链的相应部分之间的相互作用可以将系链的报告物区移动相应的量，相应的量有助于通过信号例如经由通过孔的孔径的电流或通量的相应核苷酸的鉴定。
在一个非限制性的例示性实施方案中，孔包含MspA，其可提供核苷酸特异性电流或通量的令人满意的分开，例如与α-溶血素相比核苷酸特异性电流或通量的3.5倍更大的分开。然而，应当理解，α-溶血素或其它类型的孔适当地可以与本发明的组合物，系统和方法一起使用。
另外，注意，在其中跨孔施加电压并且通过经由孔的电流或通量测量(例如，光学或电学测量)报告物区的移动的实施方案中，电压可以适当地使用直流(DC)或交流(AC)。AC电流可以帮助伸长电极寿命，如果标签变得卡住，则有助于从孔中喷射裂开的伸长标签，或者可以执行抵抗施加电压的力拉动系链的工作的一部分。另外，注意，带正电荷的系链可以在孔上具有反向偏压，以便抑制被测序的DNA被吸入孔中。另外，注意，带负电荷的系链可以反向螺纹通过孔(例如，锚定到孔的第二侧的头部区和邻近孔的第一侧布置的聚合酶)，反向偏置为带负电荷的伸长标签，以便抑制伸长标签阻断入收缩部，并抑制被测序的DNA进入孔。
另外，可以采用随机感测方法。在此类布置中，可以使用AC电流来移动邻近收缩部的杂合双链体，如下面参照图18A-18E更详细地描述的。
用于检测聚合酶在核苷酸上的作用的示例性方法和组合物
应当理解，可选择的方法和组合物可以用于检测聚合酶对核苷酸的作用。例如，图15显示了使用包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的组合物检测聚合酶对核苷酸的作用的替代方法。例如，组合物可以包含纳米孔，该纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一和第二侧的孔；和包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链。头部区可以锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近，并且伸长体可以包含部分。聚合酶可以邻近纳米孔的第一侧布置。组合物还包含包含第一伸长标签的第一核苷酸。第一伸长标签包含响应作用于第一核苷酸上的聚合酶而与系链的部分相互作用的第一部分。
例如，图15中所示的方法1500包含提供包含纳米孔，永久性系链和与纳米孔相邻布置的聚合物的组合物(步骤1501)。例如，图16示意性显示了示例性组合物，其包含锚定到纳米孔的系链并且配置用于检测聚合酶对核苷酸的作用。在图16所示的示例性实施方案中，组合物可以包含纳米孔1600，永久性系链1610和聚合酶1650.纳米孔1600包含第一侧1601，第二侧1602，延伸穿过侧面1601和1602的孔1603，并且可选地还包含收缩部1604.永久性系链1610包含头部区1611，尾部区1612和布置在它们之间的伸长体1613。聚合酶1650与纳米孔1600的第一侧1601相邻布置。例如，聚合酶1650可以与纳米孔1600的第一侧1601接触，并且任选地可以通过任何合适的化学键固定在或邻近纳米孔1600的第一侧，蛋白质-蛋白质相互作用或通常不可逆的任何其它合适的连接。在图16所示的实施方案中，系链1610的头部区1611通过任何合适的化学键，蛋白质-蛋白质相互作用或通常不可逆的任何其它合适的附着附着到例如锚定到纳米孔1600的第一侧1601。
头部区1611可以附着到纳米孔1600的任何合适的部分，其将伸长标签1613放置得足够靠近聚合酶1650，以便与可以被聚合酶1650作用的相应核苷酸的伸长标签相互作用。例如，核苷酸1630可包含伸长标签1631，其包含与系链1610相互作用的部分1632.在例示性实施方案中，系链1610的伸长标签1613可包含与标签的部分1632可以相互作用的部分1615。尾部区1612可以向纳米孔的第二侧自由地延伸，并且可以布置在纳米孔的第一侧上，诸如下面参考图17A-17B所描述的。或者可以布置在纳米孔的第二侧上或超出纳米孔的第二侧，例如上文参照图图7A-7B描述的，或者可以在纳米孔的第一和第二侧之间移动，例如下面参照图19-20B描述的。可选地，尾部区1612可以以例如参考图1I和1M描述的方式附着到另一成员。其它成员可任选地布置在孔1603内。注意，聚合酶1650或核苷酸1630或两者可以但不一定被认为是本发明组合物的一部分，而是可以被认为是与包含纳米孔1600和永久性系链1610的组合物接触。
如图15所示，方法1500包含用聚合酶作用于核苷酸(步骤1502)。例如，图16示意性显示了通过聚合酶1650结合核苷酸1630，但是应当理解，聚合酶1650可以多种方式作用于核苷酸，例如通过将核苷酸1630添加到多核苷酸，从现有多核苷酸切割核苷酸1630，例如，与核苷酸1630短暂相互作用而不结合核苷酸1630。示于图15中的方法1500还包含使核苷酸的部分与系链相互作用(步骤1503)。例如，在图16所示的实施方案中，作用于核苷酸1630的聚合酶1650可以使核苷酸1630的部分1632与部分1615充分接近，使得部分彼此相互作用，例如彼此键合。此类相互作用可以是可逆的，例如可以包含氢键，离子键，偶极-偶极键，伦敦分散力，可逆共价键或其任何合适的组合的形成。
再次参考图15，方法1500还可以包含以任何合适的方式检测部分与系链的相互作用。例如，核苷酸的伸长标签可以包含报告物区，方法1500可以包含检测纳米孔的孔内存在报告物区(步骤1504)。例如，图17A-17B示意性显示了包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的组合物，并且配置用于检测聚合酶对包含包含报告物区的伸长标签的核苷酸的作用。如图17A所示，组合物可以包含纳米孔1700，包含第一侧1701，第二侧1702，延伸穿过第一侧和第二侧的孔径1703，以及可选的收缩部1704；包含锚定到纳米孔1700的第一侧1701的头部区1711，布置在纳米孔1700的第一侧1702上的尾部区1712和包含部分1715但缺少报告物区的伸长体1713的永久性系链1710；和核苷酸1730，包含包含部分1732和报告物区1734的伸长标签1731。
如图17B所示，核苷酸1730的部分1732和系链1710的部分1715之间的相互作用可以将报告物区1734布置在孔1703内。应当理解，报告物区1734在孔1703内的布置可以以任何合适的方式检测。例如，组合物可以与测量电路可操作地通信，例如上面参考图2A或图2C所述的。测量电路可以配置为检测孔1703内的报告物区1734的布置。在一个例示性实施方案中，纳米孔1700，系链1710，聚合酶1750和核苷酸1730可以浸没在导电流体(例如盐水溶液)中。与图2A中所示的测量电路230或图2C中所示的测量电路240类似配置的测量电路可以可以与第一和第二电极通信，并且可以配置为在那些电极之间施加电压，以便跨纳米孔1700施加电压。测量电路还可以配置为使用电极来测量电流的幅度或通量通过孔1703.报告物区1734可以具有与伸长标签1731的一些或所有其它区不同的电或通量阻断特征。例如，报告物区1734可以包含静电电荷，而伸长标签1731的一些或所有其它区可以包含不同的静电电荷，或者可以是不带电的(例如，可以是电中性的)。或者，例如，报告物区1734可以是不带电的，而伸长体1731的一些或所有其它区可以包含静电电荷。响应报告体区1734在孔1703内的布置，通过孔1703的电流或通量的大小可以可测量地改变，并且电流或通量中的此类可测量变化的时间段可以基于部分1715和1732之间的相互作用的时间持续，其又可以基于聚合酶1750对核苷酸1730的作用的时间持续。在一个例示性，非限制性实例中，伸长体1731包含多核苷酸，其包含限定报告物区1734的一个或多个无碱基核苷酸。
在一个例示性实施方案中，双链体的形成可以使用双链中断测序(interruptedsequencing)来监测，例如在Derrington等人，“Nanopore DNA sequencing with MspA”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Natl.Acad。Sci.USA，107：16060-16065(2010)，其全部内容通过引用并入本文。本系统可以使用AC驱动电压，其时间周期与双链体形成的时间具有相同的数量级，预期该时间周期明显短于测量的聚合酶催化结合事件。还参见Gundlach等人的PCT公开号WO2011/106459，其全部内容通过引用并入本文。
聚合酶1750对核苷酸1730的作用可以基于由此类系统产生的信号的测量(例如，光学或电学测量)幅度或时间持续或两者而单独鉴别。例如，聚合酶1750对核苷酸1730的作用可以引起部分1715和1732之间的相互作用，这进而导致报告物区1734变为布置在孔1703内的第一位置，并且报告物区1734在第一位置的存在导致信号具有第一幅度。因此，具有第一量级的信号与已发生聚合酶1750对核苷酸1730的作用相关。
注意，在一些实施方案中，伸长体1713和伸长标签1731的相应长度，部分1715和1732的相应位置以及报告体区1734的相应位置被共同选择，以便抑制力的施加核苷酸1730，而核苷酸受聚合酶1750作用，因此抑制或阻止此类力改变聚合酶的性能。在一个例示性实施方案中，部分1715和部分1713之间的相互作用形成双链体。可以选择伸长体1713的长度，使得伸长体基本上不延伸通过报告体区1734将要布置的位置。伸长标签1731的长度可以选择为延伸穿过要布置报告体区的位置，同时提供额外的松弛，使得伸长标签1731不需要被拉紧以便在该位置处布置报告体区1734。在一些实施方案中，沿着系链1710的伸长体1713的部分1715的各自位置和部分1732沿着核苷酸1730的伸长标签1731的相应位置被共同选择，以便在伸长标签1731中在因此，头部区1711锚定到孔1700可以抑制双链体1715,1732通过孔1703的移动，并且可以吸收原本可能已经通过伸长标签施加到核苷酸1730的力另外，报告物区1734可以沿着伸长体1731布置在合适的位置，以便布置在孔1730内的合适位置，以便于当部分1715和1732彼此相互作用时检测报告物区。在一个示例性实施方案中，报告物区1734布置在沿着伸长体1731的合适位置，以便当部分1715和1732响应聚合酶1750的作用而彼此相互作用时，布置在纳米孔1700的收缩1704内或邻近纳米孔1700的收缩1704。
可以使用检测聚合酶1750对核苷酸的作用的其它方法。例如，方法1500可替代地可以包含改变纳米孔孔上施加的电压(步骤1505)，响应所施加的电压的变化在孔径内的位置布置系链的报告物区(步骤1506)在孔径内的位置处的系链的报告物区(步骤1507)。例如，图18A-18D示意性显示了包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的组合物，并且配置用于检测聚合酶对核苷酸的作用，其使用锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链，响应纳米孔上的电势的变化，以及图18E显示了在使用此类组合物期间可以产生的示例性信号。
图18A包含纳米孔1800，其包含第一侧1801，第二侧1802，延伸穿过第一侧和第二侧的孔径1803，以及布置在第一侧和第二侧之间的收缩部1804；包含锚定到纳米孔1800的第一侧1801的头部区(未具体标记)，可在纳米孔1800的第一侧1801和第二侧1802之间移动的尾部区(未具体标记)和长形体特异性标记)，其包含报告物区1814和部分1815；和核苷酸1830，包含包含部分1832但缺乏报告物区的伸长标签(未特异性标记)。如图所示。如图18A所示，核苷酸1830的部分1832和系链1810的部分1815之间的相互作用可以将报告物区1814布置在相对于部分1832的预定位置。任选地，可以提供多于一个报告物区，例如至少两个或三个，或四个，或五个，或多于五个报告物区。另外，部分1815可以位于沿着伸长标签1813的任何合适的位置，例如，可以位于头部区1811和报告物区1814之间，并且邻近报告物区1814，如图1所示。或者可以与头部区1811相邻，与尾部区1812相邻，或者在尾部区1812和报告物区1814之间。
应当理解，报告物区1814相对于部分1832在预定位置的布置可以以任何合适的方式检测。例如，组合物可以与测量电路可操作地通信，例如上面参考图2A或图2C描述的。测量电路可以配置为检测报告物区1814相对于部分1832的位置。在一个示例性实施方案中，纳米孔1800，系链1810，聚合酶1850和核苷酸1830可以浸没在导电流体中，例如盐水溶液。配置为与类似于图2A所示的测量电路230或图2C中所示的测量电路240类似的测量电路可以与第一和第二电极连通，并且可以配置为在那些电极之间施加第一电压，以便跨纳米孔1800施加电压，如图18A中所示的“+”和“-”符号所示，并且使用电极来测量在第一电压下通过孔1803的电流或通量的大小。图18E在图18A下紧接的部分显示了在第一电压下通过孔1803的示例性电流或通量。报告物区1814可以具有与系链(未具体标记)的伸长体的一些或所有其它区不同的电或通量阻断特征。例如，报告物区1814可以包含静电电荷，而伸长体的一些或所有其它区可以包含不同的静电电荷，或者可以是不带电的(例如，可以是电中性的)。或者，例如，报告物区1814可以是不带电的，而伸长体的一些或所有其它区可以包含静电电荷。在一个例示性的非限制性实例中，系链的伸长体包含多核苷酸，其包含限定报告物区1814的一个或多个无碱基核苷酸。通过孔1803的电流或通量的量值可响应报告物区的相对位置1814，并且此类相对位置可以基于所施加的电压和报告物区1814相对于部分1832的位置，这又可以基于聚合酶1850对核苷酸1830的作用。
更具体地，测量电路还可以配置为将纳米孔1800上施加的电压改变为第二电压，例如通过反转所施加的电压，例如由“+”和“-”符号的反转表示，如图18B所示。施加的电压的此类变化可以引起纳米孔1800的孔1803内的相互作用部分1815，1832的移动。例如，如图18B所示，施加电压的变化可以移动邻近收缩1804的相互作用部分1815，1832，并且可以将收集器区1814布置在收缩1804附近或内部。测量电路可以配置为使用电极来测量电流的幅度或在第二电压下通过孔1803的通量。图18E在图18B下紧接的部分显示了在第二电压下通过孔1803的示例性电流或通量。可以看出，第一电压处的电流或通量不同于第二电压处的电流或通量，并且此类电流或通量可以基于第二电压和报告物区1814相对于部分1832的位置，其又可以基于聚合酶1850对核苷酸1830的作用。
聚合酶1850对核苷酸1830的作用可以基于由此类系统产生的信号的测量(例如，光学或电学测量)幅度或时间持续或两者而单独鉴别。例如，聚合酶1850对核苷酸1830的作用可以引起部分1815和1832之间的相互作用，这进而导致报告物区1814变成相对于部分1832位于第一位置，并且在第一位置存在报告物区1814使得信号(例如，通过孔1803的电流或通量)具有第一幅度。因此，具有第一量级的信号与已经发生核苷酸1830时聚合酶1850的作用相关。注意，在部分1815和部分1832之间形成的双链体可以足够大，以便抑制双链体通过收缩部的移动，例如在第二电压下。
如图18C所示，在一些实施方案中，继续施加第二电压可以使部分1815与部分1832解离。此类解离可以被认为是“中断”部分1815和部分1832之间形成的双链体。在一些实施方案中，报告物区1814或1815或两者能移动通过收缩部1804，以便布置在纳米孔1800的第二侧1802上。图18E在图18C下紧接的部分显示了在部分1815与部分1832分开后在第二电压下通过孔1803的示例性电流或通量。部分1832可以配置为保持布置在纳米孔1800的第一侧上，即使部分1815变得布置在第二侧，以便暂时抑制部分1815和1832之间的相互作用。如图18D所示，在此类分开后，跨越孔1803施加的电压可以再次改变，例如可以改变回到第一电压，响应部分1815和1832可以彼此相互作用。图18E在图18D下紧接的部分显示在部分1815与部分1832相互作用后，在第一电压下通过孔1803的示例性电流或通量。
注意，在一些实施方案中，共同选择系链的伸长体和核苷酸的伸长标签的各自长度，部分1815和1832的各自位置以及报告物区1814的各自位置，以便以在核苷酸受聚合酶1850作用时抑制向核苷酸1830施加力，从而抑制或阻止此类力改变聚合酶的性能。在一个例示性实施方案中，部分1815和部分1832之间的相互作用形成双链体。系链的伸长体的长度以及部分1815沿着伸长体的位置可以共同选择，使得部分1815可以响应适当的施加电压而延伸通过收缩1804，例如以引起分开在部分1815和部分1832之间。核苷酸的伸长标签的长度和部分1832沿伸长标签的位置可以共同选择，以便提供额外的松弛，使得伸长的标签不需要按顺序拉紧以在第二施加电压下邻近收缩部1804布置报告体区1814。双链体1815，1832的大小可以抑制双链体通过收缩1804的移动，并且可以屏蔽核苷酸免受否则可能已经通过伸长标签1831施加到核苷酸1830的力。此外，报告物区1814和部分的相对位置1815和1832可以被共同选择，以便在第二电压下相对于收缩1804将报告物区1814布置在合适的位置，以便于当部分1815和1832彼此相互作用时检测报告物区。在一个示例性实施方案中，报告物区1814布置在沿着伸长体1831的合适位置处，以便当部分1815和1832响应聚合酶1850的作用而彼此相互作用时，布置在纳米孔1800的收缩1804内或邻近纳米孔1800的收缩1804。
作为检测聚合酶对核苷酸的作用的另一种替代方法，方法1500可选地可以包含检测孔内的系链的报告物区的移动(步骤1508)。上文参照图7A-14进一步描述了用于检测与作用于聚合酶的核苷酸结合的系链的报告物区的移动的示例性组合物。
注意，在步骤1507,1507或1508中的任一步骤后，方法1500还可以包含以与上面参照图7A-14类似的方式从系链释放核苷酸的部分。(图15中未具体显示的步骤)。另外，如下面参照图19A-20B或上文参考图7A-14更详细地描述的，本发明的组合物和方法可用于单独检测聚合酶对不同核苷酸的作用。
使用基于检测聚合酶在核苷酸上的作用的示例性方法和组合物通过合成测序
应当理解的是，15可以适当地用于检测聚合酶对具有与其连接的合适部分的任何类型的核苷酸的作用。在下面参照图1和2描述的例示性实施方案中，如图18-22F所示，方法1500可用于检测聚合酶对核苷酸的作用及其用于通过合成与第一核苷酸互补的第二多核苷酸来对第一多核苷酸进行测序，例如使用“通过合成测序”(SBS)。
图19A-19B示意性显示了包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的组合物，并且配置用于检测聚合酶对包含包含报告物区的伸长标签的核苷酸的作用。纳米孔包含生物孔1905，其可以布置在屏障(未具体显示)中，例如生物来源的膜例如脂质双层或固态膜。生物孔1905包含孔1903和收缩部1904.永久性系链包含头部区1911，伸长体1913和部分1915.聚合酶1950布置为邻近生物孔1905并与生物孔1905接触，并任选地锚定于生物孔1905通过物理或化学连接(例如，使用点击化学或半胱氨酸-马来酰亚胺键)。聚合酶1950配置为接收模板多核苷酸1970，例如待测序的环状或线性ssDNA，以通过根据以下顺序接收，结合和添加核苷酸而合成具有与ssDNA的序列互补的序列的多核苷酸1960。系链的头部区1911可以锚定到生物孔1905的任何合适的部分，其将部分1915放置得足够接近聚合酶1950，以便与可以由聚合酶1950结合的核苷酸的相应部分相互作用。例如，如图19B所示，核苷酸1930可以包含伸长标签1931，其包含与系链的部分1915相互作用的部分1932，以及配置为通过纳米孔1905的孔1903布置的报告物区1934。
在一个实例中，可以例如使用测量电路230和电极231，232施加跨越纳米孔1905的电压，如上面参照图2A进一步描述的，或测量电路240和电极241，242，如上面参照图2C进一步描述的。报告物区1914或伸长体1913任选地包含响应所施加的电压而使伸长体1913的尾部区1912向纳米孔1905的第二侧1902延伸的静电电荷。此外，核苷酸1930的伸长标签1931包含静电电荷响应所施加的电压，使得标签1931的末端区1933通过收缩1904，使得报告物区1934布置在收缩1904内或附近。响应聚合酶1950结合核苷酸1930，核苷酸1930的部分1932可以可逆地键合系链1932的部分1915，其可将报告物区1934布置在收缩1904内或附近。结果，通过聚合酶1950的核苷酸1930的结合可以被转化或转换成通过收缩1904的电流或通量的可测量变化，也可以称为阻断电流或通量。另外，通过施加的电压施加在系链上的力预期通过部分1915而不是聚合酶牵拉孔，因此预期不会显著破坏聚合酶活性。
在一个例示性实施方案中，部分1915包含第一寡核苷酸，并且部分1932包含与第一寡核苷酸互补的第二寡核苷酸，例如与第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的杂交可以使报告物区1934变得布置在收缩1904内或邻近收缩1904.核苷酸1930的结合可以基于测量的(例如，光学或电测量的)幅度或时间持续，或两者，通过收缩1904的电流或通量。图19B示意性显示了示例性核苷酸1930，例如T，包含伸长标签1931，其包含寡核苷酸部分1932，其可以例如通过δ磷酸连接附着于核苷酸1930的γ磷酸。
寡核苷酸部分1932可以包含选择为与系链的部分1915内的相应核苷酸序列杂交的任何合适的核苷酸序列。例如，图19B中所示的寡核苷酸部分1932可以包含示例性序列TACG，并且部分1915可以包含互补序列ATGC。以类似于上面参照图8A-14所描述的方式，聚合酶1905对核苷酸1930的作用可以将部分1932保持在相对接近系链部分1915的位置，导致寡核苷酸部分1932的局部浓度的瞬时增加，其可以优选诱导部分1932和1915之间的杂交附着到目前未被聚合酶1905作用的核苷酸上。所得杂交导致位于收缩1904内或附近的报告物区1934的部署。聚合酶1950可在将核苷酸1930并入多核苷酸中时释放伸长的标签1931，部分1932可以与部分1915解离。
每种不同类型的核苷酸可以包含以与图19B所示类似的方式附着到其γ磷酸酯的相应的伸长标签。例如，图19C示意性显示了包含伸长标签的示例性核苷酸，其包含各自的报告物区和在用于通过邻近纳米孔布置的聚合酶检测核苷酸的作用时结合示例性系链的部分。如图19C所示，A，T，C和G核苷酸可以分别包含伸长标签，伸长标签包含彼此不同的报告物区，例如分别由三角形，菱形，正方形和圆形表示。关于可以附着到核苷酸以允许彼此区分核苷酸的报告物区的进一步信息，参见Turner等人的美国专利号8,652,779，其全部内容通过引用并入本文。另外，伸长标签包含可以适当选择以与永久性系链的相应部分杂交的部分。然而，部分不需要彼此不同，并且实际上可以彼此相同，因为核苷酸可以基于它们各自的报告物区之间的差异而彼此区分。在一个例示性实施方案中，部分具有5至8个核苷酸的长度。预期在连接核苷酸上的部分之间的双链体和在系链上的部分之间的双链体的解链温度比其它方面相同的自由扩散寡核苷酸对显著更稳定，因为系链和整合的核苷酸相对于另一个保持在相对固定的位置，导致部分的局部浓度的有效增加，如上文参考图8A-14所讨论的。其它组合物可适当地用于基于聚合酶对核苷酸的检测作用通过合成进行测序。例如，图20A-20D示意性显示了包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的组合物，并且配置为用于检测聚合酶对第一核苷酸的作用，使用锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链，响应跨过纳米孔。图20E显示了在使用此类组合物期间可以产生的示例性信号。
图20A所示的组合物包含纳米孔2000，其包含第一侧2001，第二侧2002，延伸穿过第一侧和第二侧的孔径2003以及布置在第一侧和第二侧之间的收缩部2004；包含锚定到纳米孔2000的第二侧2002的头部区(未具体标记)，在纳米孔2000的第一侧2001和第二侧2002之间能移动的尾部区(未具体标记)的永久性系链包含多个报告物区2014，2024，2034和部分2015的伸长体(未具体标记)；和核苷酸2030，其包含包含部分2032但缺乏报告物区的伸长标签(未特异性标记)。如图20A所示，核苷酸2030的部分2032和系链2010的部分2015之间的相互作用可以将每个报告物区2014，2024，2034布置在相对于部分2032的预定位置。可以提供任何合适数量的报告物区，例如至少两个报告物区，三个报告物区，四个报告物区，五个报告物区或多于五个报告物区。另外，部分2015可以位于沿着伸长标签2013的任何合适的位置，例如，可以位于尾部区2012和第一报告物区2014中的每一个之间并且与之相邻，诸如图20A所示，或者可以邻近头部区2011，或者头部区2011和第三报告物区2034之间，或者任何报告物区2014，2024或2034之间。
应当理解，部分2032和一个或多个报告物区例如报告物区2014的相对位置可以以任何合适的方式检测。例如，组合物可以与测量电路可操作地通信，例如上面参考图2A或图2C所描述的。测量电路可以配置为检测报告物区2014相对于部分2032的位置。在一个例示性实施方案中，纳米孔2000，系链2010，聚合酶2050和核苷酸2030可以浸没在导电流体中，例如盐水溶液。类似于图2A所示的测量电路230或图2C中所示的测量电路240配置的测量电路可以与第一和第二电极连通，并且可以配置为在那些电极之间施加第一电压，以便跨纳米孔2000施加电压，如图20A中所示的“+”和“-”符号所示，并且使用电极来测量在第一电压下通过孔2003的电流或通量的大小。图20E在图20A下紧接的部分显示了在第一电压下通过孔2003的示例性电流或通量。报告物区2014可以具有与系链(未具体标记)的伸长体的一些或所有其它区以及一些或所有其它报告物区2024，2034不同的电或通量阻断性质。电流的大小或通量通过孔2003可以响应报告物区2014在孔2003内的相对位置而可测量地改变，并且此类相对位置可以基于所施加的电压和报告物区2014相对于部分2032的位置，其又可以是基于聚合酶2050在核苷酸2030上的作用。
更具体地，测量电路还可以配置为例如通过反转所施加的电压，例如通过反转“+”和“-”符号来将施加的跨纳米孔2000的电压改变为第二电压，例如如图20B所示。施加的电压的此类变化可以引起纳米孔2000的孔2003内的相互作用部分2015,2032的移动。如图20B所示，所施加的电压的变化可以移动邻近收缩部2004的相互作用部分2015，2032，并且可以相对于报告部区2024，2034选择性地相对于收缩部2004或者在收缩部2004内部布置报告物区2014。测量电路可以配置为使用电极以测量在第二电压下通过孔2003的电流或通量的量值。图20E在图20B下紧接的部分显示了在第二电压下通过孔2003的示例性电流或通量。可以看出，第一电压处的电流或通量不同于第二电压处的电流或通量，并且此类电流或通量可以基于第二电压和基于报告物区2014相对于部分2032的位置，这又可以基于聚合酶2050在核苷酸2030上的作用。
聚合酶2050对核苷酸2030的作用可以基于由此类系统产生的信号的测量(例如，光学或电学测量)幅度或时间持续或两者而单独鉴别。例如，聚合酶2050在核苷酸2030上的作用可以引起部分2015和2032之间的相互作用，这又导致报告物区2014相对于部分2032被置于第一位置，并且在第一位置存在报告物区2014使得信号(例如，通过孔2003的电流或通量)具有第一量值。因此，具有第一量级的信号与在发生核苷酸2030时聚合酶2050的作用相关。注意，在部分2015和部分2032之间形成的双链体可以足够大，以便抑制双链体通过收缩部的移动，例如在第二电压下。
如图20C所示，在一些实施方案中，继续施加第二电压可以使部分2015与部分2032解离。此类解离可以被认为是“中断”部分2015和部分2032之间形成的双链体。在一些实施方案中，报告物区2014或部分2015或两者可以移动通过收缩部2004，以便布置在纳米孔2000的第二侧2002上。图20E在图20C下紧接的部分显示了在部分2015从部分2032离解后在第二电压下通过孔2003的示例性电流或通量。部分2032可以配置为保持布置在纳米孔2000的第一侧上，即使部分2015变得布置在第二侧，以便暂时抑制部分2015和2032之间的相互作用。如图20D所示，在此类分开后，跨越孔2003施加的电压可以再次改变，例如可以改变回到第一电压，响应哪些部分2015和2032可以彼此相互作用。图20E在图20D下紧接的部分显示了在部分2015与部分2032相互作用后，在第一电压下通过孔2003的示例性电流或通量。
作为聚合酶2050在核苷酸2030上的作用的一部分，聚合酶2050可以例如从核苷酸2030切割伸长的标签，引起部分2032与部分2015的解离，并且可以根据以下步骤将核苷酸2030添加到多核苷酸2060：聚合酶2050然后可以作用于第二核苷酸。例如，图21A-21D示意性显示了图20A-20D的组合物，其配置用于检测聚合酶对第二核苷酸的作用，使用响应穿过纳米孔的电势的变化锚定或邻近纳米孔的系链，图21E显示了在使用此类组合物期间可以产生的示例性信号。更具体地，图21显示了作用于具有第二部分2032'的第二核苷酸2030'上的聚合酶2050。第二核苷酸2030'的第二部分2032'以与第一核苷酸2030的部分2032不同的方式与部分2015相互作用。
例如，如图21A所示，第二核苷酸2030'的部分2032'和系链的部分2015之间的相互作用可以将每个报告物区2014，2024，2034布置在相对于部分2032'的预定位置，该预定位置不同于图21A中所示的预定位置。因为部分2032'不同于部分2032，例如，与部分2023的不同部分相互作用。测量电路可配置为响应第一和第二部分2032'检测报告物区2024相对于部分2032'的位置以类似于上面参照图20A-20E描述的方式施加电压。例如，图21E在图21A下紧接的部分显示了在第一电压下通过孔2003的示例性电流或通量。报告物区2024可以具有与系链(未具体标记)的伸长体的一些或所有其它区以及一些或所有其它报告物区2014，2034不同的电或通量阻断性质。
响应报告物区2014在孔2003内的相对位置，通过孔2003的电流或通量的大小可以可测量地改变，并且此类相对位置可以基于施加的电压和报告物区2014相对于部分2032'，其又可以基于聚合酶2050对核苷酸2030'的作用。更具体地，测量电路还可以配置为例如通过反转施加的电压，例如通过“+”和“-”符号的反转表示，将施加的跨纳米孔2000的电压改变为第二电压，例如如图21B中所示。施加的电压的此类变化可以引起纳米孔2000的孔2003内的相互作用部分2015，2032'的移动。例如，如图21B所示，所施加的电压的变化可以移动邻近收缩部2004的相互作用部分2015，2032'，并且可以相对于报告部区2014，2034选择性地将收集器区2024相对于收缩部2004布置或邻近收缩部2004.测量电路可以配置为使用电极以测量在第二电压下通过孔2003的电流或通量的大小。图21E在图21B下紧接的部分显示了在第二电压下通过孔2003的示例性电流或通量。可以看出，第一电压处的电流或通量不同于第二电压处的电流或通量，并且此类电流或通量可以基于第二电压和报告物区2024相对于部分2032'的位置，这又可以基于聚合酶2050对核苷酸2030'的作用。例如，可以看出，对应于图21B的图21E中所示的电流或通量大于对应于图20B的图20E中所示的电流或通量，因为报告物区2024具有与报告物区2014相比可测量的不同特征。因此，信号的量值，例如电流或通量，与聚合酶2050作用的特定类型的核苷酸相关。
如图21C所示，在一些实施方案中，继续施加第二电压可以使得部分2015以类似于上面参考图20C所描述的方式从部分2032'解离。图21E在图21C下紧接的部分显示了在部分2015与部分2032'相互作用后，在第一电压下通过孔2003的示例性电流或通量。如图21D所示，在此类分开后，跨越孔2003施加的电压可以再次改变，例如可以改变回到第一电压，响应哪些部分2015和2032'可以以上面参考图20D描述的方式彼此相互作用。图21E在图21D下紧接的部分显示了在部分2015与部分2032'的相互作用后，在第一电压下通过孔2003的示例性电流或通量。
注意，在一些实施方案中，系链的伸长体和核苷酸的伸长标签的各自长度，部分2015和2032和2032'的各自位置，以及报告物区2014，2024，2024的各自位置，和2034被共同选择，以便抑制对核苷酸2030或2030'施加力，同时核苷酸分别受聚合酶2050作用，因此抑制或排除此类力来修饰聚合酶的性能，如以允许不同的核苷酸可以彼此单独能区分。在一个例示性实施方案中，部分2015与部分2032或2032'之间的相互作用形成双链体。系链的伸长体的长度和部分2015沿着伸长体的位置可以共同选择，使得部分2015可以响应适当施加的电压而延伸通过收缩部2004，例如，以允许部分2015在部分2015和部分2032或部分2032'之间。可以共同选择核苷酸的伸长标签的长度以及沿伸长标签的部分2032或2032'的位置，以便提供额外的松弛，使得伸长的标签不需要被拉紧，以便分别布置一个在第二施加电压下在收缩部2004内或邻近收缩部2004内的报告物区2014，2024或2034。双链体2015，2032或2015，2032'的尺寸可以抑制双链体通过收缩器2004的移动，并且可以屏蔽相应的核苷酸2030，2030'免受否则可能已经通过伸长施加到核苷酸2030或2030'的力标签2031.另外，报告物区2014，2024和2034以及部分2015和2032和2032'的相对位置可以共同选择，以便将这些报告物区中的一个布置在相对于在第二电压，以便当部分2015和2032或部分2015和2032'分别彼此相互作用时促进对该报告物区的检测。在一个示例性实施方案中，报告物区2014布置在沿着伸长体2031的第一位置处，以便当部分2015和2032响应聚合酶2050的作用而彼此相互作用时，布置在纳米孔2000的收缩部2004内或邻近纳米孔2000的收缩部2004，报告物区2024布置在沿着伸长体2031的第二位置处，以便当部分2015和2032'响应聚合酶2050和报告物区2034的作用而彼此相互作用时，布置在纳米孔2000的收缩部2004内或邻近纳米孔2000的收缩部2004沿着伸长体2031布置在合适的位置，以便当部分2015与响应聚合酶2050的作用的另一个核苷酸的部分相互作用时，布置在纳米孔2000的收缩部2004内或附近。因此，应当理解可以提供任何合适数量的报告物区，以便提供对应于被聚合酶作用的特定核苷酸的可检测信号。
注意，上面参考图18A-18E进一步描述的实施方案，其中系链的头部区锚定到纳米孔的第一侧，而不是锚定到纳米孔的第二侧，可以以类似于图20A-21E的方式使用，以便单独鉴定被聚合酶作用的核苷酸。
还可以使用其它适当的构造。例如，图22A-22F示意性显示根据本发明的一些实施方案的包含邻近纳米孔锚定的系链并且配置为用于使用跨纳米孔施加的电压的变化来检测聚合酶对第一核苷酸的作用的组合物。
更具体地，图22A显示了包含纳米孔2300的组合物，纳米孔2300包含第一侧2201，第二侧2202，延伸穿过第一侧和第二侧的孔径2203，以及布置在第一侧和第二侧之间的收缩部2204。例示性地，纳米孔2200可以包含布置在屏障(例如生物来源的膜(例如脂质双层)或固态膜)中的生物孔，例如MspA纳米孔(例如，M2-NNN MspA突变体)。另外，图22A还包含系链2210，其包含头部区2211，尾部区2212和布置在它们之间的伸长体2213。头部区2211适当地锚定于聚合酶2250，例如使用本文提供的或本领域已知的任何合适的连接。系链2210的伸长体2213可包含部分2214.例示性地，伸长体2213可包含多核苷酸，并且多核苷酸的核酸的第一子集可限定部分2214.另外，尾部区2212可包含至少一个带电原子使得基于跨越图1中所示的纳米孔2200施加的电压，在步骤1期间，如图22A所示，此类电压产生第一定向力F1，其导致尾部区2212通过孔2203和经过收缩部2204的位移，使得伸长尾部2213的一部分变得布置在孔2203内，并且尾部区变得布置超过第二侧2202纳米孔2200，以例如图22B中所示的方式。例如，此类电压可以使用诸如本文参照图2A-2C描述的系统来施加。此类定向力F1还引起聚合酶2250向纳米孔2200的第二侧2202移位，直到聚合酶2250以如图5所示的方式停留在纳米孔2200的第一侧2201上或邻近纳米孔2200的第一侧2201，以例如图22B中所示的方式，防止或抑制聚合酶2250在定向力F1下的进一步移动。注意，聚合酶任选地可以部分地布置在纳米孔2200的孔2203内。
图22A中所述的组合物还可以包含另一成员2250'，系链210的尾部区2212可以以类似于上面参考图1M的方式附着到其上。例如，图22A中所示的组合物可以包含一个或多个多核苷酸2250'，其具有适当地可以与伸长体2213或系链2210的尾部区2212上的相应核酸杂交的序列。如图22B所示，在步骤1(图22A)期间施加并且可以在步骤2(图22B)期间施加的定向力F1下，尾部区2212变得布置成超过纳米孔2200的第二侧2202，并且变得附着到，例如，成员2250'，例如，邻近存在的互补DNA片段(“捕获-DNA”)。尾部区2212和成员2250'之间的键，例如尾部区2212的一个或多个第一核酸与成员2250的一个或多个第二核酸之间的杂交以形成例如双链DNA的双链体2212,2250'足够强，使得在施加反向力F2时(例如，在图22C所示的步骤3期间)，例如电压的反转，双链体抑制聚合酶从纳米孔分开，因此，聚合酶保持捕获在纳米孔。例如，双链体2212，2250'可以包含足够数量的杂交核酸，使得双链体在施加力F2时不解离。另外，双链体2212，2250'可以足够大，以便抑制双链体通过收缩部2204的移动。另外，在一些实施方案中，选择纳米孔2200的收缩部2204的横向尺寸，使得只有单个伸长体2213单个系链2210可以穿过其布置，因此确保只有一个聚合酶2250在纳米孔处被捕获。
在具体实施方案中，质量评估步骤可用于评价纳米孔或聚合酶在纳米孔处的捕获。适当地嵌入膜中的纳米孔可以产生与当在膜中不存在纳米孔时或当纳米孔不是完全功能时得到的电流或通量样式可区分的特征电流或通量样式。在质量评估表明纳米孔未适当地嵌入膜中的情况下，可以重复用于装载纳米孔的步骤。
由纳米孔适当捕获的聚合酶也可以产生特征电流或通量模式。例如，施加到已经通过系链捕获聚合酶的纳米孔的偏置电压可以产生指示纳米孔孔和核酸系链中的标记基底之间的相互作用的电流或通量模式。可以在相反方向上施加偏压电压，以确定系链在纳米孔腔中是否具有所需的迁移率，使得标记基底与所预测的孔相互作用。在质量评估表明聚合酶没有被纳米孔适当捕获的情况下，可以例如通过施加强反向偏压来剥离聚合酶，并且可以重复用于在纳米孔捕获聚合酶的步骤。
在另一个可选的质量评估程序中，可以向系统施加相对大的反向偏置电压，以确定聚合酶和系链是否从纳米孔中除去。通常，在成员2250'和2212之间形成的双相将足够强以防止系链的移除。此质量评估程序将指示是否是此类情况。类似地，可以在该阶段施加偏置电压，并且检测所得到的电流或通量模式，以确定是否如本文先前发生栓塞或不栓。在质量评估表明聚合酶没有被具有足够稳定性的纳米孔捕获的情况下，可以重复用于在纳米孔捕获聚合酶的步骤。
本文列出的的几个实施方案涉及装载有多个纳米孔的多重装置，其中每个纳米孔都希望附着到聚合酶。可以对多重群体进行质量评估步骤，例如上述的那些步骤。如果在多重纳米孔装置中没有形成所需数量的功能性纳米孔，或者如果分数负载不足，则可以整体处理装置以重复纳米孔(或聚合酶)负载。任选地，可以在重复加载步骤之前除去纳米孔(或聚合酶)，例如，如果存在有缺陷的纳米孔或聚合酶。例如，如果多重装置以小于90％，75％，50％，30％或更少的预期位点装载，则可以进行装载的重复(和任选地去除纳米孔或聚合酶)。
在图22C所示的步骤3，图22B所示的组合物还可以经受反向力F2，例如相对于步骤1和2的电压反向的电压，基于哪个聚合酶2250可以脱离与纳米孔2200的第一侧2201的接触，并且可以与纳米孔2200的第一侧2201接触测序引物2280，靶单链DNA 2270(靶)和多个核苷酸2230,2230'，每个核苷酸包含相应的伸长标签2231，2231'，其包含与系链2213的部分相互作用的相应部分2232，2232'，响应作用于核苷酸2230或230'的聚合酶2250。
在图22D所示的步骤4，基于靶物2270的序列，聚合酶2250作用于第一核苷酸2230，基于此，核苷酸2230的伸长标签2231的相应部分2232与系链2310的部分2214相互作用。例如，聚合酶2250可优先结合第一核苷酸。另外，伸长的标签2231可以包含第一核苷酸序列，并且伸长体2213的部分2214可以包含第二核苷酸序列，其中第一核苷酸2230与靶2270的序列中的下一个核苷酸互补，其与伸长标签2231的第一核苷酸序列互补，使得第一核苷酸序列和第二核苷酸序列彼此杂交。注意，步骤4可以在反向力F2下进行，例如相对于步骤1和2的电压反转电压，使得聚合酶2250不需要布置在纳米孔2200的第一侧2201上。
在图22E所示的步骤5，可以再次施加方向力F1，这可能导致尾部区2212在远离纳米孔220的第一侧2201的方向上的移位以及聚合酶2250向纳米孔2200的第二侧2202的移位。例如，纳米孔2200也可以颠倒，例如，使用诸如本文参考图2A-2C描述的系统。然而，在步骤5施加力F1可能不一定导致聚合酶2250以如图22B所示的方式停留在纳米孔2200的第一侧2201上或与之相邻。相反，施加力F1(拉向反方向)可以导致由部分2214和2232之间的相互作用(例如，结合或杂交)限定的双链体停留在收缩部2204上或邻近收缩部2204.例如，组合物可以包含在包含配置为测量通过收缩部2204的电流或通量的测量电路的系统。在步骤5期间，电流或通量可以基于第一部分2232，例如基于部分2232的特定序列，并且第一核苷酸2230可以可基于电流或通量鉴定。例如，第一核苷酸2230的部分2232可以具有与第二核苷酸2230'的部分2232'不同的序列，并且可以与系链2210的伸长体2213的不同部分(部分)结合。例示性地，伸长标签可以包含有助于彼此区分此类标签连接的核苷酸的任何合适的多核苷酸序列，例如本文参考图19A-21D。
在图22F所示的步骤6，在连续施加定向力F1的情况下，在随机时间后，系链2210的部分2214和核苷酸2230的伸长标签2231的部分2232之间的双链体以类似于Derrington等人，PNAS 2010，其它地方。在此类解离后，定向力F1可以使聚合酶2250以例如图22B所示的方式停留在纳米孔2200的第一侧2201上或邻近纳米孔2200的第一侧2201。注意，可以适当地使用其它配置。例如，作为分别在图22E和22F中分别显示的步骤5和6的替代，伸长标签2231可以足够短，使得系链2210的部分2214和核苷酸2230的伸长标签2231的部分2232之间的双链不会到达收缩在施加定向力F1的同时，聚合物2250以例如图22B所示的方式停留在纳米孔2200的第一侧2201上或附近。在此类实施方案中，附着到可以由聚合酶2250结合的不同核苷酸2230，2230'的伸长标签2231,2231'可以包含彼此不同的序列或长度的部分2232，2232'，因此与不同的核苷酸2230，2230'与系链2210的部分2214彼此不同地杂交，以便以类似于本文参考图7A-14的方式引起系链2214的长度的不同变化。基于由部分2214和相应部分2232，2223'之间的相互作用引起的系链2210的长度，基于电流或通量的变化可鉴定相应的核苷酸2230,2230'。类似于图22D-22F中所示的步骤可以重复，因此施加保持电极的AC电压。在另一个实施方案中，伸长标签或伸长体可以包含诸如本文别处提供的报告物区，并且通过孔2203的电流或通量可以基于布置在孔径内的报告物区，并且核苷酸2230可以能鉴定基于电流或通量。
另外，注意如果捕获到功能失调的聚合酶，可以将电压反转到非常高的电压，使得捕获DNA脱落并且可以捕获新的聚合酶(重复步骤1-3)。
可以测量穿过纳米孔的系链的各种状态的电压，电流或光学波形。电压，电流或光学波形可用于确定在纳米孔系统上进行的分析方法的结果。例如，波形可以拟合数据以增加测序读数的准确度。
图24A至24C显示模拟本文阐述的核酸测序方法中经历的状态的系链的三种电势状态。所得到的光学或电学信号，例如电压波形，如图24D所示。蛋白质-DNA系链缀合物被捕获在MspA纳米孔中并使用反式侧锁寡核苷酸锁定到位。然后将与DNA系链的区互补的寡核苷酸加入到顺式侧。电压在120mV和-60mV之间循环，大约200msec周期。图24A显示了在施加正向电压时的缀合物，并且所得到的信号在图24D的102处指示。图24B显示了在施加负电压时的缀合物，并且所得到的信号在图24D的2400处指示。图24C显示了被拉至孔收缩的寡核苷酸缀合物的杂交。在图24D的2401处的剥离之前看到双链体信号。在剥离后，系统返回到图24A所示的状态，同时电压仍然在120mV，导致信号2402。
在诸如上面参照图20A-22F和24A-24D描述的实施方案中，注意到核苷酸上的伸长标签的部分被设计成与系链的伸长体的部分相互作用。例如，核苷酸的伸长标签和伸展的系链体可以包含彼此杂交(退火)，例如可以包含DNA的多核苷酸。在此类实施方案中，核苷酸的伸长标签可以包含基本上不与聚合酶相互作用的核苷酸类似物。核苷酸之间的区别可以通过使用在系链序列内的略微不同位置退火的四个不同部分来实现。例如，在一个例示性实施方案中，与新生双链体相邻的3-4个核苷酸产生最大不同的对应于四个不同核苷酸的封闭电流或通量。如果存在双链体，则系链可以以类似于图18B，20B或21B所示的方式停止在收缩部附近，持续一段时间，例如几毫秒，因为双链体被解离(剥离)，并记录与邻近双链体区的3-4个核苷酸成比例的电流或通量阻断读数。在剥离时，AC电压通过其与标记的核苷酸上的DNA标签的随机相互作用重置双链体，标记的核苷酸锁定在第三封闭状态复合物中。可以调节AC电压的频率，使得对于给定的AC循环，检测扩散事件(游离核苷酸)的可能性相对较低，并且检测掺入事件(结合在封闭的三级结构体)。此外，每个核苷酸掺入事件的AC循环的数目可以是5X至100X过采样的数量级，以充分地区分掺入事件与扩散事件。注意，在此类相互作用模式中，代替依赖于来自系链的核苷酸的伸长标签的固有解离速率，伸长标签的部分和系链彼此相互作用，然后可以在下面被有效地剥离AC电压控制，以类似于图18C，20C或21C所示的方式。AC电压的频率(即)可以被调节为恰好足够长以检测“mM浓度”标签的结合，但显著短于掺入的停留时间。双链体的此类主动剥离可以消除对解离速率的指数分布的依赖性。
如本文别处所述，多种组合物可适当地包含在核苷酸的伸长标签或系链的伸长体或两者中。此类组合物可以包含DNA，PNA，LNA，RNA，吗啉代，PEG(聚乙二醇)等，并且可以具有任何合适的长度。包含适当修饰的核苷酸的寡核苷酸标记物可以适当地附着到此类不同的组合物，例如，使用点击化学相容的前体是理想的。在一个实例中，核苷酸是叠氮化物标记的，这将有利于使用容易合成的炔标记的寡核苷酸。示例性分子包含如下所示的四磷酸盐标记的核苷酸，其中(A)对应于叠氮化物-P4O13-dTTP，(B)对应于Alkyne-P4O13-dTTP。这些核苷酸可以通过使用标准点击化学用任何期望的标签进行修饰：
关于制备和标记四磷酸核苷酸的参考文献包含以下，其各自的全部内容通过引用并入本文：
Kumar，S.，A.Sood，J.Weener，PJFinn，S.Nampalli，JRNelson，A.Sekher，P.Mitsis，J.Macklin和CWFuller，“Terminal phosphate labeled nucleotides：synthesis，applications，and linker effect on incorporation by DNA polymerases，“Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 24(5-7)：401-408(2005)；
Sood，A.，S.Kumar，S.Nampalli，J.R.Nelson，J.Macklin和C.W.Fuller，"Terminalphosphate-labeled nucleotides with improved substrate properties forhomogeneous nucleic acid assays“，J Am Chem Soc 127(8)：2394-2395(2005)；
Kumar，S.，C.Tao，M.Chien，B.Hellner，A.Balijepalli，JWRobertson，Z.Li，JJRusso，JEReiner，JJKasianowicz和J.Ju，“PEG-labeled nucleotides and nanoporedetection for single molecule DNA sequencing by synthesis”，Sci Rep2：684(8pages)(2012)；
Bonnac，L.，SELee，GT Giuffredi，LMElphick，AAAnderson，ESBird，DJMann andV.Gouverneur,“Synthesis and O-phosphorylation of3,3,4,4-tetrafluoroaryl-C-nucleoside analogues”,Org Biomol Chem 8(6)：1445-1454(2010)；和
Lee，SE，LMElphick，AAAnderson，L.Bonnac，ESBird，DJMann和V.Gouverneur，“Synthesis and reactivity of novel gamma-phosphate modified ATP analogues”，Bioorg Med Chem Lett 19(14)：3804-3807(2009)。
如本文别处所述，任何合适的检测方法或系统可用于检测聚合酶对核苷酸的作用。例如，荧光共振能量转移(FRET)是基于光学的检测方法，其适合地可以与本发明的组合物一起使用，以检测聚合酶对核苷酸的作用。在示例性方法中，第一核苷酸的第一伸长标签还包含第一荧光共振能量转移(FRET)对配偶体，例如FRET受体或供体，并且该系链还包含第二FRET对配偶体，例如FRET供体或受体。第一FRET对配偶体和第二FRET对配偶体可以响应作用于第一核苷酸上的聚合酶而彼此相互作用。该方法还可以包含检测响应第一FRET对配偶体和第二FRET对配偶体之间的相互作用而发射的第一波长。该方法还可以包含提供包含第二伸长标签的第二核苷酸，第二伸长标签包含第三荧光共振能量转移(FRET)配偶体，例如FRET受体或供体。第三FRET对配偶体和第二FRET对配偶体可以响应作用于第二核苷酸上的聚合酶而彼此相互作用。该方法还可以包含检测响应第三FRET对配偶体和第二FRET对配偶体之间的相互作用而发射的第二波长。基于第一和第二波长，第一和第二核苷酸可以单独地彼此区分。
作为一个例示性示例，图23A示意性显示了根据本发明的一些实施方案的包含伸长标签的示例性核苷酸，其包含相应报告物区和在检测聚合酶对核苷酸的作用期间可以结合示例性系链的部分。每种不同类型的核苷酸可以包含以与上文参照图19B-19C描述的方式类似的方式连接至其γ磷酸盐的相应的伸长标签，并且包含可以用作报告物区的相应的荧光共振能量转移(FRET)配偶体，例如FRET受体或供体。例如，图23A示意性显示了包含伸长标签2331的示例性核苷酸2330，伸长标签2331包含各自的基于FRET受体的报告物区2334，并且任选地还包含在用于通过邻近纳米孔布置的聚合酶检测核苷酸作用时可以结合示例性系链的部分2332。如图23A所示，A，T，C和G核苷酸可以分别包含伸长的标签，伸长的标签包含彼此不同的，例如分别由三角形，菱形，正方形和圆圈表示的不同的基于FRET受体的报告物区。或者，A，T，C和G核苷酸可以分别包含伸长的标签，其包含彼此不同的基于FRET供体的报告物区，例如分别由三角形，菱形，正方形和圆形表示。关于FRET对配偶体(例如受体和供体)以及用于检测FRET对配偶体之间的相互作用的排放的系统和方法的进一步信息，参见Huber的美国专利公开号2014/0087474和PCT专利公开号WO 2014/066902，Huber等人，两者的全部内容通过引用并入本文。
任选地，核苷酸2330的伸长的标签2331包含可以适当地选择以与永久性系链的相应部分杂交的部分，如下文参考图23B-23C更详细地描述。然而，核苷酸的任选部分2332不需要彼此不同，并且实际上可以彼此相同，因为核苷酸可以基于它们基于FRET对配偶体的各自报告物区之间的差异而彼此区分。在一个例示性实施方案中，任选的部分2315和2332具有5至8个核苷酸的长度。预期在连接核苷酸上的部分之间的双链体和在系链上的部分之间的双链体的解链温度比其它方面相同的自由扩散寡核苷酸对显著更稳定，因为系链和整合的核苷酸相对于另一个保持在相对固定的位置，导致部分的局部浓度的有效增加，如上文参考图8A-14所讨论的。可以用作部分的示例性寡核苷酸在本文中进一步描述，例如参考图19A-19C。
在一个示例中，图23B示意性显示了根据本发明的一些实施方案，包含锚定到纳米孔或纳米孔附近的系链的组合物，并且配置用于基于系链和核苷酸的报告物区之间的相互作用来检测聚合酶对第一核苷酸的作用。本发明。系链可以包含与核苷酸2331的相应FRET对配对体相互作用的FRET对配偶体。在一个例示性实施方案中，该链的FRET对配对体是FRET供体，并且核苷酸的相应FRET对配偶体是FRET受体。在另一个例示性实施方案中，系链的FRET对配偶体是FRET受体，并且核苷酸的相应FRET对配偶体是FRET供体。
纳米孔包含生物孔2305，其可以布置在屏障(未具体显示)中，例如生物来源的膜，例如脂质双层或固态膜。生物孔2305包含孔2303和收缩部2304.永久性系链包含头部区2311，伸长体2313，任选的部分2315和FRET对配偶体2316，例如供体或受体，任选其可以位于或邻近尾部区2312的固定系链。聚合酶2350邻近生物孔2305布置并与生物孔2305接触，并任选地通过物理或化学连接(例如，使用点击化学或半胱氨酸-马来酰亚胺键)锚定到生物孔2305。聚合酶2350配置为接收待测序的模板多核苷酸2370，例如环状或线性ssDNA，以通过依照接收，结合和添加核苷酸而合成具有与ssDNA互补的序列的多核苷酸2360ssDNA的序列。系链的头部区2311可锚定到生物孔2305的任何合适部分，其使FRET对配偶体2316足够接近聚合酶2350，以便与可以通过聚合酶结合的核苷酸2330的基于FRET对配体的报告物区2334相互作用例如，基于FRET供体2316和基于FRET受体的报告物区2334彼此在约70埃内，可以基于可以鉴定哪个核苷酸2330来发射特征波长的光。在另一个实例中，基于FRET受体2316和基于FRET供体的报告物区2334彼此在约70埃内，可以基于可以鉴定哪个核苷酸2330来发射特征波长的光。
例如，图23C示意性显示了根据本发明的一些实施方案，在聚合酶对第一核苷酸的作用期间图23A的报告物区之一与图23B之间的可检测相互作用。，如图23C所示，核苷酸2330可以包含伸长标签2331，其包含与系链的第二FRET对配偶体2316相互作用的第一基于FRET对配偶体的报告基因区2334。在其中永久性系链包含部分2315并且核苷酸的伸长标签2331包含部分2332的某些实施方案中，部分2315和2332可以彼此相互作用。
在一些实施方案中，第一基于FRET对配偶体的报告基因区2334和第二FRET对配偶基因2316响应作用于核苷酸2330上的聚合酶2350而彼此相互作用，第一波长响应第一基于FRET基于配偶体报告物区2334和第二FRET对配偶体2316可以是可检测的。例如，如图23C所示，示例性核苷酸2330(例如T)包含伸长标签2331，其包含基于FRET受体的报告物区2334和任选的寡核苷酸部分2332，其可以附着到核苷酸2330的γ磷酸，例如，通过δ磷酸酯键。基于FRET受体的报告基因区2334和系链的FRET供体2316之间的相互作用导致选择的波长“λT”的光被发射。合适的测量电路，例如上面参照图2A进一步描述的。可选地，在一个示例性实施方案中，在一个例示性实施方案中，部分2315包含第一寡核苷酸，并且部分2332包含与第二寡核苷酸互补的第二寡核苷酸第一寡核苷酸，例如，与第一寡核苷酸杂交。第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的杂交可以导致基于FRET受体的报告物区2334变得与FRET供体2316相邻布置。聚合酶2350对核苷酸2330的作用可以基于具有波长“λT”的光的发射而单独检测，响应基于FRET受体的报告基因区2334和FRET供体2316之间的相互作用。应当理解，区2334可以替代地基于FRET供体，而区2316可以基于FRET受体。
另外，如图23A所示，每种不同类型的核苷酸可以包含相应的伸长标签2331，其包含相应的基于FRET对配偶体的报告物区2334.每个此类报告物区2334可以配置为使得报告物区和FRET对配偶体2316之间的相互作用发射相应波长，基于其可以鉴定相应的核苷酸。例如，附着到A核苷酸2330(用三角形表示)的FRET对配偶体报告基因区2334与FRET对配偶体2316的相互作用可以引起具有波长“λA”的光的发射；附着到C核苷酸2330(用正方形表示)与FRET对配偶体2316的基于FRET对配偶体的报告基因区2334的相互作用可以引起具有波长“λC”的光的发射；并且附着到G核苷酸2330(用圆圈表示)与FRET对配偶体2316的基于FRET对配偶体的报告物区2334的相互作用可以引起具有波长“λG”的光的发射。因此，每个此类报告物区2334与FRET对配偶体2316的相互作用可促进相应核苷酸的鉴定。例如，响应聚合酶作用于第一核苷酸，第一核苷酸的第一FRET对配偶体和系链的第二FRET对配偶体可以彼此相互作用。可以检测响应第一FRET对配偶体和第二FRET对配偶体之间的相互作用而发射的第一波长。第二核苷酸可以包含包含第三FRET对配偶体的第二伸长标签。响应聚合酶作用于第二核苷酸，第三FRET对配偶体和系链的第二FRET对配偶体可以彼此相互作用。光学检测系统可以配置为检测响应第三FRET对配偶体和第二FRET配偶体之间的相互作用而发射的第二波长。基于第一和第二波长，第一和第二核苷酸可以单独地彼此区分。
核苷酸2330的伸长标签2331可以在以例如本文别处描述的方式将此类核苷酸并入多核苷酸2360中后被切割。
另外，注意，FRET供体和受体的作用适当地可以互换。例如，永久性系链可以包含FRET受体，并且核苷酸2330的伸长标签2331可以包含基于FRET供体的报告物区2334。或者，例如，永久性系链可以包含FRET供体，并且伸长的标签2331核苷酸2330可以包含基于FRET受体的报告物区2334。此类FRET对配偶体之间的相互作用可以基于可以鉴定每个相应的核苷酸而导致发射光。
信号的统计分布的示例性修改
应当注意，可以基于响应施加的电压的伸长体的第一部分和伸长标签的第二部分之间的相互作用而形成的双链体的解离可以表征为限定第一途径，其特征在于两个或更多个动力学常数。另外，聚合酶对核苷酸的作用，例如聚合酶的构象变化，焦磷酸的释放或核苷酸的伸长标签的释放，可以表征为限定第二途径，其特征在于两种或更多种动力学常数。在获得第一途径或第二途径的测量过程期间测量(例如，光学或电学测量)的信号的统计分布可以基于对应于该途径的这些动力学常数的相对值。例如，基于第一途径或第二途径的给定动力学常数明显大于该途径的其它动力学常数，该途径的动力学可以由给定的动力学常数支配，并且得到的信号的统计分布可以通过指数函数描述。相比之下，第一途径或第二途径的两个或更多个动力学常数可以选择为彼此具有相同的数量级，或者甚至使得彼此基本相同(例如，彼此相差5倍或更少，或4倍或更少，或3倍或更少，或两倍或更少)，使得该途径的动力学不受任一动力学常数支配，并且所得的统计分布信号可以由伽马函数描述，其中基本上不存在基本上不可观察的零时间或非常短的事件的概率。相比之下，对于指数分布，存在基本上不可观察的非常短或零时间事件的高概率。
可以以任何合适的方式修饰第一或第二途径的一个或多个动力学常数，以便与该途径的一个或多个其它动力学常数具有相同的顺序，或者甚至是基本上与该途径的一个或多个其它动力学常数相同。例如，可以修饰本文提供的任何组合物的聚合酶以响应核苷酸掺入第一核苷酸而延迟焦磷酸的释放，从而修饰第二途径的至少一个动力学常数。例如，在一些实施方案中，聚合酶可包含修饰的重组Ф29，B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，G1，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5,CP-7，PR4，PR5，PR722或L17聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶可以包含具有选自以下的至少一个氨基酸取代或取代组合的修饰的重组Φ29DNA聚合酶：在位置484的氨基酸取代，在位置198的氨基酸取代和在一些实施方案中，聚合酶可包含具有选自E375Y，K512Y，T368F，A484E，A484Y，N387L，A484E，A484Y，N387L和E384L的至少一个氨基酸取代或取代组合的修饰的重组Φ29DNA聚合酶，T372Q，T372L，K478Y，1370W，F198W和L381A。关于可响应核苷酸掺入多核苷酸而延迟焦磷酸盐释放的示例性修饰聚合酶的进一步细节，参见Bjornson等人的美国专利号8,133,672，其全部内容通过引用并入本文。
作为另一个实例，第一途径的一个或多个动力学常数可以通过沿着任何本发明的系链包含与第一部分杂交以形成发夹结构的第二部分来修饰。系链的第一和第二部分可以配置为响应施加在纳米孔上的电压，在两步过程中彼此去杂交。具有配置为形成发夹结构的标记物的示例性四磷酸修饰的核苷酸显示在图26A中。在与系链杂交时，形成如图26C所示的发夹。该发夹可以预期具有两个剥离速率常数k1和k2，如图26C所示。这些速率常数可以设计为彼此具有相似的量级，使得当加在一起时，它们可以形成伽马分布。具有两个标记的第二个示例性四磷酸修饰的核苷酸示于图26B。存在两个标签，每个标签配置为与系链相互作用，如图26D所示。每个标记物分别具有其自己的剥离速率常数k1和k2，并且对于整个剥离事件的这两个速率常数的总和可以产生伽马函数。注意，可以使用任何合适的磷酸酯部分，例如包含三种，四种或六种磷酸酯的部分。
例示性地，在一些实施方案中，组合物包含纳米孔，其包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一和第二侧的孔；和包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链，头部区锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近，并且伸长体包含可在孔响应邻近纳米孔的第一侧发生的第一事件。以上至少参考图1C，1D，1E-1M，5A-5B，6C-6D，7A-7B，8A-8B，9A-9B，10A-10C，11A-11D，12A-12C，13A-13E，20A-20E，22E，23A-23C和24A-24D提供了此类组合物的示例性实施方案。
在一些实施方案中，此类组合物还包含布置在第一侧上的聚合酶，头部区锚定到聚合酶。组合物还可以包含第一核苷酸和各自与聚合酶接触的第一和第二多核苷酸，聚合酶配置为基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。聚合酶任选地可以被修饰以响应将第一核苷酸添加到第一多核苷酸而延迟焦磷酸盐的释放。例如，聚合酶可包含修饰的重组Ф29，B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，G1，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5，Cp-7,PR4,PR5，PR722或L17聚合酶。例如，聚合酶可以包含具有选自以下的至少一个氨基酸取代或取代组合的修饰的重组Φ29DNA聚合酶：在位置484的氨基酸取代，在位置198的氨基酸取代和氨基酸或者，例如，聚合酶可以包含具有至少一个氨基酸取代或选自E375Y，K512Y，T368F，A484E，A484Y，N387L，K482Y，N387L，T372Q，T372L，K478Y，1370W，F198W和L381A。
例示性地，在一些实施方案中，方法可包含提供包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一和第二侧的孔的纳米孔；提供包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链，头部区锚定到纳米孔的第一或第二侧或纳米孔的第一或第二侧附近，伸长体包含报告物区；以及响应邻近纳米孔的第一侧发生的第一事件，在孔径内移动报告物。这些方法的示例性实施方案至少参考图3A，4A-4B和15提供。
在一些实施方案中，方法还可以包含在第一侧上布置聚合酶，头部区锚定到聚合酶。该方法还可以包含使聚合酶与第一核苷酸以及与第一和第二多核苷酸接触，聚合酶基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。聚合酶任选地可以被修饰以响应将第一核苷酸添加到第一多核苷酸而延迟焦磷酸盐的释放。例如，聚合酶可包含修饰的重组Ф29，B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，G1，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5，Cp-7,PR4,PR5，PR722或L17聚合酶。例如，聚合酶可以包含具有选自以下的至少一个氨基酸取代或取代组合的修饰的重组Φ29DNA聚合酶：在位置484的氨基酸取代，在位置198的氨基酸取代和氨基酸或者，例如，聚合酶可以包含具有至少一个氨基酸取代或选自E375Y，K512Y，T368F，A484E，A484Y，N387L，K482Y，N387L，T372Q，T372L，K478Y，1370W，F198W和L381A。
例示性地，在一些实施方案中，组合物可包含纳米孔，其包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一和第二侧的孔；包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链，头部区锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近，伸长体包含部分；聚合酶，其邻近纳米孔的第一侧布置；和包含第一伸长标签的第一核苷酸，第一伸长标签包含响应作用于第一核苷酸的聚合酶而与系链的部分相互作用的第一部分。以上至少参考图7A-7B，8A-8B，9A-9B，10A-10C，11A-11D，12A-12C，13A-13E，16,17A-17B，18A-18E，19A-19C，20A-20E，21A-21E，22A-22F，23A-23C和24A-24D提供了此类组合物的示例性实施方案。
在一些实施方案中，组合物还包含与聚合酶接触的第一和第二多核苷酸，聚合酶配置为基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。任选地，可以修饰聚合酶以响应将第一核苷酸添加到第一多核苷酸而延迟焦磷酸盐的释放。例如，聚合酶可包含修饰的重组Ф29，B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，G1，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5，Cp-7,PR4,PR5，PR722或L17聚合酶。例如，聚合酶可以包含具有选自以下的至少一个氨基酸取代或取代组合的修饰的重组Φ29DNA聚合酶：在位置484的氨基酸取代，在位置198的氨基酸取代和氨基酸或者，例如，聚合酶可以包含具有至少一个氨基酸取代或选自E375Y，K512Y，T368F，A484E，A484Y，N387L，K482Y，N387L，T372Q，T372L，K478Y，1370W，F198W和L381A。
另外或可选地，在一些实施方案中，第一部分和系链的部分配置为彼此杂交，从而形成发夹结构。系统可以包含此类组合物和电压源，其配置为在第一侧和第二侧上施加电压。发夹结构的非限制性实例如上参照图26A和26C。以上参照至少图2A和2C描述了示例性系统。以上参考至少图2B，14,18E，20E，21E和24D描述了可以使用此类系统产生的示例性信号。在一些实施方案中，第一部分和系链的部分配置为响应两步过程中的电压而彼此去杂交。
另外或备选地，在一些实施方案中，第一伸长标签还包含第二部分，组合物还包含锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近的第三部分，第二部分和第三部分相互作用以响应将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。系统可以包含此类组合物和电压源，其配置为在第一侧和第二侧上施加电压。第三部分的非限制性实例在上文中参考图26B和26D进行了描述。以上参照至少图2A和2C描述了示例性系统。以上参考至少图2B，14,18E，20E，21E和24D描述了可以使用此类系统产生的示例性信号。在一些实施方案中，响应第一过程中的电压，第一部分和系链的部分配置为彼此分开，并且第二部分和第三部分配置为响应第一过程中的电压而彼此分开第二过程。
例示性地，在一些实施方案中，方法包含提供包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一和第二侧的孔的纳米孔；提供包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链，头部区锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近，伸长体包含部分；提供邻近纳米孔的第一侧布置的聚合酶；提供包含第一伸长标签的第一核苷酸，第一伸长标签包含部分；用聚合酶作用于第一核苷酸；以及响应作用于第一核苷酸的聚合酶，使第一部分与系链的部分相互作用。以上至少参考图4B和15描述了示例性方法。
在一些实施方案中，方法包含在第一侧上布置聚合酶，头部区锚定到聚合酶。该方法还可以包含使聚合酶与第一核苷酸以及与第一和第二多核苷酸接触，聚合酶基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。聚合酶任选地可以被修饰以响应将第一核苷酸添加到第一多核苷酸而延迟焦磷酸盐的释放。例如，聚合酶可包含修饰的重组Ф29，B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，G1，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5，Cp-7,PR4,PR5，PR722或L17聚合酶。例如，聚合酶可以包含具有选自以下的至少一个氨基酸取代或取代组合的修饰的重组Φ29DNA聚合酶：在位置484的氨基酸取代，在位置198的氨基酸取代和氨基酸例如，聚合酶可以包含具有至少一个氨基酸取代或选自E375Y，K512Y，T368F，A484E，A484Y，N387L，T372Q，T372L，T372Q，T372L，K478Y，1370W，F198W和L381A。
另外或备选地，在一些实施方案中，第一部分和系链的部分彼此杂交，以形成发夹结构。一些实施方案还包含在第一侧和第二侧上施加电压。响应两步法中的电压，第一部分和系链的部分可以彼此去杂交。
另外或备选地，在一些实施方案中，第一伸长标签还可以包含第二部分，组合物还包含锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近的第三部分，第二部分和第三部分，其响应将第一核苷酸添加到第一多核苷酸而相互作用。一些实施方案还包含在第一侧和第二侧上施加电压。响应第一过程中的电压，系链的第一部分和部分可以彼此分开，并且响应第二过程中的电压，第二部分和第三部分可以彼此分开。
通过合成测序的可选修饰
在其中聚合酶将第一核苷酸添加到多核苷酸，例如添加到与正在测序的第二多核苷酸互补的第一多核苷酸的实施方案中，如在合成测序(SBS)中，注意第一核苷酸可以与任何合适的可逆终止剂偶联，抑制聚合酶向第一多核苷酸添加第二核苷酸，直至进行“解锁”步骤。
例如，可以通过在流动池中布置任何合适的本发明组合物来进行SBS，并且可以将用于SBS方案中的每个步骤的流体试剂递送到流动池。例如，在SBS中，监测核酸引物沿核酸模板(例如，靶多核苷酸或其扩增子)的延伸以确定模板中的核苷酸序列。基础化学过程可以包含聚合(例如，如通过聚合酶催化的)。在特定的基于聚合酶的SBS实施方案中，以模板依赖性方式将核苷酸添加到引物(从而延伸引物)，使得添加到引物的核苷酸的顺序和类型的检测可用于确定模板的序列。如本文所提供的，核苷酸可包含便于鉴定那些核苷酸的标签，例如使用本文的纳米孔组合物。
流动池提供用于容纳经历SBS技术的聚合酶附着的纳米孔阵列的方便的形式，SBS技术包含循环中重复递送试剂。为了启动第一SBS循环，可以使一种或多种标记的核苷酸流入/流过流动池，流动池容纳与模板核酸形成复合物的聚合酶附着的纳米孔阵列，模板核酸与测序引物杂交。可以使用本文提供的组合物，系统和方法检测其中引物延伸引起标记的核苷酸的阵列的那些位点。任选地，核苷酸可以进一步包含一旦核苷酸已经添加到引物中就终止进一步引物延伸的可逆终止剂。例如，与复合物接触的核苷酸可以包含以下述方式添加到引物中的可逆终止剂部分：随后的延伸不会发生，直到递送去封闭剂以去除该部分。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可以将去封闭试剂递送到流动池(在检测发生之前或后)。可以在相应递送步骤之间进行洗涤。然后可以将该循环重复n次以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。可以容易地适用于本公开的方法的系统中的示例性SBS方法，流体系统和检测系统组合物描述于例如Bentley等人，Nature 456：53-59(2008)，WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281和US 2008/0108082，其每个的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，标签可以在核苷酸的3'糖位置上提供，使得标签可以用于鉴定核苷酸和作为可逆终止剂以抑制聚合酶向第一核苷酸添加第二核苷酸多核苷酸，直至进行“解锁”步骤。
在一些实施方案中，可以在核苷酸的3'糖位置上提供可逆终止剂，并且可以在碱基上提供标签，或反之亦然，以增强对均聚物测序的控制和置信度处理。例如，在其中可逆终止剂提供在3'糖位置并且标签提供在碱基上的实施方案中，可以进行第一“解锁”过程，以去除可逆终止剂并暴露3'OH，并且可以执行第二“解块”过程以便以第一和第二“解块”过程的任何适当顺序去除标签。例如，可以首先除去标签，基于该标签不再可以观察到与此类标签相关的信号，并且3'可逆终止剂的存在可以抑制聚合酶向第一多核苷酸添加第二核苷酸，直到对该可逆终止剂进行第二“解锁”步骤。以此类方式，基于在执行第二解块步骤之前的第二周期中观察到的相同信号，第一和第二周期之间不存在信号可以确认标签在第一周期结束时被释放，在第二周期期间加回，从而增加多核苷酸是均聚物的置信度。或者，例如，在其中在碱基上提供可逆终止剂并且在3'糖位置上提供标签的实施方案中，聚合酶可以在将核苷酸并入多核苷酸中时去除标签，而不需要单独的化学步骤。
另外，注意，可以通过跨纳米孔的选择性施加电压梯度来控制的方式从反面(与核苷酸相反的屏障侧)递送解封阻剂。可以预期去封闭剂基本上仅在纳米孔的第一侧附近具有有效浓度，并且可以预期其具有低浓度，因为它扩散到其中存在核苷酸池的本体中，从而不会解锁大块中的核苷酸。或者，配置为中和或失活去封闭剂的试剂可存在于纳米孔的第一侧上。该试剂可以通过去封闭剂通过纳米孔的运输而局部耗尽，并且可以预期将去封闭剂进一步远离纳米孔(例如在第一侧的本体中)中和或去活化，从而抑制大块中核苷酸的解锁。
在具体实施方案中，3'OH封闭基团可包含一个或多个部分，例如PCT公开号WO2004/018497中公开的，其全部内容通过引用并入本文。例如，封端基团可以包含叠氮基甲基(CH2N3)或烯丙基，并且去封闭剂可以包含强还原剂，例如THP(三(羟丙基)膦)。有用的封闭基团的其它实例描述于例如以下参考文献中，其各自的全部内容通过引用整体并入本文：美国专利7,816,503，美国专利7,771,903，美国专利公开2008/0108082，美国专利公开号2010/00317531，PCT公开号WO 91/06678，PCT公开号WO 04/018497和PCT公开号WO 07/123744。
例示性地，在一些实施方案中，组合物包含纳米孔，其包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一和第二侧的孔；和包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链，头部区锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近，并且伸长体包含可在孔响应邻近纳米孔的第一侧发生的第一事件。组合物还可以包含布置在第一侧上的聚合酶，头部区锚定到聚合酶。组合物还可以包含第一核苷酸和各自与聚合酶接触的第一和第二多核苷酸，聚合酶配置为基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。以上参照至少图1F，1M，5A-5B，6C-6D，7A-7B，8A-8B，9A-9B，10A-10C，11A-11D，12A-12C，13A-13E，20A-20E，22A-22E，23C和24A-24D提供了此类组合物的示例性实施方案。
任选地，第一核苷酸偶联至可逆终止剂，其抑制聚合酶将第二核苷酸添加到第一多核苷酸，任选以通过跨纳米孔的电压梯度的选择性施加控制的方式。可以预期去封闭剂基本上仅在纳米孔的第一侧附近具有有效浓度，并且可以预期其具有低浓度，因为其扩散到其中存在核苷酸池的本体中。或者，配置为中和或失活去封闭剂的试剂可存在于纳米孔的第一侧上。该试剂可以通过去封闭剂通过纳米孔的运输而局部耗尽，并且可以预期将去封闭剂进一步远离纳米孔(例如在第一侧的本体中)中和或去活化，从而抑制核苷酸。在一些实施方案中，可逆终止剂可通过暴露于光或热而切割。例如，可逆终止剂可通过吸收来自光的热而切割。在一个非限制性实例中，可逆终止剂可包含金纳米粒子，其被光充分加热以切割可逆终止剂。或者，例如，可逆终止剂可以通过由光诱导的光化学反应切割。或者，例如，可逆终止剂可以通过与化学剂的反应而切割。该组合物还可以包含化学剂的来源。在一些实施方案中，可逆终止剂布置在第一侧，化学剂来源布置在第二侧，使得化学剂通过孔径从第二侧移动到第一侧。在一个非限制性实例中，可逆终止剂包含叠氮基甲基(CH2N3)，并且化学剂包含THP。
在一些实施方案中，装置包含任何此类组合物，组合物存在于流动池中，并且流动池配置为补充与聚合酶接触的试剂。
例示性地，在一些实施方案中，一种方法可包含提供包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一和第二侧的孔的纳米孔；提供包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链，头部区锚定到纳米孔的第一或第二侧或纳米孔的第一或第二侧附近，伸长体包含报告物区；以及响应邻近纳米孔的第一侧发生的第一事件，在孔径内移动报告物。聚合酶可以布置在第一侧，头部区锚定到聚合酶。该方法还可以包含使聚合酶与第一核苷酸以及与第一和第二多核苷酸接触，聚合酶基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。这些方法的示例性实施方案在上面至少参考图15提供。
任选地，第一核苷酸可以偶联到可逆终止剂，并且该方法还可以包含通过可逆终止剂抑制聚合酶向第一多核苷酸添加第二核苷酸。在一些实施方案中，方法可以包含通过暴露于光或热来切割可逆终止剂。例如，该方法可包含通过吸收来自光的热量来切割可逆终止剂。或者，例如，方法可包含通过由光诱导的光化学反应切割可逆终止剂。或者，例如，方法可以包含通过与化学剂反应切割可逆终止剂。该方法任选地可以包含提供化学剂来源。该方法任选地可以包含使流体流过聚合酶以除去化学剂。该方法任选地可以包含通过流体流将新试剂供应到聚合酶。在一些实施方案中，可逆终止器布置在第一侧上，并且化学剂的源布置在第二侧上，并且该方法包含通过孔径将化学剂从第二侧移动到第一侧。在一个非限制性实例中，可逆终止剂包含叠氮基甲基(CH2N3)，并且化学剂包含THP。
例示性地，在一些实施方案中，组合物可以包含纳米孔，其包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一和第二侧的孔；包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链，头部区锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近，伸长体包含部分；聚合酶，其邻近纳米孔的第一侧布置；和包含第一伸长标签的第一核苷酸，第一伸长标签包含响应作用于第一核苷酸的聚合酶而与系链的部分相互作用的第一部分。组合物还可以包含与聚合酶接触的第一和第二多核苷酸，聚合酶配置为基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。以上至少参考图7A-7B，8A-8B，9A-9B，10A-10C，11A-11D，12A-12C，13A-13E，16,17A-17B，18A-18E，19A-19C，20A-20E，21A-21E，22A-22F，23A-23C和24A-24D提供了此类组合物的示例性实施方案。
任选地，第一伸长标签还可以是可逆终止剂的部分，其抑制聚合酶向第一多核苷酸添加第二核苷酸。例如，可逆终止剂可以是可切割的，以从聚合酶-核酸复合物中除去伸长的标签。切割可以是例如通过暴露于光或热。例如，可逆终止剂可通过吸收来自光的热而切割。或者，例如，可逆终止剂可以通过由光诱导的光化学反应切割。或者，例如，可逆终止剂可以通过与化学剂的反应而切割。在一些实施方案中，组合物还包含化学剂来源。在一些实施方案中，可逆终止剂布置在第一侧，化学剂来源布置在第二侧，使得化学剂通过孔径从第二侧移动到第一侧。在一个非限制性实例中，可逆终止剂包含叠氮基甲基(CH2N3)，并且化学剂包含THP。
在一些实施方案中，装置包含任何此类组合物，组合物存在于流动池中，并且流动池配置为补充与聚合酶接触的试剂。
例示性地，在一些实施方案中，方法包含提供包含第一侧，第二侧和延伸穿过第一和第二侧的孔的纳米孔；提供包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体的永久性系链，头部区锚定到纳米孔的第一侧或第二侧或纳米孔的第一侧或第二侧附近，伸长体包含部分；提供邻近纳米孔的第一侧布置的聚合酶；提供包含第一伸长标签的第一核苷酸，第一伸长标签包含部分；用聚合酶作用于第一核苷酸；以及响应作用于第一核苷酸的聚合酶，使第一部分与系链的部分相互作用。该方法还可以包含在第一侧上布置聚合酶，头部区锚定到聚合酶。该方法还可以包含使聚合酶与第一核苷酸以及与第一和第二多核苷酸接触，聚合酶基于第二多核苷酸的序列将第一核苷酸添加到第一多核苷酸。以上至少参考图15描述了示例性方法。
任选地，第一伸长标签可以包含可逆终止剂，并且该方法还可以包含通过可逆终止剂抑制聚合酶向第一多核苷酸添加第二核苷酸。例如，该方法可以包含通过暴露于光或热来切割可逆终止剂。例如，该方法可包含通过吸收来自光的热量来切割可逆终止剂。或者，例如，方法可包含通过由光诱导的光化学反应切割可逆终止剂。或者，例如，方法可以包含通过与化学剂反应切割可逆终止剂。该方法还可以包含提供化学剂的来源。在一些实施方案中，可逆终止剂布置在第一侧，化学剂来源布置在第二侧，该方法包含通过孔径将化学剂从第二侧移动到第一侧。在一个非限制性实例中，可逆终止剂包含叠氮基甲基(CH2N3)，并且化学剂包含THP。在一些实施方案中，方法包含使流体流过聚合酶以除去化学剂。该方法还可以包含通过流体流将新试剂供应到聚合酶。
其它替代实施方案
尽管上面描述了本发明的各种例示性实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的情况下可以在其中进行各种改变和修改。例如，虽然上面参照检测与测序多核苷酸例如DNA或RNA相关的事件讨论了某些组合物，系统和方法，但是应当理解，本发明的组合物，系统和方法适合用于检测任何类型的事件，例如分子或其一部分的移动，其可以与邻近纳米孔的收缩的报告物区的存在或移动相关联。所附权利要求旨在覆盖落入本发明的真实精神和范围内的所有此类改变和修改。

Claims (350)

1.组合物，所述组合物包含：
纳米孔，所述纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过所述第一侧和第二侧的孔径；和
永久性系链，所述永久性系链包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体，
所述头部区锚定到所述纳米孔的第一侧或第二侧或所述纳米孔的第一侧或第二侧附近，
所述伸长体包含响应在邻近所述纳米孔的第一侧发生的第一事件而能在所述孔径内移动的报告物区。
2.权利要求1的组合物，其中所述报告物区响应所述第一事件而在所述孔径内能平移移动。
3.权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述报告物区响应所述第一事件而能在所述孔径内旋转移动。
4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述报告物区响应所述第一事件而能在所述孔径内构象性移动。
5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述头部区通过共价键锚定到所述纳米孔的第一侧或第二侧或所述纳米孔的第一侧或第二侧附近。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述头部区锚定到所述纳米孔的第一侧。
7.权利要求1-6中任一项的组合物，其中所述尾部区向所述纳米孔的第二侧自由延伸。
8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中所述报告物区响应所述第一事件而能向所述纳米孔的第一侧平移移动。
9.权利要求1-8中任一项的组合物，其中所述报告物区在所述第一事件后能向所述第二侧平移移动。
10.权利要求8的组合物，其中所述报告物区还响应邻近所述纳米孔的第一侧发生的第二事件而向能所述第一侧平移移动，所述第二事件在所述第一事件后。
11.权利要求10的组合物，其中所述报告物区在所述第二事件后还能向所述第二侧平移移动。
12.权利要求10或11的组合物，其中所述第一事件包含向多核苷酸添加第一核苷酸。
13.权利要求10-12中任一项的组合物，其中所述第二事件包含向所述多核苷酸添加第二核苷酸。
14.权利要求1-13中任一项的组合物，其中所述报告物区的电或通量阻断特征不同于所述伸长体的另一区域的电或通量阻断特征。
15.系统，所述系统包含权利要求1-14中任一项的组合物和测量电路，所述测量电路配置为在所述报告物区响应所述第一事件而移动时测量通过所述孔径的第一电流或通量或第一光学信号。
16.权利要求1-14中任一项的组合物，其还包含邻近所述纳米孔的第一侧布置的蛋白质，其中所述第一事件包含所述蛋白质的第一构象变化。
17.权利要求16的组合物，其中所述头部区锚定到所述蛋白质。
18.权利要求16或权利要求17的组合物，其中所述第一构象变化移动所述头部区，并且所述头部区的移动平移移动所述报告物区。
19.权利要求16-18中任一项的组合物，其中所述蛋白质与所述纳米孔的第一侧接触。
20.权利要求16-19中任一项的组合物，其中所述蛋白质锚定到所述纳米孔的第一侧或所述纳米孔的第一侧附近。
21.权利要求16-20中任一项的组合物，其中所述蛋白质包括酶。
22.权利要求21的组合物，其中所述酶包括聚合酶。
23.权利要求21的组合物，其中所述第一构象变化响应作用于第一核苷酸的聚合酶而发生。
24.权利要求22或权利要求23的组合物，其中所述第一构象变化移动所述头部区，并且所述头部区的移动平移移动所述报告物区。
25.权利要求24的组合物，其中所述第一核苷酸基于响应所述报告物区的平移移动的通过所述孔径的电流或通量的变化或光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定。
26.权利要求23-25中任一项的组合物，其中所述报告物区还响应所述聚合酶的第二构象变化而平移移动，所述聚合酶的第二构象变化响应作用于第二核苷酸的所述聚合酶而发生。
27.权利要求26的组合物，其中所述第一核苷酸基于响应所述报告物区的平移移动的通过所述孔径的电流或通量的第一变化或第一光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定，所述报告物区的平移移动响应所述第一构象变化。
28.权利要求27的组合物，其中所述第二核苷酸基于响应所述报告物区的平移移动的通过所述孔径的电流或通量的第二变化或第二光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定，所述报告物区的平移移动响应所述第二构象变化。
29.权利要求28的组合物，其中所述第一和第二核苷酸基于所述电流或通量的所述第一和第二变化或基于所述第一和第二光学信号彼此单独区分。
30.权利要求1-14中任一项的组合物，其还包含邻近所述纳米孔的第一侧布置的聚合酶，其中所述第一事件包含作用于第一核苷酸的所述聚合酶。
31.权利要求30的组合物，其中所述第一核苷酸包含伸长标签，所述伸长标签包含与所述系链相互作用的部分。
32.权利要求30或权利要求31的组合物，其中所述部分与所述系链的相互作用平移移动所述报告物区。
33.权利要求30-32中任一项的组合物，其中所述系链的所述伸长体包含合成聚合物。
34.权利要求30-32中任一项的组合物，其中所述系链包含第一寡核苷酸。
35.权利要求34的组合物，其中所述第一寡核苷酸的无碱基核苷酸限定所述报告物区。
36.权利要求35的组合物，其中所述部分包含与所述第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。
37.权利要求36的组合物，其中所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸的杂交使所述系链缩短第一量。
38.权利要求37的组合物，其中所述第一核苷酸基于响应所述系链缩短所述第一量的通过所述孔径的电流或通量的变化或光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定。
39.权利要求38的组合物，其中所述报告物区还响应作用于第二核苷酸的所述聚合酶而向所述第一侧平移移动。
40.权利要求39的组合物，其中所述第二核苷酸包含与所述第一寡核苷酸杂交的第三寡核苷酸。
41.权利要求40的组合物，其中所述第三寡核苷酸与所述第一寡核苷酸的杂交使所述系链缩短第二量。
42.权利要求41的组合物，其中所述第一核苷酸基于响应所述系链缩短所述第一量的通过所述孔径的电流或通量的第一变化或第一光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定。
43.权利要求42的组合物，其中所述第二核苷酸基于响应所述系链缩短所述第二量的通过所述孔径的电流或通量的第二变化或第二光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定。
44.权利要求43的组合物，其中所述第一和第二核苷酸基于所述电流或通量的所述第一和第二变化或基于所述第一和第二光学信号彼此单独区分。
45.权利要求30-44中任一项的组合物，其中所述头部区锚定到所述纳米孔的第一侧。
46.权利要求30-45中任一项的组合物，其中所述聚合酶与所述纳米孔的第一侧接触。
47.权利要求30-46中任一项的组合物，其中所述聚合酶锚定到所述纳米孔的第一侧或所述纳米孔的第一侧附近。
48.方法，所述方法包括：
提供纳米孔，所述纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过所述第一侧和第二侧的孔径；
提供永久性系链，所述永久性系链包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体，
所述头部区锚定到所述纳米孔的第一或第二侧或所述纳米孔的第一或第二侧附近，
所述伸长体包含报告物区；并且
响应与所述纳米孔的第一侧相邻发生的第一事件而在所述孔径内移动所述报告物。
49.权利要求48的方法，其中响应所述第一事件而在所述孔径内平移移动所述报告物区。
50.权利要求48或权利要求49的方法，其中响应所述第一事件在所述孔径内旋转移动所述报告物区。
51.权利要求48-50中任一项的方法，其中响应所述第一事件在所述孔径内构象性移动所述报告物区。
52.权利要求48-51中任一项的方法，其中所述头部区通过共价键锚定到所述纳米孔的第一侧或第二侧或所述纳米孔的第一侧或第二侧附近。
53.权利要求48-52中任一项的方法，其中所述头部区锚定到所述纳米孔的第一侧。
54.权利要求48-53中任一项的方法，其中所述尾部区向所述纳米孔的第二侧自由延伸。
55.权利要求48-54中任一项的方法，其中响应所述第一事件向所述纳米孔的第一侧平移移动所述报告物区。
56.权利要求48-55中任一项的方法，还包含在所述第一事件后向第二侧平移移动所述报告物区。
57.权利要求55的方法，所述方法还包括响应邻近所述纳米孔的第一侧发生的第二事件将所述报告物区向所述第一侧平移移动，所述第二事件在所述第一事件后。
58.权利要求57的方法，所述方法还包含在所述第二事件后向所述第二侧平移移动所述报告物区。
59.权利要求57或权利要求58的方法，其中所述第一事件包含向多核苷酸添加第一核苷酸。
60.权利要求57-59中任一项的方法，其中所述第二事件包含向所述多核苷酸添加第二核苷酸。
61.权利要求48-60中任一项的方法，其中所述报告物区的电或通量阻断特征不同于所述伸长体的另一区域的电或通量阻断特征。
62.权利要求48-61中任一项的方法，其还包含在响应所述第一事件移动所述报告体区时测量通过所述孔径的第一电流或通量或第一光学信号。
63.权利要求48-62中任一项的方法，其中蛋白质邻近所述纳米孔的第一侧布置，并且其中所述第一事件包含所述蛋白质的第一构象变化。
64.权利要求63的方法，其中所述头部区锚定到所述蛋白质。
65.权利要求63或权利要求64的方法，其中所述第一构象变化移动所述头部区，并且所述头部区的移动平移移动所述报告物区。
66.权利要求63-65中任一项的方法，其中所述蛋白质与所述纳米孔的第一侧接触。
67.权利要求63-66中任一项的方法，其中所述蛋白质锚定到所述纳米孔的第一侧或所述纳米孔的第一侧附近。
68.权利要求63-67中任一项的方法，其中所述蛋白质包括酶。
69.权利要求68的方法，其中所述酶包括聚合酶。
70.权利要求69的方法，其中所述第一构象变化响应作用于第一核苷酸的所述聚合酶而发生。
71.权利要求69或权利要求70的方法，其中所述第一构象变化移动所述头部区，并且所述头部区的移动平移移动所述报告物区。
72.权利要求71的方法，其还包含基于响应所述报告物区的平移移动的通过所述孔径的电流或通量的变化或光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定所述第一核苷酸。
73.权利要求70-73中任一项的方法，其还包含响应所述聚合酶的第二构象变化平移移动所述报告物区，所述聚合酶的第二构象变化响应作用于第二核苷酸的所述聚合酶而发生。
74.权利要求73的方法，其还包含基于响应所述报告物区的平移移动的通过所述孔径的电流或通量的第一变化或第一光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定所述第一核苷酸，所述报告物区的平移移动响应所述第一构象变化。
75.权利要求74的方法，其还包含基于响应所述报告物区的平移移动的通过所述孔径的电流或通量的第二变化或第二光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定第二核苷酸，所述报告物区的平移移动响应所述第二构象变化。
76.权利要求75的方法，其中所述第一和第二核苷酸基于所述电流或通量的所述第一和第二变化或基于所述第一和第二光学信号彼此单独区分。
77.权利要求48-62中任一项的方法，还包含邻近所述纳米孔的第一侧布置聚合酶，其中所述第一事件包含作用于第一核苷酸的所述聚合酶。
78.权利要求77的方法，其中所述第一核苷酸包含伸长标签，所述伸长标签包含与所述系链相互作用的部分。
79.权利要求78的方法，其中所述部分与所述系链的相互作用平移移动所述报告物区。
80.权利要求77-79中任一项的方法，其中所述系链的所述伸长体包含合成聚合物。
81.权利要求77-79中任一项的方法，其中所述系链包含第一寡核苷酸。
82.权利要求81的方法，其中所述第一寡核苷酸的无碱基核苷酸限定所述报告物区。
83.权利要求81或权利要求82的方法，其中所述部分包含与所述第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。
84.权利要求83的方法，其中所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸的杂交使所述系链缩短第一量。
85.权利要求84的方法，其还包含基于响应所述系链缩短所述第一量的通过所述孔径的电流或通量的变化或光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定所述第一核苷酸。
86.权利要求85的方法，其还包含响应作用于第二核苷酸的所述聚合酶向所述第一侧平移移动所述报告物区。
87.权利要求86的方法，其中所述第二核苷酸包含与所述第一寡核苷酸杂交的第三寡核苷酸。
88.权利要求87的方法，其中所述第三寡核苷酸与所述第一寡核苷酸的杂交使所述系链缩短第二量。
89.权利要求88的方法，其还包含基于响应所述系链缩短所述第一量的通过所述孔径的电流或通量的第一变化或第一光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定所述第一核苷酸。
90.权利要求89的方法，其还包含基于响应所述系链缩短所述第二量的通过所述孔径的电流或通量的第二变化或第二光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定所述第二寡核苷酸。
91.权利要求90的方法，其中所述第一和第二核苷酸基于所述电流或通量的所述第一和第二变化或基于所述第一和第二光学信号彼此单独区分。
92.权利要求77-91中任一项的方法，其中所述头部区锚定到所述纳米孔的第一侧。
93.权利要求77-92中任一项的方法，其中所述聚合酶与所述纳米孔的第一侧接触。
94.权利要求77-93中任一项的方法，其中所述聚合酶锚定到所述纳米孔的第一侧或所述纳米孔的第一侧附近。
95.组合物，所述组合物包含：
纳米孔，所述纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过所述第一侧和第二侧的孔径；
永久性系链，所述永久性系链包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体，所述头部区锚定到所述纳米孔的第一侧或第二侧或所述纳米孔的第一侧或第二侧附近，所述伸长体包含部分；
聚合酶，所述聚合酶邻近所述纳米孔的第一侧布置；和
第一核苷酸，所述第一核苷酸包含第一伸长标签，所述第一伸长标签包含响应作用于所述第一核苷酸的聚合酶而与所述系链的所述部分相互作用的第一部分。
96.权利要求95的组合物，其中所述头部区通过共价键锚定到所述纳米孔的所述第一侧或第二侧或所述纳米孔的所述第一侧或第二侧附近。
97.权利要求95或权利要求96的组合物，其中所述头部区锚定到所述纳米孔的第一侧。
98.权利要求95-97中任一项的组合物，其中所述尾部区向所述纳米孔的第二侧自由延伸。
99.权利要求95-98中任一项的组合物，其中所述尾部区响应施加的电压在所述纳米孔的第一和第二侧之间移动。
100.权利要求95或权利要求96的组合物，其中所述头部区锚定到所述纳米孔的第二侧。
101.权利要求100的组合物，其中所述尾部区向所述纳米孔的第一侧自由延伸。
102.权利要求100或权利要求101的组合物，其中所述尾部区响应施加的电压在所述纳米孔的第一和第二侧之间移动。
103.权利要求95-102中任一项的组合物，其中所述聚合酶与所述纳米孔的第一侧接触。
104.权利要求95-103中任一项的组合物，其中所述聚合酶锚定到所述纳米孔的第一侧或所述纳米孔的第一侧附近。
105.权利要求95-104中任一项的组合物，其中所述第一部分和所述系链的部分之间的相互作用限定双链体(duplex)。
106.权利要求105的组合物，其中所述纳米孔还包含布置在所述第一和第二侧之间的收缩部。
107.权利要求106的组合物，其中对所述纳米孔的所述第一或第二侧或在所述纳米孔的所述第一或第二侧附近锚定所述头部区抑制所述双链体通过所述收缩部的移动。
108.权利要求106的组合物，其中所述双链体足够大，从而抑制所述双链体通过所述收缩部的移动。
109.权利要求95-108中任一项的组合物，其中所述第一核苷酸的第一伸长标签还包含第一报告物区。
110.权利要求109的组合物，其中所述第一报告物区配置为响应所述第一部分与所述系链的所述部分的相互作用而布置在所述孔径内。
111.系统，所述系统包含权利要求109或权利要求110的组合物和测量电路，所述测量电路配置为在所述第一报告物区布置在所述孔径内时测量通过所述孔径的电流或通量或光学信号。
112.权利要求111的系统，其中所述电流或通量或光学信号基于所述第一报告物区的电或通量阻断特征，并且其中所述第一核苷酸基于所述电流或通量或光学信号鉴定。
113.权利要求110的组合物，其还包括包含第二伸长标签的第二核苷酸，所述第二伸长标签包含响应作用于所述第二核苷酸的聚合酶而与所述系链的所述部分相互作用的第二部分。
114.权利要求113的组合物，其中所述第二伸长标签还包含第二报告物区。
115.权利要求114的组合物，其中所述第二报告物区配置为响应所述第二部分与所述系链的所述部分相互作用而布置在所述孔径内。
116.系统，所述系统包含权利要求114或权利要求115的组合物和测量电路，所述测量电路配置为在所述第一报告物区布置在所述孔径内时测量通过所述孔径的第一电流或通量或第一光学信号，并且在所述第二报告物区布置在所述孔径内时测量通过所述孔径的第二电流或通量或第二光学信号。
117.权利要求116的系统，其中：
所述第一电流或通量或所述第一光学信号基于所述第一报告物区的第一电或通量阻断特征，
所述第一核苷酸基于所述第一电流或通量或所述第一光学信号鉴定，
所述第二电流或通量或所述第二光学信号基于所述第二报告物区的第二电或通量阻断特征，并且
所述第二核苷酸基于所述第二电流或通量或所述第二光学信号鉴定。
118.权利要求116或权利要求117的系统，其中所述第一和第二核苷酸基于所述第一电流或通量和第二电流或通量或基于所述第一和第二光学信号彼此单独区分。
119.权利要求113-115中任一项的组合物，其中所述第一伸长标签响应作用于所述第一核苷酸的聚合酶而从所述第一核苷酸切割，并且其中所述第二伸长标签响应作用于所述第二核苷酸的聚合酶而从所述第二核苷酸切割。
120.权利要求113-115中任一项的组合物，其中所述系链的所述伸长体包含合成聚合物。
121.权利要求113的组合物，其中所述系链的部分包含第一寡核苷酸。
122.权利要求121的组合物，其中所述第一部分包含与所述第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。
123.权利要求122的组合物，其中所述第二寡核苷酸的无碱基核苷酸限定所述报告物区。
124.权利要求122或权利要求123的组合物，其中所述第二部分包含与所述第一寡核苷酸杂交的第三寡核苷酸。
125.权利要求124的组合物，其中所述第一部分和所述第二部分彼此相同。
126.权利要求95-108中任一项的组合物，其中所述系链的所述伸长体还包含报告物区。
127.权利要求126的组合物，其中所述报告物区响应所述第一部分与所述系链的部分的相互作用而布置在相对于所述第一部分的预定位置处。
128.权利要求126或权利要求127的组合物，其中所述报告物区响应第一施加电压而在所述孔径内平移移动。
129.权利要求126-128中任一项的组合物，所述纳米孔还包含布置在所述第一和第二侧之间的收缩部。
130.权利要求129的组合物，其中所述报告物区响应所述第一施加电压平移移动到相对于所述收缩部的第一预定位置。
131.权利要求129或权利要求130的组合物，其中所述报告物区的电或通量阻断特征不同于所述伸长体的另一区域的电或通量阻断特征。
132.系统，其包含权利要求131的组合物和测量电路，所述测量电路配置为在所述报告物区布置在所述第一预定位置时测量通过所述孔径的电流或通量或光学信号。
133.权利要求132的系统，其中所述电流或通量或光学信号基于所述报告物区的电或通量阻断特征和所述报告物区的第一预定位置，并且其中所述第一核苷酸基于所述电流或通量或光学信号鉴定。
134.权利要求130的组合物，其中所述第一部分和所述系链的部分响应所述第一施加电压解离。
135.权利要求134的组合物，其中所述系链的所述部分响应所述第一部分和所述系链的部分的解离而通过所述收缩部平移移动。
136.权利要求134或权利要求135的组合物，其中所述第一部分响应在所述第一施加电压后的第二施加电压而与所述系链的所述部分相互作用。
137.权利要求130-136中任一项的组合物，其还包括包含第二伸长标签的第二核苷酸，所述第二伸长标签包含响应作用于所述第二核苷酸的所述聚合酶而与所述系链的所述部分相互作用的第二部分。
138.权利要求137的组合物，其中所述报告物区响应所述第二部分与所述系链的所述部分的相互作用而布置在相对于所述第二部分的预定位置。
139.权利要求138的组合物，其中所述报告物区响应第二施加电压而在所述孔径内平移移动。
140.权利要求139的组合物，所述纳米孔进一步包含布置在所述第一和第二侧之间的收缩部。
141.权利要求140的组合物，其中所述报告物区响应所述第二施加电压而平移移动到相对于所述收缩部的第二位置。
142.权利要求141的组合物，其中所述报告物区的电或通量阻断特征不同于所述伸长体的另一区域的电或通量阻断特征。
143.系统，所述系统包含权利要求142的组合物和测量电路，所述测量电路配置为在所述报告物区响应所述第一施加电压而布置在所述第一位置时测量通过所述孔径的第一电流或通量或第一光学信号，并且在所述报告物区响应所述第二施加电压而布置在所述第二位置时测量通过所述孔的第二电流或通量或第二光学信号。
144.权利要求143的系统，其中：
所述第一电流或通量或第一光学信号基于报告物区的电或通量阻断特征和所述报告物区的第一预定位置，
所述第一核苷酸基于所述第一电流或通量或第一光学信号鉴定，
所述第二电流或通量或第二光学信号基于所述报告物区的电或通量阻断特征和所述报告物区的第二预定位置，以及
所述第二核苷酸基于所述第二电流或通量或第二光学信号鉴定。
145.权利要求143或权利要求144的系统，其中所述第一和第二核苷酸基于所述第一电流或通量和第二电流或通量或基于所述第一和第二光学信号彼此单独区分。
146.权利要求143-145中任一项的系统，其中所述第一和第二电压具有彼此相同的幅度，并且所述第二电压在所述第一电压后。
147.权利要求137的组合物，其中所述第一伸长标签响应作用于所述第一核苷酸的所述聚合酶而从所述第一核苷酸切割，并且其中所述第二伸长标签响应作用于所述第二核苷酸的所述聚合酶而从所述第二核苷酸切割。
148.权利要求126-142中任一项的组合物，其中所述系链的所述伸长体包含合成聚合物。
149.权利要求137-142中任一项的组合物，其中所述系链的部分包含第一寡核苷酸。
150.权利要求149的组合物，其中所述第一寡核苷酸的无碱基核苷酸限定所述报告物区。
151.权利要求149或权利要求150的组合物，其中所述第一部分包含与所述第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。
152.权利要求151的组合物，其中所述第二部分包含与所述第一寡核苷酸杂交的第三寡核苷酸。
153.权利要求152的组合物，其中所述第一部分和所述第二部分彼此不同。
154.权利要求126的组合物，其中所述报告物区响应作用于所述第一核苷酸的聚合酶而在所述孔径内平移移动。
155.权利要求126或权利要求154的组合物，其中所述报告物区响应作用于所述第一核苷酸的聚合酶而在所述孔径内旋转移动。
156.权利要求126，权利要求154或权利要求155的组合物，其中所述报告物区响应作用于所述第一核苷酸的聚合酶而在所述孔径内构象性移动。
157.权利要求126或154-156中任一项的组合物，其中所述系链的所述伸长体包含合成聚合物。
158.权利要求154的组合物，其中所述系链的部分包含第一寡核苷酸。
159.权利要求158或权利要求159的组合物，其中所述第一寡核苷酸的无碱基核苷酸限定所述报告物区。
160.权利要求158或权利要求159的组合物，其中所述第一部分包含与所述第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。
161.权利要求160的组合物，其中所述第二寡核苷酸与第一个寡核苷酸的杂交将所述系链缩短第一量。
162.权利要求161的组合物，其中所述第一核苷酸基于响应将所述系链缩短所述第一量的通过所述孔径的电流或通量的变化或光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定。
163.方法，所述方法包含：
提供纳米孔，所述纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过所述第一侧和第二侧的孔径；
提供永久性系链，所述永久性系链包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体，所述头部区锚定到所述纳米孔的第一侧或第二侧或所述纳米孔的第一侧或第二侧附近，所述伸长体包含部分；
提供邻近所述纳米孔的第一侧布置的聚合酶；
提供包含第一伸长标签的第一核苷酸，所述第一伸长标签包含部分；
用聚合酶作用于所述第一核苷酸；并且
响应作用于所述第一核苷酸的所述聚合酶使所述第一部分与所述系链的部分相互作用。
164.权利要求163的方法，其中所述头部区通过共价键锚定到所述纳米孔的第一侧或第二侧或所述纳米孔的第一侧或第二侧附近。
165.权利要求163或权利要求164的方法，其中所述头部区锚定到所述纳米孔的所述第一侧。
166.权利要求163-165中任一项的方法，其中所述尾部区向所述纳米孔的第二侧自由延伸。
167.权利要求163-166中任一项的方法，其包括响应施加的电压在所述纳米孔的第一和第二侧之间移动所述尾部区。
168.权利要求163或权利要求164的方法，其中所述头部区锚定到所述纳米孔的第二侧。
169.权利要求168的方法，其中所述尾部区向所述纳米孔的第一侧自由延伸。
170.权利要求168或权利要求169的方法，其包括响应施加的电压在所述纳米孔的第一和第二侧之间移动所述尾部区。
171.权利要求163-170中任一项的方法，其中所述聚合酶与所述纳米孔的第一侧接触。
172.权利要求163-171中任一项的方法，其中所述聚合酶锚定到所述纳米孔的第一侧或所述纳米孔的第一侧附近。
173.权利要求163-172中任一项的方法，其中所述第一部分和所述系链的部分之间的相互作用限定双链体。
174.权利要求173的方法，其中所述纳米孔还包含布置在所述第一侧和所述第二侧之间的收缩部。
175.权利要求174的方法，其还包括通过对所述纳米孔的第一或第二侧或在所述纳米孔的第一或第二侧附近锚定所述头部区抑制所述双链体通过所述收缩部的移动。
176.权利要求174的方法，其中所述双链体足够大，从而抑制所述双链体通过所述收缩部的移动。
177.权利要求163-176中任一项的方法，其中所述第一核苷酸的第一伸长标签还包含第一报告物区。
178.权利要求177的方法，其包括响应所述第一部分与所述系链的所述部分相互作用而将所述第一报告物区布置在所述孔径内。
179.权利要求177或权利要求178的方法，其还包括在所述第一报告物区布置在所述孔径内时，测量通过所述孔径的电流或通量或光学信号。
180.权利要求179的方法，其中所述电流或通量或所述光学信号基于所述第一报告物区的电或通量阻断特征，并且其中所述第一核苷酸基于所述电流或通量或基于所述光学信号鉴定。
181.权利要求178的方法，所述方法还包括：
提供包含第二伸长标签的第二核苷酸，所述第二伸长标签包含第二部分；
用聚合酶作用于第二核苷酸；并且
响应作用于所述第二核苷酸的聚合酶使所述第二部分与所述系链的部分相互作用。
182.权利要求181的方法，其中所述第二伸长标签还包含第二报告物区。
183.权利要求182的方法，其还包括响应所述第二部分与所述系链的所述部分相互作用而将所述第二报告物区布置在所述孔径内。
184.权利要求183的方法，其还包括在所述第一报告物区布置在所述孔径内时测量通过所述孔径的第一电流或通量或第一光学信号，并且在所述第二报告物区布置在所述孔径内时测量通过所述孔径的第二电流或通量或第二光学信号。
185.权利要求184的方法，其中：
所述第一电流或通量或第一光学信号基于所述第一报告物区的第一电或通量阻断特征，
所述第一核苷酸基于所述第一电流或通量或第一光学信号鉴定，
所述第二电流或通量或第二光学信号基于所述第二报告物区的第二电或通量阻断特征，
所述第二核苷酸基于所述第二电流或通量或第二光学信号鉴定。
186.权利要求185的方法，其中所述第一和第二核苷酸基于所述第一电流或通量和第二电流或通量或基于所述第一和第二光学信号彼此单独区分。
187.权利要求181-186中任一项的方法，所述方法还包括响应作用于所述第一核苷酸的所述聚合酶从所述第一核苷酸切割所述第一伸长标签，并且响应作用于所述第二核苷酸的所述聚合酶从所述第二核苷酸切割所述第二伸长标签。
188.权利要求177或181-187中任一项的方法，其中所述系链的所述伸长体包含合成聚合物。
189.权利要求177或181-188中任一项的方法，其中所述系链的部分包含第一寡核苷酸。
190.权利要求189的方法，其中所述第一部分包含与所述第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。
191.权利要求190的方法，其中所述第二寡核苷酸的无碱基核苷酸限定所述报告物区。
192.权利要求190或权利要求191的方法，其中所述第二部分包含与所述第一寡核苷酸杂交的第三寡核苷酸。
193.权利要求192的方法，其中所述第一部分和所述第二部分彼此相同。
194.权利要求193或权利要求194的方法，其中所述系链的伸长体还包含报告物区。
195.权利要求194的方法，还包含响应所述第一部分与所述系链的部分的相互作用，将所述报告物相对于所述第一部分布置在预定位置。
196.权利要求194或195的方法，其还包括响应第一施加电压在所述孔径内平移移动所述报告物区。
197.权利要求196的方法，其中所述纳米孔还包含布置在所述第一侧和所述第二侧之间的收缩部。
198.权利要求197的方法，其中响应所述第一施加电压将所述报告物区平移移动到相对于所述收缩部的第一预定位置。
199.权利要求198的方法，其中所述报告物区的电或通量阻断特征不同于所述伸长体的另一区域的电或通量阻断特征。
200.权利要求198或权利要求199的方法，其还包括在所述报告物区布置在所述第一预定位置时测量通过所述孔径的电流或通量或光学信号。
201.权利要求200的方法，其中所述电流或通量或光学信号基于所述报告物区的电或通量阻断特征和所述报告物区的第一预定位置，并且其中所述第一核苷酸基于所述电流或通量或光学信号鉴定。
202.权利要求198或权利要求199的方法，其还包括响应所述第一施加电压而解离所述第一部分和所述系链的所述部分。
203.权利要求202的方法，其还包括响应所述第一部分和所述系链的部分的解离通过所述收缩部平移移动所述系链的部分。
204.权利要求203的方法，其还包括响应在所述第一施加电压后的第二施加电压使所述第一部分与所述系链的所述部分相互作用。
205.权利要求198-204中任一项的方法，其还包括提供包含第二伸长标签的第二核苷酸，所述第二伸长标签包含响应作用于所述第二核苷酸的所述聚合酶而与所述系链的所述部分相互作用的第二部分。
206.权利要求205的方法，其还包括响应所述第二部分与所述系链的部分的相互作用将所述报告物区布置在相对于所述第二部分的预定位置。
207.权利要求205或权利要求206的方法，其还包括响应第二施加电压在所述孔径内平移移动所述报告物区。
208.权利要求207的方法，其中所述纳米孔还包含布置在所述第一侧和所述第二侧之间的收缩部。
209.权利要求208的方法，其中响应所述第二施加电压将所述报告物区平移移动到相对于所述收缩部的第二位置。
210.权利要求209的方法，其中所述报告物区的电或通量阻断特征不同于所述伸长体的另一区域的电或通量阻断特征。
211.权利要求209或权利要求210的方法，所述方法还包括在所述报告物区响应所述第一施加电压而布置在所述第一位置时测量通过所述孔径的第一电流或通量或第一光学信号，以及在所述报告物区响应所述第二施加电压而布置在所述第二位置时测量通过所述孔径的第二电流或通量或第二光学信号。
212.权利要求211的方法，其中：
所述第一电流或通量或第一光学信号基于所述报告物区的电或通量阻断特征和所述报告物区的第一预定位置，
所述第一核苷酸基于所述第一电流或通量或第一光学信号鉴定，
所述第二电流或通量或第二光学信号基于所述报告物区的电或通量阻断特征和所述报告物区的第二预定位置，以及
所述第二核苷酸基于所述第二电流或通量或第二光学信号鉴定。
213.权利要求212的方法，其中所述第一和第二核苷酸基于所述第一电流或通量和第二电流或通量或基于所述第一和第二光学信号彼此单独区分。
214.权利要求211-213中任一项的方法，其中所述第一电压和第二电压具有彼此相同的幅度，并且所述第二电压在所述第一电压后。
215.权利要求205-214中任一项的方法，其中所述第一伸长标签响应作用于所述第一核苷酸的所述聚合酶而从所述第一核苷酸切割，并且其中所述第二伸长标签响应作用于所述第二核苷酸的所述聚合酶而从所述第二核苷酸切割。
216.权利要求205-215中任一项的方法，其中所述系链的所述伸长体包含合成聚合物。
217.权利要求205-215中任一项的方法，其中所述系链的部分包含第一寡核苷酸。
218.权利要求217的方法，其中所述第一寡核苷酸的无碱基核苷酸限定所述报告物区。
219.权利要求217-218中任一项的方法，其中所述第一部分包含与所述第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。
220.权利要求219的方法，其中所述第二部分包含与所述第一寡核苷酸杂交的第三寡核苷酸。
221.权利要求220的方法，其中所述第一部分和所述第二部分彼此不同。
222.权利要求194的方法，其中所述报告物区响应作用于所述第一核苷酸的聚合酶而在所述孔径内平移移动。
223.权利要求194或权利要求222的方法，其中所述报告物区响应作用于所述第一核苷酸的所述聚合酶而在所述孔径内旋转移动。
224.权利要求194，权利要求222或权利要求223的方法，其中所述报告物区响应作用于所述第一核苷酸的所述聚合酶而在所述孔径内构象性移动。
225.权利要求194或222-224中任一项的方法，其中所述系链的所述伸长体包含合成聚合物。
226.权利要求194或222-224中任一项的方法，其中所述系链的所述部分包含第一寡核苷酸。
227.权利要求226的方法，其中所述第一寡核苷酸的无碱基核苷酸限定所述报告物区。
228.权利要求226或权利要求227的方法，其中所述第一部分包含与所述第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。
229.权利要求228的方法，其中所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸的杂交使所述系链缩短第一量。
230.权利要求229的方法，其中所述第一核苷酸基于响应将所述系链缩短所述第一量的通过所述孔径的电流或通量的变化或光学信号的测量幅度或时间持续或两者鉴定。
231.权利要求163的方法，其中所述第一核苷酸的第一伸长标签进一步包含第一荧光共振能量转移(FRET)对配偶体，并且其中所述系链还包含第二FRET对配偶体。
232.权利要求231的方法，其中所述第一FRET对配偶体和所述第二FRET对配体响应作用于所述第一核苷酸的所述聚合酶而彼此相互作用，所述方法还包含检测响应所述第一FRET对配偶体和所述第二FRET对配体之间的相互作用发射的第一波长。
233.权利要求232的方法，其还包括提供包含第二伸长标签的第二核苷酸，所述第二伸长标签包含第三荧光共振能量转移(FRET)对配偶体。
234.权利要求233的方法，其中所述第三FRET对配偶体和所述第二FRET对配体响应作用于所述第二核苷酸的所述聚合酶而彼此相互作用，所述方法还包括检测响应所述第三FRET对配偶体和所述第二FRET对配体之间的相互作用发射的第二波长。
235.权利要求234的方法，其中所述第一和第二核苷酸基于所述第一和第二波长彼此单独区分。
236.权利要求95的组合物，其中所述第一核苷酸的第一伸长标签还包含第一荧光共振能量转移(FRET)对配偶体，并且其中所述系链还包含第二FRET对配偶体。
237.权利要求236的组合物，其中所述第一FRET对配偶体和所述第二FRET对配体响应作用于所述第一核苷酸的所述聚合酶而彼此相互作用，响应所述第一FRET对配偶体与所述第二FRET对配偶体之间的相互作用发射的第一波长可以是检测的。
238.权利要求237的组合物，其还包括包含第二伸长标签的第二核苷酸，所述第二伸长标签包含第三荧光共振能量转移(FRET)对配偶体。
239.包含权利要求238的组合物的系统，其中所述第三FRET对配偶体和所述第二FRET对配偶体响应作用于所述第二核苷酸的所述聚合酶而彼此相互作用，所述系统包含光学检测系统，其配置为检测响应所述第三FRET对配偶体和所述第二FRET对配偶体之间的相互作用发射的第二波长。
240.权利要求239的系统，其中所述第一和第二核苷酸基于所述第一和第二波长彼此单独区分。
241.组合物，所述组合物包含：
纳米孔，所述纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过所述第一侧和第二侧的孔径；
永久性系链，所述永久性系链包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体，所述头部区锚定到聚合酶，所述伸长体包含部分；
所述聚合酶邻近所述纳米孔的第一侧布置；和
包含第一伸长标签的第一核苷酸，所述第一伸长标签包含响应作用于所述第一核苷酸的聚合酶而与所述系链的所述部分相互作用的第一部分。
242.权利要求241的组合物，其中所述尾部区包含第一核酸。
243.权利要求242的组合物，其还包含与所述第一核酸杂交的第二核酸。
244.权利要求243的组合物，所述头部区布置在所述纳米孔的第一侧上，所述尾部区布置在所述第二侧上。
245.权利要求244的组合物，其中所述头部区锚定到所述聚合酶。
246.权利要求245的组合物，其中所述第一核酸和所述第二核酸之间的相互作用限定双链体。
247.权利要求246的组合物，其中所述纳米孔还包含布置在所述第一和第二侧之间的收缩部。
248.权利要求247的组合物，其中所述双链体足够大，从而抑制所述双链体通过所述收缩部的移动。
249.权利要求248的组合物，其中包含所述双链体的所述系链抑制所述聚合酶与所述纳米孔分开。
250.系统，所述系统包含权利要求249的组合物和测量电路，所述测量电路配置为测量通过所述收缩部的电流或通量或光学信号。
251.权利要求250的系统，其中所述电流或通量基于所述第一部分，并且其中所述第一核苷酸基于所述电流或通量或基于所述光学信号鉴定。
252.权利要求250的系统，其中所述第一伸长标签或所述伸长体还包含报告物区，其中所述电流或通量或光学信号基于布置在所述孔径内的所述报告物区，并且其中所述第一核苷酸基于所述电流或通量或基于所述光学信号鉴定。
253.方法，所述方法包含：
提供纳米孔，所述纳米孔包含第一侧，第二侧和延伸穿过所述第一侧和第二侧的孔径；
提供永久性系链，所述永久性系链包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体，所述头部区锚定到聚合酶，所述伸长体包含部分；
提供邻近所述纳米孔的第一侧布置的所述聚合酶；
提供包含第一伸长标签的第一核苷酸，所述第一伸长标签包含部分；
用聚合酶作用于所述第一核苷酸；并且
响应作用于所述第一核苷酸的聚合酶，使所述第一部分与所述系链的部分相互作用。
254.权利要求253的方法，其中所述尾部区包含第一核酸。
255.权利要求254的方法，其还包括将第二核酸与所述第一核酸杂交。
256.权利要求255的方法，其包括将所述头部区布置在所述纳米孔的第一侧上，并且将所述尾部区布置在所述第二侧上。
257.权利要求256的方法，其还包括将头部区锚定到所述聚合酶。
258.权利要求257的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸之间的相互作用限定双链体。
259.权利要求258的方法，其中所述纳米孔还包含布置在所述第一侧和所述第二侧之间的收缩部。
260.权利要求259的方法，其还包括通过所述双链体的尺寸抑制所述双链体通过所述收缩部的移动。
261.权利要求260的方法，其还包括通过包含所述双链体的系链抑制所述聚合酶与所述纳米孔分开。
262.权利要求261的方法，其还包括测量通过所述收缩部的电流或通量或光学信号。
263.权利要求262的方法，其中所述电流或通量或光学信号基于所述第一部分，所述方法还包括基于所述电流或通量或基于所述光学信号鉴定所述第一核苷酸。
264.权利要求262的方法，其中所述第一伸长标签或所述伸长体还包含报告物区，其中所述电流或通量或光学信号基于布置在所述孔径内的所述报告物区，所述方法还包括基于所述电流或通量或基于所述光学信号鉴定所述第一核苷酸。
265.制备纳米孔测序装置的方法，其包含：
提供腔室，所述腔室包含通过纳米孔与第二液体介质分开的第一液体介质，所述纳米孔包含与所述第一液体介质接触的第一侧，与所述第二液体介质接触的第二侧，以及延伸穿过所述第一和第二侧的孔径；
向所述第一液体培养基提供聚合酶，其中所述聚合酶包含系链，所述系链包含头部区，尾部区和布置在它们之间的伸长体，所述头部区锚定于所述聚合酶；
向所述第二液体介质提供捕获部分；
施加通过所述纳米孔的电流或通量以使所述系链的尾部区移位通过所述纳米孔；并且
将所述捕获部分结合到所述系链的尾部区，从而将所述系链保持在所述纳米孔中。
266.权利要求265的方法，其中所述系链包含核酸。
267.权利要求265的方法，其中所述尾部区包含核酸。
268.权利要求267的方法，其中所述捕获部分包含与所述尾部区的核酸互补的核酸。
269.权利要求265的方法，其中所述捕获部分共价结合到所述尾部区。
270.权利要求269的方法，其中所述捕获部分非共价结合到所述尾部区。
271.权利要求1的组合物，其还包含布置在所述第一侧上的聚合酶，所述头部区锚定到所述聚合酶。
272.权利要求271的组合物，其还包含各自与所述聚合酶接触的第一核苷酸和第一和第二多核苷酸，所述聚合酶配置为基于所述第二多核苷酸的序列将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸。
273.权利要求272的组合物，所述聚合酶经修饰而响应将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸来延迟焦磷酸盐的释放。
274.权利要求273的组合物，其中所述聚合酶包含经修饰的重组Ф29，B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，G1，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5，Cp-7，PR4，PR5，PR722或L17聚合酶。
275.权利要求274的组合物，其中所述聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：在位置484的氨基酸取代，在位置198的氨基酸取代和在位置381的氨基酸取代。
276.权利要求274的组合物，其中所述聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：E375Y，K512Y，T368F，A484E，A484Y，N387L，T372Q，T372L，K478Y，1370W，F198W和L381A。
277.权利要求48的方法，其还包括在所述第一侧上布置聚合酶，所述头部区锚定到所述聚合酶。
278.权利要求277的方法，其进一步使所述聚合酶与第一核苷酸以及与第一和第二多核苷酸接触，所述聚合酶基于所述第二多核苷酸的序列将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸。
279.权利要求278的方法，所述聚合酶经修饰而响应将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸来延迟焦磷酸盐的释放。
280.权利要求279的方法，其中所述聚合酶包含经修饰的重组Ф29，B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，G1，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5，Cp-7，PR4，PR5，PR722或L17聚合酶。
281.权利要求279的方法，其中所述聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：在位置484的氨基酸取代，在位置198的氨基酸取代，和在位置381的氨基酸取代。
282.权利要求279的方法，其中所述聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：E375Y，K512Y，T368F，A484E，A484Y，N387L，T372Q，T372L，K478Y，1370W，F198W和L381A。
283.权利要求95的组合物，其还包含与聚合酶接触的第一和第二多核苷酸，所述聚合酶配置为基于所述第二多核苷酸的序列将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸。
284.权利要求283的组合物，所述聚合酶经修饰而响应将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸来延迟焦磷酸盐的释放。
285.权利要求284的组合物，其中所述聚合酶包含经修饰的重组Ф29，B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，G1，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5，Cp-7，PR4，PR5，PR722或L17聚合酶。
286.权利要求284的组合物，其中所述聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：在位置484的氨基酸取代，在位置198的氨基酸取代和在位置381的氨基酸取代。
287.权利要求284的组合物，其中所述聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：E375Y，K512Y，T368F，A484E，A484Y，N387L，T372Q，T372L，K478Y，1370W，F198W和L381A。
288.权利要求283的组合物，其中所述第一部分和所述系链的部分配置为彼此杂交，以形成发夹结构。
289.系统，所述系统包含权利要求288的组合物和电压源，所述电压源配置为在所述第一侧和第二侧间施加电压。
290.权利要求289的系统，其中所述第一部分和所述系链的所述部分配置为在两步过程中响应所述电压而彼此去杂交。
291.权利要求283的组合物，所述第一伸长标签还包含第二部分，所述组合物还包含锚定到所述纳米孔的第一侧或第二侧或所述纳米孔的第一侧或第二侧附近的第三部分，所述第二部分和所述第三部分响应将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸而相互作用。
292.系统，所述系统包含权利要求291的组合物和电压源，所述电压源配置为在所述第一侧和第二侧间施加电压。
293.权利要求292的系统，其中所述第一部分和所述系链的所述部分配置为响应第一过程中的电压而彼此分开，并且其中所述第二部分和所述第三部分配置为响应第二过程中的电压而彼此分开。
294.权利要求135的方法，其还包括在所述第一侧上布置聚合酶，所述头部区锚定到所述聚合酶。
295.权利要求294的方法，其进一步使所述聚合酶与第一核苷酸以及与第一和第二多核苷酸接触，所述聚合酶基于所述第二多核苷酸的序列将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸。
296.权利要求295的方法，所述聚合酶经修饰而响应将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸来延迟焦磷酸盐的释放。
297.权利要求296的方法，其中所述聚合酶包含经修饰的重组Ф29，B103，GA-1，PZA，Φ15，BS32，M2Y，Nf，G1，Cp-1，PRD1，PZE，SF5，Cp-5，Cp-7，PR4，PR5，PR722或L17聚合酶。
298.权利要求296的方法，其中所述聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Ф29DNA聚合酶：在位置484的氨基酸取代，在位置198的氨基酸取代，和在381位的氨基酸取代。
299.权利要求296的方法，其中所述聚合酶包含具有选自下组的至少一个氨基酸取代或取代组合的经修饰的重组Φ29DNA聚合酶：E375Y，K512Y，T368F，A484E，A484Y，N387L，T372Q，T372L，K478Y，1370W，F198W和L381A。
300.权利要求135的方法，其中所述第一部分和所述系链的所述部分彼此杂交，以形成发夹结构。
301.权利要求300的方法，其还包括在所述第一侧和所述第二侧间施加电压。
302.权利要求301的方法，其中所述第一部分和所述系链的部分响应两步过程中的电压而彼此去杂交。
303.权利要求135的方法，所述第一伸长标签进一步包含第二部分，第三部分，所述第三部分锚定到所述纳米孔的第一侧或第二侧或所述纳米孔的第一侧或第二侧附近，所述第二部分和所述第三部分响应将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸而相互作用。
304.权利要求303的方法，其还包括在所述第一侧和所述第二侧间施加电压。
305.权利要求304的方法，其中所述第一部分和所述系链的部分响应第一过程中的电压而彼此分开，并且其中所述第二部分和所述第三部分响应第二过程中的电压而彼此分开。
306.权利要求1的组合物，其还包含布置在所述第一侧上的聚合酶，所述头部区锚定到所述聚合酶。
307.权利要求306的组合物，其还包含各自与所述聚合酶接触的第一核苷酸和第一和第二多核苷酸，所述聚合酶配置为基于所述第二多核苷酸的序列将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸。
308.权利要求307的组合物，所述第一核苷酸与可逆终止剂偶联，所述可逆终止剂抑制所述聚合酶向所述第一多核苷酸添加第二核苷酸。
309.权利要求308的组合物，其中所述可逆终止剂通过暴露于光或热能切割。
310.权利要求309的组合物，其中所述可逆终止剂通过吸收来自所述光的热能切割。
311.权利要求309的组合物，其中所述可逆终止剂通过由所述光诱导的光化学反应切割。
312.权利要求308的组合物，其中所述可逆终止剂通过与化学剂的反应切割。
313.权利要求312的组合物，其还包含所述化学剂的来源。
314.权利要求313的组合物，其中所述可逆终止剂布置在所述第一侧上，其中所述化学剂的来源布置在所述第二侧上，使得所述化学剂通过所述孔径从所述第二侧移动到所述第一侧。
315.权利要求312的组合物，其中所述可逆终止剂包含叠氮基甲基(CH2N3)，并且其中所述化学剂包含THP。
316.包含权利要求306的组合物的装置，其中所述组合物存在于流动池中，并且所述流动池配置为补充与所述聚合酶接触的试剂。
317.权利要求48的方法，其中聚合酶布置在所述第一侧上，所述头部区锚定到所述聚合酶。
318.权利要求317的方法，其进一步使所述聚合酶与第一核苷酸以及与第一和第二多核苷酸接触，所述聚合酶基于所述第二多核苷酸的序列将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸。
319.权利要求318的方法，所述第一核苷酸与可逆终止剂偶联，所述方法还包含通过所述可逆终止剂抑制所述聚合酶向所述第一多核苷酸添加第二核苷酸。
320.权利要求319的方法，所述方法还包括通过暴露于光或热来切割所述可逆终止剂。
321.权利要求320的方法，其包括通过吸收来自所述光的热切割所述可逆终止剂。
322.权利要求320的方法，其包括通过由所述光诱导的光化学反应切割所述可逆终止剂。
323.权利要求318的方法，所述方法还包含通过与化学剂反应切割所述可逆终止剂。
324.权利要求323的方法，其还包含提供所述化学剂来源。
325.权利要求324的方法，其还包含使流体流过所述聚合酶以除去所述化学剂。
326.权利要求325的方法，其还包含通过流体流向所述聚合酶提供新试剂。
327.权利要求326的方法，其中所述可逆终止剂布置在所述第一侧上，并且其中所述化学剂来源布置在所述第二侧上，所述方法包括通过孔径将所述化学剂从所述第二侧移动到所述第一侧。
328.权利要求323的方法，其中所述可逆终止剂包含叠氮基甲基(CH2N3)，并且其中所述化学剂包含THP。
329.权利要求95的组合物，其还包含与所述聚合酶接触的第一和第二多核苷酸，所述聚合酶配置为基于所述第二多核苷酸的序列将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸。
330.权利要求329的组合物，所述第一伸长标签还包含可逆终止剂，所述可逆终止剂抑制所述聚合酶向所述第一多核苷酸添加第二核苷酸。
331.权利要求330的组合物，其中所述可逆终止剂通过暴露于光或热能切割。
332.权利要求331的组合物，其中所述可逆终止剂通过吸收来自所述光的热能切割。
333.权利要求331的组合物，其中所述可逆终止剂通过由所述光诱导的光化学反应能切割。
334.权利要求330的组合物，其中所述可逆终止剂通过与化学剂的反应能切割。
335.权利要求334的组合物，其还包含所述化学剂的来源。
336.权利要求335的组合物，其中所述可逆终止剂布置在所述第一侧上，其中所述化学剂的来源布置在所述第二侧上，使得所述化学剂通过所述孔径从所述第二侧移动到所述第一侧。
337.权利要求334的组合物，其中所述可逆终止剂包含叠氮基甲基(CH2N3)，并且其中所述化学剂包含THP。
338.包含权利要求329的组合物的装置，其中所述组合物存在于流动池中，并且所述流动池配置为补充与所述聚合酶接触的试剂。
339.权利要求135的方法，其还包括在所述第一侧上布置聚合酶，所述头部区锚定到所述聚合酶。
340.权利要求339的方法，其进一步使所述聚合酶与第一核苷酸以及与第一和第二多核苷酸接触，所述聚合酶基于所述第二多核苷酸的序列将所述第一核苷酸添加到所述第一多核苷酸。
341.权利要求340的方法，所述第一伸长标签包含可逆终止剂，所述方法还包含通过所述可逆终止剂抑制所述聚合酶向所述第一多核苷酸添加第二核苷酸。
342.权利要求341的方法，所述方法还包括通过暴露于光或热来切割所述可逆终止剂。
343.权利要求342的方法，其包括通过吸收来自所述光的热来切割可逆终止剂。
344.权利要求342的方法，其包括通过由所述光诱导的光化学反应切割所述可逆终止剂。
345.权利要求341的方法，所述方法还包括通过与化学剂反应切割所述可逆终止剂。
346.权利要求345的方法，其还包含提供所述化学剂的来源。
347.权利要求346的方法，其中所述可逆终止剂布置在所述第一侧上，并且其中所述化学剂的来源布置在所述第二侧上，所述方法包括通过所述孔将所述化学剂从所述第二侧移动到所述第一侧。
348.权利要求345的方法，其中所述可逆终止剂包含叠氮基甲基(CH2N3)，并且其中所述化学剂包含THP。
349.权利要求339的方法，其还包括使流体流过所述聚合酶以除去所述化学剂。
350.权利要求349的方法，其还包含通过流体流向所述聚合酶提供新试剂。
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