WO2007066430A1 - ペプチドの製造法 - Google Patents

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WO2007066430A1
WO2007066430A1 PCT/JP2006/315199 JP2006315199W WO2007066430A1 WO 2007066430 A1 WO2007066430 A1 WO 2007066430A1 JP 2006315199 W JP2006315199 W JP 2006315199W WO 2007066430 A1 WO2007066430 A1 WO 2007066430A1
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WO
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protein
dna
peptide
amino acid
glutamyl
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/315199
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kuniki Kino
Yuji Nakazawa
Atsushi Noguchi
Makoto Yagasaki
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the synthetic method is not an economical and efficient method because it requires some kind of sensory / protective work, and the body is also added.
  • a microorganism belonging to the genus Ara ancapsn (Aa an capsn), which is a biogenic substance, has only the activity of synthesizing Ala Alan (Aa Aa) (5 and 6) It has been reported that it has the activity of producing different amino acids and other amino acids (, 7) .
  • Glutathione synthase is linked to the stain (G) of glutain (GC s) at the position. Not only does it generate a glutathione (GC s G), but it also joins the C-terminal annotations of a class of glutaano () to produce a gluta (to) (8). No activity has been reported for linking with the outside of the anode.
  • CA40 gene is a gene that contains white matter that has a functional function, as well as the white matter that is expressed by the CA4 gene in the gene.
  • Larvae containing light, peptic white matter, containing white matter, and traits transformed with the larvae A white matter for a recombinant, a white matter for a white matter, and a transformant or a microorganism for producing a white matter.
  • White matter is generated, accumulated, and more white matter is collected.
  • the microorganisms having the ability to produce white matter of () or the white matter of () above and the above-mentioned ANO or ANO and ANO are present in an aqueous solution to produce, accumulate, and Made to collect.
  • Anoic acid is ara, gutta, gutta, li, ai, sine, pun, alan, toppan, on, sen, on, stain, asuragine, nin, gin, Agin, Jin, Asuragine, Anochin, Sen ,, 4, Pun, 3 Pun, Chin, Ton 6 Azo 5 in, N Stain and N
  • Glutanoic acid is a stain and a stain.
  • CA 40 is the CA 40 gene from C. acetum ATCC824, P is the 7-gene, and H ag is the H ag sequence.
  • the above ano acid is composed of a substituted or added ano sequence, and has a white matter having a sex, and has homology on the ano 8 represented by 3.
  • the term “sex” means the activity of forming a bond, the activity of forming a bond between the anoic acid position and an amino acid of another anoic acid, and the C-terminal anodic position of The activity of forming a bond between the carboxylic acid and the amino acid.
  • the above amino acid consists of a substituted or added amino acid sequence
  • the white matter having sex is Moec a Conng a abo ao man a Th dEd on Cod p ngHabo abo ao Pess (20001) (bottom, lang 3), C en Po ocos nMoec a Boog JohnWeons 1987 1997) (bottom, camps in kira iodi), N cecAcdsResea ch 6487 1982 ) Poc Na Acad c UA 6409 (1982) Gene 315 1985) N cecAcdsResea c h 4431 1985) P oc Na Aca c UA 488 1985), for example, by introducing a site mutation into a protein consisting of an amino acid sequence represented by [0115]
  • the number of anoic acid to be substituted or added is not particularly limited.
  • amino acid on the amino acid sequence represented by is substituted or added, and it means that the amino acid may be substituted or added in the same position, or a plurality of amino acids may be substituted or added. .
  • substitution or addition may occur simultaneously, and the substituted or added anoic acid may be natural or non-natural.
  • Ano asuragin, asuragin, agin, gutan, gutan, kun, histine, soin, inn, gin, on, alan, pun, strig
  • There are various types such as on, on, top, bottom, stain, etc.
  • the white matter of Ming in order for the white matter of Ming to have sex, it has the sequence of amino acids represented by the sequence, or 8 above, preferably 9 above, compared with the amino acid represented by the sequence. It is desirable that they have a homology of over 94, more preferably over 98, and most preferably over 99.
  • the homology of the amino acid sequence can be determined by using the algorithm B A TP o Na Aca c U A 5873 (1993) or A TAMehodsEnz o ⁇ 83 63 (1990) by KanandA h. Based on this asm BAT, programs called BATN and BA TX have been developed. Mo Bo 215 4103 1990) When the base sequence is analyzed by BA TN based on BAT, the lamella is For example, co e 0 wo d ngh 12 Also, when analyzing an array by B A TX based on B A T, the lamella is, for example. . . 50, w. dengh 3 When using B A T and Gapped B A T programs, use the program parameters. The physical method of these methods is (h p IV wwwncb nmnhgov).
  • a transformant expressing the white matter of Ming is produced by using the method, and the white matter of Ming is produced using the recombinant.
  • the white matter of the present invention and the above-mentioned anno, or anno, preferably an ananocho selected from the group consisting of guananoano, gun, and alan, and P are present in an aqueous solution.
  • a method that can be used to analyze and confirm whether or not is generated and accumulated by using a PC, etc.
  • 002 means that it has a specific base sequence
  • a base sequence having a constant base sequence or a part of the base sequence is useful as a primer for Northern or Southern analysis, while a base sequence for use as an identifier is a primer for PC analysis. It can be of any length. As a group, at least above, preferably above 5, more preferably above, even more preferably above 2, especially above 5
  • the stringent conditions described in 002 are, for example,
  • the conditions for washing the solution in 0 ° C solution at 65C can be mentioned.
  • the stringent conditions can be adjusted according to the depth of the pump and the amount of GC, and can be determined by the method described in Killing King 3. It is also possible to use a lower strength condition, but if the condition is strong, adjust the degree of homing (the lower the degree of homing, the stronger the strength of the condition) and change the condition. Is possible.
  • Examples of the stringent conditions are CE (2 CE is 3 mo sodium, 0.2 mo sodium hydrogen, 0.02 mo EDTA pH74), 0.5 D, 3 0 at 37C in a solution containing 0 salmon and 00 salmon.
  • the conditions described above can also be determined by adding or changing the anti-locking agent used to suppress the background of the experiment. It may also be accompanied by a modification of the requirements of the listed anti-drugs to suit the conditions.
  • the ability to be sized under the above-mentioned stringent conditions is, for example, when using the programs such as BAT and ATA described above and calculating based on the above parameters, the above-mentioned or 2
  • the sequence may have a homology of at least 8, preferably of 9, more preferably of 94, even more preferably of 98, and particularly preferably of 99.
  • the presence or absence of the above-mentioned anno, or anno, preferably an anano selected from the group consisting of anno-ano, announ, and an alun, and P in the water, is generated and accumulated by the PC. It can be confirmed by the method of analysis.
  • the microorganism and the transformant used for A. cerevisiae are not particularly limited as long as it is a microorganism and a transformant having the ability to produce white matter of Ming sunflower, but as an organism, a microorganism belonging to the genus Cos dm is preferable. , More preferably a microbe belonging to the class Axocum (Cos d ace ob c), and more preferably Cos d mace ob c mATCC824, Examples of the transformant include a transformant transformed with the light white matter.
  • the transformant obtained by transforming the host cell by a public method can be used, and the transformant obtained by transforming the host cell by the public method can be used.
  • the present invention is a microorganism belonging to the genus of Cos dm, for example, a Pseudomonas acetacum (Cos dm), which uses a group capable of being based on the base sequence represented by Sequence 2.
  • d ace ob vcm more preferably a Southern lysate for the chromophore of Cos d mace ob vc mATCC824, or a ply that can be based on the base sequence represented by sequence 2.
  • a microorganism belonging to the genus Cos dm more preferably a microorganism belonging to Cos d mace ob vcm, even more preferably a PC PCRP o ocos AcademcPess using the color body of Cos d mace ob vc mATCC824 as a mold. 1990).
  • the base sequence of the array of amino acids represented by the sequence for various gene sequence databases is 8 above, preferably 9 above, more preferably 94 above, and still more preferably 98 above.
  • a sequence having homology over 99 is searched, and based on the base sequence obtained by the search, it is determined by the method described above from the chromophoric C-lyer of the organism having the base sequence. Can also be obtained.
  • the obtained product is cleaved as it is or with an appropriate restriction enzyme, and the resulting product is inserted into a cell by a conventional method, and then the resulting product is introduced into a cell. Then, a commonly used grouping method such as Deoki P. . ⁇ N " ⁇ A.” d ⁇ . ⁇ UA 5463 1977) or App edBos ses 3700DNAAna ze (Apply Io system) can do.
  • the total length can be obtained by Southern edi- tion for the color layer using the.
  • the desired product can be prepared by synthesizing it using the EYE SYSTEMS 8905 type based on the determined base sequence.
  • Examples of the compound obtained as described above include those having the basic sequence represented by Sequence 2.
  • PB esc p K ((stragen) pDRECTN cecAcdsRes 6069 1990) pPCR cp Amp (stratagene), pT7B e (gene), pCR (imbitogen) and pCR TR AP (diamine). Internet) and so on.
  • Examples of 003 include microorganisms belonging to the genus Hia.
  • Hia (Esche chaCo) XB e, Hia X 2 B e, Hia DH, Hia MC 000 Hya ATC 2435, Hia W1485, Hia M09, Hia HB. 01, here N 49, here W3110, here NY49, here MP347, here NM522, here B21, here ME8415.
  • any method can be used as long as the above method is introduced.
  • Hia B 2 pCAC 540 which is a microorganism having an bacterium containing the sequence represented by 2.
  • Transformants and organisms used in If necessary prepare pieces of appropriate length including the white matter-containing portion of light.
  • a transformant with improved white matter can be obtained.
  • An embryo is prepared by inserting the 003 piece into a stream of appropriate expression vector.
  • a transformant producing light white matter can be obtained by introducing the transformant into a host cell compatible with the vector.
  • It may be bacteria, mothers, animals, plants, or any gene capable of expressing a gene of interest.
  • the 003 vector one that is capable of being in a self-sustaining or chromophore in the above cell and that contains a pattern at a position capable of transferring light is used.
  • the body with Ming is a body that is self-sustaining at the same time as, and is also a body composed of peta, bosom, Ming, and transcription. It may contain genes that control the protein.
  • Vectors include pBTac pBTac2 (deviation is normal), p He x (diagnostics), pKK233 2 (a aa iotech), p E28 (inbitogen), pGEMEX (p), pQE 8 (gen), pET 3 pET 2 d ((even deviation), pKYP0 (58 1 1600) pKYP200Ag c Bo Che 669 1984) p A Ag c Bo Che m ⁇ 277 1989) pGE P oc Na Aca c UA 4306 1985) pB esc p K pB esc p K () (stragin), prepared from pT 30 here, M 10g pT 30 (ERMBP 5407) pT 32 here, prepared from M0g pT 32 (E RMBP 5408), published on pPAC31 98 2343), pU Gene 103 1985) pTV28 (Takara Io), pUC 18 (T
  • a plus which is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18) between the start of the insomia (hne Dagano) which is a som train. Transcription is not always necessary in a vector in which the gene is bound to an expression vector, but it is preferable to place a transcription sequence under the structural gene.
  • pCA 40 can be given as the A-body.
  • XB e here. X 2 Be, Here DH, Here D, Here MC, Here KY3276, Here W1485, Here 9, Here HB 01, Here N 49, Here W311, Here NY49, Here MP347 , Here NM522, Here B21, B s S bs ATCC33712, This um (Ba sme ae), Ctium Im (B eVbac em D hm ATCC 4068, Ct um) -Sevtatikam (B evbac e mSacch.
  • any method can be used as long as the above is introduced. For example, a method of using um ion Poc Na Ac ad c UA 2110 (1972), Putplast (63 248394), N cecAcdsRes, 6127 1988) and the like.
  • an expression vector such as YEp3 ( ATCC37 5 YEp24 (ATCC37051) YCp50 (ATCC37419) pH g pH 5 and the like can be used.
  • the 039 platter use the ones that do not fit. Also, for example, PH5, PGK, aP, ADH, ga, ga0, hitota, M, CUPY, etc. may be mentioned. it can.
  • saccharoses accha omvces
  • bussacces ch zosaccha omvces
  • quices K eo vces
  • tosspons T cho
  • cess cess
  • chia chia
  • nudi Candda
  • Yeast strains belonging to the following are specifically mentioned, and specifically, Saccharomyces cerevisiae (acch omvces Ce evsae), Bussacacces mbé (chzo saccha omvces), Quibeces lactis (Ke omvces ac s), Examples include T chos o on Dans, chwan nomvces avs, Pcha Das os, and Can dda s.
  • Any method can be used as the method for introducing the body into the mother as long as it is introduced into the mother, for example, MethodsEnz mo 194 82 1990), Sprat Poc Na Acad c UA 4889 1984), Chiu. Mu U, Bac eo, 153 63 1983) and the like.
  • pcDNA, pcD M8 (commercially available), pAGE07 (3 22979), pA 33 (2 227075) pCDM8Na e 329 840 1987) pcDNA Amp (imbitogen) pREP 4 (imbitogen) pAGE03 Boche 01307 1987) pAGE20 pAMo, pAMoA, etc.
  • pcDNA, pcD M8 commercially available
  • pAGE07 (2 227075)
  • pcDNA Amp (imbitogen) pREP 4 (imbitogen) pAGE03 Boche 01307 1987)
  • pAGE20 pAMo, pAMoA, etc. can be used.
  • Any animal animal can be used as the 004 type, for example, the E (mmeda ee) gene type of Cytomegavirus (CMV), the V40 type or Toui It is possible to name such as a computer, a hot-potter, and an S-putter. You can also use the E-gene sensor of human CMV together with the pattern.
  • 004 includes Us, rat, Us id, human (Na awa) or KM, human, human blood disease, Acadaza, Is must CH, HBT5637 (63) 299) etc. can be listed as P. 2 NO, etc. as a rat, YB2 0 as a rat, HEK293 (ATCCCR 573) as a human, BA as a human blood disease, CC 7 as an academia, etc. Can be raised.
  • the gene vector and kiwi can be introduced into the cell to obtain the above-mentioned group, and then the cell can be further infected with the virus to produce white matter.
  • Examples of the gene vector used in the method include pV 392 pV 393 pB eBac shift in vitro) and the like.
  • the kiwis there is a virus that is infected by theft at night, such as Outgoer Cacaqua Pod Wis (A og aphaCa onca). cea po hed os s V s) etc. can be used.
  • topor T cho sa mountain egg, derived from a nest
  • Examples include Bix (Bo bvxmo) N4.
  • the expression vector can be, for example, plus, Zyquis vector or the like.
  • any plant may be used as long as it is a plant, and examples thereof include 35 platters of Karawa Zyquis (CaMV) and rice activators.
  • Examples of 004 include plants such as mussel, toto, ginseng, soybean, rape, aa, rice, mu, and oo.
  • Kuta's method can be changed as long as it is a method of introducing a plant into a plant cell, for example, a method of using A obac em (59 140885, Japanese Patent 6078008, International Publication 94 00977). , Cotton (60 251887), the method of using a Tikgun (generator) (2606856, Patent 2517813) and the like.
  • the white matter can be produced by cultivating the transformant obtained by the above method 5 on the ground, producing the white matter of the present invention, accumulating it, and collecting it from the material.
  • the transformant for producing the white matter of 050 is mainly bacteria, mother, animal, plant or plant, but preferably bacteria, more preferably microorganisms belonging to the genus Hia, more preferably here. ⁇ The microorganisms belonging to can be listed.
  • the method for locating the transformant can be carried out in accordance with the usual method used for the host.
  • the substance can be used, it can be used for the decomposition of starch, starch hydrolyzate, and the like, including gust, lactose, and sucrose.
  • organic acids such as ,, and pion, tano, and puno.
  • Examples include inorganic acids such as annua, ammonium, ammonium, ammonium, and ammonium, and organic acids such as ammonium, and other substances, as well as peptone, kiss, kiss, starch, and casein water.
  • inorganic acids such as annua, ammonium, ammonium, ammonium, and ammonium
  • organic acids such as ammonium, and other substances, as well as peptone, kiss, kiss, starch, and casein water.
  • Decomposition, soybean meal and soybean meal water decomposition, various, and their compounds can be used.
  • nickel, nickel, tungsten, magnesium, sodium chloride, gangan, potassium carbonate, or the like it is possible to use nickel, nickel, tungsten, magnesium, sodium chloride, gangan, potassium carbonate, or the like.
  • Inorganic or organic aka ,, carbonate, anan, etc. 005
  • antibiotics such as anne tetracycline may be added to the ground as needed during the feeding.
  • an index may be added to the ground if necessary.
  • soap or the like may be added, and when using a microorganism that has been transformed with an expression vector that uses a vector, you may add it to the Indian site.
  • antibiotics such as canine, pen, and stopin may be added to the soil depending on the nutritional needs.
  • TNM engine
  • g001 M Ry-Technologies
  • ExCe 400 ExCe 4 05 R ions
  • transformants obtained by adding antibiotics such as genin to the ground as the main source of cells, depending on the need for cultivation should be cultivated as cells or divided into cells or cells. You can It is generally used as a land for substitution. ⁇ Anskug (M) land, White e) land, or these grounds with plant horns such as quinine and cytokine added. be able to. 005, usually 3 to 60 under conditions of pH 5 to 9 and 20 to 40C.
  • antibiotics such as canine and ignin may be added to the soil depending on the nutritional needs.
  • the method of producing white matter includes the method of producing it in the host, the method of secreting it in the host, and the method of producing it in the host. Depending on the method selected, the structure of the white matter produced is changed. be able to.
  • the white matter including the white matter of Ming can be produced by adding gnuna before the white matter, so that the white matter can be actively secreted.
  • Genes can also be used to increase production.
  • a gene-introduced animal (transgenic human) or (transdy,) is produced, and these bodies are used to produce white matter of light. It can also be manufactured.
  • the transgenic human body introduced with the body for example, Ming or used for Ming, is bred and the Ming white matter is collected.
  • White matter can be produced by producing, accumulating, and collecting more white matter.
  • An example of a place for producing and accumulating the white matter of the product is the product product (63 309192). Any type of animal may be used as the type of animal used in this case. Used.
  • Examples of the method for producing white matter of meitai using 006 body include transgenic substances introduced with the addition of white matter of light (1994), Organization (1995) Tends B. . . hn. ⁇ According to 45 1997), there is a method of producing white matter by producing, accumulating and collecting white matter.
  • the ordinary purification method of elementary enzyme can be used as a method for isolating and purifying the produced white matter of light using the transformant producing white matter of light.
  • the cells when light white matter is produced in a lysed state in cells, after completion, the cells are recovered by centrifugation, and then the cells are collected in a water system, and then the cells are collected by ultrasonication, ultrasonic waves, tips, anton gauze analyzer, a dye, etc. Crush and obtain effluent.
  • the white matter was produced by forming an insoluble substance in the cells, the cells were similarly recovered and then centrifuged to obtain the white matter. After recovering the quality, the white matter solution is solubilized in the white matter.
  • the white matter thus obtained may be, for example, the white matter composed of an array of sequences.
  • Akira white matter is produced as a white matter with a, and the a-body is used as an active ingredient P oc Na Acad c UA 8227 (1989) GenesDeveop 1288 (1990), as white matter with apo. It is also possible to purify the product by using the metallurgy having a porosity. In addition, it is possible to use body to body for white matter.
  • the white matter can be produced by a synthetic method such as oc (omechi okibo) and oc (oki cab) based on the obtained white matter anomaly. Also, AdvancedChemTec, Kin Phamaca Po enTechnoog ns men y hece Ve It can also be synthesized by using ga, Pe ep ve, Shimadzu, etc.
  • the above-mentioned 3 organisms or transformants, or the above-mentioned light white matter, and the above-mentioned ANO or ANO are present in an aqueous solution, and are produced, and are collected to produce a. be able to.
  • the white matter of Ming manufactured by the above method 6 can be used.
  • a microorganism having the ability to produce white matter of light preferably a microorganism belonging to the genus of Cos dm, more preferably a microorganism belonging to the bacterium of Cos d ace ob vc, More preferably, Cos d mace ob vc mATCC824 is cultivated by the method described below, and the obtained product also has a clear white matter that can be obtained by the above method 6.
  • the above is preferable to 3 or, more preferably, the species or 2 species of the amino, or the combination of the amino acids. I can give you.
  • any anoic acid may be used as long as it is an anoic acid selected from ano, gun and alan.
  • allan, gutan, gutan, ng, in, sin, pun, ran, toppan, on, sen, on, stain asuragine, Gin, gin, agin, gin, asuragine, annot, sen ,, 4 pun, 3 pun, chin, ton, 6 azo 5 noin, N stain and N anoic acid You can give such things.
  • anoic acid In the case of a combination of anoic acid, Taano, D Gutaano, (Meth) Gutaano, Anogutaano, (N Mechi) Gutaano, D (8 Mechi) Gutaano, D (Meth) Gutaa It can be selected from the group consisting of non-acids.
  • the types of noise include: stein stain, gluten stain, glutamstein stain, gluten, glutin, glutin, glutin, glutin, glutan e Glutanoic acid selected from the group consisting of methystain and N (guta) ano D-p may be mentioned.
  • any anoic acid selected from the group consisting of ano, gun and alan may be used.
  • Examples of announs include alan, gutan, gutan, nin, in, sine, pun, alan, toppan, on, zen, on, stain, ass, Ragin, N, Jin, Agin, Gin, Asuragin, Anochi, Sen ,, 4, Pun, 3 Pun, Chin, Ton, 6 Azo 5 in, N
  • Examples include stain and N-anoic acid.
  • anode selected from the group consisting of a stay alloy, a gun, an on, a tin, and a stain.
  • ano, or anoic acid can be supplied as a powder or as a liquid to an aqueous body that forms and accumulates pep.
  • Stain can be supplied. Before generating and stacking However, it is trap at the same time as the formation of Pep.
  • the white matter of Ming is as or is 0. 01 to 09 per mg of anod, preferably 0.
  • the above-mentioned anoic acid is added to the aqueous solution at the initial stage or during the reaction so that the amount thereof is 0.1 to 50 g, preferably 0.2 to 200 g, respectively.
  • P can be used as a green onion in 005, and P is used every 0.5 m to mo.
  • P can be supplied as powder or as a liquid to the aqueous body that produces and accumulates it.However, for example, P living using glycolytic enzymes, etc. It is also possible to supply P by adding (converting activity) to the body. Physically, there can be mentioned a method of adding Co Vnebacea mona enes, Bosc Bo echno Bochem ⁇ 644 (20001), a method of adding pononic acid, Bosc Boeng ⁇ 557 (2001) and the like.
  • the aqueous body used in 007 may be a body having the following components and compositions as long as it does not inhibit the reaction of pep, for example, water, phosphate, carbonate, acid salt, sodium salt, kun salt. , Liquids such as toss can be used. In addition, it may contain methano, tano and other types of ate, thy and other steres, ace and other tones, and aceto and other aldehydes.
  • 007 aqueous, pH 5-11, preferably pH 6-0 20-50 C, preferably 25-.
  • 45C it is between 2 and 150, preferably between 6 and 120.
  • an announ As manufactured by law, it is a group of announs joined together, or an announ selected from the group consisting of the C-terminal anano, preferably gutaano, gun and alan.
  • Anoic acid selected from the group consisting of Gin, Anochi, Sen ,, 4, Pun, 3 Pun, Chin, Ton, 6 Azo 5 Iin, N Stain, N Anochin, Gun and Aa.
  • an amino acid selected from the group consisting of the stain stain stain allan, the gun, the on, the cenes and the stains.
  • Examples of the microorganisms that can be used in the production of Ming can include those obtained by cultivating the microorganisms that produce white matter of Ming by a method suitable for the growth of the organism. For example, when using Cos d ace ob vcm ATCC824 as a living organism, NBRCmed mNo 807 (popton 15g, isto kisstract 5g, goss 5g, sodium 2.59, stain 0. 59, sigma 0. , The mg pH70 72 ATCCmed 017 (Granbi 5009, N sodium 25m, peptone 309, ischistruct 5g, hydrogen 2cam 5g, 0.025n 4.0m, stain 0. 59, pH 70. ) For 25 to 4 ° C., between, and Gusuck (Becton Dickinson), etc. Examples of the transformant include those obtained by culturing the transformant by the above method 6.
  • an organism or a transformant it is obtained by centrifugation of ,,,,,,, of ,, or, obtained by centrifuging, or, of ,,,,, and Containing live bacteria that retain the same function as , Mechanical, and treated body
  • the above-mentioned anomones used for the base, or the anano are the same compounds as in the above ().
  • the amount of the source varies depending on, for example, or is added in an amount of 5 to 09, preferably 10 to 400 mg by weight per 9 of seed.
  • the above ano or anoic acid as 080 can be supplied to the aqueous solution in the same manner as the above ().
  • P can be present in water and used as a green onion.
  • the body As the body, the body of the above () can be used, and in addition, the body of the microorganism or transformant used can also be used. In response to 008, the same cases as above () can be raised.
  • the bacterium Acecum ATCC824 was tested for NBRCmed mNo807 (15 g of popton, 5 g of ischistruct, 5 g of goose, 259 of sodium, 0-5 g of stain, 0.5 g of sodium, and the mg pH of 7072). Then, it was anaerobically cultivated at 37C.
  • the ply has a base sequence containing an Nco sequence at the 5 end of cadmium.
  • a ply is a complementary nucleotide sequence containing the C ano sequence of the CA 450 gene to which a nucleotide sequence containing the Xho sequence is added to the 5'end.
  • PC was performed using the above ply and ply in the width of the same gene fragment of the 008 CA 450 gene, and the chromosome of the C. acetaecum ATCC824 strain as a template.
  • PC is 0,19 chromophore, 0,5 mo ply, 2 ns KODp sDNA polymerase (Oyobo), 5 KODp sDNA polymerase 0 (Oyobo), 200 mo dNTP (dATP 5 containing dGTP dCTP and dT TP) was prepared, and after adding 135 at 95C, adding 30 at 95C, 45 at 52C, and g0 at 68C were repeated 25 times, and further 3 at 68C. I went
  • the 0.9 pT vector pET 2 d ((gene)) was cleaved with restriction Nco and Xho, the fragments were separated by agarose, and the 5.4 kb fragment was recovered by the same method as above.
  • a fragment of about 1 kb containing the obtained A gene and a 5.4 kb fragment of the expression vector pET 2 d obtained above was used in a ligation kit (Takara
  • pA40 was used to convert Hia ⁇ B 2 (DE3) (Zin) by the method using um ion, and the transformant was applied to the B medium containing 50 gm of N, followed by overnight incubation at 30C. did.
  • Hear B 2 (DE3) (possessing p A 40 obtained in ⁇ B 2 (DE3) pCA 40) was inoculated into a test tube with 50m of B containing 3m of B, and was nourished 16 times at 30C. 100 of the nutrient solution thus obtained was inoculated into a 500 m lass inhabited by B area 0. After culturing for 2 hours at 37 ° C, the soap is adjusted so that the end is mmo.
  • HsT ap Hs white matter kit, aion
  • the purified Hs white matter obtained in 2 was prepared as a reaction consisting of 65 xg 50 mm Ts HC (pH80) 25 mmo 5 mmo ATP 25 mmo G Cs and 5 mmo anoic acid, and reacted at 37 C. After completion of the reaction, the reaction line was confirmed by quantifying the amount of released P (mede, cous) during the reaction, and analyzed by using the reaction MADTM.

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Abstract

　本発明によれば、ペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いたペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、該蛋白質を用いたペプチドの製造法、および該蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に用いたペプチドの製造法が提供される。

Description

明 細 書
ペプチドの製造法
技術分野
[0001] 本発明は、ペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする DNA、該 D NAを含有する組換え体 DNA、該組換え体 DNAで形質転換された形質転換体、該 蛋白質の製造法、該蛋白質を用いたペプチドの製造法、該蛋白質を生産する微生 物または形質転換体を用いたペプチドの製造法に関する。
背景技術
[0002] ペプチドの大量合成法につ!ヽては、化学合成法 (液相法、固相法）、酵素的合成 法および DNA組換え法を用いた生物学的合成法が知られている。現在、数十残基 以上の長鎖のペプチドに関しては酵素的合成法あるいは生物学的合成法が主に用 いられ、 2〜数残基の短鎖のペプチドに関しては化学合成法と酵素的合成法が主に 用いられている。
化学合成法による短鎖ペプチドの合成では、官能基の保護'脱保護などの操作が 必要であり、またラセミ体も副生されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法 とはいえない。
[0003] 酵素法による短鎖ペプチドの合成に関しては、蛋白質分解酵素（プロテアーゼ)の 逆反応を利用した方法 (非特許文献 1参照)、エステル交換酵素 (特許文献 1〜3、非 特許文献 2)を利用する方法、耐熱性アミノアシル t-RNA合成酵素を利用する方法（ 特許文献 4〜7)、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、 NRPSと称す)を利用す る方法 (非特許文献 3、 4および特許文献 8、 9参照）が知られている。
[0004] しかし、蛋白質分解酵素の逆反応を利用する方法では、基質となるアミノ酸の官能 基の保護'脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反 応の阻止が困難といった問題点がある。エステル交換酵素を利用する方法では、基 質となるアミノ酸のエステルイ匕が必要であり、効率化および基質となるアミノ酸エステ ルと生成したペプチドの分解による収率低下と 、つた問題点がある。耐熱性アミノア シル t-RNA合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、目的産物以外の副生反応 の阻止が困難という問題点がある。 NRPSを利用する方法に関しては、酵素分子が巨 大なために DNA組換え法を用いて該酵素を発現することが困難であること、補酵素 である 4' ホスフォパンテティン（4'-phosphopantetheine)の供給が必要であり、効率 的な製造法とはいえない。
[0005] 一方、酵素分子量力 SNRPSより小さぐ補酵素である 4'-phosphopantetheineを必要と しな ヽ γ—グノレタミノレシスティンシンセターゼ ( y -glutamylcysteine synthetase)、 D- ァラ-ルー D-ァラニン（D- Ala— D- Ala)リガーゼ（D- Ala— D- Ala ligase)、ポリ一 γ - グルタミン酸シンセターゼ（poly- y -glutamate synthetase)等の一群のペプチドシン セターゼも知られている。これらの酵素の殆どは D-アミノ酸を基質に用いる、または y位のカルボキシル基でのペプチド結合の形成を触媒する等の特徴を有するため、 L-アミノ酸の α位カルボキシル基でペプチド結合する短鎖ペプチドの合成に用いる ことはできない。
[0006] L-アミノ酸の a位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性が知られて 、るのは バシリシン合成酵素とグルタチオンシンセターゼ（glutathione synthetase)のみである 。バチルス属に属する微生物由来のバシリシン合成酵素は、ジペプチド抗生物質で あるバシリシン [L-ァラ-ル L-アンチカプシン（L-Ala - L-anticapsin) ]及び L-ァラ -ル— L-ァラニン (L-Ala— L-Ala)を合成する活性を有する（非特許文献 5および 6 参照）のみでなぐ多様な組合せの同一または異なる遊離のアミノ酸力も種々のジぺ プチドを生成する活性を有することが報告されている (特許文献 10、非特許文献 7)。 グルタチオンシンセターゼは、 γ -L-グルタミル- L-システィン（ γ - L- Glu- L- Cys)の システィン残基とグリシン（Gly)を a位で連結してダルタチオン（ γ - L-Glu-L-Cys-Gl y)を生成するだけでなぐ数種類の γ -L-ダルタミルアミノ酸 (ジペプチド）の C末端の アミノ酸残基とグリシンを連結して γ -L-ダルタミルジペプチド（トリペプチド)を生成す る（非特許文献 8)力 γ -L-ダルタミルアミノ酸とグリシン以外の L-アミノ酸とを連結す る活性は報告されていない。
[0007] これらの酵素を用いて、種々のジペプチドやトリペプチドを生産することが可能であ るが、これらの酵素の基質特異性に起因し、生成効率が十分でない短鎖ペプチドも あるため、これらの酵素とは基質特異性が異なる新たな短鎖ペプチド合成酵素が求 められている。
クロストリジゥム.ァセトブチリカム ATCC824の染色体 DNAの塩基配列、および遺伝 子の推定塩基配列とも公知である (非特許文献 9参照)。しかしながら、該遺伝子中 の CAC1540遺伝子にコードされる蛋白質の機能はもちろん、 CAC1540遺伝子が実 際に機能を有する蛋白質をコードする遺伝子である力否力も知られていない。
特許文献 1：国際公開第 2003/010187号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 2003/010307号パンフレット
特許文献 3：国際公開第 2003/010189号パンフレット
特許文献 4：特開昭 58-146539号公報
特許文献 5：特開昭 58-209991号公報
特許文献 6：特開昭 58-209992号公報
特許文献 7：特開昭 59-106298号公報
特許文献 8：米国特許第 5795738号
特許文献 9：米国特許第 5652116号
特許文献 10：国際公開第 2004/058960号パンフレット
非特許文献 1 :J. Biol. Chem., 119, 707-720 (1937)
非特許文献 2 : J. BiotechnoL, 115, 211-220 (2005)
非特許文献 3 : Chem. Biol, 7, 373-384 (2000)
非特許文献 4 : FEBS Lett., 498, 42-45 (2001)
非特許文献 5 : J. Ind. Microbiol, 2, 201-208 (1987)
非特許文献 6 : Enzyme Microb. TechnoL, 29, 400-406 (2001)
非特許文献 7 : J. BacterioL, 187, 5195-5202 (2005)
非特許文献 8 : J. Biol. Chem., 254, 5184-5190 (1979)
特干文献 9： http:// gi D . genes . nig. ac.jp/ single/ index.php?spid=Cace— ATし C824 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明の目的は、ペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする DNA 、該 DNAを含有する組換え体 DNA、該組換え体 DNAで形質転換された形質転換 体、該形質転換体等を用いた該蛋白質の製造法、該蛋白質を用いたペプチドの製 造法、および該蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵素源に 用いたペプチドの製造法を提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明は、以下の（1)〜（14)に関する。
(1)以下の [1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質。
[1]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加したアミノ酸配列力もなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
[3]配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
(2)以下の [1]〜 [3]の!、ずれかに記載の DNA。
[1]上記（1)の蛋白質をコードする DNA
[2]配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA
[3]配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ントな条件下でハイブリダィズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードす る DNA
(3)上記（2)の DNAを含有する組換え体 DNA。
(4)上記（3)の組換え体 DNAを有する形質転換体。
(5)形質転換体が微生物を宿主として得られる形質転換体である、上記 (4)の形質 転換体。
(6)微生物がエシ リヒア (Escherichia)属に属する微生物である、上記（5)の形質転 換体。
(7)上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に 該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（1)の蛋白質の 製造法。
(8)上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記 (4)〜（6)の 、ずれか 1つの形質転換体である、上記（7)の蛋白質の製造法。 (9)上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物の 処理物または上記（1)の蛋白質と、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸およびジぺプチ ドとを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から 該ペプチドを採取するペプチドの製造法。
(10)アミノ酸が L-アミノ酸、グリシン、および |8—ァラニン力 なる群力も選ばれるアミ ノ酸である上記（9)のペプチドの製造法。
(11) L-アミノ酸が L-ァラニン、 L-グルタミン、 L-グルタミン酸、 L -パリン、 L-ロイシン、 L-イソロイシン、 L-プロリン、 L-フエ二ルァラニン、 L-トリプトファン、 L-メチォニン、 L- セリン、 L-スレオニン、 L-システィン、 L-ァスパラギン、 L-チロシン、 L-リジン、 L-アル ギニン、 L-ヒスチジン、 L-ァスパラギン酸、 L- α -アミノブチル酸、 L-ァザセリン、 L-テ ァニン、 L- 4-ヒドロキシプロリン、 L- 3-ヒドロキシプロリン、 L-オル二チン、 L-シトルリン 、 L- 6-ジァゾ -5-ォキソ -ノルロイシン、 Ν-ァセチル- L-システィンおよび Ν-ァセ チル -L- aアミノブチル酸力 なる群力 選ばれる L-アミノ酸である上記（10)のぺプ チドの製造法。
( 12)ジペプチドが γ -L-グルタミルアミノ酸、 γ -D-グルタミルアミノ酸、 γ - L- ( α -メ チル）グルタミルアミノ酸、 β -ァミノグルタリルアミノ酸、 γ -L- (Ν-メチル）グルタミルァ ミノ酸、 γ -DL- ( β -メチル）ダルタミルアミノ酸、 γ - L- ( γ -メチル）ダルタミルアミノ酸 力もなる群力 選ばれるジペプチドである上記 (9)のペプチドの製造法。
(13) γ -L-グルタミルアミノ酸が γ -L-グルタミル- L-システィン、 γ - L-グルタミル- L- a -アミノブチル酸、 γ - L-グルタミル- L-S-メチルシスティン、 γ -L-グルタミル- L-セ リン、 γ -L-グルタミル- L-ァラニン、 γ -L-グルタミル- L-ノルパリン、 γ - L-グルタミル -L-ハイポグリシン、 γ -L-グルタミル- β -シァノアラニン、 γ - L-グルタミル- Se-メチ ルセレノシスティン、 N- ( γ -L-ダルタミル）ァミノ- D-プロリンからなる群から選ばれる γ -L-ダルタミルアミノ酸である上記 (12)のペプチドの製造法。
(14)上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記 (4)〜（6)の 、ずれか 1つに記載の形質転換体である、上記 (9)〜（13)のいずれか 1つに記載の記載のぺ プチドの製造法。
発明の効果 [0010] 本発明によりペプチド合成活性を有する蛋白質を製造することができ、該蛋白質ま たは該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体または微生物を用いて種々のべ プチドを製造することができる。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]プラスミド pCAC1540の構築過程を示す図である。
符号の説明
[0012] 図中の CAC1540は、クロストリジゥム 'ァセトブチリカム ATCC824株由来の
遺伝子、 PIZは T7プロモーター遺伝子、 His 'tagは His 'tag配列を表す。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 1.本発明の蛋白質
本発明の蛋白質としては、
[1]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[2]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加したアミノ酸配列力 なり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質、および [3]配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
をあげることができる。
[0014] 本明細書におけるペプチド合成活性とはペプチド結合を形成する活性であり、アミ ノ酸の OC位のカルボキシル基と他のアミノ酸のァミノ基との間のペプチド結合を形成 する活性、およびジペプチドの C末端のアミノ酸残基の α位のカルボキシル基とアミ ノ酸のアミノ基との間のペプチド結合を形成する活性をいう。
配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または 付加されたアミノ酸配列力もなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質は、 Molecul ar cloning, a laboratory manual, Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (以下、モレキュラ^ ~ ·クロー-ング第 3版と略す）、 Current Protocols in Molec ular Biology, John Wiley & Sons (1987- 1997) (以下、カレント'プロトコールズ'イン' モレキュラ^ ~ ·バイオロジーと略す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Researc h, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特 異的変異導入法を用いて、例えば配列番号 1で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白 質をコードする DNAに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる
[0015] 欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されな 、が、上記の部位特異 的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、 1個か ら数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜： L0個、さらに好ましくは 1〜5個で ある。
配列番号 1で表されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付 カロされたとは、同一配列中の任意の位置において、 1または複数のアミノ酸が欠失、 置換または付加されて 、てもよ 、。
[0016] 欠失、置換または付カ卩は同時に生じてもよぐ置換または付加されるアミノ酸は天然 型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、 Lーァラニン、 Lーァスパラギン 、 L ァスパラギン酸、 L アルギニン、 L グルタミン、 L グルタミン酸、グリシン、 L ヒスチジン、 L—イソロイシン、 L一口イシン、 L—リジン、 L メチォニン、 L—フエ二 ルァラニン、 L—プロリン、 Lーセリン、 Lースレオニン、 L—トリプトファン、 Lーチロシン 、 L—パリン、 L システィンなどがあげられる。
[0017] 以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互 に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、ノルパリン、ァラニン、 2-アミノブ タン酸、メチォニン、 0-メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t-ブチルァラニン、シクロへ キシノレァラニン
B群：ァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2-ァミノ アジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、グルタミン
D群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2,4-ジァミノブタン酸、 2,3-ジァミノプロピ オン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン F群：セリン、スレオニン、ホモセリン
G群：フエ-ルァラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質がペプチド合成活性を有するためには、配列番号 1で表され るアミノ酸配列を有するか、または配列番号 1で表されるアミノ酸配列との比較にぉ ヽ て 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 94%以上、さらに好ましくは 98% 以上、特に好ましくは 99%以上の相同性を有していることが望ましい。
[0018] アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAS T[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]や FASTA[Methods EnzymoL, 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLAST Nや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol, 215, 403 (1990) ] 。 BLASTに基づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは 例えば Score = 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによつ てアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えば score=50、 wordlength=3 とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォ ルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http：〃 www.ncbi.nlm. nih.gov.ノ。
[0019] 本発明の蛋白質が、ペプチド合成活性を有する蛋白質であることを確認する手段と しては、例えば DNA組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体を作 製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、本発明の蛋白質と 1種 以上のアミノ酸、またはジペプチドとアミノ酸、好ましくは γ -ダルタミルアミノ酸と L-ァ ミノ酸、グリシン、および j8—ァラニン力 なる群力 選ばれるアミノ酸、および ΑΤΡを 水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にペプチドが生成、蓄積するか否かを HP LC等により分析し、確認する方法をあげることができる。
2.本発明の DNA
本発明の DNAとしては、
[1]上記 1の [1]〜[3]の本発明の蛋白質をコードする DNA、
[2]配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA、または
[3]配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ントな条件下でハイブリダィズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードす る DNA、
をあげることができる。
[0020] ここで!/、う「ノ、イブリダィズする」とは、特定の塩基配列を有する DNAまたは該 DNA の一部に DNAがハイブリダィズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を 有する DNAまたは該 DNAの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解 祈のプローブとして有用である力 S、ハイブリダィゼーシヨンに用いるプローブは PCR 解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さの DNAであってもよい。プ ローブとして用いる DNAとしては、少なくとも 10塩基以上、好ましくは 15塩基以上、 より好ましくは 100塩基以上、さらに好ましくは 200塩基以上、特に好ましくは 500塩 基以上の DNAをあげることができる。
[0021] DNAのハイブリダィゼーシヨン実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー
'クロー-ング第 3版（2001年）、 Methods for General and Molecular Bacteriolgy, AS M Press (1994)、 Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の 他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダィゼーシヨンの条件を決定し、実 験を行うことができる。
[0022] 上記のストリンジェントな条件とは、例えば DNAを固定化したフィルターとプローブ DNAとを 50%ホルムアミド、 5 X SSC (750mMの塩化ナトリウム、 75mMのクェン酸ナト リウム）、 50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6)、 5 Xデンハルト溶液、 10%の硫酸デキスト ラン、および g/Lの変性させたサケ精子 DNAを含む溶液中で 42°Cでー晚、イン キュペートした後、例えば約 65°Cの 0.2 X SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件 をあげることができる。ストリンジェントな条件は、プローブ DNAの鎖長の長さや GC 含量に応じて調整が可能であり、モレキュラー 'クローユング第 3版等に記載の方法 により設定することができる。また、より低いストリンジェント条件を用いることもできるが 、ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整 (ホルムアミドの濃度を下げ るほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低 ストリンジヱント条件としては、例ぇば6 X SSCE (20 X SSCEは、 3mol/Lの塩化ナトリウ ム、 0.2mol/Lのリン酸二水素ナトリウム、 0.02mol/Lの EDTA、 pH7.4)、 0.5%の SDS、 3 0%のホルムアミド、 100 g/Lの変性させたサケ精子 DNAを含む溶液中で、 37°Cで ー晚インキュベートした後、 50°Cの 1 X SSC、 0.1%SDS溶液を用いて洗浄する条件を あげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリ ンジェント条件にお 、てハイブリダィゼーシヨンを行った後、高塩濃度 (例えば 5 X SS C)の溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。
[0023] 上記した様々な条件は、ノ、イブリダィゼーシヨン実験のバックグラウンドを抑えるた めに用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。 上記したブロッキング試薬の添カ卩は、条件を適合させるために、ハイブリダィゼーショ ン条件の変更を伴ってもょ 、。
上記したストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズ可能な DNAとしては、例えば上 記した BLASTおよび FASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づ ヽて計 算したときに、上記した [1]または [2]の DNAの塩基配列と少なくとも 80%以上、好ま しくは 90%以上、より好ましくは 94%以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましく は 99%以上の相同性を有する DNAをあげることができる。
[0024] 上記した DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA力 ペプチド合 成活性を有する蛋白質をコードする DNAであることは、該 DNAを発現する組換え体 DNAを作製し、該組換え体 DNAを宿主細胞に導入して得られる微生物を培養して 得られる培養物から該蛋白質を精製し、該精製蛋白質を酵素源に用いて、該酵素源 と 1種以上のアミノ酸、またはジペプチドとアミノ酸、好ましくは γ -ダルタミルアミノ酸と L-アミノ酸、グリシン、および |8—ァラニン力 なる群力 選ばれるアミノ酸、および A TPを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にペプチドが生成、蓄積するか否か を HPLC等により分析する方法によって確認することができる。
3.本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体
本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体としては、本発明の蛋白質 を生産する能力を有する微生物および形質転換体であれば特に限定されないが、 該微生物としては、好ましくはクロストリジゥム (Clostridium)属に属する微生物、より好 ましくはクロストリジゥム ·ァセトブチリカム (Clostridium acetobutvlicum)に属する微生 物、さらに好ましくは Clostridium acetobutylicum ATCC824をあげることができ、該形 質転換体としては、本発明の蛋白質をコードする DNAで形質転換された形質転換 体をあげることができる。
[0025] 本発明の蛋白質をコードする DNAで形質転換された形質転換体としては、上記2 の DNAを含む組換え体 DNAを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得ら れる形質転換体をあげることができ、宿主細胞としては、細菌等の原核生物、酵母、 動物細胞、昆虫細胞および植物細胞、好ましくは細菌、より好ましくは Escherichia属 に属する微生物をあげることができる。
4.本発明の DN Aの調製
本発明の DNAは、例えば、配列番号 2で表される塩基配列に基づき設計すること ができるプローブを用いた、クロストリジゥム（Clostridium)属に属する微牛.物、好まし くはクロストリジゥム ·ァセトブチリカム (Clostridium acetobutvlicum)に属する微生物、 より好ましくは Clostridium acetobutvlicum ATCC824の染色体 DNAライブラリーに対 するサザンノ、イブリダィゼーシヨン、または配列番号 2で表される塩基配列に基づき 設計することができるプライマー DNAを用いた、微生物、好ましくは Clostridium属に 属する微生物、より好ましくは Clostridium acetobutylicumに属する微牛.物、さらに好 ましく Clostridium acetobutvlicum ATCC824の染色体 DNAを铸型とした PCR[PCR P rotocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
[0026] また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号 1で表されるアミノ酸配列 をコードする DNAの塩基配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 94 %以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましくは 99%以上の相同性を有する配 列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物 の染色体 DNA、 cDNAライブラリ一等から上記した方法により本発明の DNAを取得 することちでさる。
[0027] 取得した DNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりべク ターに組み込み、得られた組換え体 DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられ る塩基配列解析方法、例えばジデォキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 ( 1977)]あるいは Applied Biosystems 3700 DNA Analyzer (アプライド 'バイオシステム 社製)等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該 DNAの塩基配列を決 定することができる。
[0028] 塩基配列を決定した結果、取得された DNAが部分長であった場合は、該部分長 D NAをプローブに用いた、染色体 DNAライブラリーに対するサザンハイブリダィゼー シヨン法等により、全長 DNAを取得することができる。
更に、決定された DNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ'バイオシステムズ 社製 8905型 DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とする DNAを調 製することちでさる。
[0029] 上記のようにして取得される DNAとして、例えば、配列番号 2で表される塩基配列 を有する DNAをあげることができる。
本発明の DNAを組み込むベクターとしては、 pBluescript II KS(+) (ストラタジーン社 製）、 pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、 pPCR- Script Amp (ストラタジ ーン社製）、 pT7Blue (ノバジェン社製）、 pCR II (インビトロジェン社製）および pCR- TR AP (ジーンノヽンター社製)などをあげることができる。
[0030] 宿主細胞としては、ェシエリヒア属に属する微生物などをあげることができる。ェシ工 リヒア属に属する微生物としては、例えば、ェシエリヒア 'コリ（Escherichia coli) XL1- B lueゝェシエリヒア'コリ XL2— Blueゝェシエリヒア'コリ DH1、ェシエリヒア'コリ MC1000、 ェシエリヒア'コリ ATCC12435、ェシエリヒア'コリ W1485、ェシエリヒア'コリ JM109、ェ シエリヒア'コリ HB101、ェシエリヒア'コリ No.49、ェシエリヒア'コリ W3110、ェシエリヒ ァ.コリ NY49、ェシエリヒア'コリ MP347、ェシエリヒア'コリ NM522、ェシエリヒア'コリ B L21、ェシエリヒア'コリ ME8415等をあげることができる。
[0031] 組換え体 DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63- 248394号）、エレクトロポ レーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の形質転換体としては、例えば配列番号 2で表さ れる配列を有する DNAを含有する組換え体 DNAを保有する微生物であるェシエリ ヒア 'コリ BL21/pCAC1540をあげることができる。
5.本発明の製造法に用いられる形質転換体および微生物の製造法 本発明の DNAをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含 む適当な長さの DNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列 を、宿主の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該蛋白質の生 産率が向上した形質転換体を取得することもできる。
[0032] 該 DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、 組換え体 DNAを作製する。
該組換え体 DNAを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより、本 発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする 遺伝子を発現できるものであれば 、ずれも用いることができる。
[0033] 発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組込が可能で、本発明の DNAを転写できる位置にプロモーターを含有して 、るも のが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の DNAを有する組換 え体 DNAは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソ一 ム結合配列、本発明の DNA、転写終結配列より構成された組換え体 DNAであるこ とが好ま ヽ。プロモーターを制御する遺伝子が含まれて!/ヽてもよ!/、。
[0034] 発現ベクターとしては、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもベーリンガーマンハイム社製）、 p Helixl (ロシュ'ダイァグノステイタス社製）、 pKK233-2 (アマシャム'フアルマシア'バイ ォテク社製）、 pSE280 (インビトロジェン社製）、 pGEMEX-Ι (プロメガ社製）、 pQE- 8 ( キアゲン社製）、 pET- 3、 pET- 21d(+) (いずれもノバジェン社製）、 pKYP10 (特開昭 58- 110600号）、 pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、 pLSAl[Agric. Biol. Che m., 53, 277 (1989)]、 pGELl[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)]、 pBluescr ipt II SK(+)ゝ pBluescript II KS (―) (ストラタジーン社製）、 pTrS30 [ェシエリヒア'コリ JM 109/pTrS30(FERM BP- 5407)より調製]、 pTrS32 [ェシエリヒア'コリ JM109/pTrS32(FE RM BP- 5408)より調製]、 pPAC31 (国際公開第 98/12343号パンフレット)、 pUC19 [Ge ne, 33, 103 (1985)]、 pSTV28(タカラバィォ社製)、 pUC118 (タカラバィォ社製）、 pPAl (特開昭 63-233798号)等を例示することができる。 [0035] プロモーターとしては、エシ リヒア 'コリ等の宿主細胞中で機能するものであれば 、かなるものでもよ!ヽ。例えば、 プロモーター（p )、 プロモーター（p ；)、 pプ
trp iac L 口モーター、 pプロモーター、 p プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来する
R SE
プロモーター、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 penPプロモーター等をあ げることができる。また P を 2つ直列させたプロモーター、 tacプロモーター、 lacT7プ
trp
口モーター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用 いることがでさる。
[0036] さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるための !Δプロモーター [Appl.
Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)]やコリネバタテリゥム（^^QOie ^li l) 属に属する微生物中で発現させるための P54-6プロモーター [Appl. Microbiol. Biote chnol, 53, 674-679 (2000)]なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン一ダルガノ（Shine-Dalgarno)配列と開始コドンと の間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ま 、。
[0037] 本発明の DNAを発現ベクターに結合させた組換え体 DNAにおいては、転写終結 配列は必ずしも必要ではな 、が、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置すること が好ましい。
このような糸且換え体 DNAとしては、例えば pCAC1540をあげることができる。 宿主細胞として用いる原核生物としては、ェシエリヒア（Escherichia)属、セラチア (Serratia)属、バチルス（Bacillus)属、ブレビパクテリゥム（Brevibacterium)属、コリネ ノ クテリゥム (Corvnebacterium;属、ミクロノくクテリゥム属 (Microbacterium)、シユード モナス（Pseudomonas)属、ァグロパクテリゥム（Agrobacterium)属、アリシクロバチルス 属 (Alicvclobacillus)、アナべナ (Anabena)属、アナシスティス (Anacvstis)属、アース ロノくクタ一 (Arthrobacter)属、ァゾトノ クタ一 (Azotobacter)属、クロマチゥム (Chroma tium)属、エノレビ-ァ (Erwinia)属、メチロバクテリウム (Methvlobacterium)属、フオノレミ ディウム（Phormidium)属、口ドノ クタ一 (Rhodobacter)属、ロドシユードモナス（Rhodop seudomonas)属、ロドスピリゥム (Rhodospirillum 属、セネァスムス (Scenedesmus)属、 ストレプトマイセス（Streptomvces)属、シネコッカス（Svnechoccus)属、ザィモモナス y_momonas)属等に属する微生物、例えば、ェシエリヒア'コリ XL1- Blue、ェシエリヒア' コリ XL2— Blueゝェシエリヒア'コリ DH1、ェシエリヒア'コリ DH5 α、ェシエリヒア'コリ Μ C1000、ェシエリヒア'コリ KY3276、ェシエリヒア'コリ W1485、ェシエリヒア'コリ JM109 、ェシエリヒア'コリ HB101、ェシエリヒア'コリ No.49、ェシエリヒア'コリ W3110、ェシェ リヒア.コリ NY49、ェシエリヒア'コリ MP347、ェシエリヒア'コリ NM522、ェシエリヒア'コ リ BL21、バチルス ·サチリス（Bacillus subtilis) ATCC33712,バチルス 'メガテリゥム（ Batillus megatenum)、ブレビノ クァリウム.イマリオフイノレム (Brevibactenum immariop hilum) ATCC14068、ブレビバクテリウム*サッカロリティカム（Brevibacterium saccharo lyticum) ATCC 14066,ブレビパクテリゥム ·フラバム（Brevibacterium flavum) ATCC14 067、ブレビパクテリゥム ·ラクトフアーメンタム（Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869、コリネパクテリゥム ·グルタミカム（Corvnebacterium elutamicum) ATCC13032 、コリネバタテリゥム 'グルタミカム ATCC14297、コリネバタテリゥム 'アンモニアゲネス（ Corvnebacterium ammoniagenes) ATCC6872.コリネバタテリゥム.ァセトァシドフィル ム (Corvnebacterium acetoacidophilum) ATCC13870.ミクロバタテリゥム 'アンモニア フィルム（Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354、セラチア，フイカリア（Serrati a ficaria)、セラチア ·フォンチコラ (Serratia fonticola)、セラチア ·リケファシエンス (Ser ratia nauefaciens 、セフチ / ·マノレセッセンス (aerratia marcescens、ンュ' ~~ モナス · エスピー（Pseudomonas sp.) D- 0110、ァグロパクテリゥム ·ラジオパクター（Agrobacte rium radiobacter)、 7グロノ クァリゥム 'リン、ン' ~~ンズ (Agrobacterium rhizogenes )、 7 グロノくクテリゥム ·ノレビ（Agrobacterium rubi)、アナべナ'シリンドリカ (Anabaena cvlind rica)、アナべナ ·ドリオノレム (Anabaena doliolum)、アナべナ ·フロスアクア (Anabaena f los-aauae)、アースロノくクタ一'オーレッセンス（Arthrobacter aurescens)、アースロノく クタ一 .シトレウス (Arthrobacter citreus)、アースロバクタ一 .グロプフォルミス (Arthro bacter globformis)、アースロノくクタ一 .ヒドロカーボグノレタミカス (Arthrobacter hvdroc arboglutamicus)、 ~~スロノくクタ1 ~~ ' ^ソレンス (Arthrobacter mvsorens)、 ~~スロノヽ クタ一 ·ニコチアナ (Arthrobacter nicotianae)、アースロバクタ一 ·パラフイネウス (Arth robacter paraffineus)、 7 ~~スロノ クタ1 ~~ ·フ—口トフオノレ ェ (Arthrobacter protophormi ae)ゝアースロノくクタ一 ·ロセオノ ラフイナス (Arthrobacter roseoparaffinus)ゝアース口 パクタ^ ~ .スルフレウス（Arthrobacter sulforeus)、アースロバクタ^ ~ ·ウレァファシェン ス (Arthrobacter ureafaciens)、クロマチゥム ·ブデリ (Chromatium buderi)、クロマチウ ム ·ァピタム (し hromatium tepidum 、クロマテゥム ·ヒノサム (し hromatium vinosum)、 クロマチゥム .ヮーミンギ (Chromatium warmingii)、クロマチゥム ·フルビアタティレ（£h romatium fluviatile)、エノレビ-ァ .ウレドノくラ (Erwinia uredovora)、エノレビ-ァ '力ロト ノ ラ (Erwinia carotovora)、エノレビ-ァ ·アナナス (Erwinia ananas)、エノレビ-ァ ·ヘリ コラ (Erwinia herbicola)、エノレビニァ ·ノ ンクタタ (Erwinia punctata)、エノレビニァ ·テレ ウス (Erwinia terreus)、メチロノくクテリウム'ロテシアナム (Methylobacterium rhodesian um)、メチロバクテリウム ·ェクソトノレクエンス (Methvlobacterium extorauens)、フオノレミ ディウム.エスピー（Phormidium sp.) ATCC29409,ロドパクタ^ ~ ·力プスラタス (Rhodo bacter capsulatus )、口!ノ クタ1 ~~ 'スフェロイァス (Rhodobacter sphaeroides)、ロドンュ ードモナス .ブラスチカ (Rhodopseudomonas blastica)、ロドシユードモナス 'マリナ（Eh odopseudomonas marina)、ロドンュ1 ~~トモナス ·ノヽルス卜リス (Rhodopseudomonas palu stris)、ロドスピリゥム ·リブラム (Rhodospirillum rubrum)、ロドスピリゥム ·サレキシゲン ス（Rhodospirillum salexigens)、ロトスピリゥム *サリナフム (Rhodospirillum sannarum) 、ストレプトマイセス 'アンボファシエンス (Streptomvces ambofaciens)、ストレプトマイ セス ·オーレオファシエンス (Streptomvces aureofaciens) 、ストレプトマイセス 'ァウレ ウス (Streptomvces aureus)、ストレプトマイセス ·フンンンアイカス (Streptomvces fungi cidicus)、ス卜レフ。卜マイセス ·グリセ才クロモケナス (atreptomvces gnseochromogenes )、ストレプトマイセス 'グリセウス (Streptomvces eriseus)、ストレプトマイセス 'リビダン ス (Streptomvces lividans)、ストレプトマイセス*オリボグリセウス（Streptomvces olivogr iseus)、ストレプトマイセス ·ラメウス (Streptomvces rameus)、ストレプトマイセス ·タナシ ェンシス (Streptomvces tanashiensis)、ストレプトマイセス ·ビナセウス (Streptomvces vinaceus)、ザィモモナス ·モビリス (Zvmomonas mobilis)等をあげることができる。 組換え体 DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63- 248394号）、エレクトロポ レーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEpl3 ( ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等を用 いることがでさる。
[0039] プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプ 口モーター、 gal iプロモーター、 gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモ 一ター、 MF a lプロモーター、 CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることが できる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Saccharomvces)属、シゾサッカロマイセス（Sch izosaccharomvces) fe、クルィベロマイセス (Kluweromvces) 、トリコス ロン (Tricho sporon)属、シヮニォマイセス (Schwanniomvces)属、ピチア（Pichia)属、またはキャン デイダ (C dida)属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマ ィセス ·セレビシェ (Saccharomvces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス ·ボンべ (Schizo saccharomvces pombe 、クノレイベロマ セス ·フクアイス (Kluweromvces lactis)、トリコ スポロン'プノレランス (Trichosporon pullulans)、シヮニォマイセス ·ァノレビウス (Schwan niomvces alluvius)、ピチア ·ノ ストリス (Pichia pastoris)、キャンディダ ·ウテイリス (Can dida utilis)等をあげることができる。
[0040] 組換え体 DNAの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であればいずれ も用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods EnzymoL, 194, 182 ( 1990)]、スフエロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889 (1984)]、酢酸リチウ ム法 [J. BacterioL, 153, 163 (1983)]等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAU pcD M8 (フナコシ社より巿販）、 pAGE107 (特開平 3-22979号）、 pAS3-3 (特開平 2-227075 号）、 pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、 pcDNAI/Amp (インビトロジェン社製）、 pREP 4 (インビトロジェン社製）、 pAGE103[J. Biochem., 101, 1307 (1987)]、 pAGE210、 pAM o、 pAMoA等を用いることができる。
[0041] プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモータ 一、 SV40の初期プロモーターあるいはメタ口チォネインのプロモーター、レトロウイノレ スのプロモーター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等をあげることがで きる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
[0042] 宿主細胞としては、マウス'ミエローマ細胞、ラット 'ミエローマ細胞、マウス'ハイブリ ドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞またはナマルバ KJM-1細胞 、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ 'ハム スターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 (特開昭 63-299号）等をあげることができる マウス ·ミエローマ細胞としては、 SP2/0、 NSO等、ラット 'ミエローマ細胞としては YB2 /0等、ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293(ATCC CRL-1573)、ヒト白血病細胞として は BALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としては COS-l、 COS-7等をあげることが できる。
[0043] 組換え体 DNAの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)]、リン酸カルシウム法（特開平 2-227075号）、リボフヱクシヨン法 [Proc. Natl. Aca d. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]、 Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげること ができる。
[0044] 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and company, New York (1992)、 7ルント-フ—ロト コーノレズ 'イン'モレキュラー'ノ ィォロジ一、 Molecular Biology, A Laboratory Manual 、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を生産すること ができる。
[0045] 即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して 昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、さらに組換えウィルスを昆虫細胞 に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、 pVL1392、 pVLl
393、 pBlueBacIII (V、ずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。
[0046] バキュロウィルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるアウトグ ラファ 'カリフオル-力'ヌクレア一'ポリへドロシス'ウィルス (Autographa californica nu clear polyhedrosis virus)等を用 ヽること力でさ 。
昆虫細胞としては、スポドプテラ ·フルギベルダ (Spodoptera frugiperda)の卵巣細 胞、トリコプルシア'二 (TrichoDlusia ni)の卵巢細朐、カイコ卵巣由来の培養細胞等 を用いることができる。
[0047] スポドプテラ ·フルギベルダの卵巣細胞としては S19、 S1 1 (バキュロウィルス'イクスプ レツシヨン'ベクターズァ 'ラボラトリー 'マ-ユアル)等、トリコプルシア '二の卵巣細胞 としては High 5、 ΒΤΙ-ΤΝ-5Β1-4 (インビトロジェン社製)等、カイコ卵巣由来の培養細 胞としてはボンビクス'モリ (Bombvx mori) N4等をあげることができる。
組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクター と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法 (特開平 2 -227075号）、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等をあ げることができる。
[0048] 植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 Tiプラス ミド、タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV)の 35Sプロモーター、ィネアクチ ン 1プロモーター等をあげることができる。
[0049] 宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファ ルファ、イネ、コムギ、ォォムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞に DNAを導入する方法であれば ヽ ずれも用いることができ、例えば、ァグロパクテリゥム (Agrobacterium)を用いる方法 ( 特開昭 59-140885号、特開昭 60-70080号、国際公開第 94/00977号パンフレット）、ェ レクト口ポレーシヨン法 (特開昭 60-251887号）、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる 方法 (特許第 2606856号、特許第 2517813号)等をあげることができる。
6.本発明の蛋白質の製造法
上記 5の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質 を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができ る。 [0050] 本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、 動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌、より 好ましくはェシエリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはェシエリヒア 'コリに属する 微生物をあげることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは 糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
[0051] 上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法 に従って行うことができる。
ェシエリヒア'コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形 質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類 等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培 地の!/、ずれを用いてもよ！、。
[0052] 炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース、 スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水 化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類 等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化 物等を用いることができる。
[0053] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養 温度は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 5時間〜 7日間である。培養中 pHは 3.0〜9 .0に保持する。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシ ゥム、アンモニア等を用いて行う。 [0054] また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に 添カロしてちょい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微 生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例 えば、 1 ^プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するとき にはイソプロピル一 β —D—チォガラタトピラノシド等を、 imプロモーターを用いた発 現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地 に添カ卩してもよい。
[0055] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている RPMI1640培地 [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)]、イーグル（Eagle)の MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)]、 DMEM培地 [Virology, 8, 396 (1959)]、 199培 地 [Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した 培地等を用いることができる。
[0056] 培養は、通常 pH6〜8、 25〜40°C、 5%CO存在下等の条件下で 1〜7日間行う。
2
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生 物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている TNM- FH培地 (ファーミンジェン社製)、 Sf-900 II SFM培地（ライフ'テクノロジ ーズ社製）、 ExCell400、 ExCell405 [いずれも JRHバイオサイエンシーズ社製]、 Grace' s Insect Medium[Nature, 195, 788 (1962)]等を用いることができる。
[0057] 培養は、通常 pH6〜7、 25〜30°C等の条件下で 1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい 植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器 官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般 に使用されているムラシゲ'アンド'スターグ (MS)培地、ホワイト (White)培地、またはこ れら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添カ卩した培地等を用いるこ とがでさる。 [0058] 培養は、通常 pH5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地 に添カ卩してもよい。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外 に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方 法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
[0059] 本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポー ルソンらの方法 [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)]、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)]、または特開平 5- 33696
3号、国際公開第 94/23021号パンフレット等に記載の方法を準用することにより、該 蛋白質を宿主細胞外に積極的〖こ分泌させることができる。
[0060] すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋 白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿 主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平 2-227075号に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺 伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
[0061] さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分ィ匕させることにより、遺伝子 が導入された動物個体 (トランスジエニック非ヒト動物)または植物個体 (トランスジェ- ック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。 本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通 常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体また は植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
[0062] 動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法 [A m. J. Clin. Nutr., 63, 639 (1996)、 Am. J. Clin. Nutr., 63, 627 (1996)、 Bio/Technolog y, 9, 830 (1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生 産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明の DNAまたは本発明の製造法に用いられる
DNAを導入したトランスジエニック非ヒト動物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中 に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造す ることができる。該動物中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該 動物のミルク（特開昭 63- 309192号）、卵等をあげることができる。この際に用いられる プロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、 例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターである αカゼインプロモーター、 βカゼイン プロモーター、 j8ラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター 等が好適に用いられる。
[0063] 植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白 質をコードする DNAを導入したトランスジエニック植物を公知の方法 [組織培養， 20 ( 1994)、組織培養， 21 (1995)、 Trends BiotechnoL, 15, 45 (1997)]に準じて栽培し、該 蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、 該蛋白質を生産する方法があげられる。
[0064] 本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単 離、精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了 後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレン チプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞 抽出液を得る。
[0065] 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精 製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジ ェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグ ラフィ一法、 Q- Sepharose FF (アマシャムバイオサイエンス社製)等のレジンを用いた 陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエ-ルセファロース等のレ ジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィ二ティ 一クロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法 等の手法を単独あるいは組合せて用い、精製標品を得ることができる。
[0066] また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回 収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋 白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まな ヽあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質 が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構 造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
[0067] 本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には 、培養上清に該蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体を回収することができる。 即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性 画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精 製標品を得ることができる。
[0068] このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号 1で表されるアミノ酸配列 力 なる蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白 質に親和性をもつ物質を用いたァフィユティークロマトグラフィーを利用して精製する こともできる。例えば、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、 Ge nes Develop., 4, 1288 (1990)]、特開平 5- 336963号、国際公開第 94/23021号パンフ レットに記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテイン Aとの融合タンパク質とし て生産し、ィムノグロブリン Gを用いるァフィユティークロマトグラフィーにより精製する ことができる。
[0069] また、本発明の蛋白質を Flagペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗 Flag抗体を 用いるァフィユティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227(1989) 、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)]や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポ リヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるァフィユティークロマトグラフ ィ一によつて精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたァフィ 二ティークロマトグラフィーで精製することもできる。
[0070] 上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、 Fmoc法 (フルォレニルメチ ルォキシカルボ-ル法）、 tBoc法（t ブチルォキシカルボ-ル法）等の化学合成法 により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、 Advanced ChemTech社、ノ ~" ン，ェルマ^ ~"社、 Pharmacia社、 Protein Technology Instrument社、 Synthecel Ve ga社、 PerS印 tive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することも できる。
7.本発明のペプチドの製造法
上記 3の微生物または形質転換体の培養物もしくは該培養物の処理物または上記 1の本発明の蛋白質と、 1種以上のアミノ酸またはジペプチドとアミノ酸とを水性媒体 中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ペプチドを 採取することにより、該ペプチドを製造することができる。
(1)本発明の蛋白質を酵素源として用いるペプチドの製造法
本発明の製造法において、酵素源として本発明の蛋白質を用いる場合、上記 6の 方法により製造された本発明の蛋白質を用いることができる。また、本発明の蛋白質 を生産する能力を有する微生物、好ましくはクロストリジゥム (Clostridium)属に属する 微生物、より好ましくはクロストリジゥム ·ァセトブチリカム (Clostridium acetobutvlicum) に属する微生物、さらに好ましくは Clostridium acetobutvlicum ATCC824を後述の方 法で培養し、得られた培養物から上記 6の単離精製法にて取得できる本発明の蛋白 質も用 、ることができる。
[0071] 本発明の製造法において、酵素源として本発明の蛋白質を用いる場合、基質とし ては、 1種以上、好ましくは 1〜3種、さらに好ましくは 1種もしくは 2種のアミノ酸、また はジペプチドとアミノ酸の組合せをあげることができる。基質が 1種以上のアミノ酸で ある場合、アミノ酸としては、 L—アミノ酸、グリシンおよび |8—ァラニンからなる群より 選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸を用いてもよい。 L—アミノ酸としては、 例えば L-ァラニン、 L-グルタミン、 L-グルタミン酸、 L-ノ リン、 L-ロイシン、 L-イソロイ シン、 L-プロリン、 L-フエ-ルァラニン、 L-トリプトファン、 L-メチォニン、 L-セリン、 L- スレオニン、 L-システィン、 L-ァスパラギン、 L-チロシン、 L-リジン、 L-ァノレギニン、 L- ヒスチジン、 L-ァスパラギン酸、 L- α -アミノブチル酸、 L-ァザセリン、 L-テアニン、 L- 4-ヒドロキシプロリン、 L- 3-ヒドロキシプロリン、 L-オル二チン、 L-シトルリン、 L-6-ジァ ゾ- 5-ォキソ -ノルロイシン、 Ν-ァセチル- L-システィンおよび Ν-ァセチル- L- aァミノ ブチル酸などをあげることができる。
[0072] 基質がジペプチドとアミノ酸の組合せである場合、ジペプチドとしては、 γ -L-ダル タミルアミノ酸、 γ -D -ダルタミルアミノ酸、 γ - L- ( α -メチル）ダルタミルアミノ酸、 13 - アミノグルタリルアミノ酸、 γ -L- (Ν-メチル）ダルタミルアミノ酸、 γ - DL- ( β -メチル） ダルタミルアミノ酸、 γ -DL- ( γ -メチル)ダルタミルアミノ酸力もなる群力も選ばれるジ ペプチドをあげることができる。 γ -L-ダルタミルアミノ酸としては、 γ -L-ダルタミル- L -システィン、 γ - L-グルタミル- L- a -アミノブチル酸、 γ - L-グルタミル- L- S-メチル システィン、 γ - L-グルタミル- L-セリン、 γ -L-グルタミル- L-ァラニン、 γ - L-グルタミ ル- L-ノルパリン、 γ -L-グルタミル- L-ハイポグリシン、 γ - L-グルタミル- j8 -シァノア ラニン、 γ -L-グルタミル- Se-メチルセレノシスティン、 N- ( γ -L-グルタミル）ァミノ- D- プロリンカもなる群力 選ばれる Ί -L-ダルタミルアミノ酸をあげることができる。また、 基質がジペプチドとアミノ酸の糸且合せである場合、アミノ酸としては、 L—アミノ酸、ダリ シンおよび ι8—ァラニン力 なる群より選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸 を用いてもよい。 L—アミノ酸としては、例えば L-ァラニン、 L-グルタミン、 L-グルタミン 酸、 L—ノ リン、 L—ロイシン、 L—イソロイシン、 L—プロリン、 L—フエ-ルァラニン、 L—トリプ トフアン、 L-メチォニン、 L-セリン、 L-スレオニン、 L-システィン、 L-ァスパラギン、 L- チロシン、 L-リジン、 L-アルギニン、 L-ヒスチジン、 L-ァスパラギン酸、 L- α -アミノブ チル酸、 L-ァザセリン、 L-テアニン、 L-4-ヒドロキシプロリン、 L-3-ヒドロキシプロリン、 L-オル-チン、 L-シトルリン、 L- 6-ジァゾ -5-ォキソ -ノルロイシン、 Ν-ァセチル- L-シ スティンおよび Ν-ァセチル -L- aアミノブチル酸などをあげることができる。
上記製造法に用いられる、より好ま U、基質としては、 γ -L-ダルタミル- L-システィ ンと L-ァラニン、グリシン、 L-メチォニン、 L-セリン、および L-システィン力もなる群か ら選ばれるアミノ酸との組合せをあげることができる。
基質である 1種以上のアミノ酸、またはジペプチドとアミノ酸は、ペプチドを生成、蓄 積させる水性媒体に粉末のまま、あるいは溶液として供給することができるが、該水 性媒体中で化学合成法、酵素的合成法、または生物学的合成法等により基質を合 成することにより供給することもできる。例えば、ペプチドを生成、蓄積させる水性媒 体中に、ェシエリヒア'コリ由来の Ύ—ダルタミルシスティン合成酵素 [EC6.3.2.2]、 L- グルタミン酸、 L-システィン、および ΑΤΡを共存させること〖こより、 γ - L-グルタミル- L -システィンを供給することができる。基質の供給はペプチドを生成、蓄積させる前に 行ってもよぐペプチドの生成と同時でも構わない。
[0074] 上記製造法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるジペプチドまたは 1種 のアミノ酸 lmgあたり 0.01〜100mg、好ましくは 0.1mg〜10mg添カ卩する。
上記製造法において、基質として用いるジペプチドとアミノ酸は、それぞれ 0.1〜50 Og/L、好ましくは 0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中 に添カ卩する。
[0075] 上記製造法において、エネルギー源として ATPを用いることができ、 ATPは、 0.5m mol〜10mol/Lの濃度で用いる。 ATPはペプチドを生成、蓄積させる水性媒体に粉 末のまま、あるいは溶液として供給することができるが、例えば解糖系やポリリン酸キ ナーゼなどを利用した ATP再生活性 (ペプチド生成の際に生じる ADPを ATPに変 換する活性)を該水性媒体に加えることで ATPを供給することもできる。具体的には 、 Corvnebacterium ammoniagenesの;！^着菌体と成素源を添カ卩する方 fe「Biosci. Biot echnol. Biochem., 65, 644(2001)]、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸を添カ卩する方法 [J. Biosci. Bioeng., 91, 557(2001) ]等をあげることができる。
[0076] 上記製造法で用いられる水性媒体としては、ペプチドの生成反応を阻害しない限り 、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよぐ例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢 酸塩、ほう酸塩、クェン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタ ノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸ェチルなどのエステル類、アセトンなど のケトン類、ァセトアミドなどのアミド類を含有して 、てもよ 、。
[0077] ペプチドの生成反応は水性媒体中、 pH5〜ll、好ましくは pH6〜10、 20〜50°C、好 ましくは 25〜45°Cの条件で 2〜150時間、好ましくは 6〜120時間行う。
上記方法で製造されるペプチドとしては、アミノ酸同士がペプチド結合で連結した ペプチド、またはジペプチドの C末端のアミノ酸残基とアミノ酸、好ましくは γ - L-ダル タミルアミノ酸と L-アミノ酸、グリシンおよび β -ァラニン力 なる群力 選ばれるァミノ 酸、より好ましくは γ -L -ダルタミル- L-システィンのシスティン残基と L-ァラニン、 L- グルタミン、 L-グルタミン酸、 L -パリン、 L-ロイシン、 L-イソロイシン、 L-プロリン、 L-フ ェ-ルァラニン、 L-トリプトファン、 L-メチォニン、 L-セリン、 L-スレオ-ン、 L-システィ ン、 L-ァスパラギン、 L-チロシン、 L-リジン、 L-ァノレギニン、 L-ヒスチジン、 L-ァスパラ ギン酸、 L- α -アミノブチル酸、 L-ァザセリン、 L-テアニン、 L- 4-ヒドロキシプロリン、 L -3-ヒドロキシプロリン、 L-オル二チン、 L-シトルリン、 L- 6-ジァゾ -5-ォキソ -ノル口イシ ン、 Ν-ァセチル- L-システィン、 Ν-ァセチル- L- aアミノブチル酸、グリシンおよび 13 - Alaからなる群力 選ばれるアミノ酸がペプチド結合で連結したペプチド、さらに好ま しくは、 γ -L-ダルタミル- L-システィンのシスティン残基と L-ァラニン、グリシン、 L-メ チォニン、 L-セリンおよび L-システィン力もなる群力も選ばれるアミノ酸がペプチド結 合で連結したトリペプチドをあげることができる。
(2)微生物または形質転換体の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用い るペプチドの製造法
本発明の製造において酵素源として用いられる微生物の培養物としては、本発明 の蛋白質を生産する微生物を該微生物の生育に適した培養方法で培養して得られ る培養物をあげることができる。例えば、該微牛.物 して Clostridium acetobutvlicum ATCC824を用いる場合、 NBRC medium No.807培地（ポリペプトン 15g/L、イースト' エキストラタト 5g/L、グルコース 5g/L、塩化ナトリウム 2.5g/L、 L-システィン 0.5g/L、 チォグリコール酸ナトリウム 0.5g/L、レザズリン lmg/L、 pH 7.0- 7.2)や ATCC mediu m 1017培地（グランド 'ビーフ 500g/L、 IN水酸化ナトリウム 25mL/L、ペプトン 30g/L 、イースト 'エキストラタト 5.0g/L、リン酸水素 2カリウム 5.0g/L、 0.025%レザズリン溶液 4.0mL/L、 L-システィン 0.5g/L、 pH7.0)などの培地を用い、 25〜40°C、 1〜10日 間、ガスパック（日本べタトン 'ディッキンソン社製)等を用いて嫌気的に培養して得ら れる培養物をあげることができる。また、本発明の製造法において酵素源として用い られる形質転換体の培養物としては、該形質転換体を上記 6の培養方法で培養して 得られる培養物をあげることができる。
微生物または形質転換体の培養物の処理物としては、該培養物の濃縮物、該培養 物の乾燥物、該培養物の界面活性剤処理物、該培養物の溶媒処理物、該培養物の 酵素処理物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥 物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該 菌体の酵素処理物、および該菌体の固定ィヒ物などの酵素源として該微生物の培養 物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理 物、該菌体の機械的摩砕処理物、および当該処理した菌体から得られる粗酵素抽 出物などをあげることができる。
[0079] 形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる 場合、基質に用いられる 1種以上のアミノ酸、またはジペプチドとアミノ酸との組合せ としては、上記（1)と同様の化合物をあげることができる。
該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用い るジペプチドまたは 1種のアミノ酸 lmgあたり湿菌体重量として 5〜1000mg、好ましくは 10〜400mg添カ卩する。
[0080] 基質として用いる 1種以上のアミノ酸、またはジペプチドとアミノ酸は、上記（1)と同 じょうに水性媒体中に供給することができる。上記（1)と同様、 ATPを水性媒体中に 存在せしめ、エネルギー源として用いることができる。
水性媒体としては、上記（1)の媒体を用いることができ、加えて酵素源に使用する 微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。
[0081] ペプチドの生成反応の反応条件は、上記（1)と同様の条件をあげることができる。
上記方法で製造されるペプチドとしては、上記（1)と同様のペプチドをあげることが できる。
上記（1)および (2)の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したペプチドの 採取は、活性炭やイオン交換榭脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒によ る抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うこと ができる。
[0082] 以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例 1
[0083] C AC 1540遣伝子発現株の诰成
クロストリジゥム.ァセトブチリカム ATCC824の染色体 DNA上に存在する配列番号 2 で表される塩基配列を有する、機能未知蛋白質をコードする CACI Q遺伝子の塩基 配列情報（http://gib.genes.nig.ac.jp/single/index.php?spid=Cace— ATCC824、 http:/ /w .ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=15024486&itemID=4&view=gbwithpar ts)に基づき、クロストリジゥム 'ァセトブチリカム ATCC824の染色体 DNAから CAC154 Q遺伝子の相同遺伝子を以下のようにして取得した。
[0084] まず、クロストリジゥム ·ァセトブチリカム ATCC824株を NBRC medium No.807培地（ ポリペプトン 15g/L、イースト 'エキストラタト 5g/L、グルコース 5g/L、塩化ナトリウム 2. 5g/L、 L-システィン 0.5g/L、チォグリコール酸ナトリウム 0.5g/L、レザズリン lmg/L 、 pH 7.0-7.2) 10mLに植菌して 37°Cで嫌気的に 24時間静置培養した。培養液 ImLを 250mLの NBRC medium No.807培地に植菌し、 37°Cで嫌気的に 48時間静置培養し た。遠心分離により集菌した菌体力も DNeasy Kit (キアゲン社製)を用いて染色体 D NAを調製した。
[0085] パーセプティブ ·バイオシステムズ (Perseptive Biosystems)社製 8905型 DNA合成 機を用いて、配列番号 3および 4で表される塩基配列を有する DNA (以下、それぞ れプライマー A、プライマー Bと呼ぶ）を合成した。プライマー Aは、クロストリジゥム 'ァ セトブチリカム ATCC824株の染色体 DNAの 遺伝子の開始コドンを含む領 域の 5'末端に tol認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマー Bは、 CACHSn遺伝子の C末端アミノ酸配列を含む DNA配列と相補的な塩基配列の 5'末 端に 20 l認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
[0086] £ΔΩΗ5β遺伝子の相同遺伝子断片の増幅には上記のプライマー Aおよびプライマ 一 B、铸型としてクロストリジゥム 'ァセトブチリカム ATCC824株の染色体 DNAを用い て PCRを行った。 PCRは、 0.1 μ gの染色体 DNA、 0.5 μ mol/Lの各プライマー、 2 uni tsの KOD plus DNAポリメラーゼ（東洋紡社製）、 5 μ Lの KOD plus DNAポリメラーゼ 用 X 10緩衝液（東洋紡社製）、各 200 μ mol/Lの dNTP(dATP、 dGTP、 dCTPおよび dT TP)を含む反応液 50 Lを調製し、 95°Cで 135秒間加温した後、 95°Cで 30秒間、 52°C で 45秒間、 68°Cで 90秒間の工程を 25回繰り返し、さらに 68°Cで 3分間加温することに より行った。
[0087] 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、該 PCRにより ^AC! Q遺伝子の 相同遺伝子断片に相当する約 1.Okbの DNA断片が増幅して ヽることを確認した後、 残りの反応液から GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (アマシャムバイオサ ィエンス社製)を用いて該 DNA断片を精製し、 20 Lの TEに溶解した。
該 DNAの塩基配列を公知の方法で決定したところ、配列番号 1で表されるアミノ酸 配列をコードする配列番号 2で表される塩基配列であることを確認した。
[0088] 次に、上記で得られた DNA溶液 5 μ Lを用い、該 DNAを制限酵素 および 20^1 で切断し、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離した後、 GFX PCR DNA a nd Gel Band purification kitを用いて、 CAC1540遣伝子を含む約 l.Okbの DNA断片 を回収した。
0.2 μ gの発現ベクター pET- 21d(+) (ノバジェン社製）を制限酵素 および 20^1で 切断後、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、上記と同様の方法によ り約 5.4kbの DNA断片を回収した。
[0089] 上記で得られた ^ACI Q遺伝子を含む約 l.Okbの DNA断片および上記で取得し た発現ベクター pET-21d(+)の約 5.4kbの DNA断片をライゲーシヨンキット（タカラバイ ォ社製)を用いて、 16°Cで 1時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシ リヒア 'コリ JM109株 (タカラノィォ社製)を、カルシウムィォ ンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]によって形質転換し、 該形質転換体を 50 g/mLのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布した後、 30°Cで 一晩培養した。
[0090] 生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制 限酵素を用いてその構造を解析することにより、 3'末端に Hisタグ配列をコードする 配列が付加された CACI Q遺伝子が IZプロモーター下流に連結された発現べクタ 一である PCAC1540が取得されて!、ることを確認した（図 1)。
PCAC1540を用いてェシエリヒア'コリ BL21(DE3)株（ノバジェン社製）を、カルシウム イオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を 50 g/mLのアンピシリン を含む LB寒天培地に塗布した後、 30°Cで一晚培養した。
[0091] 生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制 限酵素を用いてその構造を解析することにより、 PCAC1540が保持されていることを確 した 0
実施例 2
[0092] ペプチド合成活性を有する蛋白質の生産
実施例 1で得られた PCAC1540を保有するェシエリヒア'コリ BL21(DE3) (ェシエリヒ ァ 'コリ BL21(DE3)/pCAC1540)を 50 g/mLのアンピシリンを含む 3mLの LB培地が 入った試験管に接種し、 30°Cで 16時間振盪培養した。得られた培養液のうち 100 L を lOOmLの LB培地が入った 500mL三角フラスコに接種した。 37°Cで 2時間振盪培養 した後、終濃度力 Slmmol/Lになるようにイソプロピル一 β—D—チォガラタトピラノシド (IPTG)を添加して、さらに 37°Cで 5時間振盪培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌 体を取得した。
[0093] 該湿菌体を超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られる上清から、 HisTra p (Hisタグ付加蛋白質精製キット、アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて Hisタグ が付加した蛋白質を精製した。
実施例 3
[0094] Hisタグ付カ卩蛋白質を用いたトリペプチドの生産
実施例 2で得られた精製 Hisタグ付カ卩蛋白質を 65 g/L、 50mmol/Lの Tris-HCl緩 衝液（pH8.0)、 12.5mmol/Lの硫酸マグネシウム、 12.5mmol/Lの ATPゝ 12.5mmol/Lの γ - L-Glu-L-Cysと 12.5mmol/Lの各種 L-アミノ酸からなる反応液を調製し、 37°Cで 19 時間反応を行った。反応終了後、反応液中に遊離したリン酸量をデタミナ一 L IP (協 和メデッタス社製)を用いて定量することにより、トリペプチド生成反応の進行を確認し 、反応生成物を MALDI-TOFMSを用いて分析することにより、表 1に示すトリペプチド の生成を確認した。
[0095] [表 1]
Figure imgf000033_0001
表 1にあるとおり、本発明の蛋白質はアミノ酸の α位のカルボキシル基、またはジぺ プチドの C末端のカルボキシル基とアミノ酸のァミノ基とをペプチド結合で連結させ、 種々のペプチドを生成する活性を有することがわ力つた。 産業上の利用可能性
[0097] 本発明により、種々のペプチドを製造することができる 配列表フリーテキスト
[0098] 配列番号 3 人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 4 人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲 [1] 以下の [1]〜 [3]の 、ずれかに記載の蛋白質。 [1]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質 [2]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加したアミノ酸配列力もなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質 [3]配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質 [2] 以下の [1]〜[3]のいずれかに記載の DNA。
[1]請求項 1記載の蛋白質をコードする DNA
[2]配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA
[3]配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ントな条件下でハイブリダィズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードす る DNA
[3] 請求項 2記載の DNAを含有する組換え体 DNA。
[4] 請求項 3記載の組換え体 DNAを有する形質転換体。
[5] 形質転換体が微生物を宿主として得られる形質転換体である、請求項 4記載の形質 転換体。
[6] 微生物がェシエリヒア (Escherichia)属に属する微生物である、請求項 5記載の形質 転換体。
[7] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中 に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項 1記載の蛋 白質の製造法。
[8] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項 4〜6のいずれか 1 項に記載の形質転換体である、請求項 7記載の蛋白質の製造法。
[9] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物の 処理物または請求項 1記載の蛋白質と、 1種以上のアミノ酸またはアミノ酸およびジ ペプチドとを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該 媒体力 該ペプチドを採取するペプチドの製造法。
[10] アミノ酸が L-アミノ酸、グリシン、および β—ァラニン力 なる群力 選ばれるアミノ酸 である請求項 9記載のペプチドの製造法。
[11] L-アミノ酸が L-ァラニン、 L-グルタミン、 L-グルタミン酸、 L -パリン、 L-ロイシン、 L-ィ ソロイシン、 L-プロリン、 L-フエ二ルァラニン、 L-トリプトファン、 L-メチォニン、 L-セリン 、 L-スレオニン、 L-システィン、 L-ァスパラギン、 L-チロシン、 L-リジン、 L-ァノレギニン 、 L-ヒスチジン、 L-ァスパラギン酸、 L- α -アミノブチル酸、 L-ァザセリン、 L-テアニン 、 L- 4-ヒドロキシプロリン、 L- 3-ヒドロキシプロリン、 L-オル二チン、 L-シトルリン、 L- 6- ジァゾ -5-ォキソ -ノルロイシン、 Ν-ァセチル- L-システィンおよび Ν-ァセチル- L- aァ ミノブチル酸力もなる群力も選ばれる L-アミノ酸である請求項 10記載のペプチドの製 造法。
[12] ジペプチドが γ -L-グルタミルアミノ酸、 γ - L- Dグルタミルアミノ酸、 γ - L- ( α -メチル )ダルタミルアミノ酸、 β -ァミノグルタリルアミノ酸、 γ -L- (Ν-メチル）ダルタミルァミノ 酸、 γ -DL- ( β -メチル）ダルタミルアミノ酸、 γ - DL- ( y -メチル）ダルタミルアミノ酸か らなる群力 選ばれるジペプチドである請求項 9記載のペプチドの製造法。
[13] γ -L-グルタミルアミノ酸が γ -L-グルタミル- L-システィン、 γ - L-グルタミル- L- α - アミノブチル酸、 γ - L-グルタミル- L-S-メチルシスティン、 γ - L-グルタミル- L-セリン ゝ γ -L-グルタミル- L-ァラニン、 γ - L-グルタミル- L-ノルパリン、 γ - L-グルタミル- L- ノ、ィポグリシン、 γ - L-グルタミル- j8 -シァノアラニン、 γ - L-グルタミル- Se-メチルセ レノシスティン、 N- ( γ -L-グルタミル）ァミノ- D-プロリンからなる群から選ばれる γ - L -ダルタミルアミノ酸である請求項 12記載のペプチドの製造法。
[14] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項 4〜6のいずれか 1 項に記載の形質転換体である、請求項 9〜 13のいずれか 1項に記載のペプチドの製 造法。
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