CN111051508A - D型氨基酸脱氢酶 - Google Patents

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CN111051508A CN201880050244.7A CN201880050244A CN111051508A CN 111051508 A CN111051508 A CN 111051508A CN 201880050244 A CN201880050244 A CN 201880050244A CN 111051508 A CN111051508 A CN 111051508A
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渡边真宏
松鹿昭则
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Abstract

一种酶，其具有下述(a)和(b)的特征：(a)具有可逆地对D‑氨基酸进行脱氢的活性；(b)是具有与序列号2的氨基酸序列的同一性为80％以上的氨基酸序列的多肽的六聚体。

Description

D型氨基酸脱氢酶
技术领域
本发明公开一种与D型氨基酸脱氢酶关连的技术。
背景技术
作为生物体的重要成分之一的蛋白质主要由20种α-氨基酸构成。其中，除了甘氨酸之外的19种具有不对称碳，因此存在D型氨基酸和L型氨基酸这两种旋光异构体。已知构成蛋白质的氨基酸大部分为L型氨基酸，但通过近年来的分析技术的发展而明确了：在包含人的哺乳类、水生动物、植物等高等生物的细胞内，也微量存在D型氨基酸。
D型氨基酸作为排卵诱发剂、血液凝固阻止剂、镇痛剂等医药品的生产原料，而且作为杀虫剂、抗生素、化妆品等工业产品的中间体，具有广泛的工业用途。因此，需要D型氨基酸的高效的制造方法。
发明内容
发明要解决的问题
提供有助于D型氨基酸的高效制造的技术是一个问题。
技术方案
为了解决上述问题，反复进行了昼夜研究，最终提供以下述为代表的发明。
项1.
一种酶，其具有下述(a)和(b)的特征：(a)具有可逆地对D- 氨基酸进行脱氢的活性；(b)是具有与序列号2的氨基酸序列的同一性为80％以上的氨基酸序列的多肽的六聚体。
项2.
根据项1所述的酶，其具有由2-氧代丁二酸合成D-天冬氨酸的活性。
项3.
根据项1或2所述的酶，其还具有下述特征(c)：(c)能将NADH 和NADPH这两者用作辅酶。
项4.
根据项1～3中任一项所述的酶，其还具有下述特征(d)：(d)以meso-二氨基庚二酸为底物、以NAD+为辅酶的情况下的相对于NAD+的 Km值为30mM以下。
项5.
根据项1～4中任一项所述的酶，其还具有下述特征(e)：(e)以meso-二氨基庚二酸为底物的情况下的最适活性pH为10.5。
项6.
根据项1所述的酶，其还具有下述特征(f)：(f)以meso-二氨基庚二酸为底物的情况下的最适活性温度为55℃。
项7.
根据项1或2所述的酶，其在与序列号2的氨基酸序列的同一性为80％以上的氨基酸序列中，具有选自由Asp94Ser、Met154Leu、Val158G1y、Thr173Ile、Argl83Met以及His229Asn构成的组中的一个以上氨基酸置换。
项8.
一种多核苷酸，其对项1～7中任一项的酶进行编码。
项9.
一种载体，其整合有项8所述的多核苷酸。
项10.
一种转化体，其包含项9所述的载体。
项11.
一种项1～7中任一项所述的酶的制造方法，其包括对项10所述的转化体进行培养。
项12.
一种使项1～7中任一项所述的酶作用于2-氧代酸来制造D-氨基酸的方法。
有益效果
能高效地合成D型氨基酸和/或2-氧代酸。
附图说明
图1表示对来源于T.lipolytica的D型氨基酸脱氢酶进行编码的DNA 的碱基序列。下划线是克隆用的限制酶识别位点，粗体字是终止密码子。
图2表示来源于T.lipolytica的D型氨基酸脱氢酶的氨基酸序列。
图3表示将粗酶液、热处理酶液以及各种层析后所得到的活性级分和分子量标记供于SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)的结果。泳道1 表示分子量标记的结果，泳道2表示粗酶液的结果，泳道3表示热处理后粗酶液的结果，泳道4表示Ni+-Chelating SepharoseTM FastFlow层析后活性级分的结果，泳道5表示Superdex200凝胶过滤层析后活性级分的结果。
图4表示将纯化酶供于蛋白质染色和活性染色的结果。泳道1表示蛋白质染色的结果，泳道2表示辅酶使用NAD+的情况下的活性染色的结果，泳道3表示辅酶使用NADP+的情况下的活性染色的结果。
图5表示测定出酶的meso-二氨基庚二酸的脱氨基反应的pH依赖性的结果。将甘氨酸缓冲液(pH10.5)中的比活性设为100％计算出各pH 下的相对活性。横轴是测定pH(pH)，纵轴是相对活性(％)。●表示甘氨酸缓冲液，■表示碳酸缓冲液。
图6表示测定出酶的meso-二氨基庚二酸的脱氨基反应的温度依赖性的结果。横轴是测定温度(℃)，纵轴是相对活性(％)。
图7表示测定出酶的热稳定性的结果。横轴是热处理温度(℃)，纵轴是相对活性(％)。
图8表示测定出酶的pH稳定性的结果。横轴是测定温度(pH)，纵轴是相对活性(％)。●表示磷酸缓冲液，■表示甲酸缓冲液，◆表示醋酸缓冲液，▲表示柠檬酸缓冲液，
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表示磷酸缓冲液，○表示硼酸缓冲液，□表示碳酸缓冲液。
图9表示来源于T.lipolytica的D型氨基酸脱氢酶的晶体。
图10表示来源于T.lipolytica的D型氨基酸脱氢酶的三维结构。
图11表示来源于T.lipolytica的D型氨基酸脱氢酶的氨基酸序列与其他四种meso-二氨基庚二酸脱氢酶的氨基酸序列的比对(alignment)。其他四种meso-二氨基庚二酸脱氢酶为来源于Bacillus sphaericus的物质 (序列号3)、来源于Corynebacterium glutamicum的物质(序列号4)、来源于Symbiobacterium thermophilum的物质(序列号5)以及来源于Ureibacillus thermosphaericus的物质(序列号6)。
图12表示对将来源于T.lipolytica的D型氨基酸脱氢酶的六个氨基酸残基置换后的氨基酸序列进行编码的DNA的碱基序列。四方形是突变导入部位，粗体字是终止密码子。
图13表示将来源于T.lipolytica的D型氨基酸脱氢酶的六个氨基酸残基置换后的氨基酸序列。四方形是突变导入部位。
图14表示对将来源于T.lipolytica的D型氨基酸脱氢酶的五个氨基酸残基置换后的氨基酸序列进行编码的DNA的碱基序列。四方形是突变导入部位，粗体字是终止密码子。
图15表示将来源于T.lipolytica的D型氨基酸脱氢酶的五个氨基酸残基置换后的氨基酸序列。四方形是突变导入部位。
图16表示将纯化后的D型氨基酸脱氢酶供于蛋白质染色和活性染色的结果。泳道1表示蛋白质染色的结果，泳道2表示底物使用D-丙氨酸的情况下的活性染色的结果，泳道3表示底物使用L-丙氨酸的情况下的活性染色的结果。
具体实施方式
酶优选具有可逆地对D型氨基酸进行脱氢的活性。需要说明的是，在本文中，将D型氨基酸也表达为“D-氨基酸”或“D氨基酸”。D型氨基酸是指，具有不对称碳的氨基酸的旋光异构体。在本文中，D型氨基酸也包含分子内具有L型和D型这两方的结构的meso型氨基酸(例如，meso- 二氨基庚二酸)。在一个实施方式中，D型氨基酸优选为不是meso型(实质上不存在L型)的D型氨基酸。
可逆地对D型氨基酸进行脱氢是指，对将D型氨基酸转化为对应的氧代酸的反应和将氧代酸转化为对应的D型氨基酸的反应这两方进行催化。如果用式子表示该反应则如下。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
例如，在D型氨基酸为meso-二氨基庚二酸的情况下，对将meso- 二氨基庚二酸转化为L-2-氨基-6-氧代庚二酸的反应和将L-2-氨基-6-氧代庚二酸转化为meso-二氨基庚二酸的反应这两方进行催化。也可以将这样的酶称为“meso-二氨基庚二酸脱氢酶”。在一个实施方式中，酶优选至少具有对氧代酸向D型氨基酸的转化进行催化的活性。即，在一个实施方式中，酶不一定需要具有将D型氨基酸转化为氧代酸的活性。
酶优选具有序列号2的氨基酸序列或者与该序列号2的氨基酸序列的同一性为60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％、91％以上、92％以上、93％条、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上％以上的氨基酸序列。序列号2是来源于Thermosyntropha lipolytica的D型氨基酸脱氢酶的氨基酸序列。
氨基酸的同一性可以使用市售的或能通过网络利用的分析工具(例如，FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等软件)进行计算。例如，可以在Advanced BLAST 2.1中，程序使用blastp，将Expect值设为10，Filter 全部设为OFF，Matrix使用BLOSUM62，将Gapexistencecost、Per residuegap cost以及Lambdaratio分别设为11、1、0.85(默认值)，其他各种参数也设定为默认值，进行检索，由此计算出氨基酸序列的同一性的值(％)。
酶优选具有选自由序列号2的氨基酸序列中的第5个～第17个、第 19个、第23个、第27～35个、第37个、第49个、第51个、第54个、第56个、第58个、第63个、第64个、第67个～第69个、第72个、第 74个、第83个、第89个～第94个、第96个、第99个、第106个、第107 个、第109个、第110个、第114个、第116个～第126个、第129个、第 130个、第132个、第138个、第145个、第146个、第148个、第149个、第151个～第153个、第155个～第157个、第159个、第161个、第163 个、第165个～第171个、第173个～第175个、第181个、第183个、第 186个、第187个、第190个、第192个～第194个、第197个～第200个、第202个、第204个、第206个、第208个、第209个、第212个、第213 个、第215个、第218个、第226个、第227个、第229个、第230个、第 233个、第236个、第237个、第239个、第240个、第244个、第245个、第247个、第249个、第251个～第256个、第258个～第261个、第264 个、第265个、第268个～第270个、第272个、第274个、第276个、第 277个、第279个～第283个、第292个、第299个以及第301个构成的组中的1个以上氨基酸残基。在此，“1个以上氨基酸残基”例如优选为2 个以上、3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、 9个以上、10个以上、15个以上、20个以上、25个以上、30个以上、35 个以上、40个以上、45个以上、50个以上、55个以上、60个以上、65个以上、70个以上、75个以上、80个以上、85个以上、90个以上、95个以上、100个以上、105个以上、110个以上、115个以上、120个以上、125 个以上、130个以上、135个以上、140个以上、145个以上或者150个。
在一个实施方式中，酶优选具有选自由序列号2的氨基酸序列中的第6个、第10～14个、第16个、第17个、第27～29个、第31个、第 37个、第51个、第54个、第68个、第69个、第89个、第91个、第 94个、第96个、第110个、第120个、第122个～第126个、第129个、第132个、第146个、第149个、第151个、第153个、第155个～第157 个、第159个、第161个、第163个、第165个、第166个、第169个、第173个、第175个、第181个、第183个、第187个、第193个、第194 个、第199个、第204个、第206个、第215个、第229个、第230个、第237个、第255个、第256个、第259个、第265个、第268个、第269 个、第276个、第279个以及第291个构成的组中的1个以上氨基酸残基。在此，“1个以上氨基酸残基”可以为1个以上、2个以上、3个以上、4 个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个以上、 15个以上、20个以上、25个以上、30个以上、35个以上、40个以上、 45个以上、50个以上、55个以上、60个以上或者63个氨基酸残基。在一个实施方式中，优选具有所述特定的氨基酸残基的更多的氨基酸残基。
在优选的一个实施方式中，酶进一步优选具有选自由序列号2的氨基酸序列中的第5个、第7个、第9个、第15个、第23个、第30个、第34个、第63个、第67个、第72个、第74个、第83个、第90个、第92个、第93个、第99个、第106个、第107个、第117～119个、第 130个、第138个、第145个、第148个、第152个、第160个、第161 个、第163个、第167个、第170个、第174个、第186个、第190个、第198个、第202个、第208个、第212个、第218个、第227个、第233 个、第239个、第244个、第245个、第249个、第251个、第253个、第254个、第258个、第260个、第264个、第270个、第272个、第280 个～第283个以及第301个构成的组中的1个以上氨基酸残基。在此，“1 个以上氨基酸残基”可以为1个以上、2个以上、3个以上、4个以上、5 个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个以上、15个以上、20个以上、25个以上、30个以上、35个以上、40个以上、45个以上、50个以上、55个以上或者58个氨基酸残基。在一个实施方式中，优选具有所述特定的氨基酸残基的更多的氨基酸残基。
在更优选的一个实施方式中，酶进一步优选具有选自由序列号2的氨基酸序列中的第8个、第19个、第32个、第33个、第49个、第56个、第58个、第64个、第19个、第114个、第116个、第121个、第168个、第171个、第192个、第197个、第200个、第209个、第213个、第218 个、第226个、第236个、第240个、第247个、第252个、第261个、第274个、第277个、第292个以及第299个构成的组中的1个以上氨基酸残基。在此，“1个以上氨基酸残基”可以为1个以上、2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10 个以上、15个以上、20个以上、25个以上或者29个氨基酸残基。
在一个实施方式中，酶可以在序列号2的氨基酸序列中具有下述表1 的氨基酸残基的置换中的1个以上。在此，“1个以上”可以为1个以上、 2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、 9个以上、10个以上、15个以上、20个以上、25个以上、30个以上、35 个以上、40个以上、45个以上、50个以上、55个以上、60个以上、65 个以上、70个以上、75个以上、80个以上或者85个。
[表1]
位置 置换氨基酸残基 位置 置换氨基酸残基 位置 置换氨基酸残基
5 L 116 A 218 I
7 I 117 S 226 G
8 G 118 L.I 227 V
9 V 119 V 233 V
15 L 121 T，V 236 T，S
19 V 130 I，L 239 T
23 V 138 V 240 D
30 D 145 H 244 K
32 V 148 W 245 H
33 A 152 L，V 247 V，F，I
34 I 160 L，I 249 Y
35 F 161 R 251 L
49 T，V 163 I 253 L
56 D 167 Q，R 254 D，E
58 S 168 K，D 258 F
63 I 170 V 260 S
64 Q，D 171 Q 261 S
67 I 174 L 264 I
72 S 186 W，F 270 A
74 T 190 D 272 R
83 F 192 A 274 Q
90 I 197 L，R，E 277 A
92 T 198 I 280 V
93 F 200 Q，N，R，H 281 L，F
99 I 202 I 282 E，D
106 V，M 208 Y 283 V
107 N 209 F 292 S，N
109 A 212 Y 299 E，R，K
114 G 213 V 301 L
116 A 218 I
在表1中，“位置”是指，序列号2中的氨基酸残基的位置。“置换氨基酸残基”是指，能对序列号2的特定的位置的氨基酸残基进行置换的氨基酸残基的种类。在表1中，氨基酸残基的种类用字母表单字母表达来表示。
在一个实施方式中，氨基酸残基的置换优选保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”是指，将某个氨基酸残基置换为具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链如碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)那样被分类为几个家族。由此，优选在同一家族内的氨基酸残基间进行置换。
在一个实施方式中，酶优选在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中，选自由Asp94、Met154、Val158、Thr173、 Arg183以及His229构成的组中的1个以上氨基酸残基被置换为其他氨基酸残基。一个实施方式中，酶优选在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有选自由Asp94Ser、Met154Leu、 Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn构成的组中的1个以上氨基酸残基的置换。在此，“Met154Leu”是指，第154个的蛋氨酸残基被置换为亮氨酸残基。对于其他置换也是同样的。另外，“1个以上”可以优选为2个以上、3个以上、4个以上、5个以上或者6个。通过具有Thr173Ile、Arg183Met和/或His229Asn的置换，能以更宽种类的D-氨基酸和2-氧代酸为底物来生产对应的氧代酸和D-氨基酸。另外，通过具有 Asp94Ser、Met154Leu和/或Val158Gly的置换，能进一步提高催化效率。
例如，通过在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn 的置换，酶与突变前相比在将NADPH用作辅酶的同时具有对下述反应进行催化的高活性：将2-氧代-4-甲基戊酸转化为D-亮氨酸酸的反应、将2- 氧代-3-甲基戊酸转化为D-异亮氨酸的反应、将2-氧代-4-(甲硫基)丁酸转化为D-蛋氨酸的反应、将2-氧代-3-苯基丙酸转化为D-苯丙氨酸的反应以及将2-氧代辛酸转化为D-2-氨基辛酸的反应。因此，在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、 Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn的置换的酶适合制造D- 亮氨酸、D-异亮氨酸、D-蛋氨酸、D-苯丙氨酸以及D-2-氨基辛酸。
另一方面，在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中不具有Met154Leu、Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及 His229Asn这样的突变的酶具有对下述反应进行催化的比较高的活性：将 2-氧代丙酸转化为D-丙氨酸的反应、将2-氧代-3-甲基丁酸转化为D-缬氨酸的反应、将2-氧代丁二酸转化为D-天冬氨酸的反应、将2-氧代戊二酸转化为D-谷氨酸的反应以及将2-氧代丁酸转化为D-2-氨基丁酸的反应。因此，不具有上述的特定的突变(置换)的酶适合制造D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸以及D-2-氨基丁酸。
在一个实施方式中，酶优选在序列号2的氨基酸序列中具有选自由 Asp94、Asp124、Met154、Gly155、Thr173、Arg183以及His229构成的组中的1个以上氨基酸残基。“1个以上”可以优选为2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、6个以上或者7个。可以认为：通过具有(维持) 该1个以上氨基酸残基，优选满足与后述的kcat(min-1)等有关的特性。
酶优选为六聚体。六聚体是指，酶在活性型(具有活性的状态)时呈6个多肽(单体)形成1个聚集的结构的状态。六聚体可以为均六聚体和杂六聚体中的任一种，但优选为均六聚体。
在一个实施方式中，酶优选具有由2-氧代丁二酸生产D-天冬氨酸的活性。这样的酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有上述的Asp94Ser、Met154Leu、Val158Gly、 Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的突变。在一个实施方式中，从更高效地生产D-天冬氨酸的观点考虑，酶优选不具有所述突变。
在一个实施方式中，酶优选具有由2-氧代戊二酸生产D-谷氨酸的活性。这样的酶优选在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中不具有上述的Asp94Ser、Met154Leu、Val158Gly、Thr173Ile、 Arg183Met以及His229Asn这样的突变。
酶优选也能将NADH和NADPH中的任一种用作用于催化可逆地对 D型氨基酸进行脱氢的反应的辅酶。NADH一般能比NADPH便宜地获取。由此，能将NADH用作辅酶在降低使用酶的D型氨基酸等的制造成本方面是有意义的。
酶优选以meso-二氨基庚二酸为底物的情况下的kcat(min-1)为1.0 ×103以上。kcat(min-1)优选为2.0×103以上、3.0×103以上、4.0×103以上或4.4×103以上。kcat是每单位时间能催化几个底物的参数。
酶优选以meso-二氨基庚二酸为底物的情况下的Km值为6.0mM以下或5.7mM以下。Km值是表示酶与底物的亲和性的参数，其值越低，亲和性越高，能以少量的酶高效地促进所期望的反应。
酶优选以meso-二氨基庚二酸为底物、以NAD+为辅酶的情况下的相对于NAD+的Km值为30mM以下、20mM以下或15mM以下。通过满足这样的Km值，能降低使用酶来生产D-氨基酸或氧代酸所需的NAD+的量。
酶优选以meso-二氨基庚二酸为底物、以NADP+为辅酶的情况下的相对于NADP+的Km值为20mM以下、10mM以下或1mM以下。通过满足这样的Km值，能降低使用酶来生产D-氨基酸或氧代酸所需的NADP+的量。
酶优选以meso-二氨基庚二酸为底物的情况下的最适活性pH为 10.5。最适活性pH为10.5是指，如图5所示，与pH为9.5～10.0和pH 为11.0～11.5的情况相比，pH为10.5的情况下的酶活性高。
酶优选以meso-二氨基庚二酸为底物的情况下的最适活性温度为55 ℃。最适活性温度为55℃是指，如图6所示，与40℃～50℃和60℃下的酶活性相比，55℃下的酶活性高。
酶优选利用其多肽部分(单体)的SDS-PAGE测定出的分子量为约 36kDa。“约36kDa”是指，在利用SDS-PAGE测定出分子量时，包含本领域技术人员通常判断为在36kDa的位置存在条带的范围。“多肽部分”是指，实质上未结合糖链的状态的多肽。
酶优选热稳定性优异。例如，酶优选与在50℃下保持30分钟后的活性(以meso-二氨基庚二酸为底物)相比，在65℃下保持30分钟后的活性为95％以上。
酶优选pH稳定性优异。例如，酶优选在pH5.5～9.5的缓冲液中保持30分钟后的残存活性与在pH9.0的缓冲液中保持30分钟后的残存活性相比为90％以上。
酶的来源不特别限制。例如，酶优选来源于属于Thermosyntropha属的微生物(例如，Thermosyntropha lipolytica)。
酶可以为结晶状态。结晶状态的酶例如可以按照后述的实施例来得到。结晶状的酶对于高纯度的纯化、高密度且蛋白酶抗性强的稳定保存、向固定化的利用是有用的。
上述的酶可以通过任意的方法来得到。例如，可以通过如下方式来获取：直接(或者在氨基酸残基加入突变之后)利用对具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质进行编码的基因，对宿主细胞进行转化，从其培养物中采取具有上述活性的蛋白质。另外，酶通过对构成该酶的多肽进行化学合成也能得到。
对上述的酶进行编码的多核苷酸的结构不特别限制。例如，多核苷酸优选具有与序列号1的碱基序列的同一性为60％以上、65％以上、70％以上、 75％以上、80％以上、85％以上、90％、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的碱基序列。
碱基序列的相同性可以使用市售的或能通过电信线路(网络)利用的分析工具(例如，BLAST等)来计算出。在使用BLAST的情况下，各种参数可以在初始条件下进行计算。
多核苷酸可以为DNA、RNA或DNA-RNA杂合体等中的任一种。多核苷酸优选为分离出的多核苷酸。在多核苷酸为DNA的情况下，可以为 cDNA。
多核苷酸可以通过任意的方法来得到。例如，可以基于序列号1的信息通过化学合成法(例如，通过亚磷酰胺法(phosphoramidite method) 实现的固相合成法)来制造、获取。另外，通过使用标准的基因工程学方法、分子生物学方法、生物化学方法等也能容易地制备。
载体优选整合有对上述酶进行编码的多核苷酸。载体的种类不特别限制，可以根据宿主细胞的种类适当选择。例如，可列举出质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体(腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体等)等。
只要多核苷酸能在宿主中表达，载体的构成就不限制。载体优选包含多核苷酸的表达所需的其他碱基序列。作为其他碱基序列，例如可列举出启动子序列、前导序列、信号序列、增强子序列以及核糖体结合序列等。
转化体优选包含对上述的酶进行编码的多核苷酸。这样的转化体可以通过将上述的包含多核苷酸的载体导入宿主来得到。宿主细胞只要能表达上述多核苷酸而生产上述酶就不特别限制。具体而言，可列举出：大肠杆菌和枯草杆菌等原核细胞；酵母、霉菌、昆虫细胞以及哺乳动物细胞等真核细胞；等。使用载体的宿主的转化可以按照常规方法(例如，氯化钙法、电穿孔法、显微注射法、脂质体转染(liposome fection)法)来进行。
可以通过培养上述转化体来得到上述酶。培养条件可以根据宿主的种类等适当设定。培养后，可以从培养液或菌体中回收酶。在使用将酶分泌至菌体外的微生物的情况下，例如，可以通过如下方式来得到酶：通过对培养上清液进行过滤、离心处理等来去除不溶物后，将利用超滤膜进行的浓缩、硫酸铵沉淀等盐析透析、各种层析等适当组合而进行分离、纯化。这样能以低成本大量生产上述的酶。
在一个实施方式中，酶的热稳定性优异。因此，在分离、纯化工序中并用热处理是有用且便利的。从培养物中得到的宿主细胞和培养上清液中含有来源于该宿主细胞的各种蛋白质。但是，通过进行热处理，来源于宿主细胞的夹杂蛋白质产生变性而凝聚沉淀。相对于此，热稳定性优异的酶不会产生变性，因此能通过离心分离等与来源于宿主的夹杂蛋白质容易地分离。热处理的条件并不特别限定，例如可以采用约50～65℃下10～ 30分钟的处理。通过直接对培养液进行热处理或者对粗提取液进行热处理，其他蛋白质失活，能高效地得到目标的酶。
通过利用上述的酶，能合成D-氨基酸。D-氨基酸的合成例如可以通过作为底物的2-氧代酸的氨基化来进行。可以在NADPH(或NADH)和氨的存在下，使酶与作为底物的2-氧代酸反应，回收在该酶的催化反应中生成的D-氨基酸。D-氨基酸的回收可以通过任意的方法(例如，使用离子交换树脂的方法)来进行。同样地，可以使用上述的酶由D-氨基酸制造2-氧代酸。
D-丙氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代丙酸来得到。在一个实施方式中，在D-丙氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2 具有80％以上的同一性的氨基酸序列中不具有Asp94Ser、Met154Leu、 Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的突变的酶。
D-缬氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代-3-甲基丁酸来得到。在一个实施方式中，在D-缬氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号 2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中不具有Asp94Ser、Met154Leu、 Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。
D-亮氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代-4-甲基戊酸来得到。在一个实施方式中，在D-亮氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、Val158Gly、 Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换，在一个实施方式中，优选不具有Asp94Ser的置换。
D-异亮氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代-3-甲基戊酸来得到。在一个实施方式中，在D-异亮氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、Val158Gly、 Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换，在一个实施方式中，优选不具有Asp94Ser的置换。
D-蛋氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代-4-(甲硫基)丁酸来得到。在一个实施方式中，在D-蛋氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、Val158Gly、 Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换，在一个实施方式中，优选不具有Asp94Ser的置换。
D-苯丙氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代-3-苯基丙酸来得到。在一个实施方式中，在D-苯丙氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、Val158Gly、 Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换，在一个实施方式中，优选不具有Asp94Ser的置换。
D-天冬氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代丁二酸来得到。在一个实施方式中，在D-天冬氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中不具有Met154Leu、Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn(或者，还不具有 Asp94Ser的置换)这样的置换的酶。
D-谷氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代戊二酸来得到。在一个实施方式中，在D-谷氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2 具有80％以上的同一性的氨基酸序列中不具有Met154Leu、Va1158Gly、 Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn(或者，还不具有Asp94Ser的置换)的置换的酶。
D-2-氨基丁酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代丁酸来得到。在一个实施方式中，在D-2-氨基丁酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中不具有Asp94Ser、Metl54Leu、 Val158Gly、Thrl73Ile、Arg183Met以及His229Asn的置换的酶。
D-2-氨基辛酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代辛酸来得到。在一个实施方式中，在D-2-氨基辛酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、Val158Gly、 Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换，在一个实施方式中，优选不具有Asp94Ser的置换。
D-2-氨基庚酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代庚酸来得到。在一个实施方式中，在D-2-氨基庚酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、 Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换。
D-正亮氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代己酸来得到。在一个实施方式中，在D-正亮氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、Val158Gly、 Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换。
D-正缬氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代戊酸来得到。在一个实施方式中，在D-正缬氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换。
D-丝氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代-3-羟基丙酸来得到。在一个实施方式中，在D-丝氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Metl54Leu、 Val158Gly、Thrl73Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换。
D-苏氨酸可以通过使上述的酶作用于2-3-羟基丁酸来得到。在一个实施方式中，在D-苏氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2 具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、Val158Gly、 Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换。
D-半胱氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代-3-巯基(sulfanyl)丙酸来得到。在一个实施方式中，在D-半胱氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有 Met154Leu、Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换。
D-天冬酰胺可以通过使上述的酶作用于2-氧代-3-氨基甲酰基丙酸来得到。在一个实施方式中，在D-天冬酰胺的制造中，优选使用在序列号2 或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、 Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换。
D-谷氨酰胺可以通过使上述的酶作用于2-氧代-4-氨基甲酰基丁酸来得到。在一个实施方式中，在D-谷氨酰胺的制造中，优选使用在序列号2 或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换。
D-色氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸来得到。在一个实施方式中，在D-色氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有 Met154Leu、Va1158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换。
D-赖氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代-6-氨基己酸来得到。在一个实施方式中，在D-赖氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、 Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换。
D-精氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代-5-胍基戊酸来得到。在一个实施方式中，在D-精氨酸的制造中，优选使用在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Metl54Leu、 Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换。
D-酪氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代-3-(4-羟基苯基)丙酸来得到。在一个实施方式中，在D-酪氨酸的制造中，优选使用在序列号2 或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、 Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换。
D-组氨酸可以通过使上述的酶作用于2-氧代-3-(4-咪唑基)丙酸来得到。在一个实施方式中，在D-组氨酸的制造中，优选使用在序列号2 或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有Met154Leu、Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn这样的置换的酶。在此，酶可以在序列号2或与该序列号2具有80％以上的同一性的氨基酸序列中具有或不具有Asp94Ser的置换。
实施例
以下，通过实施例进一步对本发明进行详细说明，但本发明并不受它们限制。
[实施例1 D型氨基酸脱氢酶基因的克隆和表达载体的制作]
D型氨基酸脱氢酶基因可以使用公知的基因克隆技术来获取。例如，可以基于能通过检索GenBank等公知的数据库而获取的序列信息合成基因来获取。
从GENEWIZ公司获取对具有序列号1的碱基序列的来源于T.lipolytica的D型氨基酸脱氢酶进行编码的DNA。将其用限制酶NdeI和XhoI切断，利用琼脂糖凝胶电气流动进行分离后，从凝胶中进行提取和纯化。将限制酶处理后的DNA片段通过连接反应整合到蛋白质表达用质粒的pET-16a(NOVAGEN公司制)的限制酶位点(NdeI和XhoI)，构建保持D型氨基酸脱氢酶的基因的表达载体。该表达载体以在T7启动子、脂质体结合位点的下游、T7终止子的上游整合来源于T.lipolytica的D型氨基酸脱氢酶基因的方式构建。将该D型氨基酸脱氢酶基因的碱基序列 (序列号1)示于图1。另外，将序列号1的碱基序列所编码的氨基酸序列(序列号2)示于图2。
需要说明的是，该表达载体中包含组氨酸-标签。另外，在向其他表达载体插入D型氨基酸脱氢酶基因时，如果在D型氨基酸脱氢酶基因中除去终止密码子(在本实施例中利用TAA)，则也可以赋予C末端的组氨酸-标签。
[实施例2 D型氨基酸脱氢酶的合成]
利用在上述实施例1中得到的表达载体，对E.coli BL21(DE3)株进行转化。将其接种到含有抗生素氨苄西林(最终浓度100mg/L)的LB 培养基(500mL)中，在37℃下振荡培养，直至变为A600＝0.6左右，然后，以按最终浓度计为0.1mM的方式加入异丙基-β-D(-)-吡喃半乳糖苷 (和光纯药公司制)，在37℃下进一步振荡培养6小时。
通过离心分离来收集培养液中的菌体，将该菌体使用50mM磷酸缓冲液(pH7.2)进行悬浮，在冰冷下进行超声波破碎。在超声波破碎后进行离心分离，将所得到的上清液设为粗酶液。将粗酶液在50℃下进行30 分钟热处理，将该处理酶液使用Ni+-ChelatingSepharoseTM Fast Flow层析 (GE Healthcare Japan公司制)、Superdex200凝胶过滤层析(GE Healthcare Japan公司制)进行纯化。通过考马斯亮蓝(bradford)法测定出所得到的D型氨基酸脱氢酶的蛋白质量。
在图3中示出将粗酶液、热处理酶液以及各种层析后所得到的活性级分和分子量标记供于SDS-PAGE的结果。根据图1的泳道5，能在36kDa 的位置确认蛋白质的单个条带，能得到良好的纯化结果。
[实施例3 D型氨基酸脱氢酶的辅酶依赖性的确认]
针对在上述实施例2中获取的D型氨基酸脱氢酶，对辅酶依赖性进行评价。所述酶的辅酶依赖性通过起因于酶的催化反应的活性染色法进行评价。
更详细而言，将适量的酶溶液供于圆盘凝胶电泳。将泳动后的凝胶浸入含有200mM的磷酸类缓冲液(pH8.0)、10mM的meso-二氨基庚二酸、0.1mM的2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-氯化四唑(INT) (同仁化学公司制)、0.04mM的1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(PMS) (同仁化学公司制)以及1.25mM的各种辅酶的反应液中，在50℃下保温30分钟。该反应液中的2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H- 氯化四唑被还原而产生水溶性甲臜。以下示出反应式。需要说明的是，在下述的反应式中，将D型氨基酸脱氢酶表达为“meso-DAPDH”。
『化学式1]
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在图4中示出将纯化后的酶供于蛋白质染色和活性染色的结果。根据图4的各泳道，确认到由酶引起的单个条带。另外，根据泳道2、3，确认到本酶利用NAD+和NADP+这两个辅酶。
[实施例4 D型氨基酸脱氢酶的催化反应的最适pH的确认]
针对在实施例2中得到的D型氨基酸脱氢酶，对最适pH进行评价。所述酶的活性通过如下方式来测定出：将在酶的催化反应中生成的NADPH 定量成测定波长340nm的吸光度的增大，以其为指标，求出酶活性。
更详细而言，通过将适量的酶溶液在含有10mM的meso-二氨基庚二酸、1.25mM的NADP+的200mM的各种缓冲液中进行混合来制备出反应液。接着，通过在反应温度50℃下测定与该反应液中的从NADP+向 NADPH的变化相伴的340nm的吸光度的增大来进行活性测定。
吸光度通过紫外可见分光光度计UV-1800(SHIMADZU公司制)来测定出。利用所得到的吸光度变化和下述公式，根据所使用的酶的蛋白质量和酶稀释率来计算出酶的比活性。
[数式1]
Figure DEST_PATH_IMAGE004
ΔA340：340nm下的每一分钟的吸光度变化量
D：酶稀释率
6.22∶340nm下的NADPH的毫摩尔分子吸光系数(Lμmmol-1μcm-1)
C：蛋白浓度(mg/mL)
d：光路长(1cm)
将测定结果示于图5。根据该结果，显示出meso-二氨基庚二酸的脱氨基反应的最适活性pH为10.5。
[实施例5 D型氨基酸脱氢酶的催化反应的最适温度的确认]
向在规定温度(50、55、60、65、70、75或80℃)下加热后的反应溶液中添加1.25mM的NADP+，立即测定出吸光度的增大，除此以外，与实施例4同样地测定吸光度，计算出相对活性。在图6中示出测定结果。根据该结果，确认到最适活性温度为约55℃。
[实施例6 D型氨基酸脱氢酶的热稳定性的确认]
将在实施例2中纯化后的D型氨基酸脱氢酶在10mM的磷酸缓冲液 (pH 7.2)中于各种温度条件(50、55、60、65或70℃)下进行30分钟热处理，确认在冰中静置5分钟后的残存活性。对于酶活性而言，通过实施例4所记载的方法，通过将meso-二氨基庚二酸用作底物的情况下的NADPH 的生成所引起的340nm下的吸光度的增大进行评价。将50℃下的处理的活性设为100％，将其他温度下的处理后的残存活性设为相对活性而计算出。
在图7中示出测定结果。根据该结果，确认到该酶在70℃热处理后保持约74％的残存活性。
[实施例7 D型氨基酸脱氢酶的pH稳定性的确认]
将在实施例2中纯化后的D型氨基酸脱氢酶在100mM的各缓冲液(pH 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、 9.0、9.5、10.0、10.5、11.0或11.3)中于50℃下进行30分钟热处理，确认在冰中静置5分钟后的残存活性。对于酶活性而言，通过实施例4所记载的方法，通过将meso-二氨基庚二酸用作底物的情况下的NADPH的生成所引起的340nm下的吸光度的增大进行评价。将pH9.0下的处理的活性设为 100％，将其他pH下的处理后的残存活性设为相对活性而计算出。
在图8中示出测定结果。如图8所示，D型氨基酸脱氢酶在pH5.0 至9.5下的处理后保持约90％以上的残存活性。
[实施例8 D型氨基酸脱氢酶的动力学分析]
针对在实施例2中得到的D型氨基酸脱氢酶，将meso-二氨基庚二酸用作底物、将NADP+或NAD+用作辅酶而进行活性的测定，进行动力学分析。
对于作为反应速度参数的周转率(kcat)、米氏常数(Km)值以及催化效率(kcat/Km)而言，使用Igor Pro ver.3.14(WaveMetrics公司制)，根据生成的NAD(P)H相对于时间的标绘图确定不同的底物/辅酶浓度下的D型氨基酸脱氢酶的催化反应的初速度后，基于Michaelis-Menten 公式来确定。对于酶活性而言，通过实施例4所记载的方法，通过将meso- 二氨基庚二酸用作底物的情况下的NAD(P)H的生成所引起的340nm 下的吸光度的增大进行评价。
在表2中示出所述纯化酶的动力学分析结果。如表2所示，显示出：对于D型氨基酸脱氢酶而言，与将NAD+用作辅酶相比，将NADP+用作辅酶时，催化效率更高。
[表2]
表2动力学分析
Figure DEST_PATH_IMAGE005
关于相对于meso-二氨基庚二酸的kcat、Km、kcat/Km，将NADP+用作辅酶来确定。
[实施例9 D型氨基酸脱氢酶的结晶化]
将纯化后的D型氨基酸脱氢酶(浓度10.64mg/mL)溶液和由0.2M 的氯化钾、20％w/v的聚乙烯甘油(polyethylene glycerol)3350构成的结晶化溶液以相同量(各自0.5μL)混合。使用96孔板(Hampton Research 公司)，将上述的结晶化溶液50μL设为母液，使用坐滴(sitting drop) 法中的蒸汽扩散，在20℃下静置。1天后析出晶体，3天后生长为能测定的大小(1.5×1.0×1.0mm左右)的晶体(图9)。
[实施例10 D型氨基酸脱氢酶的晶体结构分析]
对于D型氨基酸脱氢酶的晶体而言，在常温测定下因X射线损伤而晶体产生劣化，分辨率逐渐降低，因此进行低温条件下的测定。将晶体转移至含有30％的甘油的结晶化溶液后，吹送90K的氮气，进行快速冷却。使用X射线衍射装置MX300HEdetector(Raynonix公司制)，收集
Figure DEST_PATH_IMAGE006
分辨率的X射线衍射数据，确定晶体学参数。空间群为C2，晶格常数为
Figure DEST_PATH_IMAGE007
α＝90°、β＝110.01°、γ＝90°。若假定不对称单位含有六个分子，则晶体的水分含有率为54.1％。
[实施例11 D型氨基酸脱氢酶的立体结构确定]
使用所得到的X射线衍射强度数据和在实施例10中获取的D型氨基酸脱氢酶的三维结构坐标，进行通过程序PHASER实现的分子置换法。将来源于Symbiobacterium thermophilum的meso-DAPDH的三维结构坐标设为搜索模型进行分子置换法的计算。使用
Figure DEST_PATH_IMAGE008
至
Figure DEST_PATH_IMAGE009
分辨率的X射线衍射强度数据的计算的结果是得到一种有效解。
对于所得到的结构模型，通过程序REFMAC5中的限制性精修 (restrainedrefinement)的方法，使用
Figure DEST_PATH_IMAGE010
至
Figure DEST_PATH_IMAGE011
分辨率的结构因子进行精修，其结果是，在由297个氨基酸残基构成的修饰型meso-DAPDH 中，在A、B两个分子中鉴定出Lys4-Val301的氨基酸残基。另外，作为蛋白质以外的原子，鉴定出332个水分子。在精修的最终阶段，R因子为19.3％，Free-R因子为24.7％。而且，来自各原子间的键合距离和键合角的理想状态的均方根误差分别为
Figure DEST_PATH_IMAGE012
和1.68度。
通过以上的分析，得到三维结构坐标。根据所得到的结构坐标，确认到D型氨基酸脱氢酶的缔合状态为六聚体(图10)。
[实施例12突变型D型氨基酸脱氢酶的合成]
通过合成来获取对向来源于T.lipolytica的D型氨基酸脱氢酶的氨基酸序列导入了6种突变(Asp94Ser、Met154Leu、Val158Gly、Thr173Ile、 Arg183Met、His229Asn)的突变酶的多肽进行编码的DNA。将其用作模板，使用TAKARA BIO公司制的“PrimeSTAR Max DNAPolymerase”，通过PCR扩增该酶的基因。PCR按照制造厂家的指示来执行。PCR反应液以含有以下的引物各0.3μM、50ng的上述的模板DNA的方式制备。
5’-CACCATGGGTGAGAAGATTCGCGTGGCAAT-3’(序列号9)
5’-TTAAACCAGTTGGCGGATGATTTCATCCGG-3’(序列号10)
将PCR后的反应液利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega公司制)进行纯化，通过琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增产物。其结果是，可确认到获取预期的扩增产物(约0.9kbp)。
按照制造商的方案(protocol)，将纯化后的扩增产物整合到蛋白质表达用质粒的pET100载体(Invitrogen公司制)，构建6突变导入型D 型氨基酸脱氢酶/pET100。该表达载体以在T7启动子以及脂质体结合位点的下游且T7终止子的上游整合来源于T.lipolytica的6突变导入型D型氨基酸脱氢酶基因的方式构建。将该6突变导入型D型氨基酸脱氢酶基因的碱基序列(序列号7)示于图12。另外，将序列号7的碱基序列所编码的氨基酸序列(序列号8)示于图13。
需要说明的是，该表达载体中包含组氨酸-标签。另外，在向其他表达载体插入突变型D型氨基酸脱氢酶基因时，如果在D型氨基酸脱氢酶基因中除去终止密码子(在本实施例中利用TAA)，则也可以赋予C末端的组氨酸标签。
制作向来源于T.lipolytica的D型氨基酸脱氢酶导入了5种突变的突变酶的基因，因此，将上述所制作的6突变导入型D型氨基酸脱氢酶/pET100 用作模板，使用TAKARA BIO公司制的“PrimeSTAR Max DNA Polymerase”，通过PCR制作出该表达载体。PCR按照制造厂家的指示来执行。PCR反应液以含有以下的引物各0.3μM、50ng的上述的模板DNA的方式制备。
5’-CCGTGGATAGCTATGATATTCACGGCCAGC-3’(序列号11)
5’-GCTGGCCGTGAATATCATAGCTATCCACGG-3’(序列号12)
在PCR后，向反应液中加入2μL的DpnI并在37℃下处理1小时，使用处理后的溶液，对E.coli DH5α进行转化。将转化细胞涂布于含有抗生素氨苄西林(最终浓度100mg/L)的LB琼脂培养基板上，在37℃下培养16小时。采取生成的菌落，在含有氨苄西林的LB培养基中振荡培养一晚。通过离心分离从培养液中回收菌体后，将5突变导入型D型氨基酸脱氢酶/pET100利用AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit(BIONEER)按照制造商的方案回收。将该5突变导入型D型氨基酸脱氢酶基因的碱基序列(序列号13)示于图14。另外，将序列号13的碱基序列所编码的氨基酸序列(序列号14)示于图15。
利用上述所得到的表达载体或D型氨基酸脱氢酶/pET-16b(+)，分别对E.coliBL21(DE3)株进行转化。将它们接种到含有氨苄西林的 Overnight Express Instant LB培养基(Merck Millipore公司制)250mL中，在37℃下振荡培养16小时。
通过离心分离来收集培养液中的菌体，将该菌体使用50mM磷酸缓冲液(pH7.2)进行悬浮，在冰冷下进行超声波破碎。在超声波破碎后进行离心分离，将所得到的上清液设为粗酶液。将粗酶液在50℃下进行30 分钟热处理，将该处理酶液使用Ni+-ChelatingSepharoseTM Fast Flow层析 (GE Healthcare Japan公司制)、Superdex200凝胶过滤层析(GE Healthcare Japan公司制)进行纯化。通过考马斯亮蓝法测定出所得到的D型氨基酸脱氢酶的蛋白质量。
[实施例13 D型氨基酸脱氢酶的光学活性的确认]
针对在上述实施例2中获取的D型氨基酸脱氢酶，对光学活性进行评价。需要说明的是，酶的光学活性通过起因于酶的催化反应的活性染色法进行评价。更详细而言，将适量的酶溶液供于圆盘凝胶电泳。将泳动后的凝胶浸入含有200mM的磷酸类缓冲液(pH8.0)、10mM的D-丙氨酸或 L-丙氨酸、0.1mM的2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-氯化四唑(INT)(同仁化学公司制)、0.04mM的1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(PMS)(同仁化学公司制)以及1.25mM的NADP+的反应液中，在50℃下保温30分钟。该反应液中的2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基) -5-苯基-2H-氯化四唑被还原而产生水溶性甲臜。以下示出反应式。需要说明的是，在下述的反应式中，将D型氨基酸脱氢酶表达为“meso-DAPDH”。
『化学式2]
Figure DEST_PATH_IMAGE013
在图16中示出将纯化后的D型氨基酸脱氢酶供于蛋白质染色和活性染色的结果。根据图16的泳道1和2，确认到由酶引起的单个条带。另外，根据泳道2，确认到本酶选择性地作用于D-氨基酸。另外，D型氨基酸脱氢酶可逆地对D-氨基酸的脱氨基反应进行催化。因此，确认到D型氨基酸脱氢酶通过2-氧代酸的氨基化来合成D-氨基酸而不是L-氨基酸。
[实施例14各种酶的D-氨基酸合成活性的确认]
进行在实施例2和12中得到的各种酶的D-氨基酸合成活性的测定，讨论突变导入对D-氨基酸的合成活性带来的影响。所述酶的活性通过如下方式测定出：将在酶的催化反应中减少的NADPH或NADH定量成测定波长340nm的吸光度的减少，以其为指标，求出酶活性。更详细而言，通过将适量的酶溶液在含有5mM的2-氧代酸、0.1mM的NAD(P)H、200mM的氯化铵的200mM的甘氨酸缓冲液(pH9.5)中进行混合来制备出反应液。接着，通过在反应温度50℃下测定与该反应液中的从NAD(P) H向NAD(P)+的变化相伴的340nm的吸光度的减少来进行活性测定。吸光度通过紫外可见分光光度计UV-1800(SHIMADZU公司制)来测定出。利用所得到的吸光度变化和与在实施例4中使用的公式相同的公式来测定酶活性，根据所使用的酶的蛋白质量和酶稀释率计算出酶的比活性。在表3中分别示出各酶的D-氨基酸合成活性。
Figure DEST_PATH_IMAGE014
根据表3的结果，确认到：突变导入前的D型氨基酸脱氢酶将各种 2-氧代酸用作底物来合成支链D-氨基酸、含硫D-氨基酸、酸性D-氨基酸等各种D-氨基酸。另外，通过向D型氨基酸脱氢酶导入突变，确认到NAD (P)H依赖性的支链D-氨基酸的合成活性的3倍左右的上升。而且，确认到在突变导入前的酶中未检测到活性的NADH依赖性的芳香族D-氨基酸的合成活性的新表达。
序列表
<110> 国立研究开发法人产业技术综合研究所（NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCEDINDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY）
<120> D型氨基酸脱氢酶
<130> QS-P200086P
<150> JP 2017-154621
<151> 2017-08-09
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 915
<212> DNA
<213> Thermosyntropha lipolytica
<400> 1
catatgggcg aaaagataag agtagctatt gtgggttatg gcaatatagg aagatatgct 60
ttagatgcta taaaggcagc tcctgatatg gaattagccg gggtagttcg caggtcttca 120
tctctggggg ataagccggc agaactggct gatgtgccgg tagtagggtc tattaaggaa 180
cttacagggg taaaggtagc ccttttatgt acccctaccc gttcagtacc ggagtatgcc 240
agagagattt tagctcttgg cattaatacg gttgacagtt atgatattca tggccagtta 300
gctgatttac gattggaatt agataaagtt gccaaggaac ataatgcagt agcggtgata 360
tcagccggct gggatccggg aactgattcc atggtgcgct gtatgtttga atttatggct 420
cccaaaggta taacctacac caattttggc cccggcatga gcatggggca ctcggtagcc 480
gtaaaggcgg ttaaaggggt taaaaatgcc ctttctatga ctataccttt aggcaccggt 540
gtgcatcggc gcatggttta tgtggaatta gaaccgggag ctgattttgc ccaggtagaa 600
aaggcagtaa aaactgatcc ctattttgta aaagatgaaa ctcatgtcat ccaggtagaa 660
gatgttgatg cccttatcga tatgggacat ggagtattga tggaaagaaa aggagtatct 720
ggcggtaccc acaatcagtt gttaagtttt tccatgcgca taaacaatcc ggctttaact 780
gctcagataa tggtagcttc ggccagagcc agtgtaaaac agaaacctgg tgcttatact 840
atgattcaga taccgataat agactatatg tatggagatc ctgacgaaat tatccgccag 900
cttgtataac tcgag 915
<210> 2
<211> 301
<212> PRT
<213> Thermosyntropha lipolytica
<400> 2
Met Gly Glu Lys Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Ile Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Ala Leu Asp Ala Ile Lys Ala Ala Pro Asp Met Glu Leu Ala
20 25 30
Gly Val Val Arg Arg Ser Ser Ser Leu Gly Asp Lys Pro Ala Glu Leu
35 40 45
Ala Asp Val Pro Val Val Gly Ser Ile Lys Glu Leu Thr Gly Val Lys
50 55 60
Val Ala Leu Leu Cys Thr Pro Thr Arg Ser Val Pro Glu Tyr Ala Arg
65 70 75 80
Glu Ile Leu Ala Leu Gly Ile Asn Thr Val Asp Ser Tyr Asp Ile His
85 90 95
Gly Gln Leu Ala Asp Leu Arg Leu Glu Leu Asp Lys Val Ala Lys Glu
100 105 110
His Asn Ala Val Ala Val Ile Ser Ala Gly Trp Asp Pro Gly Thr Asp
115 120 125
Ser Met Val Arg Cys Met Phe Glu Phe Met Ala Pro Lys Gly Ile Thr
130 135 140
Tyr Thr Asn Phe Gly Pro Gly Met Ser Met Gly His Ser Val Ala Val
145 150 155 160
Lys Ala Val Lys Gly Val Lys Asn Ala Leu Ser Met Thr Ile Pro Leu
165 170 175
Gly Thr Gly Val His Arg Arg Met Val Tyr Val Glu Leu Glu Pro Gly
180 185 190
Ala Asp Phe Ala Gln Val Glu Lys Ala Val Lys Thr Asp Pro Tyr Phe
195 200 205
Val Lys Asp Glu Thr His Val Ile Gln Val Glu Asp Val Asp Ala Leu
210 215 220
Ile Asp Met Gly His Gly Val Leu Met Glu Arg Lys Gly Val Ser Gly
225 230 235 240
Gly Thr His Asn Gln Leu Leu Ser Phe Ser Met Arg Ile Asn Asn Pro
245 250 255
Ala Leu Thr Ala Gln Ile Met Val Ala Ser Ala Arg Ala Ser Val Lys
260 265 270
Gln Lys Pro Gly Ala Tyr Thr Met Ile Gln Ile Pro Ile Ile Asp Tyr
275 280 285
Met Tyr Gly Asp Pro Asp Glu Ile Ile Arg Gln Leu Val
290 295 300
<210> 3
<211> 326
<212> PRT
<213> Bacillus sphaericus
<400> 3
Met Ser Ala Ile Arg Val Gly Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
1 5 10 15
Gly Val Glu Phe Ala Ile Ser Gln Asn Pro Asp Met Glu Leu Val Ala
20 25 30
Val Phe Thr Arg Arg Asp Pro Ser Thr Val Ser Val Ala Ser Asn Ala
35 40 45
Ser Val Tyr Leu Val Asp Asp Ala Glu Lys Phe Gln Asp Asp Ile Asp
50 55 60
Val Met Ile Leu Cys Gly Gly Ser Ala Thr Asp Leu Pro Glu Gln Gly
65 70 75 80
Pro His Phe Ala Gln Trp Phe Asn Thr Ile Asp Ser Phe Asp Thr His
85 90 95
Ala Lys Ile Pro Glu Phe Phe Asp Ala Val Asp Ala Ala Ala Gln Lys
100 105 110
Ser Gly Lys Val Ser Val Ile Ser Val Gly Trp Asp Pro Gly Leu Phe
115 120 125
Ser Leu Asn Arg Val Leu Gly Glu Ala Val Leu Pro Val Gly Thr Thr
130 135 140
Tyr Thr Phe Trp Gly Asp Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Val
145 150 155 160
Arg Arg Ile Glu Gly Val Lys Asn Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ile
165 170 175
Lys Asp Ala Val Glu Arg Val Arg Asn Gly Glu Asn Pro Glu Leu Thr
180 185 190
Thr Arg Glu Lys His Ala Arg Glu Cys Trp Val Val Leu Glu Glu Gly
195 200 205
Ala Asp Ala Pro Lys Val Glu Gln Glu Ile Val Thr Met Pro Asn Tyr
210 215 220
Phe Asp Glu Tyr Asn Thr Thr Val Asn Phe Ile Ser Glu Asp Glu Phe
225 230 235 240
Asn Ala Asn His Thr Gly Met Pro His Gly Gly Phe Val Ile Arg Ser
245 250 255
Gly Glu Ser Gly Ala Asn Asp Lys Gln Ile Leu Glu Phe Ser Leu Lys
260 265 270
Leu Glu Ser Asn Pro Asn Phe Thr Ser Ser Val Leu Val Ala Tyr Ala
275 280 285
Arg Ala Ala His Arg Leu Ser Gln Ala Gly Glu Lys Gly Ala Lys Thr
290 295 300
Val Phe Asp Ile Pro Phe Gly Leu Leu Ser Pro Lys Ser Ala Ala Gln
305 310 315 320
Leu Arg Lys Glu Leu Leu
325
<210> 4
<211> 320
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 4
Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
1 5 10 15
Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
20 25 30
Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp
35 40 45
Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
50 55 60
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala
65 70 75 80
Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro
85 90 95
Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
100 105 110
Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg
115 120 125
Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp
130 135 140
Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro
145 150 155 160
Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu
165 170 175
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr
180 185 190
His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg
195 200 205
Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu
210 215 220
Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr
225 230 235 240
Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly
245 250 255
Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
260 265 270
Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met
275 280 285
Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro
290 295 300
Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val
305 310 315 320
<210> 5
<211> 297
<212> PRT
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 5
Met Asp Lys Leu Arg Val Ala Val Val Gly Tyr Gly Asn Val Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Ala Leu Glu Ala Val Gln Ala Ala Pro Asp Met Glu Leu Val Gly
20 25 30
Val Val Arg Arg Lys Val Leu Ala Ala Thr Pro Pro Glu Leu Thr Gly
35 40 45
Val Arg Val Val Thr Asp Ile Ser Gln Leu Glu Gly Val Gln Gly Ala
50 55 60
Leu Leu Cys Val Pro Thr Arg Ser Val Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Met
65 70 75 80
Leu Arg Arg Gly Ile His Thr Val Asp Ser Tyr Asp Ile His Gly Asp
85 90 95
Leu Ala Asp Leu Arg Arg Arg Leu Asp Pro Val Ala Arg Glu His Gly
100 105 110
Ala Ala Ala Val Ile Ser Ala Gly Trp Asp Pro Gly Thr Asp Ser Ile
115 120 125
Ile Arg Ala Leu Leu Glu Phe Met Ala Pro Lys Gly Ile Thr Tyr Thr
130 135 140
Asn Phe Gly Pro Gly Met Ser Met Gly His Ser Val Ala Val Lys Ala
145 150 155 160
Ile Pro Gly Val Arg Asp Ala Leu Ser Met Thr Ile Pro Ala Gly Met
165 170 175
Gly Val His Lys Arg Ala Val Tyr Val Glu Leu Glu Pro Gly Ala Asp
180 185 190
Phe Ala Glu Val Glu Arg Ala Ile Lys Thr Asp Pro Tyr Phe Val Arg
195 200 205
Asp Glu Thr Arg Val Thr Gln Val Glu Ser Val Ser Ala Leu Met Asp
210 215 220
Val Gly His Gly Val Val Met Glu Arg Lys Gly Val Ser Gly Ala Thr
225 230 235 240
His Asn Gln Leu Phe Arg Phe Glu Met Arg Ile Asn Asn Pro Ala Leu
245 250 255
Thr Ala Gln Val Met Val Ala Ala Leu Arg Ala Ala Ala Arg Pro Gly
260 265 270
Cys Tyr Thr Met Ile Glu Ile Pro Val Ile Asp Tyr Leu Pro Gly Asp
275 280 285
Arg Glu Ala Trp Ile Arg Lys Leu Val
290 295
<210> 6
<211> 326
<212> PRT
<213> Ureibacillus thermosphaericus
<400> 6
Met Ser Lys Ile Arg Ile Gly Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
1 5 10 15
Gly Val Glu Ala Ala Ile Gln Gln Asn Pro Asp Met Glu Leu Val Ala
20 25 30
Val Phe Thr Arg Arg Asp Pro Lys Thr Val Ala Val Lys Ser Asn Val
35 40 45
Lys Val Leu His Val Asp Asp Ala Gln Ser Tyr Lys Asp Glu Ile Asp
50 55 60
Val Met Ile Leu Cys Gly Gly Ser Ala Thr Asp Leu Pro Glu Gln Gly
65 70 75 80
Pro Tyr Phe Ala Gln Tyr Phe Asn Thr Ile Asp Ser Phe Asp Thr His
85 90 95
Ala Arg Ile Pro Asp Tyr Phe Asp Ala Val Asn Ala Ala Ala Glu Gln
100 105 110
Ser Gly Lys Val Ala Ile Ile Ser Val Gly Trp Asp Pro Gly Leu Phe
115 120 125
Ser Leu Asn Arg Leu Leu Gly Glu Val Val Leu Pro Val Gly Asn Thr
130 135 140
Tyr Thr Phe Trp Gly Lys Gly Val Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Ile
145 150 155 160
Arg Arg Ile Gln Gly Val Lys Asn Ala Val Gln Tyr Thr Ile Pro Ile
165 170 175
Asp Glu Ala Val Asn Arg Val Arg Ser Gly Glu Asn Pro Glu Leu Ser
180 185 190
Thr Arg Glu Lys His Ala Arg Glu Cys Phe Val Val Leu Glu Glu Gly
195 200 205
Ala Asp Pro Ala Lys Val Glu His Glu Ile Lys Thr Met Pro Asn Tyr
210 215 220
Phe Asp Glu Tyr Asp Thr Thr Val His Phe Ile Ser Glu Glu Glu Leu
225 230 235 240
Lys Gln Asn His Ser Gly Met Pro His Gly Gly Phe Val Ile Arg Ser
245 250 255
Gly Lys Ser Asp Glu Gly His Lys Gln Ile Ile Glu Phe Ser Leu Asn
260 265 270
Leu Glu Ser Asn Pro Met Phe Thr Ser Ser Ala Leu Val Ala Tyr Ala
275 280 285
Arg Ala Ala Tyr Arg Leu Ser Gln Asn Gly Asp Lys Gly Ala Lys Thr
290 295 300
Val Phe Asp Ile Pro Phe Gly Leu Leu Ser Pro Lys Ser Pro Glu Asp
305 310 315 320
Leu Arg Lys Glu Leu Leu
325
<210> 7
<211> 906
<212> DNA
<213> Thermosyntropha lipolytica
<400> 7
atgggtgaga agattcgcgt ggcaattgtt ggctacggca atatcggccg ctacgcttta 60
gatgccatta aagccgcccc ggatatggaa ctggccggtg ttgtgcgtcg tagcagctct 120
ttaggcgata aaccggcaga actggccgat gtgccggtgg tgggcagcat caaagagctg 180
accggtgtga aagtggcttt attatgtaca ccgacccgca gtgtgccgga gtatgcccgt 240
gaaattctgg ctttaggcat taataccgtg gatagctatt ctattcacgg ccagctggca 300
gatttacgtt tagaactgga taaagtggcc aaggagcaca atgcagtggc cgtgattagc 360
gctggttggg atccgggtac cgatagcatg gtgcgttgca tgttcgagtt tatggccccg 420
aaaggcatta cctacaccaa tttcggcccg ggtatgtctt taggtcatag tggtgccgtg 480
aaagccgtga aaggcgtgaa gaacgcttta agcatgatta tcccgctggg taccggcgtt 540
caccgcatga tggtgtatgt ggaactggaa ccgggtgccg attttgccca agttgaaaaa 600
gccgtgaaga ccgatccgta cttcgtgaag gacgagaccc acgtgattca agttgaggat 660
gtggatgctt taatcgatat gggtaacggc gtgctgatgg aacgtaaagg cgtgagcggc 720
ggcacccata accagctgct gagctttagc atgcgcatca acaaccccgc tctgaccgcc 780
cagattatgg tggccagtgc ccgtgccagc gtgaaacaga aaccgggtgc ctacaccatg 840
atccagatcc cgatcattga ctatatgtat ggcgatccgg atgaaatcat ccgccaactg 900
gtttaa 906
<210> 8
<211> 301
<212> PRT
<213> Thermosyntropha lipolytica
<400> 8
Met Gly Glu Lys Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Ile Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Ala Leu Asp Ala Ile Lys Ala Ala Pro Asp Met Glu Leu Ala
20 25 30
Gly Val Val Arg Arg Ser Ser Ser Leu Gly Asp Lys Pro Ala Glu Leu
35 40 45
Ala Asp Val Pro Val Val Gly Ser Ile Lys Glu Leu Thr Gly Val Lys
50 55 60
Val Ala Leu Leu Cys Thr Pro Thr Arg Ser Val Pro Glu Tyr Ala Arg
65 70 75 80
Glu Ile Leu Ala Leu Gly Ile Asn Thr Val Asp Ser Tyr Ser Ile His
85 90 95
Gly Gln Leu Ala Asp Leu Arg Leu Glu Leu Asp Lys Val Ala Lys Glu
100 105 110
His Asn Ala Val Ala Val Ile Ser Ala Gly Trp Asp Pro Gly Thr Asp
115 120 125
Ser Met Val Arg Cys Met Phe Glu Phe Met Ala Pro Lys Gly Ile Thr
130 135 140
Tyr Thr Asn Phe Gly Pro Gly Met Ser Leu Gly His Ser Gly Ala Val
145 150 155 160
Lys Ala Val Lys Gly Val Lys Asn Ala Leu Ser Met Ile Ile Pro Leu
165 170 175
Gly Thr Gly Val His Arg Met Met Val Tyr Val Glu Leu Glu Pro Gly
180 185 190
Ala Asp Phe Ala Gln Val Glu Lys Ala Val Lys Thr Asp Pro Tyr Phe
195 200 205
Val Lys Asp Glu Thr His Val Ile Gln Val Glu Asp Val Asp Ala Leu
210 215 220
Ile Asp Met Gly Asn Gly Val Leu Met Glu Arg Lys Gly Val Ser Gly
225 230 235 240
Gly Thr His Asn Gln Leu Leu Ser Phe Ser Met Arg Ile Asn Asn Pro
245 250 255
Ala Leu Thr Ala Gln Ile Met Val Ala Ser Ala Arg Ala Ser Val Lys
260 265 270
Gln Lys Pro Gly Ala Tyr Thr Met Ile Gln Ile Pro Ile Ile Asp Tyr
275 280 285
Met Tyr Gly Asp Pro Asp Glu Ile Ile Arg Gln Leu Val
290 295 300
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
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<222> (1)..(30)
<223> primer
<400> 9
caccatgggt gagaagattc gcgtggcaat 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> primer
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ttaaaccagt tggcggatga tttcatccgg 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
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gctggccgtg aatatcatag ctatccacgg 30
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<213> Thermosyntropha lipolytica
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accggtgtga aagtggcttt attatgtaca ccgacccgca gtgtgccgga gtatgcccgt 240
gaaattctgg ctttaggcat taataccgtg gatagctatg atattcacgg ccagctggca 300
gatttacgtt tagaactgga taaagtggcc aaggagcaca atgcagtggc cgtgattagc 360
gctggttggg atccgggtac cgatagcatg gtgcgttgca tgttcgagtt tatggccccg 420
aaaggcatta cctacaccaa tttcggcccg ggtatgtctt taggtcatag tggtgccgtg 480
aaagccgtga aaggcgtgaa gaacgcttta agcatgatta tcccgctggg taccggcgtt 540
caccgcatga tggtgtatgt ggaactggaa ccgggtgccg attttgccca agttgaaaaa 600
gccgtgaaga ccgatccgta cttcgtgaag gacgagaccc acgtgattca agttgaggat 660
gtggatgctt taatcgatat gggtaacggc gtgctgatgg aacgtaaagg cgtgagcggc 720
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gtttaa 906
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<211> 301
<212> PRT
<213> Thermosyntropha lipolytica
<400> 14
Met Gly Glu Lys Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Ile Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Ala Leu Asp Ala Ile Lys Ala Ala Pro Asp Met Glu Leu Ala
20 25 30
Gly Val Val Arg Arg Ser Ser Ser Leu Gly Asp Lys Pro Ala Glu Leu
35 40 45
Ala Asp Val Pro Val Val Gly Ser Ile Lys Glu Leu Thr Gly Val Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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245 250 255
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260 265 270
Gln Lys Pro Gly Ala Tyr Thr Met Ile Gln Ile Pro Ile Ile Asp Tyr
275 280 285
Met Tyr Gly Asp Pro Asp Glu Ile Ile Arg Gln Leu Val
290 295 300

Claims (12)

1.一种酶，其具有下述(a)和(b)的特征：
(a)具有可逆地对D-氨基酸进行脱氢的活性；
(b)是具有与序列号2的氨基酸序列的同一性为80％以上的氨基酸序列的多肽的六聚体。
2.根据权利要求1所述的酶，其具有由2-氧代丁二酸合成D-天冬氨酸的活性。
3.根据权利要求1或2所述的酶，其还具有下述特征(c)：
(c)能将NADH和NADPH这两者用作辅酶。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的酶，其还具有下述特征(d)：
(d)以meso-二氨基庚二酸为底物、以NAD+为辅酶的情况下的相对于NAD+的Km值为30mM以下。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的酶，其还具有下述特征(e)：
(e)以meso-二氨基庚二酸为底物的情况下的最适活性pH为10.5。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的酶，其还具有下述特征(f)：
(f)以meso-二氨基庚二酸为底物的情况下的最适活性温度为55度。
7.根据项1～3中任一项所述的酶，其在与序列号2的氨基酸序列的同一性为80％以上的氨基酸序列中，具有选自由Asp94Ser、Met154Leu、Val158Gly、Thr173Ile、Arg183Met以及His229Asn构成的组中的一个以上氨基酸置换。
8.一种多核苷酸，其对权利要求1～7中任一项的酶进行编码。
9.一种载体，其整合有权利要求8所述的多核苷酸。
10.一种转化体，其包含权利要求9所述的载体。
11.一种权利要求1～5中任一项所述的酶的制造方法，其包括对权利要求10所述的转化体进行培养。
12.一种使权利要求1～7中任一项所述的酶作用于D-氨基酸来制造2-氧代酸的方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104350147A (zh) * 2012-04-20 2015-02-11 赢创工业集团股份有限公司 Nadp依赖性丙氨酸脱氢酶
CN105821014A (zh) * 2015-01-07 2016-08-03 中国科学院天津工业生物技术研究所 嗜热共生杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104350147A (zh) * 2012-04-20 2015-02-11 赢创工业集团股份有限公司 Nadp依赖性丙氨酸脱氢酶
CN105821014A (zh) * 2015-01-07 2016-08-03 中国科学院天津工业生物技术研究所 嗜热共生杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "NCBI Reference Sequence: WP_073090506.1", 《NCBI》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112746061A (zh) * 2021-02-23 2021-05-04 江南大学 内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用

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