CN114790465A

CN114790465A - 提高纳米材料稳定性的方法

Info

Publication number: CN114790465A
Application number: CN202110103570.3A
Authority: CN
Inventors: 郭岩彬; 李奎; 赵桂慎; 徐巧林; 高珊珊
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2022-07-26

Abstract

本发明提供一种提高纳米材料稳定性的方法。将来自水生拉恩氏菌、大肠杆菌的鞭毛蛋白FilC和孔蛋白OmpF用于提高纳米材料的稳定性，所述纳米材料可选自纳米硒、纳米金、纳米银。来自水生拉恩氏菌的FilC和OmpF，与其他纳米材料稳定剂(如SDS、PEG、PVP、BSA以及大肠杆菌FilC和OmpF)相比，在达到稳定化学合成纳米硒不受强酸、强碱和强离子浓度的影响条件下，所需水生拉恩氏菌FilC和OmpF的稳定效能是PVP、BSA以及大肠杆菌FilC和OmpF的10‑100倍。水生拉恩氏菌FliC和OmpF也能够显著增加纳米金和纳米银在强离子浓度条件下的稳定性，且效果显著优于大肠杆菌FilC和OmpF。

Description

提高纳米材料稳定性的方法

技术领域

本发明涉及微生物学、纳米科学和蛋白质技术领域，具体地说，涉及一种提高纳米材料稳定性的方法。

背景技术

硒(Selenium,Se)元素是人和动物必需的微量元素之一，是生物体内硫氧还原蛋白酶、脱碘酶、谷胱甘肽过氧化酶等多种含硒酶蛋白的必需组分，并且参与人体多种代谢途径。研究发现，人体缺硒会导致多种疾病，并且增加患癌风险。我国具有丰富硒资源，但硒在自然界分布极不均匀，导致我国三分之二以上地区缺硒。中国营养学会及FAO/WHO/IAEA联合专家委员会确定人体摄入量适宜范围为60-250μg/d，安全剂量为400μg/d，中毒剂量为800μg/d。硒过量也会造成人体危害。因此亟待为缺硒人群开发安全高效硒源。自然界中硒形态包括负二价、零价、四价及六价四种形态，研究表明，负二价、四价及六价形态的硒毒性巨大，作为补硒源具有潜在危险；块状零价单质灰硒不具有生物学活性，而纳米级别的单质硒具有显著生物学活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、减少DNA损伤、减少化疗副作用等，开发纳米硒作为补硒源具有明显优势。此外纳米硒还被设计为肿瘤靶药递释系统、用于抵抗肿瘤多药耐药等。

纳米材料在储存、加工和应用过程中稳定与否是其能否广泛应用的关键。纳米硒生物活性依赖于其纳米结构，其纳米结构是发挥其生物活性的关键。纳米硒可以通过物理、化学、生物的方法制备，其中化学合成和生物合成是目前纳米硒最高效经济的合成方式。化学合成纳米硒易于合成、粒径可控，但其稳定性较差，转化率低，环境风险大；生物纳米硒具有较高稳定性，生物转化率高，并且环境风险低，但是其合成周期长，工艺较复杂，粒径大小和均一性与菌株有关，不易控制。虽然目前已有许多关于纳米硒的报道，但是缺少对于纳米硒稳定性以及如何利用高稳定性生物纳米硒的稳定机制解决化学合成纳米硒稳定性差的深入研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高纳米材料稳定性的方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供孔蛋白OmpF的以下任一应用：

1)用于提高纳米材料的稳定性；

2)用于制备纳米材料的稳定剂；

3)用于制备纳米硒；

其中，所述纳米材料选自纳米硒、纳米金、纳米银。

本发明中，所述鞭毛蛋白FilC来自水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)，如水生拉恩氏菌HX2、大肠杆菌K12。

优选地，水生拉恩氏菌孔蛋白OmpF包含如下氨基酸序列或由其组成：

i)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白.

优选地，大肠杆菌孔蛋白OmpF包含如下氨基酸序列或由其组成：

i)如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

第二方面，本发明提供一种提高纳米材料稳定性的方法，在纳米材料制备过程中添加孔蛋白 OmpF，或者向纳米材料溶液中添加孔蛋白OmpF。

第三方面，本发明提供孔蛋白OmpF在提高纳米硒在强酸、强碱、高浓度盐离子、高浓度氧化剂、不同温度条件下稳定性中的应用。

所述纳米硒包括生物纳米硒和化学纳米硒；

对于生物纳米硒，所述强酸条件为1mM生物纳米硒溶液中HCl浓度为1mM；

所述强碱条件为1mM生物纳米硒溶液中NaOH浓度为1-1000mM；

所述高浓度盐离子条件为1mM生物纳米硒溶液中NaCl浓度为1-2000mM、MgCl₂浓度为0.1-10 mM、CaCl₂浓度为0.1-1mM或AlCl₃浓度为0.001-10mM；

所述高浓度氧化剂条件为1mM生物纳米硒溶液中H₂O₂浓度为0.01％-1％；

所述温度条件为-20℃～80℃。

对于化学纳米硒，所述强酸条件为1mM化学纳米硒溶液中HCl浓度为0.001-1M；

所述强碱条件为1mM化学纳米硒溶液中NaOH浓度为0.001-1M；

所述高浓度盐离子条件为1mM化学纳米硒溶液中MgCl₂浓度为0.1-100mM。

本发明中，所述生物纳米硒的制备方法可参见CN104774875B。

本发明中，所述化学纳米硒的制备方法可参见CN104310319B。

第四方面，本发明提供孔蛋白OmpF在提高纳米金或纳米银在高浓度盐离子条件下稳定性中的应用。

对于纳米金，所述高浓度盐离子条件为2nM纳米金溶液中MgCl₂浓度为0.1-10mM。

对于纳米银，所述高浓度盐离子条件为40mg/mL纳米银溶液中MgCl₂浓度为0.1-10mM。

第五方面，本发明提供一种纳米硒的制备方法，包括：

a)亚硒酸盐溶液与还原剂溶液在酸液和稳定剂存在的条件下发生还原反应，得到纳米硒悬浮液；其中，亚硒酸盐溶液与还原剂溶液按溶质质量比1:2-30；

b)将纳米硒悬浮液离心，去上清液，用去离子水清洗后重新悬浮于去离子水中，经冷冻干燥，即得成品固态纳米硒；

其中，所述还原剂为硫代硫酸钠溶液；

所述酸液为盐酸，加入量与亚硒酸盐溶液按溶质质量比为1-2.5:1。

进一步地，配制如下反应体系：40mM硫代硫酸钠、5mM亚硒酸钠、10mM盐酸和0.1mg/mL 鞭毛蛋白FilC，反应总体积为10mL；于25℃反应8小时；反应结束后，将反应产物于4℃，10000g 离心10min，用去离子水清洗3次，重新悬浮于去离子水中，冷冻干燥，即得成品固态纳米硒。

本发明提供来源于水生拉恩氏菌(菌株HX2)、大肠杆菌(菌株K12)的高稳定性生物纳米硒以及两种从该生物纳米硒表面剥离的特异性结合蛋白鞭毛蛋白FliC和孔蛋白OmpF，并提供FliC和 OmpF在稳定纳米材料中的应用。本发明利用一株可耐受高浓度亚硒酸盐的水生拉恩氏菌HX2合成生物纳米硒，对生物纳米硒进行分离纯化，从纯化后的生物纳米硒表面剥离蛋白，鉴定为鞭毛蛋白 FliC和孔蛋白OmpF。克隆FliC和OmpF蛋白基因，通过外源表达并纯化后，得到蛋白纯品。经体外纳米硒稳定实验验证发现，相比其他纳米材料稳定剂，如十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇(PEG) K30、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K30、牛血清白蛋白(BSA)，以及大肠杆菌K12鞭毛蛋白FliC和孔蛋白OmpF，在达到稳定化学合成纳米硒不受强酸、强碱和强离子浓度的影响条件下，所需水生拉恩氏菌HX2鞭毛蛋白FliC-HX2和孔蛋白OmpF-HX2的稳定效能是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K30、牛血清白蛋白(BSA)，以及大肠杆菌K12鞭毛蛋白FliC和孔蛋白OmpF的10-100倍。水生拉恩氏菌HX2 FliC和OmpF蛋白也能够显著增加纳米金和纳米银在强离子浓度处理条件下的稳定性，且效果显著优于FliC-K12和OmpF-K12，大肠杆菌K12鞭毛蛋白FliC-K12会导致纳米银的聚集。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中生物纳米硒与化学合成纳米硒透射电镜照片。A-E：对应表1所列52 nm～260nm粒径生物纳米硒；F-J：对应表1所列55nm～241nm粒径化学合成纳米硒。标尺200nm。

图2为本发明较佳实施例中生物纳米硒(A)及化学纳米硒(B)EDS能谱、HRTEM及mapping图像 (标尺100nm)。

图3为本发明较佳实施例中生物纳米硒与化学合成纳米硒消光谱。A、B：1mM浓度下52-260nm 粒径生物纳米硒和55-241nm粒径化学合成纳米硒的消光谱；C、D：0.1-4mM的90nm粒径生物纳米硒与化学合成纳米硒的消光谱。

图4为本发明较佳实施例中NaCl、MgCl₂、CaCl₂、AlCl₃、HCl、NaOH、H₂O₂以及温度对生物纳米硒和化学合成纳米硒稳定性影响的照片。

图5为本发明较佳实施例中生物纳米硒和化学合成纳米硒在NaCl、MgCl₂、CaCl₂、AlCl₃、HCl、 NaOH和H₂O₂中，以及在低温和高温下的稳定性。数值代表平均值±标准差(n＝3)。注：**表示p<0.01 (Student’s T-Test)。

图6为本发明较佳实施例中生物纳米硒表面剥离蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图。M：蛋白分子量标记；条带1为空白对照样品；条带2-5分别为利用4％十二烷基硫酸钠，20％的氨水，7M的尿素和 2％的曲拉通X-100剥离的生物纳米硒表面蛋白。

图7为本发明较佳实施例中外源表达的HX2 FliC(A)和OmpF(B)蛋白所在整个蛋白中的位置。箭头标记部分为引物扩增位置。

图8为本发明较佳实施例中表达载体pET29a-fliC-HX2、pET29a-fliC-K12、pET29a-ompF-HX2 和pET29a-ompF-K12的构建和验证。(A)基因fliC-HX2(1)和ompF-HX2(2)的扩增。(B)Not I和Xho I双酶切pET29a(3)、fliC-HX2(4)和ompF-HX2(5)。(C)PCR验证阳性克隆菌落E.coli BL21(DE3) pLysS-pET29a-fliC-HX2(6)和E.coli BL21(DE3)pLysS-pET29a-ompF-HX2(7)。(D)基因fliC-K12(8) 和ompF-K12(9)的扩增。(E)Not I和Xho I双酶切pET29a(10)、fliC-K12(11)和ompF-K12(12)。(F)PCR 验证阳性克隆菌落E.coli BL21(DE3)pLysS-pET29a-fliC-K12(13)和E.coli BL21(DE3) pLysS-pET29a-ompF-K12(14)。

图9为本发明较佳实施例中FliC-HX2、FliC-K12、OmpF-HX2和OmpF-K12蛋白外源表达验证及分子量。(A-D)FliC-HX2(A)、FliC-K12(B)、OmpF-HX2(C)和OmpF-K12(D)蛋白的外源表达 SDS-PAGE图。泳道1、2、3和4分别为无ITPG诱导E.coli BL21(DE3)pLysS-pET29a-fliC-HX2菌体， ITPG诱导菌体，ITPG诱导裂解菌体上清和ITPG诱导裂解菌体沉淀。泳道5、6、7和8分别为无ITPG 诱导E.coli BL21(DE3)pLysS-pET29a-fliC-K12菌体，ITPG诱导菌体，ITPG诱导裂解菌体沉淀和 ITPG诱导裂解菌体上清。泳道9、10、11和12分别为无ITPG诱导E.coli BL21(DE3) pLysS-pET29a-ompF-HX2菌体，ITPG诱导菌体，ITPG诱导裂解菌体上清和ITPG诱导裂解菌体沉淀。泳道13、14、15和16分别为无ITPG诱导E.coli BL21(DE3)pLysS-pET29a-ompF-K12菌体，ITPG诱导菌体，ITPG诱导裂解菌体上清和ITPG诱导裂解菌体沉淀。

图10为本发明较佳实施例中纯化FliC-HX2、FliC-K12、OmpF-HX2和OmpF-K12蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图11为本发明较佳实施例中OmpF-K12、FliC-K12、OmpF-HX2和FliC-HX2控制纳米硒体外组装电镜照片，CK是无蛋白体外组装纳米硒。标尺：200nm。

图12为本发明较佳实施例中纳米硒表面修饰蛋白OmpF-K12、FliC-K12、OmpF-HX2和 FliC-HX2免疫印迹分析图片。泳道1、3、5和7分别为纯化的FliC-HX2、FliC-K12、OmpF-HX2和 OmpF-K12蛋白，泳道2、4、6和8分别为从蛋白修饰纳米硒表面剥离的FliC-HX2、FliC-K12、 OmpF-HX2和OmpF-K12蛋白。M：分子量标记。

图13为本发明较佳实施例中100mM MgCl₂，1M HCl和1M NaOH处理条件下，SDS、PEGK30、PVP K30、BSA、OmpF-K12、OmpF-HX2、FliC-K12和FliC-HX2稳定化学合成纳米硒的照片。

图14为本发明较佳实施例中FliC和OmpF蛋白和对照品体外稳定化学合成纳米硒结果。100 mM MgCl₂(A)、1M HCl(B)和1M NaOH(C)处理条件下，SDS、PEG K30、PVP K30和BSA对化学合成纳米硒的稳定作用。100mM MgCl₂(D)、1M HCl(E)和1M NaOH(F)处理条件下，OmpF-K12、 OmpF-HX2、FliC-K12和FliC-HX2对化学合成纳米硒的稳定作用。数值代表平均值±标准差(n＝3)。

图15为本发明较佳实施例中化学纳米硒表面OmpF-K12、FliC-K12、OmpF-HX2和FliC-HX2蛋白免疫印迹分析图片。泳道1、3、5和7分别为纯化的FliC-HX2、FliC-K12、OmpF-HX2和OmpF-K12 蛋白，泳道2、4、6和8分别为从化学合成纳米硒表面剥离的FliC-HX2、FliC-K12、OmpF-HX2和 OmpF-K12蛋白。M：分子量标记。

图16为本发明较佳实施例中MgCl₂处理条件下纳米金和纳米银颗粒的消光谱变化。(A)0-10 mM MgCl₂处理条件下纳米金颗粒的消光谱变化。(B)0-10mM MgCl₂处理条件下纳米银颗粒的消光谱变化。

图17为本发明较佳实施例中FliC和OmpF蛋白体外稳定纳米金和纳米银颗粒中的作用。(A,B) 10mM MgCl₂处理条件下，OmpF-K12、OmpF-HX2、FliC-K12和FliC-HX2对纳米金和纳米银颗粒的稳定作用照片。(C,D)10mM MgCl₂处理条件下，OmpF-K12、OmpF-HX2、FliC-K12和FliC-HX2 对纳米金和纳米银颗粒的稳定作用消光比。数值代表平均值±标准差(n＝3)。

图18为本发明较佳实施例中FliC-K12诱导纳米银聚集结果。上面照片为纳米银与0.0001 mg/mL-0.1mg/mL FliC-K12蛋白孵育1h后照片。下图为为纳米银与0.0001mg/mL-0.1mg/mL FliC-K12蛋白孵育后消光值比。数值代表平均值±标准差(n＝3)。

具体实施方式

本发明通过一株亚硒酸盐的还原细菌水生拉恩氏菌HX2合成生物纳米硒，对生物纳米硒进行分离纯化，可得到不同粒径大小的纳米硒。对纯化后的生物纳米硒稳定性测试发现，其耐受强酸、强碱、高浓度盐离子、高浓度氧化剂和高温低温的稳定性显著高于化学合成纳米硒。从纯化后的生物纳米硒表面剥离特异性结合蛋白，鉴定为鞭毛蛋白FliC和孔蛋白OmpF。利用大肠杆菌表达系统外源表达并纯化后，得到FliC-HX2和OmpF-HX2蛋白纯品。经体外组装实验验证发现，相比其他稳定剂，十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇(PEG)K30、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K30、牛血清白蛋白(BSA)以及大肠杆菌鞭毛蛋白FliC和孔蛋白OmpF，水生拉恩氏菌HX2鞭毛蛋白FliC和孔蛋白OmpF能够在显著低浓度下稳定纳米硒不受强酸、强碱和高浓度盐离子的影响。进一步研究水生拉恩氏菌HX2鞭毛蛋白 FliC-HX2和孔蛋白OmpF-HX2在稳定纳米金和纳米银的功能中发现，两者均能在低浓度下使纳米金和纳米银耐受高浓度盐离子。而大肠杆菌K12鞭毛蛋白FliC-K12和孔蛋白OmpF-K12效果低于水生拉恩氏菌HX2，且大肠杆菌K12鞭毛蛋白FliC-K12会导致纳米银的聚集。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，MolecularCloning:a Laboratory Manual， 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1生物纳米硒的分离与表征

1、生物纳米硒合成与纯化

水生拉恩氏菌HX2合成生物纳米硒的方法参考中国专利CN104774875B。将制备的生物纳米硒采用密度梯度离心方法制备260、146、118、90和52nm粒径的生物纳米硒。利用动态光散射法测定纳米硒的粒径大小、粒径分布和多分散性指数，结果见表1。利用透射电子显微镜观察颗粒形貌，如图1中A-E所示，不同粒径生物纳米硒均为球形，且透射电镜观察到的粒径大小与动态光散射法测定的结果吻合。

表1

2、化学合成纳米硒制备

参考中国专利CN104310319B中公开的方法。制备55、91、113、160和241nm粒径化学合成纳米硒。利用动态光散射法测定粒径大小、粒径分布和多分散性指数，如表1。利用透射电子显微镜观察颗粒形貌，如图1中F-J所示，不同粒径化学合成纳米硒均为均匀分散的球形。

3、电子能谱分析

利用能量散射谱分析，可以对生物纳米硒和化学合成纳米硒元素进行鉴定。在高分辨透射电子显微镜下观察生物纳米硒和化学合成纳米硒，并获得两者电子能谱图。如图2所示，生物纳米硒和化学合成纳米硒能谱图分别在1.37,11.22,12.49keV有Se元素K、L、M电子层特征谱峰。对生物纳米硒和化学合成纳米硒颗粒做元素分布(mapping)扫描，获得Se元素在颗粒上的分布，如图3插图所示。对生物纳米硒和化学合成纳米硒的能谱分析表明纳米颗粒元素成分为硒元素，颗粒中硒元素均匀分布。

4、利用消光谱测定纳米硒的粒径的方法

取1mM各粒径的生物纳米硒及化学合成纳米硒各200μL加入到96孔板，每种粒径纳米硒三个重复；设置全波长扫描仪波长范围为300-900nm，读数间隔4nm；根据光谱扫描数值绘制纳米硒消光光谱，如图3所示。生物纳米硒和化学合成纳米硒的颜色随着粒径增加呈现出由黄色到红色的变化(图3，A和B中的插图)。利用多功能全波长扫描仪测定表1中生物纳米硒和化学合成纳米硒的消光谱，如图3中A和B所示，随着纳米硒粒径的增加，生物纳米硒和化学合成纳米硒的消光谱均发生红移。本研究选择粒径最为接近的约90nm的生物纳米硒和化学合成纳米硒进行后续测试实验，设置不同浓度的生物纳米硒和化学纳米硒测定消光谱，结果如图3中C和D所示，生物纳米硒和化学合成纳米硒消光谱随着样品浓度的增加(0.1-4mM)，消光值增加，但是消光谱无红移。说明纳米硒消光谱红移与粒径有关，而与浓度无关。可以利用消光谱是否红移测定纳米硒粒径的变化、纳米硒聚集和稳定性。

以90nm粒径纳米硒为初始粒径，进行粒径变化评估，由图3中A和B可知，生物纳米硒消光值在300-328nm范围内随着粒径增加而减小，化学纳米硒在300-348nm范围内随着粒径增加而减小。因此可根据此现象以对照品和测试样品在该波长范围内的消光值比值定量研究纳米硒粒径变化。在后续评估粒径变化时，可选用两种纳米硒消光值随着粒径增加而减小的共同波长范围300-328nm。由于纳米硒消光值也随着波长增加而减少，可优选接近300-316nm波长范围内波长进行评估，最优选用308nm处消光值比定量纳米硒粒径变化。本发明以化学纳米硒为标品，建立纳米硒粒径变化评估模型。化学纳米硒从91nm到113nm、160nm和241nm增加时，91nm化学纳米硒在308nm处的消光值与113nm、160nm和241nm化学纳米硒在308nm处的消光值的比值分别为1.29、1.86和2.69。定义消光值比＜1.2表示纳米硒稳定性未受显著影响，1.2≤消光值比＜2.0表示纳米硒发生较明显聚集，消光值比≥2.0表示纳米硒发生严重聚集。

实施例2 HX2菌株合成生物纳米硒具有强的稳定性

1、HX2合成的纳米硒在盐离子下的稳定性

金属离子盐溶液终浓度：1mM、10mM、100mM、1000mM NaCl，0.1mM、1mM、10mM、 100mMMgCl₂，0.1mM、1mM、10mM、100mM CaCl₂，0.001mM、0.01mM、0.1mM、1mM、 10mM、100mM AlCl₃。取96孔板，分别加入100μL相应浓度的NaCl、MgCl₂、CaCl₂、AlCl₃；在相应盐溶液孔中分别加入100μL 2mM的生物及化学合成纳米硒溶液，每个处理三个重复，25℃处理1h；使用全波长扫描仪读取308nm波长处消光值；计算对照样品和处理后样品在308nm波长处的消光值比值，定量化学合成纳米硒与生物纳米硒的聚集程度。

处理后生物纳米硒和化学合成纳米硒的颜色变化如图4所示，纳米硒颜色随着聚集程度增加，转变为橙红色。

定量结果如图5所示，生物纳米硒在1-2000mM的NaCl中，消光值比无显著增加，表明生物纳米硒在1-2000mM的NaCl处理条件下可稳定存在；化学合成纳米硒在1-10mM NaCl消光值比无显著增加，100mM NaCl中出现聚集，消光值比达到1.2，在1000-2000mM时完全聚集，消光值比达到 2.3和2.1。消光值比结果表明生物纳米硒在高浓度NaCl中可稳定存在，化学合成纳米硒仅能在低于 1-10mM NaCl中稳定存在。生物纳米硒耐受NaCl浓度至少高于化学合成纳米硒200倍。

生物纳米硒在0.1-10mM MgCl₂中，消光值比无显著增加，表明生物纳米硒在0.1-10mM MgCl₂处理条件下可稳定存在；在100mM MgCl₂中聚集，消光值比为1.2。化学合成纳米硒在0.1-1mM MgCl₂处理条件下可稳定存在；在10-100mM MgCl₂中聚集，消光值比达到2.0以上。生物纳米硒耐受MgCl₂浓度高于化学合成纳米硒10倍。

生物纳米硒在0.1-1mM CaCl₂中，消光值比无显著增加，表明生物纳米硒在0.1-1mM CaCl₂处理条件下可稳定存在；在10-100mM CaCl₂中聚集，消光值比为1.7和2.5。化学合成纳米硒在0.1-1mM CaCl₂处理条件下可稳定存在；在10-100mM CaCl₂中聚集，消光值比分别达到2.3和2.2。生物纳米硒耐受CaCl₂浓度与化学合成纳米硒相当。

生物纳米硒在0.001-10mM AlCl₃中，消光值比无显著增加，表明生物纳米硒在0.001-10mM AlCl₃处理条件下可稳定存在；在100mM AlCl₃中聚集，消光值比为1.5。化学合成纳米硒在0.001-0.01 mM AlCl₃处理条件下可稳定存在；在0.1-100mM AlCl₃中均聚集，消光值比均达到2.0以上。生物纳米硒耐受AlCl₃浓度高于化学合成纳米硒1000倍。

根据消光值比的结果，生物纳米硒和化学合成纳米硒对高价盐离子更敏感，而生物纳米硒耐受各种盐离子的能力高于化学合成纳米硒10倍至1000倍不等。

2、HX2合成的纳米硒在酸、碱中的稳定性

酸碱溶液终浓度：1mM、10mM、100mM、1000mM HCl，1mM、10mM、100mM、1000mM NaOH；取96孔板，分别加入100μL相应浓度的HCl和NaOH；在相应酸碱溶液中分别加入100μL 2 mM的生物及化学合成纳米硒溶液，每个处理三个重复，25℃处理1h；使用全波长扫描仪在308nm 测定消光值，计算对照样品和处理后样品在308nm波长处的消光值比值，定量化学合成纳米硒与生物纳米硒的聚集程度。定量结果如图5所示，生物纳米硒在1mM HCl中，消光值比无显著增加，表明生物纳米硒在1mM HCl处理条件下可稳定存在；在10、100和1000mM HCl中聚集，消光值比为1.4、1.2和1.2，发生不同程度聚集。化学合成纳米硒在1-10mM HCl处理条件下可稳定存在；在 100和1000mM HCl中聚集，消光值比达到1.6和3.8。生物纳米硒耐受HCl浓度低于化学合成纳米硒 10倍，但在高浓度HCl中，生物纳米硒聚集程度显著低于化学合成纳米硒。

生物纳米硒在1-1000mM NaOH中，消光值比无显著增加，表明生物纳米硒在1-1000mM NaOH 处理条件下可稳定存在。化学合成纳米硒在1-100mM NaOH处理条件下可稳定存在；在1000mM NaOH中聚集，消光值比达到5.7。生物纳米硒耐受NaOH浓度高于化学合成纳米硒至少10倍。

3、HX2合成的纳米硒在氧化剂中的稳定性

过氧化氢溶液终浓度：0.01％、0.1％、1％、10％、15％H₂O₂；取96孔板，分别加入100μL相应浓度的H₂O₂；在相应盐溶液孔中分别加入100μL 2mM的生物及化学合成纳米硒溶液，每个处理三个重复，25℃处理1h；使用全波长扫描仪在308nm测定消光值，计算对照样品和处理后样品在308 nm波长处的消光值比值，定量化学合成纳米硒与生物纳米硒的聚集程度。处理后生物纳米硒和化学合成纳米硒的颜色变化如图4所示，纳米硒颜色随着氧化程度增加，转变为无色。定量结果如图5 所示，生物纳米硒在0.01％-1％H₂O₂中，消光值比无显著增加，表明生物纳米硒在0.01％-1％H₂O₂处理条件下可稳定存在；在10％和15％H₂O₂中发生氧化，消光值比为1.2和1.4。化学合成纳米硒在 0.01％-1％H₂O₂处理条件下可稳定存在；在10％和15％H₂O₂中发生氧化，消光值比达到2.6和3.8。生物纳米硒耐受H₂O₂浓度与化学合成纳米硒相当，但在高浓度H₂O₂中，生物纳米硒氧化程度显著低于化学合成纳米硒。

4、HX2合成的纳米硒对温度的稳定性

温度处理：-80℃、-20℃、4℃、25℃、37℃、60℃、80℃、100℃、121℃；准备-80℃、-20℃、 4℃冰箱及37℃、60℃、80℃、100℃水浴锅和121℃灭菌锅；每个温度下取三管500μL1mM化学合成纳米硒及生物纳米硒溶液，置于上述不同温度下冰箱和水浴中，处理1h后取出恢复至室温；每管取200μL加入96孔板。使用全波长扫描仪在308nm测定消光值，计算对照样品和处理后样品在308 nm波长处的消光值比值，定量化学合成纳米硒与生物纳米硒的聚集程度。

处理后生物纳米硒和化学合成纳米硒的颜色变化如图4所示，纳米硒颜色随着聚集程度增加，转变为橙红色。定量结果如图5所示，生物纳米硒在-20℃～80℃处理条件下稳定，在-80℃和100℃处理条件下开始聚集。化学合成纳米硒在4℃～80℃处理条件下稳定，在-20℃和100℃处理条件下开始聚集。

生物纳米硒在-20℃～100℃处理条件下，消光值比无显著增加，表明生物纳米硒在-20℃～80℃处理条件下可稳定存在；在-80℃和121℃处理条件下，消光值比为1.1和2.8。化学合成纳米硒在 4℃～80℃处理条件下可稳定存在；在-80℃、-20℃、100℃和121℃中发生聚集，消光值比达到2.1、 1.2、1.2和3.6。温度处理实验结果表明纳米硒在高温和低温条件下不稳定，但生物纳米硒对高温和低温处理的耐受能力比化学合成纳米硒更强。

5、MgCl₂处理条件下纳米硒的稳定性和表面电势变化

取1mL的200mM MgCl₂，分别加入1mL 2mM的化学合成纳米硒及生物纳米硒溶液，室温处理1h；分别将处理后纳米硒溶液置于比色皿和电泳池中，利用动态光散射仪测定其粒径分布及表面电势。

结果如表2所示，在MgCl₂处理条件下，生物纳米硒的平均水合粒径从90nm增加至326nm，多分散性指数从0.205增加至0.310，表面电势由-52.4mV增加至-0.9mV。化学合成纳米硒的平均水合粒径从91nm增加至536nm，多分散性指数从0.127增加至0.457，表面电势由-51.9mV增加至-3.1 mV。处理后生物纳米硒和化学合成纳米硒表面电势无显著差异，而生物纳米硒水合直径和多分散性指数均显著小于化学合成纳米硒。进一步证明生物纳米硒对MgCl₂的耐受能力比化学合成纳米硒更强。

表2

6、HCl处理条件下纳米硒的稳定性和表面电势变化

取1mL的2M HCl，分别加入1mL 2mM的化学合成纳米硒及生物纳米硒溶液，室温处理1h；分别将处理后纳米硒溶液置于比色皿和电泳池中，利用动态光散射仪测定其粒径分布及表面电势。

结果如表2所示，在HCl处理条件下中，生物纳米硒的平均水合粒径从90nm增加至108nm，多分散性指数从0.205增加至0.385，表面电势由-52.4mV增加至-11.6mV。化学合成纳米硒的平均水合粒径从91nm增加至884nm，多分散性指数从0.127增加至0.799，表面电势由-51.9mV增加至-1.0 mV。处理后生物纳米硒和化学合成纳米硒表面电势无显著差异，而生物纳米硒水合直径和多分散性指数均显著小于化学合成纳米硒。进一步证明生物纳米硒对HCl的耐受能力比化学合成纳米硒更强。

7、NaOH处理条件下纳米硒的稳定性和表面电势变化

取1mL的2M NaOH，分别加入1mL 2mM的化学合成纳米硒及生物纳米硒溶液，室温处理1h；分别将处理后纳米硒溶液置于比色皿和电泳池中，利用动态光散射仪测定其粒径分布及Zeta电势。

结果如表2所示，在NaOH处理条件下中，生物纳米硒的平均水合粒径从90nm增加至100nm，多分散性指数从0.205增加至0.242，表面电势由-52.4mV增加至4.4mV。化学合成纳米硒的平均水合粒径从91nm增加至1568nm，多分散性指数从0.127增加至0.433，表面电势由-51.9mV增加至2.7 mV。处理后生物纳米硒和化学合成纳米硒表面电势和多分散性指数无显著差异，而生物纳米硒水合直径显著小于化学合成纳米硒。进一步证明生物纳米硒对NaOH的耐受能力比化学合成纳米硒更强。

实施例3生物纳米硒表面特异性蛋白的剥离、质谱鉴定

1、生物纳米硒包被蛋白的剥离

尿素处理剥离生物纳米硒包被蛋白。取40mg纯化的生物纳米硒，以7M尿素溶液，100℃水浴 5min处理生物纳米硒样品，处理后4℃离心20min，取离心上清液，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)检测蛋白剥离效果。结果如图6所示，7M尿素处理后可从纯化后生物纳米硒表面分离得到两个蛋白条带。

SDS处理剥离生物纳米硒包被蛋白。取40mg纯化的生物纳米硒，以4％SDS尿素溶液，100℃水浴5min处理生物纳米硒样品，处理后4℃离心20min，取离心上清液，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)检测蛋白剥离效果。结果如图6所示，4％SDS尿素处理后可从纯化后生物纳米硒表面分离得到两个蛋白条带。

曲拉通X-100处理剥离生物纳米硒包被蛋白。取40mg纯化的生物纳米硒，以2％曲拉通X-100 溶液，100℃水浴5min处理生物纳米硒样品，处理后4℃离心20min，取离心上清液，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白剥离效果。结果如图6所示，2％曲拉通X-100处理后可从纯化后生物纳米硒表面分离得到两个蛋白条带。

氨水处理剥离生物纳米硒包被蛋白。取40mg纯化的生物纳米硒，以20％的氨水溶液，100℃水浴处理生物纳米硒样品，100℃水浴5min处理生物纳米硒样品，处理后4℃离心20min，取离心上清液，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白剥离效果。结果如图6所示，20％的氨水溶液处理未能获得蛋白条带。

对比图6胶图中各处理条带，SDS处理条件下，蛋白条带均一，浓度显著高于其他处理，4％SDS 溶液，100℃水浴5min是生物纳米硒包被蛋白剥离的最优条件。

2、质谱鉴定

在SDS-PAGE胶上切取剥离下来蛋白的电泳条带，用Trypsin酶切，以C18柱高效液相色谱分离用Orbitrap-ELite质谱仪(Thermo Finnigan,San Jose,CA)进行鸟枪法质谱分析；用Mascot的 Proteome Discoverer 2.1(Thermo Scientific)进行查库鉴定及定量分析。将所得数据搜索水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)HX2蛋白数据库。蛋白条带1和条带2鉴定结果分别对应水生拉恩氏菌 (Rahnella aquatilis)HX2鞭毛蛋白FliC和孔蛋白OmpF。如表3所示，鞭毛蛋白FliC和孔蛋白OmpF 分别鉴定出14条和5条独特肽段，蛋白序列覆盖率分别为46.9％和16.8％。FliC蛋白共426个氨基酸，分子量为43.4KDa，OmpF蛋白共370个氨基酸，分子量为40.4KDa。

实施例4水生拉恩氏菌HX2和大肠杆菌K12的鞭毛蛋白FliC和孔蛋白OmpF的外源表达及纯化

1、HX2和K12鞭毛蛋白FliC和孔蛋白OmpF外源表达

利用表4中的引物，分别扩增HX2及K12菌株的fliC和ompF基因。HX2菌株的fliC基因引物序列 HX2-fliC-f：5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAACCGCTTCACTTCTAACATC-3’，HX2-fliC-r： 5’-CCGCTCGAGTTGCAGCAGGGACAGTAC-3’；HX2菌株的ompF基因引物序列HX2-ompF-f： 5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCAGAAATCTATAACAAA-3’，HX2-ompF-r： 5’-CCGCTCGAGGAACTGGTAAACGATACC-3’；K12菌株的fliC基因引物序列K12-fliC-f： 5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAACCGTTTCACCTCTAACA-3’，K12-fliC-r： 5’-CCGCTCGAGACCCTGCAGCAGAGACAGAAC-3’；K12菌株的fliC基因引物序列K12-ompF-f： 5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCAGAAATCTATAACAAA-3’，K12-ompF-r： 5’-CCGCTCGAGGAACTGGTAAACGATACC-3’。HX2菌株的fliC和ompF基因引物扩增的基因序列编码的氨基酸序列所在整个蛋白中的位置见图7。扩增连接于载体用于表达的FliC-HX2蛋白序列范围为52-426aa，OmpF蛋白序列范围为24-370aa。

PCR反应体系为：ddH₂O 18.5μL；10×Buffer 5μL；dNTPs 4μL；引物F终浓度10μM；引物R 终浓度10μM；模板0.5μL(终浓度2-5ng/μL)；rTaq酶0.5μL(终浓度0.1-0.2U/μL)。PCR反应条件为： 95℃5min；94℃1min，55～62℃1min，72℃2min，30个循环；72℃：10min；4℃；保存。扩增 DNA片段电泳胶图如图8中A和D所示，HX2及K12菌株的fliC和ompF基因DNA片段大小正确， HX2-fliC为1125bp，HX2-ompF为1041bp，K12-fliC为1341bp，K12-ompF为1020bp。扩增的HX2 菌株的fliC和ompF基因DNA片段所编码氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示，扩增的K12菌株的 fliC和ompF基因DNA片段所编码氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7和8所示。

HX2和K12的fliC和ompF基因及pET29a质粒的酶切、纯化：将HX2和K12的fliC、ompC基因以及pET29a质粒分别用限制性核酸内切酶Not I与Xho I酶切，利用Takara DNA纯化试剂盒纯化酶切后的fliC和ompF基因及pET29a质粒。双酶切后的基因和质粒DNA电泳结果如图8中B和E所示，酶切后 HX2及K12菌株的fliC和ompF基因以及pET29a质粒DNA片段大小正确，HX2-fliC为约1100bp， HX2-ompF为约1000bp，K12-fliC为约1300bp，K12-ompF为约1000bp，pET29a质粒为约5300bp。

HX2和K12的fliC和ompF基因与pET29a质粒的连接，连接产物热激转化BL21感受态细胞，将转化产物，涂布均匀于抗生素平板上，37℃倒置培养至长出菌落。从过夜培养的Km抗性的平板上挑取菌落，利用pET29a质粒T7启动子引物(表4)PCR扩增HX2和K12的fliC和ompF基因DNA序列。利用阳性克隆菌落扩增的DNA片段电泳胶图如图8中C和F所示，HX2-fliC片段大小为约1400bp， HX2-ompF片段大小为约1300bp，K12-fliC片段大小为约1600bp，K12-ompF片段大小为约1300bp，除去pET29a质粒T7启动子引物间序列大小约300bp后，与设计大小相同。将扩增的DNA片段分别测序，验证设计引物酶切位点与pET29a质粒的连接情况以及DNA片段内碱基序列是否有误。扩增的 HX2-fliC片段，HX2-ompF片段，K12-fliC片段和K12-ompF片段分别分别如SEQ ID NO:3-6所示，经与设计的序列比对，酶切位点与碱基序列均正确。

将验证的表达菌株BL21-pET29a-fliC-HX2、BL21-pET29a-ompC-HX2、BL21-pET29a-fliC-K12、 BL21-pET29a-ompC-K12于含Km液体培养基中活化；加入IPTG至终浓度为0.1mM，诱导融合蛋白表达，继续培养6h，取菌液离心收集菌体；将收集的菌体超声破碎10min，离心取上清，并将沉淀加入1％SDS于100℃水浴3-5min，利用SDS-PAGE凝胶电泳检测。如图9所示，与诱导前未加ITPG 处理组相比，ITPG添加组成功诱导蛋白的外源表达，FliC-HX2、FliC-K12、OmpF-HX2和OmpF-K12 蛋白ITPG诱导组分别在约45KDa、50KDa、40KDa和40KDa分子量处有显著增强的蛋白条带。通过细胞裂解，离心分离细胞裂解上清液和沉淀，得知蛋白FliC-HX2和FliC-K12主要存在于细胞上清中，蛋白OmpF-HX2和OmpF-K12主要以包涵体蛋白方式存在于沉淀中。

表4

注：Ap^r、Cm^r、Km^r分别代表氨苄霉素、氯霉素、卡那霉素抗性。引物下划线代表酶切位点。

2、FliC和OmpF蛋白纯化

FliC-HX2和FliC-K12蛋白纯化：1g表达细胞沉淀用100mL的PBS缓冲液稀释，将细胞悬液于冰浴中用超声波破碎仪破碎细胞，设置100％功率，启停间隔5s，时间20min。破碎后于4℃，13000 rpm离心30min，取上清液，利用海狸公司镍离子磁珠试剂盒，将上清液与磁珠混合30min，用磁铁分离磁珠，利用含50mM咪唑的PBS缓冲液清洗磁珠5-10遍，利用含500mM咪唑的PBS缓冲液洗脱磁珠上的目标蛋白。将收集的蛋白于10KDa分子量的超滤离心管中浓缩，用ddH₂O清洗脱盐，4℃保存待用。

OmpF-HX2和OmpF-K12蛋白纯化：1g表达细胞沉淀用100mL的PBS缓冲液稀释，将细胞悬液于冰浴中用超声波破碎仪破碎细胞，设置100％功率，启停间隔5s，时间20min。破碎后于4℃，13000 rpm离心30min，取沉淀。用PBS缓冲液充分洗涤5-10遍包涵体，将包涵体变性溶解在7M盐酸胍中，于20000g，4℃离心30min后，取上清快速稀释于10倍体积的ddH₂O中，并混合充分。4℃10000g 离心30min后，弃上清，收集沉淀；使用8M尿素充分变性溶解上述沉淀。4℃20000g离心30min 后，取上清，按照1-5mL/min的速度稀释至10倍体积的ddH₂O中，并混合充分，此时得到可溶的复性蛋白；将可溶复性蛋白按照上述可溶性蛋白纯化步骤纯化，得到OmpF-HX2和OmpF-K12蛋白。

利用考马斯亮蓝法对纯化后的FliC-HX2、FliC-K12、OmpF-HX2和OmpF-K12蛋白进行定量， 1g湿重的FliC-HX2、FliC-K12、OmpF-HX2和OmpF-K12蛋白表达细胞可分别获得约2.5mg、1.4mg、 43.1mg和17.7mg的纯化蛋白。对纯化后蛋白纯度进行聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，如图10所示，获得可进行后续实验的纯化蛋白。

实施例5鞭毛蛋白FliC和孔蛋白OmpF在体外组装纳米硒中的应用

1、FliC和OmpF蛋白修饰纳米硒的体外合成和形貌观察

FliC和OmpF蛋白修饰纳米硒的体外组装反应体系如下：终浓度为40mM的硫代硫酸钠为还原剂，5mM亚硒酸钠为反应底物，10mM盐酸调控反应体系pH，分别以0.1mg/mL FliC-HX2、 OmpF-HX2、FliC-K12和OmpF-K12为稳定剂，总反应体积为10mL，于25℃反应8小时。设置不加稳定剂组为对照组。

反应8小时后，将反应产物4℃10000g离心10min，用去离子水清洗3次，重新悬浮于去离子水中，获得纯化的FliC-HX2、OmpF-HX2、FliC-K12和OmpF-K12修饰的纳米硒。

利用电子显微镜观察反应产物形貌和大小，如图11所示，无稳定剂时，反应产物为聚集的团块状沉淀，而SDS、FliC-HX2、FliC-K12、OmpF-HX2和OmpF-K12作为稳定剂修饰的纳米硒颗粒粒径范围分别为70–100nm、60–150nm、150–200nm、150–200nm和150–300nm。此外，FliC-HX2、 FliC-K12、OmpF-HX2和OmpF-K12修饰的纳米硒颗粒形貌也存在差异。体外修饰合成纳米硒试验表明，FliC-HX2、FliC-K12、OmpF-HX2和OmpF-K12蛋白具有良好的稳定剂性能，可用于体外合成纳米硒。

将上述中的反应产物进行纯化清洗，用4％SDS 100℃水浴5min处理OmpF-K12、FliC-K12、 OmpF-HX2和FliC-HX2蛋白组装的纳米硒，变性剥离的相应蛋白经his-tag抗体免疫反应验证FliC和 OmpF蛋白是否修饰在纳米硒表面。结果如图12所示，免疫印迹分析表明OmpF-K12、FliC-K12、 OmpF-HX2和FliC-HX2条带大小正确，证明OmpF-K12、FliC-K12、OmpF-HX2和FliC-HX2确实修饰于纳米硒表面。

实施例6鞭毛蛋白FliC和孔蛋白OmpF对化学合成纳米硒的稳定作用

1、FliC和OmpF增强化学合成纳米硒在MgCl₂中的稳定性

以100mM MgCl₂为处理条件，以SDS、PEG K30、PVP K30、BSA、FliC-K12和OmpF-K12为对照，探究并验证FliC-HX2和OmpF-HX2在稳定化学合成纳米硒中的功能。将化学合成纳米硒分别与终浓度0.02、0.2、2、20、200mM SDS，0.02、0.2、2、20、200mg/mL PEG K30，0.002、0.02、 0.2、2、20mg/mL PVP K30，0.0002、0.002、0.02、0.2、2、20mg/mL BSA以及0.00002、0.0002、 0.002、0.02、0.2mg/mL的FliC-K12、OmpF-K12、FliC-HX2和OmpF-HX2混合，使混合后化学合成纳米硒浓度为2mM，将100μL与各浓度稳定剂混合后的化学合成纳米硒加入到96孔板中，分别加入100μL 200mM MgCl₂，每个处理三个重复，25℃处理1h；使用全波长扫描仪在308nm测定消光值，计算处理前后化学合成纳米硒照片和消光值比值。结果如图13和图14所示。

在100mM MgCl₂处理条件下各稳定剂对纳米硒结构的稳定效果。最高测试浓度的100mM SDS 和100mg/mL PEG K30的纳米硒消光值比达到4.1和2.5，两者均未起到稳定化学合成纳米硒的作用，包括SDS和PEG K30其他较低浓度均对纳米硒结构未有稳定效果。

10mg/mL的PVP K30和BSA稳定结果：在100mM MgCl₂处理条件下，10mg/mL的PVPK30和 BSA稳定的化学合成纳米硒消光值比为1.2和1.2。表明10mg/mL PVP K30和BSA能够增加化学合成纳米硒在100mM MgCl₂中的稳定性，但未完全稳定。

1mg/mL的PVP K30和BSA稳定结果：在100mM MgCl₂处理条件下，1mg/mL的PVP K30和BSA 稳定的化学合成纳米硒消光值比为1.2和1.2。表明1mg/mL PVP K30和BSA能够增加化学合成纳米硒在100mM MgCl₂中的稳定性，但未完全稳定。

0.1mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定结果：在100 mM MgCl₂处理条件下，0.1mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2 稳定的化学合成纳米硒消光值比分别为1.3、3.9、1.0、1.1、1.3和1.5。表明0.1mg/mL FliC-K12和 FliC-HX2可增加化学合成纳米硒在MgCl₂中的稳定性且可完全稳定化学合成纳米硒；0.1mg/mL PVP K30、OmpF-K12和OmpF-HX2能够增加化学合成纳米硒在100mM MgCl₂中的稳定性，但未完全稳定；而0.1mg/mL BSA未能增加化学合成纳米硒稳定性。

0.01mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定结果：在100 mM MgCl₂处理条件下，0.01mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2 稳定的化学合成纳米硒消光值比分别为2.8、2.8、3.1、1.1、2.2和2.4。表明0.01mg/mL FliC-HX2可增加化学合成纳米硒在100mM MgCl₂中的稳定性且可完全稳定化学合成纳米硒；0.01mg/mL PVP K30、BSA、FliC-K12、OmpF-K12和OmpF-HX2均未能增加化学合成纳米硒稳定性。

0.001mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定结果：在 100mM MgCl₂处理条件下，0.001mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定的化学合成纳米硒消光值比分别为2.3、2.3、2.3、1.3、2.6和2.5。表明0.001mg/mL FliC-HX2可增加化学合成纳米硒在100mM MgCl₂中的稳定性但未完全稳定化学合成纳米硒；0.001 mg/mL PVP K30、BSA、FliC-K12、OmpF-K12和OmpF-HX2均未能增加化学合成纳米硒稳定性。

0.0001mg/mL及以下浓度的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2 稳定结果：在100mM MgCl₂处理条件下，0.0001mg/mL及以下浓度的PVP K30、BSA、FliC-K12、OmpF-K12、FliC-HX2和OmpF-HX2稳定的化学合成纳米硒消光值比均达到2以上，未能稳定化学合成纳米硒。

MgCl₂处理条件下各稳定剂效能比较：在100mM MgCl₂处理条件下，化学合成纳米硒完全稳定所需稳定剂PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2的浓度分别为>10 mg/mL、>10mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL、>0.1mg/mL和>0.1mg/mL。结果表明在100mMMgCl₂处理条件下，FliC-HX2稳定化学合成纳米硒的效能超过PVP K30的100倍，超过BSA的100倍，是 FliC-K12的10倍，超过OmpF-K12和OmpF-HX2的10倍。

2、FliC和OmpF增强化学合成纳米硒在HCl中的稳定性

以1M HCl为处理条件，以SDS、PEG K30、PVP K30、BSA、FliC-K12和OmpF-K12为对照，探究并验证FliC-HX2和OmpF-HX2在稳定化学合成纳米硒中的功能。将化学合成纳米硒分别与终浓度0.02、0.2、2、20、200mM SDS，0.02、0.2、2、20、200mg/mL PEG K30，0.002、0.02、0.2、 2、20mg/mL PVP K30，0.0002、0.002、0.02、0.2、2、20mg/mL BSA以及0.00002、0.0002、0.002、 0.02、0.2mg/mL的FliC-K12、OmpF-K12、FliC-HX2和OmpF-HX2混合，使混合后化学合成纳米硒浓度为2mM，将100μL与各浓度稳定剂混合后的化学合成纳米硒加入到96孔板中，分别加入100 μL 1M HCl，每个处理三个重复，25℃处理1h；使用全波长扫描仪在308nm测定消光值，计算处理前后化学合成纳米硒照片和消光值比值如图13和图14所示。

在1M HCl处理条件下，最高测试浓度的100mM SDS和100mg/mL PEG K30的纳米硒消光值比达到4.6和2.5，两者均未起到稳定化学合成纳米硒的作用，包括SDS和PEG K30其他较低浓度均对纳米硒结构未有稳定效果。

10mg/mL的PVP K30和BSA稳定结果：在100mM MgCl₂处理条件下，10mg/mL的PVPK30和 BSA稳定的化学合成纳米硒消光值比为1.1和0.9。表明10mg/mL PVP K30和BSA能够增加化学合成纳米硒在1M HCl中的稳定性，且可完全稳定化学合成纳米硒。

1mg/mL的PVP K30和BSA稳定结果：在100mM MgCl₂处理条件下，1mg/mL的PVP K30和BSA 稳定的化学合成纳米硒消光值比为1.1和1.3。表明1mg/mL PVP K30能够增加化学合成纳米硒在1M HCl中的稳定性，且可完全稳定化学合成纳米硒。1mg/mL BSA能够增加化学合成纳米硒在1M HCl 中的稳定性，但未完全稳定。

0.1mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定结果：在1M HCl处理条件下，0.1mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定的化学合成纳米硒消光值比分别为2.4、3.1、1.7、1.0、1.3和1.6。表明0.1mg/mL FliC-HX2可增加化学合成纳米硒在1M HCl中的稳定性且可完全稳定化学合成纳米硒；0.1mg/mLFliC-K12、 OmpF-K12和OmpF-HX2能够增加化学合成纳米硒在1M HCl中的稳定性，但未完全稳定；而0.1 mg/mL PVP K30和BSA未能增加化学合成纳米硒稳定性。

0.01mg/mL及以下浓度的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定结果：在1M HCl处理条件下，0.01mg/mL及以下浓度的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、 OmpF-K12和OmpF-HX2稳定的化学合成纳米硒消光值比均达到2以上，均未能稳定化学合成纳米硒。

1M HCl处理条件下各稳定剂效能比较：在1M HCl处理条件下，化学合成纳米硒完全稳定所需稳定剂PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2的浓度分别为1mg/mL、 10mg/mL、>0.1mg/mL、0.1mg/mL、>0.1mg/mL和>0.1mg/mL。结果表明在1M HCl处理条件下， FliC-HX2稳定化学合成纳米硒的效能超过PVP K30的10倍，超过BSA的100倍，优于FliC-K12、 OmpF-K12和OmpF-HX2。

3、FliC和OmpF增强化学合成纳米硒在NaOH中的稳定性

以1M NaOH为处理条件，以SDS、PEG K30、PVP K30、BSA、FliC-K12和OmpF-K12为对照，探究并验证FliC-HX2和OmpF-HX2在稳定化学合成纳米硒中的功能。将化学合成纳米硒分别与终浓度0.02、0.2、2、20、200mM SDS，0.02、0.2、2、20、200mg/mL PEG K30，0.002、0.02、0.2、 2、20mg/mL PVP K30，0.0002、0.002、0.02、0.2、2、20mg/mL BSA以及0.00002、0.0002、0.002、 0.02、0.2mg/mL的FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2混合，使混合后化学合成纳米硒浓度为2mM，将100μL与各浓度稳定剂混合后的化学合成纳米硒加入到96孔板中，分别加入100 μL 200mM 1M NaOH，每个处理三个重复，25℃处理1h；使用全波长扫描仪在308nm测定消光值，计算处理前后化学合成纳米硒照片和消光值比值如图13和图14所示。

在1M NaOH处理条件下，最高测试浓度的100mM SDS和100mg/mL PEG K30的纳米硒消光值比达到2.0和2.8，两者均未起到稳定化学合成纳米硒的作用，包括SDS和PEG K30其他较低浓度均对纳米硒结构未有稳定效果。

10mg/mL的PVP K30和BSA稳定结果：在1M NaOH处理条件下，10mg/mL的PVP K30和BSA 稳定的化学合成纳米硒消光值比为1.1和1.0。表明10mg/mL PVP K30和BSA能够增加化学合成纳米硒在1M NaOH中的稳定性，且完全稳定。

1mg/mL的PVP K30和BSA稳定结果：在1M NaOH处理条件下，1mg/mL的PVP K30和BSA稳定的化学合成纳米硒消光值比为1.2和1.1。表明1mg/mL PVP K30和BSA能够增加化学合成纳米硒在1M NaOH中的稳定性，但未完全稳定。1mg/mL BSA能够增加化学合成纳米硒在1MNaOH中的稳定性，且完全稳定。

0.1mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、OmpF-K12、FliC-HX2和OmpF-HX2稳定结果：在1M NaOH处理条件下，0.1mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定的化学合成纳米硒消光值比分别为1.2、1.1、1.0、1.1、1.0和1.0。表明0.1mg/mL BSA、FliC-K12、 FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2可增加化学合成纳米硒在1M NaOH中的稳定性且可完全稳定化学合成纳米硒；0.1mg/mL PVP K30能够增加化学合成纳米硒在1M NaOH中的稳定性，但未完全稳定。

0.01mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、OmpF-K12、FliC-HX2和OmpF-HX2稳定结果：在1M NaOH处理条件下，0.01mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2 稳定的化学合成纳米硒消光值比分别为4.0、1.5、1.1、1.1、1.0和1.0。表明0.01mg/mLFliC-K12、 FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2可增加化学合成纳米硒在1M NaOH中的稳定性且可完全稳定化学合成纳米硒；0.1mg/mL BSA能够增加化学合成纳米硒在1M NaOH中的稳定性，但未完全稳定； 0.1mg/mL PVP K30未能增加化学合成纳米硒稳定性。

0.001mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定结果：在1 M NaOH处理条件下，0.001mg/mL的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2 稳定的化学合成纳米硒消光值比分别为3.5、3.7、3.5、1.3、5.0和4.2。表明0.001mg/mL FliC-HX2 可增加化学合成纳米硒在1M NaOH中的稳定性但未完全稳定化学合成纳米硒；0.001mg/mL PVP K30、BSA、FliC-K12、OmpF-K12和OmpF-HX2均未能增加化学合成纳米硒稳定性。

0.0001mg/mL及以下浓度的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2 稳定结果：在1M NaOH处理条件下，0.0001mg/mL及以下浓度的PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定的化学合成纳米硒消光值比均达到2以上，未能稳定化学合成纳米硒。

1M NaOH处理条件下各稳定剂效能比较：在1M NaOH处理条件下，化学合成纳米硒完全稳定所需稳定剂PVP K30、BSA、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2的浓度分别为10mg/mL、 0.1mg/mL、0.01mg/mL、0.01mg/mL、0.01mg/mL和0.01mg/mL。结果表明在1MNaOH处理条件下，FliC-HX2稳定化学合成纳米硒的效能是PVP K30的100倍，是BSA的10倍，与FliC-K12、 OmpF-K12和OmpF-HX2的效能相同。

稳定实验结果表明，OmpF和FliC蛋白具有稳定化学合成纳米硒的功能。OmpF-K12与 OmpF-HX2蛋白在稳定化学合成纳米硒中的效率相似，表明OmpF蛋白在细菌属间可能具有纳米硒稳定功能普适性。而FliC-K12蛋白在稳定化学合成纳米硒中的效果显著低于FliC-HX2，表明FliC蛋白在细菌属间具有纳米硒稳定功能差异性。

4、免疫印迹法验证FliC和OmpF体外结合化学合成纳米硒

利用FliC-K12、OmpF-K12、FliC-HX2和OmpF-HX2包被化学合成纳米硒后的溶液于4℃12000 rpm离心10min，去上清，纳米硒沉淀用ddH₂O清洗三遍；将上述离心清洗的沉淀于4％SDS中100℃水浴处理5min，12000rpm离心10min，取上清，使用NanoDrop进行蛋白定量，后进行SDS-PAGE 电泳；将蛋白采用电转膜的方法转到NC膜；转膜完成后，取出杂交膜，清洗，封闭；加入Anti-his 一抗，室温孵育；TBS洗后加入碱性磷酸酶标记的二抗HRP-羊抗鼠抗体，室温，TBS洗后显色法检测蛋白，记录印记照片。

如图15所示，免疫印迹分析表明OmpF-K12、FliC-K12、OmpF-HX2和FliC-HX2条带大小正确，利用蛋白变性剂可从化学合成纳米硒表面剥离OmpF-K12、FliC-K12、OmpF-HX2和FliC-HX2蛋白， his-tag抗体可与剥离的融合蛋白发生免疫反应，证明OmpF-K12、FliC-K12、OmpF-HX2和FliC-HX2 可与化学合成纳米硒发生结合。

实施例7鞭毛蛋白FliC和孔蛋白OmpF对纳米金和纳米银的稳定作用

1、MgCl₂对纳米金和纳米银的影响

利用终浓度为0、0.1mM、1mM、10mM MgCl₂溶液分别与终浓度2nM的纳米金和40mg/mL 纳米银溶液混合，每个处理三个重复，25℃处理1h；然后利用全波长扫描仪在300nm-1000nm波长范围记录消光谱。

如图16所示，1-10mM MgCl₂处理条件下，纳米金颗粒消光谱开始发生红移，纳米银颗粒消光谱发生宽化，表明纳米金和纳米银颗粒仅能耐受0.1mM MgCl₂处理，10mM MgCl₂处理条件下纳米金和纳米银颗粒即可发生严重聚集。

根据文献报道方法，分别利用650nm与520nm处和500nm与400nm处消光值的比值，定量纳米金和纳米银的聚集程度。定义0.15<纳米金消光值比<0.25时，稳定性未受显著影响，0.25≤纳米金消光值比<0.50时发生较明显聚集，纳米金消光值比≥0.50时发生严重聚集；0.05<纳米银消光值比 <0.10时稳定性未受影响，0.10≤纳米银消光值比<0.40时发生较明显聚集，纳米银消光值比≥0.40时发生严重聚集。

2、FliC和OmpF增强纳米金和纳米银对离子强度的稳定性

将纳米金和纳米银分别与FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2混合。使混合后纳米金浓度为2nM，FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2浓度梯度均为0.002、0.02、0.2、2、 20μg/mL；纳米银浓度为40mg/mL，FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2浓度为0.02、 0.2、2、20、200μg/mL；将100μL与各浓度稳定剂混合后的纳米金和纳米银加入到96孔板中，分别加入100μL 20mM MgCl₂，每个处理三个重复，25℃处理1h；然后使用全波长扫描仪分别读取纳米金650nm与520nm处和纳米银500nm与400nm处消光值数据，分别计算消光值比。在10mM MgCl₂处理条件下，FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2蛋白在稳定纳米金和纳米银中的作用具有显著差异，试验结果如图17所示。

100μg/mL FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定功能测试结果：在10mMMgCl₂处理条件下，100μg/mL FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定的纳米银消光值比为 1.01、0.10、0.24和0.22，表明FliC-HX2能够完全稳定纳米银；OmpF-K12和OmpF-HX2能够增加纳米银的稳定性，但未完全稳定纳米银；而100μg/mL FliC-K12未起到稳定纳米银的作用，包括较低浓度条件下的结果。

10μg/mL FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定功能测试结果：在10mMMgCl₂处理条件下，10μg/mL FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定的纳米金消光值比为0.19、 0.20、0.19和0.25，表明10μg/mL FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2能够完全稳定纳米金；10μg/mL FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定的纳米银的消光值比为0.06、0.41和0.51，表明10μg/mL FliC-HX2能够完全稳定纳米银，10μg/mL OmpF-K12和OmpF-HX2能够增加纳米银的稳定性，但未完全稳定纳米银。

1μg/mL FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定功能测试结果：在10mMMgCl₂处理条件下，1μg/mL FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定的纳米金消光值比为0.23、 0.23、0.77和0.53，表明1μg/mL FliC-K12和FliC-HX2能够完全稳定纳米金，1μg/mL OmpF-K12和 OmpF-HX2未起到稳定纳米金的作用；1μg/mL FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定的纳米银的消光值比为0.05、0.99和0.95，表明1μg/mL FliC-HX2能够完全稳定纳米银，OmpF-K12和OmpF-HX2 未起到稳定纳米银的作用。

0.1μg/mL及以下浓度FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定功能测试结果：在10 mM MgCl₂处理条件下，0.1μg/mL及以下浓度FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定的纳米金和纳米银消光值比均达到0.50，表明0.1μg/mL及以下浓度的FliC-K12、OmpF-K12、 FliC-HX2和OmpF-HX2均未起到稳定纳米金和纳米银的作用。

OmpF-K12与OmpF-HX2蛋白，FliC-K12与FliC-HX2蛋白在稳定纳米金颗粒中的效率相似，表明OmpF和FliC蛋白在细菌属间可能具有稳定纳米金功能普适性，但FilC蛋白稳定纳米金的效率显著高于OmpF蛋白。OmpF-K12与OmpF-HX2蛋白在稳定纳米银颗粒中的效率相似，表明OmpF蛋白在细菌属间可能具有稳定纳米银功能普适性。但FliC-K12蛋白未能稳定纳米银，而FliC-HX2具有稳定纳米银的功能，表明FliC蛋白在细菌属间具有稳定纳米银功能差异性。此外，FliC-HX2蛋白稳定纳米银的效率显著高于OmpF-K12和OmpF-HX2蛋白。体外实验结果表明，OmpF-HX2和FliC-HX2 蛋白均具有稳定纳米金和纳米银颗粒的功能，FliC-HX2蛋白具有显著优异的纳米金和纳米银颗粒稳定功能。

3、FliC-K12纳米银的影响

将纳米银分别与FliC-K12，使混合后纳米银浓度为20mg/mL，FliC-K12浓度为0.01-100μg/mL；每个处理三个重复，25℃处理1h；将200μL与各浓度稳定剂混合后的纳米金和纳米银加入到96孔板中，使用全波长扫描仪读取处理后纳米银500nm和400nm消光值数据，计算消光值比。

如图18所示，10-100μg/mL FliC-K12与纳米银混合后，纳米银即发生聚集。此结果表明纳米银具有导致纳米银聚集的性质，且进一步证明FliC-K12和FliC-HX2在稳定纳米银功能中存在细菌属间差异，表明FliC-HX2在稳定纳米材料中具有特异性。

4、FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定效能比较

MgCl₂处理条件下FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定纳米金效能比较：在10mM MgCl₂处理条件下，纳米金完全稳定所需稳定剂FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2的浓度分别为1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL和10μg/mL。结果表明在10mM MgCl₂处理条件下，FliC-HX2 稳定纳米金的效能是OmpF-K12和OmpF-HX2的10倍，与FliC-K12的效能相同。

MgCl₂处理条件下FliC-K12、FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2稳定纳米银效能比较：在10mM MgCl₂处理条件下，纳米银完全稳定所需稳定剂FliC-HX2、OmpF-K12和OmpF-HX2的浓度分别为1 μg/mL、>100μg/mL和>100μg/mL。结果表明在10mM MgCl₂处理条件下，FliC-HX2稳定纳米金的效能超过OmpF-K12和OmpF-HX2的100倍。由于FliC-K12本身会导致纳米银聚集，不具有稳定纳米银的功能，故在此不做比较。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 提高纳米材料稳定性的方法

<130> KHP211110723.8

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 375

<212> PRT

<213> 水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)

<400> 1

Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Asn Gly Leu Thr Gln Ala Ser Arg Asn

1 5 10 15

Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ser Leu Ser

20 25 30

Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Ile Arg Glu Leu Ser Val Gln Ala

35 40 45

Ala Asn Gly Thr Asn Ser Asp Ser Asp Leu Thr Ser Ile Gln Asp Glu

50 55 60

Ile Thr Ser Arg Leu Ser Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln

65 70 75 80

Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Ser Asn Gln Thr Met Lys Ile Gln

85 90 95

Val Gly Ala Asn Asp Gly Gln Thr Ile Asp Ile Asp Leu Gln Lys Ile

100 105 110

Asp Ser Thr Thr Leu Gly Leu Asn Gly Phe Ser Val Ala Ser Asn Ala

115 120 125

Leu Lys Thr Ser Asp Ala Ile Thr Gln Val Gly Ala Ser Gly Ser Leu

130 135 140

Lys Asn Val Asp Leu Ser Ala Ala Ala Thr Ser Leu Gly Leu Asp Ala

145 150 155 160

Ser Lys Leu Ser Leu Lys Asn Val Gln Thr Ala Ala Gly Ala Ala Thr

165 170 175

Ala Thr Tyr Val Val Ser Asp Gly Thr Ser Asn Tyr Ala Ala Ser Val

180 185 190

Asp Asp Ala Thr Gly Ala Val Thr Leu Asn Thr Thr Asp Val Ser Tyr

195 200 205

Thr Asp Thr Asp Asn Gly Val Thr Ala Gly Thr Gln Thr Gly Lys Leu

210 215 220

Val Lys Val Gly Ala Asp Ala Thr Gly Ala Ala Val Gly Tyr Val Thr

225 230 235 240

Val Gln Gly Lys Asp Tyr Lys Thr Ala Ala Gly Ala Ile Val Asp Gly

245 250 255

Gly Ala Thr Gly Thr Ala Asn Val Ala Ser Thr Ile Gly Asp Ile Ala

260 265 270

Ser Ala Ala Asn Thr Asn Ala Tyr Thr Gly Val Ala Thr Ser Asp Pro

275 280 285

Leu Lys Ala Ile Asp Ala Ala Ile Ala Lys Val Asp Thr Phe Arg Ser

290 295 300

Ser Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asp Ser Ala Ile Thr Asn Leu

305 310 315 320

Asp Asn Thr Thr Thr Asn Leu Ser Ser Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp

325 330 335

Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Ala Met Ser Lys Ala Gln Ile Leu

340 345 350

Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ser Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln

355 360 365

Ser Val Leu Ser Leu Leu Gln

370 375

<210> 2

<211> 347

<212> PRT

<213> 水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)

<400> 2

Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Leu Asp Leu Tyr Gly Lys Val

1 5 10 15

Asp Ala Arg His Thr Phe Ser Asp Asn Ala Gly Asp Asp Gly Asp Gln

20 25 30

Thr Tyr Val Arg Phe Gly Phe Lys Gly Glu Thr Gln Ile Thr Asp Gln

35 40 45

Leu Thr Gly Tyr Gly Gln Trp Glu Tyr Asn Val Gln Ala Asn His Ala

50 55 60

Glu Ser Ala Gly Asp Glu Gly Asn Lys Thr Arg Leu Gly Phe Ala Gly

65 70 75 80

Leu Lys Phe Gly Asp Ala Gly Ser Phe Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly

85 90 95

Val Ile Tyr Asp Val Met Ser Tyr Thr Asp Gln Leu Pro Ile Tyr Gly

100 105 110

Asp Asp Thr Met Tyr Gln Asn Asn Asp Asn Phe Met Val Gly Arg Ala

115 120 125

Asn Gly Val Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Asn Phe Phe Gly Leu Val Asp

130 135 140

Gly Leu Ser Phe Ala Val Gln Tyr Gln Gly Lys Asn Asp Glu Gly Arg

145 150 155 160

Asp Gly Arg Gly Ala Val Asp Ser Asn Gly Asp Gly Trp Gly Thr Ser

165 170 175

Ala Ala Tyr Ala Ile Gly Asn Ser Gly Val Ser Ile Thr Gly Ala Tyr

180 185 190

Phe Ser Ser Asn Arg Thr Val Thr Gln Lys Gln Asp Gly Thr Gly Asp

195 200 205

Lys Ala Asp Ala Tyr Ala Phe Gly Ala Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Leu

210 215 220

Tyr Leu Ala Thr Phe Tyr Gly Glu Ser Arg Asn Thr Thr Asp Tyr Gly

225 230 235 240

Asn Pro Asp Ala Ile Ala Asn Lys Thr Gln Asn Phe Glu Val Val Ala

245 250 255

Gln Tyr Gln Phe Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Ile Ala Tyr Leu Gln

260 265 270

Ser Lys Gly Lys Ser Leu Asn Gly Phe Thr Asn Asn Gly Ser Thr Tyr

275 280 285

Ala Gly Gly Asp Ala Asp Leu Val Lys Tyr Val Glu Val Gly Thr Tyr

290 295 300

Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp Tyr Lys Ile Asn

305 310 315 320

Leu Leu Asp Asp Asn Ser Tyr Thr Lys Ala Ala Gly Arg Ser Thr Asp

325 330 335

Asp Ile Val Gly Val Gly Leu Gln Tyr Gln Phe

340 345

<210> 3

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgaaa gaaaccgctg ctgctaaatt 60

cgaacgccag cacatggaca gcccagatct gggtaccctg gtgccacgcg gttccatggc 120

tgatatcgga tccgaattcg agctccgtcg acaagcttgc ggccgcaacc gcttcacttc 180

taacatcaac ggtctgactc aggcttcacg taacgccaac gacggtatct ctgttgcgca 240

gaccactgaa ggttcactga gcgaaatcaa caacaactta caacgtattc gtgagctgtc 300

tgttcaggct gctaacggca ccaactccga ttccgacctg acctcaatcc aggacgaaat 360

cacttcccgt ctgtctgaaa tcgaccgtgt atctggtcag actcagttca acggcgtgaa 420

cgtactggcc tctaaccaga cgatgaaaac ccaggttggc gctaacgatg gtcagactat 480

cgacatcgac ctgcagaaaa tcgactctac cactctgggt ctgaacggtt tctcagtagc 540

aagcaacgca ctgaaaacca gcgatgcaat cactcaggtt ggcgcaagcg gctccctgaa 600

aaacgttgac ctgtctgcag cggcaacttc tctgggcctg gacgcaagca aactgtctct 660

gaaaaacgtt cagacagcag ctggcgcagc gactgcaact tacgttgttt ctgatggtac 720

cagcaactac gctgcatctg tagatgacgc aactggcgct gtaacactga acaccactga 780

cgtttcttac actgacactg acaacggtgt tactgcaggt actcagactg gcaaactggt 840

taaagttggc gcagacgcca ctggcgcagc ggtaggttac gttaccgttc agggtaaaga 900

ctacaaaact gcagctggcg ctatcgttga cggcggcgct accggtactg cgaacgttgc 960

aagcaccatc ggcgacatcg ccagtgctgc taacaccaac gcttacactg gcgttgcgac 1020

ttctgatcca ctgaaagcaa tcgacgctgc catcgctaaa gttgacacct tccgttcttc 1080

actgggtgcg gttcagaacc gtttcgattc tgccatcacc aacctggaca acaccacgac 1140

taacctgtct tctgcacaga gccgtattca ggatgctgac tacgcaacag aagtttcagc 1200

aatgtctaaa gcacagatcc tgcagcaggc tggtacttca gtattgtcta aagctaacca 1260

ggttcctcag tctgtactgt ccctgctgca actcgagcac caccaccacc accactgaga 1320

tccggctgct aa 1332

<210> 4

<211> 1043

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaactggtat tgcagaccaa cacccacgat gtcgtcagtg ctgcgacccg ctgctttggt 60

gtagctgttg tcgtccagca ggttgatttt gtagtcaaca taggtagaca tgtttttgtt 120

gaagtagtag taagtaccaa cttctacata tttaaccagg tcagcatcgc cgccagcgta 180

ggtagaaccg ttgttggtga aaccgttcag gctcttacct ttagactgca ggtatgcgat 240

agatgggcgc agaccgaaat cgaactggta ctgagcaaca acttcgaagt tctgagtttt 300

gttagcaatt gcatccgggt taccgtaatc ggtggtgtta cgtgattcac cgtagaaggt 360

tgccaggtac aggttgttag cgtcgtattt agcgccgaat gcgtatgcgt cagctttgtc 420

gccagtgccg tcttgtttct gagtaacagt acggttagaa gagaagtaag caccagtaat 480

gctaacacct gagttgccga tagcgtaagc ggcagaagta ccccagccgt cgccattgga 540

atcaactgcg ccacgaccat cacgaccttc gtcgtttttg ccctggtact gtacagcgaa 600

gctcaggcca tcaaccagac cgaagaagtt gctgttacgg taagttgcca caccgttagc 660

acgaccaacc atgaagttgt cgttgttctg gtacatggtg tcatcgccat agattggcaa 720

ttggtcggtg taggacatta cgtcgtagat tacgccgtag ttacgaccgt agtcgaaaga 780

acctgcatca ccaaatttca gacctgcgaa gcccagacga gttttgttgc cttcatcgcc 840

agcactttct gcatggttag cctgaacgtt gtattcccac tggccgtaac cggtcagttg 900

gtcagtaatt tgagtttcgc ctttgaagcc gaaacggaca taggtctggt cgccatcgtc 960

gccagcattg tcagagaagg tgtgacgtgc gtcaacttta ccgtacagat ccagtttgtt 1020

gccatctttg ttatagatct cag 1043

<210> 5

<211> 1564

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcctctaga ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgaa agaaaccgct 60

gctgctaaat tcgaacgcca gcacatggac agcccagatc tgggtaccct ggtgccacgc 120

ggttccatgg ctgatatcgg atccgaattc gagctccgtc gacaagcttg ggccgcaacc 180

gtttcacctc taacattaaa ggcctgactc aggcggcccg taacgccaac gacggtatct 240

ccgttgcgca gaccaccgaa ggcgcgctgt ccgaaatcaa caacaactta cagcgtgtgc 300

gtgaactgac ggtacaggcc accaccggta ctaactctga gtctgatctg tcttctatcc 360

aggacgaaat taaatcccgt ctggatgaaa ttgaccgcgt atctggtcag acccagttca 420

acggcgtgaa cgtgctggca aaaaatggct ccatgaaaat ccaggttggc gcaaatgata 480

accagactat cactatcgat ctgaagcaga ttgatgctaa aactcttggc cttgatggtt 540

ttagcgttaa aaataacgat acagttacca ctagtgctcc agtaactgct tttggtgcta 600

ccaccacaaa caatattaaa cttactggaa ttaccctttc tacggaagca gccactgata 660

ctggcggaac taacccagct tcaattgagg gtgtttatac tgataatggt aatgattact 720

atgcgaaaat caccggtggt gataacgatg ggaagtatta cgcagtaaca gttgctaatg 780

atggtacagt gacaatggcg actggagcaa cggcaaatgc aactgtaact gatgcaaata 840

ctactaaagc tacaactatc acttcaggcg gtacacctgt tcagattgat aatactgcag 900

gttccgcaac tgccaacctt ggtgctgtta gcttagtaaa actgcaggat tccaagggta 960

atgataccga tacatatgcg cttaaagata caaatggcaa tctttacgct gcggatgtga 1020

atgaaactac tggtgctgtt tctgttaaaa ctattaccta tactgactct tccggtgccg 1080

ccagttctcc aaccgcggtc aaactgggcg gagatggtgg caaaacagaa gtggtcgata 1140

ttgatggtaa aacatacgat tctgccgatt taaatggcgg taatctgcaa acaggtttga 1200

ctgctggtgg tgaggctctg actgctgttg caaatggtaa aaccacggat ccgctgaaag 1260

cgctggacga tgctatcgca tctgtagaca aattccgttc ttccctcggt gcggtgcaaa 1320

accgtctgga ttccgcggtt accaacctga acaacaccac taccaacctg tctgaagcgc 1380

agtcccgtat tcaggacgcc gactatgcga ccgaagtgtc caatatgtcg aaagcgcaga 1440

tcatccagca ggccggtaac tccgtgttgg caaaagctaa ccaggtaccg cagcaggttc 1500

tgtctctgct gcagggtctc gagcaccacc accaccacca ctgagatccg gctgctaaca 1560

aagc 1564

<210> 6

<211> 1019

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagaaatcta taacaaagat ggcaacaaag tagatctgta cggtaaagct gttggtctgc 60

attatttttc caagggtaac ggtgaaaaca gttacggtgg caatggcgac atgacctatg 120

cccgtcttgg ttttaaaggg gaaactcaaa tcaattccga tctgaccggt tatggtcagt 180

gggaatataa cttccagggt aacaactctg aaggcgctga cgctcaaact ggtaacaaaa 240

cgcgtctggc attcgcgggt cttaaatacg ctgacgttgg ttctttcgat tacggccgta 300

actacggtgt ggtttatgat gcactgggtt acaccgatat gctgccagaa tttggtggtg 360

atactgcata cagcgatgac ttcttcgttg gtcgtgttgg cggcgttgct acctatcgta 420

actccaactt ctttggtctg gttgatggcc tgaacttcgc tgttcagtac ctgggtaaaa 480

acgagcgtga cactgcacgc cgttctaacg gcgacggtgt tggcggttct atcagctacg 540

aatacgaagg ctttggtatc gttggtgctt atggtgcagc tgaccgcacc aacctgcaag 600

aagctcaacc tcttggcaac ggtaaaaaag ctgaacagtg ggctactggt ctgaagtacg 660

acgcgaacaa catctacctg gcagcgaact acggtgaaac ccgtaacgct acgccgatca 720

ctaataaatt tacaaacacc agcggcttcg ccaacaaaac gcaagacgtt ctgttagttg 780

cgcaatacca gttcgatttc ggtctgcgtc cgtccatcgc ttacaccaaa tctaaagcga 840

aagacgtaga aggtatcggt gatgttgatc tggtgaacta ctttgaagtg ggcgcaacct 900

actacttcaa caaaaacatg tccacctatg ttgactacat catcaaccag atcgattctg 960

acaacaaact gggcgtaggt tcagacgaca ccgttgctgt gggtatcgtt taccagttc 1019

<210> 7

<211> 447

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 7

Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ala Arg Asn

1 5 10 15

Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Ser

20 25 30

Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr Val Gln Ala

35 40 45

Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile Gln Asp Glu

50 55 60

Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln

65 70 75 80

Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys Ile Gln

85 90 95

Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu Lys Gln Ile

100 105 110

Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Ser Val Lys Asn Asn Asp

115 120 125

Thr Val Thr Thr Ser Ala Pro Val Thr Ala Phe Gly Ala Thr Thr Thr

130 135 140

Asn Asn Ile Lys Leu Thr Gly Ile Thr Leu Ser Thr Glu Ala Ala Thr

145 150 155 160

Asp Thr Gly Gly Thr Asn Pro Ala Ser Ile Glu Gly Val Tyr Thr Asp

165 170 175

Asn Gly Asn Asp Tyr Tyr Ala Lys Ile Thr Gly Gly Asp Asn Asp Gly

180 185 190

Lys Tyr Tyr Ala Val Thr Val Ala Asn Asp Gly Thr Val Thr Met Ala

195 200 205

Thr Gly Ala Thr Ala Asn Ala Thr Val Thr Asp Ala Asn Thr Thr Lys

210 215 220

Ala Thr Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Pro Val Gln Ile Asp Asn Thr

225 230 235 240

Ala Gly Ser Ala Thr Ala Asn Leu Gly Ala Val Ser Leu Val Lys Leu

245 250 255

Gln Asp Ser Lys Gly Asn Asp Thr Asp Thr Tyr Ala Leu Lys Asp Thr

260 265 270

Asn Gly Asn Leu Tyr Ala Ala Asp Val Asn Glu Thr Thr Gly Ala Val

275 280 285

Ser Val Lys Thr Ile Thr Tyr Thr Asp Ser Ser Gly Ala Ala Ser Ser

290 295 300

Pro Thr Ala Val Lys Leu Gly Gly Asp Asp Gly Lys Thr Glu Val Val

305 310 315 320

Asp Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ser Ala Asp Leu Asn Gly Gly Asn

325 330 335

Leu Gln Thr Gly Leu Thr Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr Ala Val Ala

340 345 350

Asn Gly Lys Thr Thr Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asp Ala Ile Ala

355 360 365

Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Leu

370 375 380

Asp Ser Ala Val Thr Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr Asn Leu Ser Glu

385 390 395 400

Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn

405 410 415

Met Ser Lys Ala Gln Ile Ile Gln Gln Ala Gly Asn Ser Val Leu Ala

420 425 430

Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln Gln Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly

435 440 445

<210> 8

<211> 340

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 8

Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Val Asp Leu Tyr Gly Lys

1 5 10 15

Ala Val Gly Leu His Tyr Phe Ser Lys Gly Asn Gly Glu Asn Ser Tyr

20 25 30

Gly Gly Asn Gly Asp Met Thr Tyr Ala Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu

35 40 45

Thr Gln Ile Asn Ser Asp Leu Thr Gly Tyr Gly Gln Trp Glu Tyr Asn

50 55 60

Phe Gln Gly Asn Asn Ser Glu Gly Ala Asp Ala Gln Thr Gly Asn Lys

65 70 75 80

Thr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr Ala Asp Val Gly Ser Phe

85 90 95

Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Ala Leu Gly Tyr Thr

100 105 110

Asp Met Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Asp Asp Phe

115 120 125

Phe Val Gly Arg Val Gly Gly Val Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Asn Phe

130 135 140

Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gln Tyr Leu Gly Lys

145 150 155 160

Asn Glu Arg Asp Thr Ala Arg Arg Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly

165 170 175

Ser Ile Ser Tyr Glu Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Val Gly Ala Tyr Gly

180 185 190

Ala Ala Asp Arg Thr Asn Leu Gln Glu Ala Gln Pro Leu Gly Asn Gly

195 200 205

Lys Lys Ala Glu Gln Trp Ala Thr Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn

210 215 220

Ile Tyr Leu Ala Ala Asn Tyr Gly Glu Thr Arg Asn Ala Thr Pro Ile

225 230 235 240

Thr Asn Lys Phe Thr Asn Thr Ser Gly Phe Ala Asn Lys Thr Gln Asp

245 250 255

Val Leu Leu Val Ala Gln Tyr Gln Phe Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser

260 265 270

Ile Ala Tyr Thr Lys Ser Lys Ala Lys Asp Val Glu Gly Ile Gly Asp

275 280 285

Val Asp Leu Val Asn Tyr Phe Glu Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn

290 295 300

Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp Tyr Ile Ile Asn Gln Ile Asp Ser

305 310 315 320

Asp Asn Lys Leu Gly Val Gly Ser Asp Asp Thr Val Ala Val Gly Ile

325 330 335

Val Tyr Gln Phe

340

Claims

1.孔蛋白OmpF的以下任一应用：

1)用于提高纳米材料的稳定性；

2)用于制备纳米材料的稳定剂；

3)用于制备纳米硒；

其中，所述纳米材料选自纳米硒、纳米金、纳米银；

所述孔蛋白OmpF来自水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，

水生拉恩氏菌孔蛋白OmpF包含如下氨基酸序列或由其组成：

i)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白；

大肠杆菌孔蛋白OmpF包含如下氨基酸序列或由其组成：

i)如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

3.提高纳米材料稳定性的方法，其特征在于，在纳米材料制备过程中添加孔蛋白OmpF，或者向纳米材料溶液中添加孔蛋白OmpF；

其中，所述纳米材料选自纳米硒、纳米金、纳米银；

所述孔蛋白OmpF同权利要求1或2中所述的孔蛋白OmpF。

4.孔蛋白OmpF在提高纳米硒在强酸、强碱、高浓度盐离子、高浓度氧化剂、不同温度条件下稳定性中的应用；

其中，所述孔蛋白OmpF同权利要求1或2中所述的孔蛋白OmpF。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纳米硒包括生物纳米硒和化学纳米硒；

所述强碱条件为1mM生物纳米硒溶液中NaOH浓度为1-1000mM；

所述高浓度盐离子条件为1mM生物纳米硒溶液中NaCl浓度为1-2000mM、MgCl₂浓度为0.1-10mM、CaCl₂浓度为0.1-1mM或AlCl₃浓度为0.001-10mM；

所述温度条件为-20℃～80℃；

所述强碱条件为1mM化学纳米硒溶液中NaOH浓度为0.001-1M；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生物纳米硒的制备方法参见CN104774875B；和/或

所述化学纳米硒的制备方法参见CN104310319B。

7.孔蛋白OmpF在提高纳米金或纳米银在高浓度盐离子条件下稳定性中的应用；其中，所述孔蛋白OmpF同权利要求1或2中所述的孔蛋白OmpF。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，

对于纳米金，所述高浓度盐离子条件为2nM纳米金溶液中MgCl₂浓度为0.1-10mM；和/或

9.纳米硒的制备方法，其特征在于，包括：

其中，所述稳定剂为孔蛋白OmpF，同权利要求1或2中所述的孔蛋白OmpF；所述还原剂为硫代硫酸钠溶液；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，配制如下反应体系：40mM硫代硫酸钠、5mM亚硒酸钠、10mM盐酸和0.1mg/mL孔蛋白OmpF，反应总体积为10mL；于25℃反应8小时；反应结束后，将反应产物于4℃，10000g离心10min，用去离子水清洗3次，重新悬浮于去离子水中，冷冻干燥，即得成品固态纳米硒。