WO2004058960A1 - ジペプチドの製造法 - Google Patents

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WO2004058960A1
WO2004058960A1 PCT/JP2003/016936 JP0316936W WO2004058960A1 WO 2004058960 A1 WO2004058960 A1 WO 2004058960A1 JP 0316936 W JP0316936 W JP 0316936W WO 2004058960 A1 WO2004058960 A1 WO 2004058960A1
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WO
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protein
dna
bacillus
microorganism
seq
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PCT/JP2003/016936
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English (en)
French (fr)
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Shin-Ichi Hashimoto
Kazuhiko Tabata
Aya Hada
Hajime Ikeda
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a protein having a dipeptide synthesizing activity, a protein for dipeptide synthesizing, a method for producing a protein having a dipeptide synthesizing activity, a protein having a dipeptide synthesizing activity, or a dipeptide using the peptide synthesizing protein.
  • the present invention relates to a microorganism or a transformant which produces a protein having a peptide synthesizing activity or a protein for the synthesis of a peptide, and a method for producing a peptide using a Sze microorganism or a transformant.
  • Known methods for mass synthesis of peptides include chemical synthesis (liquid-phase method and solid-phase method), enzymatic synthesis, and biological synthesis using recombinant DNA.
  • enzymatic synthesis or biological synthesis is used for peptides with long chains of 50 residues or more, and chemical synthesis and enzymatic synthesis are mainly used for peptides.
  • Synthesis of peptides by chemical synthesis requires operations such as protection and deprotection of functional groups, and because racemates are also synthesized, chemical synthesis is not economical and efficient. I can't say.
  • the chemical synthesis method is not preferable in terms of environmental hygiene since a large amount of an organic solvent or the like is used.
  • NRPS non-ribosomal peptide synthase
  • thermostable aminoacyl-t-RNA synthetase has a problem that it is difficult to express the enzyme and to prevent by-product reactions other than the target product.
  • the DNA recombination method was used because the enzyme molecules were huge. Therefore, it is difficult to express the enzyme, and it is necessary to supply a coenzyme, 4'-phosphopantetheine, which is not an efficient production method.
  • the enzyme has a smaller molecular weight than NRPS and does not require the coenzyme 4'-phosphopantetheine, such as selenium-minolecystin synthase, glutamyl cysteine synthetase, and glutathione synthetase.
  • a group of peptide synthases is also known. Most of these enzymes have characteristics such as using a D-amino acid as a substrate or catalyzing the formation of a peptide bond at a carboxyl group at the ⁇ -position. It cannot be used for the synthesis of dipeptides.
  • basilin synthase a dipeptide antibiotic derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus, that is known to produce dipeptides by the activity of forming a peptide bond at the carboxyl group at the L-amino acid position. It is known that basilicin synthase has an activity to synthesize basilicin (L-aralanyl-L-anticapsin, L-Ala-L-anticapsin) and L-aralanyl-L-alanan (L-Ala-L-Ala). However, the synthetic activity of other dipeptides is not known [J. Ind. Microbiol., 2, 201-208 (1987) and Enzyme. Microbial. Techno 1, 29, 400-406 (2001). See].
  • An object of the present invention is to have a peptide synthesizing activity other than L-alanyl-L-alanine (L-Ala-L-Ala), for which no enzymatic synthesis method using peptide synthase or the like is known.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a peptide using a product or the like as an enzyme source.
  • the present invention relates to the following (1) to (21).
  • amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 8 the amino acid sequence comprises one or more amino acids deleted, substituted or added, and the formula (I)
  • R 1 and R 2 represent the same or different amino acids, but do not represent L-alanine at the same time).
  • a protein comprising an amino acid sequence having at least 65% homology with the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 8, and having an activity of synthesizing the dipeptide represented by the formula (I).
  • R 1 and R 1 are the same or different and represent amino acids, but do not represent L-alanine at the same time).
  • DNA having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 10 to 16 and 36 [3] Base sequence complementary to a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 9 to 16 and 36 Hybridizes under stringent conditions with the DNA having the sequence, and has the formula (I) R 1- : R 2 (I)
  • R 1 and R 2 represent the same or different amino acids but do not represent L-alanine at the same time).
  • the transformant according to any one of the above (5) to (7) is cultured in a medium, and the protein of the above (1) is produced and accumulated in a culture.
  • the method for producing a protein according to the above (1) is cultured in a medium, and the protein of the above (1) is produced and accumulated in a culture.
  • the microorganism Bacillus (10) is a microorganism belonging to the genus (9) above manufacturing method of 0 '
  • microorganism belonging to the genus Bacillus is a microorganism belonging to the genus Bacillus having an ability to produce bacillin.
  • Microorganisms belonging to the genus Bacillus that have the ability to produce basilicin include Bacillus subtilis, Bacillus' Bacillus amyloliguefaciens, Bacillus coagulans, and Bacillus coculans. licheniformis), Bacillus megaterium (Bacillus megaterium) and Bacillus pumilus (Bacillus pumilus) The method according to the above (11), which is a microorganism belonging to a certain species.
  • the protein for synthesizing the protein of the above (1) or the dipeptide of the above (2), at least one kind of amino acid, and ATP are made to exist in an aqueous medium, and the compound of the formula (I)
  • R 1 and R 2 represent the same or different amino acids, but do not represent L-alanine at the same time
  • R 1 and R 2 represent the same or different amino acids but do not represent L-alanine at the same time, produce and accumulate the dipeptide represented by the formula: And a method for producing the peptide.
  • a culture of the transformant according to any one of the above (5) to (7) or a processed product of the culture [2] Culture of a microorganism having an ability to produce the protein of the above (1) [3] A culture of a microorganism having the ability to produce the protein for synthesizing the peptide of the above (2) or a processed product of the culture
  • the microorganism belonging to the genus Bacillus having the ability to produce basilicin is selected from the group consisting of Bacillus' Satiris, Bacillus' amyloliquefaciens, Bacillus' coagulans, Bacillus reniformis, Bacillus megaterium and Bacillus pmirus.
  • the microorganism having the ability to produce the protein for synthesizing the dipeptide of the above (2) may be a microorganism containing a recombinant DNA containing DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, or a Bacillus subtilis.
  • the method according to the above (18), wherein the microorganism containing the recombinant DNA containing the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 is a microorganism belonging to the genus Escherichia.
  • the processed product of the culture is a culture concentrate, a dried culture, a cell obtained by centrifuging the culture, a dried cell, a freeze-dried cell, Surfactant treated cells, ultrasonically treated cells, mechanically milled cells, solvent-treated cells, enzyme-treated cells, and bacterial cells.
  • R 3 and R 4 are the same or different, and L-alanine, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-valine, L-mouthlet, L-isoleucine, L-proline, L-fe Dilualanine, L-tryptophan, L-methionine, L-serine, L-threonine, L-cystine, L-asparagine, L-tyrosine, L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-aspartic acid, L-Hiichi Aminobutyric acid, ⁇ -alanine, L-azasserine, L-theanine, L-14-hydroxyproline, L-3-hydroxyproline, L-ornithin, L-citrulline and L-6-diazo-5-oxo norleucine (13) but not L-alanine at the same time), wherein the dipeptide is represented by the formula (13) to (20).
  • amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 8 the amino acid sequence comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added;
  • R 1 and: R 2 are the same or different and represent amino acids but do not represent L-alanine at the same time
  • Examples of the protein for synthesizing the dipeptide represented by the formula (I) of the present invention include a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the protein of the present invention and the protein for synthesizing the dipeptide represented by the formula (I) may be collectively referred to as the protein of the present invention.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having the activity of synthesizing the dipeptide represented by the formula (I) is a Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Edition. Spring Harbor Laboratory Press (1989) (hereinafter abbreviated as "Molecular 'Cloning 2nd Edition"), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter "Current Protocols in' Molecular” ⁇ Biology), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13,, Natl.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited. , Preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 8 means that one or more amino acids are deleted or substituted at any position in the same sequence. Or it may be added.
  • -Amino acid-substituteable amino acids include, for example, those conserved in all amino acid sequences when amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 8 are compared using known alignment software. Diamino acids can be given.
  • Known alaime For example, alignment software included in the gene analysis software Genetyx (Software Development Co., Ltd.) can be used as the component software. As an analysis parameter of the analysis software, a default value can be used.
  • amino acid positions at which amino acids can be deleted or added include, for example, the N-terminal side and the C-terminal side of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOS: 1 to 8.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-methionine — Phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • amino acids that can be substituted for each other.
  • Amino acids included in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, norin, norparin, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, 0-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group D lysine, arginine, ordinine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminobromoionic acid
  • Group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • the protein of the present invention In order for the protein of the present invention to be represented by the formula (I) and to have dipeptide synthesizing activity, it must be represented by the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 8, and preferably represented by SEQ ID NO: 1.
  • the homology with the amino acid sequence is at least 65%, preferably at least 75%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%, most preferably.
  • the homology is at least 98%.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is a region conserved among proteins having the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 7, and has an Ala-Ala ligase activity of various microorganisms. This is a region corresponding to the consensus sequence of the protein.
  • a protein having an activity of synthesizing a dipeptide is also a protein of the present invention (however, except for a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1).
  • a protein having an amino acid sequence having homology of 80% or more, preferably 90% or more, and more preferably 95% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is synthesized with the dipeptide represented by the formula (I).
  • homology between the amino acid sequence of the protein and the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 8 must be at least. It is preferable that the homology is at least 80%, usually at least 90%, especially at least 95%.
  • Amino acid sequence homology can be determined using BLAST or FASTA as described above.
  • the protein of the present invention is a protein having the dipeptide synthesizing activity represented by the above formula (I)
  • a transformant expressing the protein of the present invention using a DNA recombination method is used.
  • the protein of the present invention After preparing and producing the protein of the present invention using the transformant, the protein of the present invention, one or more L-amino acids (where L-alanine is used together with other L-amino acids), and ATP In an aqueous medium, and analyzing whether the dipeptide represented by the above formula (I) is produced and accumulated in the aqueous medium by HPLC or the like.
  • the DNA that can be used in the method for producing the dipeptide represented by the formula (I) of the present invention the DNA described in the above [5:] to [8] and the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 DNA consisting of:
  • the DNA capable of hybridizing under the above-mentioned stringent conditions refers to a part or all of a DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 9 to 16 and 36. As used herein, it refers to DNA obtained by using the colony hybridization method, plaque hybridization method or Southern blot hybridization method. After performing hybridization at 65 ° C.
  • a hybridizable DNA at least 7% of the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 9 to 16 can be obtained by calculation based on the above parameters using BLAST, FASTA, and the like described above. DNAs having a homology of 5% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more can be mentioned.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA having the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 9 to 16 and 36 is synthesized by the synthesis of the peptide represented by the formula (I).
  • the DNA encoding the protein having the activity can be confirmed, for example, by producing a protein encoded by the DNA using a recombinant DNA method and measuring the activity of the protein as described above. it can.
  • the DNA of the present invention and the DNA used in the method for producing the protein or dipeptide of the present invention are represented by, for example, SEQ ID NOs: 9 to 16 and 36.
  • the DNA of the present invention or the DNA used in the production method of the present invention can be obtained from the chromosomal DNA of a living organism having the salt sequence, a cDNA library, or the like by the method described above.
  • the obtained DNA can be used as it is or cut with an appropriate restriction enzyme or the like, incorporated into a vector by a conventional method, and the obtained recombinant DNA can be introduced into host cells.
  • DNA Sequencer-1 Perkin-Elma Inc.
  • the nucleotide sequence of the DNA can be determined.
  • a full-length DNA is obtained by Southern hybridization—a method of chromosomal DNA library using the partial-length DNA as a probe. can do.
  • the desired DNA can be prepared by chemical synthesis using a Perceptive's Biosystems 8905 type DNA synthesizer or the like.
  • Examples of the DNA obtained as described above include DNA having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 9 to 16 and 36.
  • Examples of vectors for incorporating the DNA of the present invention and the DNA used in the production method of the present invention include Bluescriptll KS (+) (manufactured by Stratagene) and DIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]. ], PCR-Script Amp SK (+) (Stratagene), T7Blue (Novagen), PCRII (Invitrogen) and pCR-TRAP (Genehan Yuichisha) Manufactured).
  • Examples of host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • Examples of microorganisms belonging to the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli Escherichia coli XLl-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli E. coli DH1, Escherichia coli, Neririchia coli 1000, Escherichia coli ATCC 12435, Escherichia coli.
  • Coli WU85 Escherichia coli KJ109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli. it can.
  • Any method for introducing the recombinant DNA can be used as long as it is a method for introducing the DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]
  • the protoplast method JP-A-63-248394
  • electroporation method Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)
  • microorganism containing DNA used in the production method of the present invention obtained by the above method examples include, for example, Escherichia coli, which is a microorganism having a recombinant DNA containing a DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 1. Cori ⁇ 522 / PPE43. (ii) Method for producing the protein of the present invention
  • the protein of the present invention can be prepared by the method described in (i) above, for example, by the method described in Molecular 'Clothing Second Edition, Current Protocols in' Molecular Biology, etc.
  • the DNA of the present invention obtained by the above and the DNA used in the production method of the present invention can be expressed in host cells for production.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the protein of the present invention is prepared. Further, by substituting a base such that the nucleotide sequence of the portion encoding the protein becomes an optimal codon for expression in a host, the production rate of the protein can be improved. Recombinant DNA is prepared by inserting the DNA fragment downstream of the appropriate expression vector promoter.
  • a transformant producing the protein of the present invention By introducing the recombinant DNA into a host cell suitable for the expression vector, a transformant producing the protein of the present invention can be obtained.
  • a host cell any cell that can express the gene of interest, such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, can be used.
  • the expression vector contains a promoter at a position capable of autonomous replication in the host cell or integration into a chromosome and capable of transcribing the DNA of the present invention or the DNA used in the production method of the present invention. Is used.
  • the DNA of the present invention or the recombinant DNA having the DNA used in the production method of the present invention can be replicated autonomously in the prokaryote. It is preferably a recombinant DNA comprising a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention or the DNA used in the production method of the present invention, or a transcription termination sequence. A gene that controls the promoter may be included. .
  • pBTrp2 pBTacls pBTac2 (both manufactured by Boehringer Mannheim), pHelixl (manufactured by Roche Diagnostics), PKK233-2 (Amersham 'Pharmacia' Biotech), pSE280 ( Invitrogen), pGEM-l (Promega), pQE-8 (Qiagen), pET-3 (Novadin), pKYPIO (Tokukaisho 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem. , 48> 669 (1984)] pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53/277 (1989)], pGELl [Proc. Natl.
  • Any promoter may be used as long as it functions in a host cell such as Escherichia coli.
  • ii - defense Promo Isseki one p tra
  • 1 promoter (P o) P L promoter evening one [rho beta promoter, promoters from P SE such promoters, E. coli and file temporary like
  • the promoter Isseki one obtained by two series of P trp, promoter, lacT7 promoter, the let I promoter evening can be used promoter evening one like that are artificially designed modified strange as one.
  • a P54-6 promoter for expression in tiny cattle belonging to the genus Conmebacterium "Appl. Microbiol. 'Biotechnol., 53, 674-679 (2000)] and the like can also be used.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not always necessary, but the transcription termination sequence is arranged immediately below the structural gene. Is preferred.
  • An example of such a recombinant DNA is pPE43.
  • Prokaryotes include the genus Escherichia, the genus Serratia, the genus Bacillus, the genus Brevibacteriuin, the genus Corynebacterium, the genus Microbacterium, the genus Pseudomonas, and the genus Pseudomonas.
  • Glucyum michael (Corynebacteri orchid glutamicum) ATCC13032, Corynebacterium gulceumumum ATCC14297, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC14297, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC14297 Bacterium 'Ammonia Film (' Microbacterium ammoniaphilum ') ATCC15354, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia rickefaciens
  • Arthrobacter aurescens Arthrobacter citreus, Arthrobacter globformis, Arthrobacter globformis, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter hydros.
  • Lipram (Rhodospiri llum rubrum), mouth dospirylum salicigenes ( Rhodosuim lum salexigens, Mouth dospirium .Salinarum (Rhodospiri llum salinarum), Streptomyces .Ambofaciens (Streptomyces ambofaciens), Streptomyces ), Streptomyces fungi cidicus, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces livites, (Streptomyces olivogriseus), Streptomyces rameus, Streptomyces rastaus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces binaseus (Streptomyces vina) ceus), Zymomonas mobilis and the like.
  • Any method for introducing the recombinant DNA can be used as long as it is a method for introducing the DNA into the main cells.
  • a method using calcium on [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69> 2110 (1972)]
  • the protoplast method JP-A-63-248394
  • the electroporation method [Nucleic Acids Res ,, 16, 6127 (1988)]
  • YEpl3 ATCC37H5
  • YEp24 ATCC37051
  • YCp50 ATCC37419
  • pHS19 pHS15, etc.
  • Any promoter may be used as long as it functions in a yeast strain.
  • PH05 Promoter PGK Promoter, GAP promoter, ADH Promoter, gal1 Promoter 1.
  • Promoters such as gal 10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MF: l promoter, and CUP 1 promoter.
  • Host cell binding includes Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwanniomyces, and Pichia.
  • yeast strains belonging to the genus (Pichia) or Candida and specifically, Saccharomyces saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombej, and Kufleiromyces.
  • ⁇ Lacteis Keluyveromyces lactis
  • Trichosporon ⁇ 'Prechorance Trichosporon pullulans
  • Siniomyces albius Sc warmiomyces alluvius
  • Pichia pastoris Pichia pastoris
  • Candida utilis Candida utilis.
  • any method can be used as long as it introduces DNA into yeast.
  • the method can be carried out by using an electrolysis method [Methods Enzymol., 194, 182 (1990)]. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)], lithium acetate method [J. Bacteriol ,, 153, 163 (1983)], and the like.
  • electrolysis method Methods Enzymol., 194, 182 (1990)
  • lithium acetate method J. Bacteriol ,, 153, 163 (1983)
  • examples of the expression vector include pcDNAI and pcDM8.
  • any promoter can be used as long as it functions in animal cells.
  • the promoter of the cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early) gene, the early promoter of SV40 or the promoter of metallothionein 1, Retrovirus promotion, Heatshock promotion, SR promotion promotion, etc. I can give it.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Host cells include mouse myeloma cells, rat myeloma cells, mouse hybridoma cells, Namalwa cells or Namalva KJM-1 cells, human embryonic kidney cells, human cells Leukemia cells, African green monkey kidney cells, Chinese hamster Itoda vesicles, CH0 cells, HBT5637 (JP-A-63-299), and the like.
  • Mouse / myeloma cells SP2 / 0, NS0, etc .
  • Rat 'myeloma cells YB2 / 0, etc .
  • human fetal kidney cells HEK293 (ATCC CRL-1573);
  • human leukemia cells BALL- Examples of African green monkey kidney cells include COS-1 and COS-7. '
  • any method can be used as long as it is a method for introducing the DNA into animal cells.
  • the electoral port method [Cytotechnology, 3, 133 (1990) ']
  • the calcium phosphate method particularly, Natl. Acad, Sci., USA, 8> 7413 (1987)]
  • Virology, 52, 456 (1973) and the like.
  • Baculovirus Expression Vectors A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992), Rent-Rent-Mouth, Molecular-Noirology, Molecular Proteins can be produced by the method described in Biology, A Laboratory Manua Bio / Technology, 6, 47 (1988).
  • the recombinant gene transfer vector and the baculovirus are co-transfected into insect cells to obtain recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is infected to insect cells to produce proteins. be able to.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include, for example, pVL1392, pVL1393, pBlueBacII (all manufactured by Invitrogen) and the like.
  • baculovirus for example, an autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects insects of the night moth family, can be used.
  • insect cells ovary cells of Spodoptera frugiperda, ovary cells of Trichoplusia ni, cultured cells derived from silkworm ovary, and the like can be used.
  • the ovarian cells of Spodoptera frugiberda include Sf9, Sf21 (Baculovirus .igspression, vectorizer 'Laboratory 1' manual), and so on.
  • Examples of cultured cells derived from chick ovaries such as 5B1-4 (manufactured by Invitrogen) include Bomby mori N4.
  • Examples of a method of co-introducing the above-mentioned recombinant gene introduction vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include a calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075) and a lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 741-3 (1987)].
  • examples of the expression vector include Ti plasmid, tobacco mosaic virus vector, and the like.
  • Any promoter may be used as long as it functions in plant cells.
  • the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV), the rice actin 1 promoter, etc. may be used. it can.
  • Examples of the host cell include plant cells such as tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, rape, alfaalpha, rice, wheat, and wheat.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • a method using Agrobacterium Japanese Patent Laid-Open No. 59-140885, 60-78080, WO94 / 00977
  • an electro-volatilization method JP-A-60-251887
  • a method using a particle gun (gene gun) Japanese Patent No. 2517813
  • sugar or sugar chain-added protein When expressed by yeast, animal cells, insect cells or plant cells, a sugar or sugar chain-added protein can be obtained.
  • the protein By culturing the transformant obtained as described above in a medium, producing and accumulating the protein of the present invention in the culture, and collecting the protein from the culture, the protein can be produced.
  • the host of the transformant for producing the protein of the present invention may be any of bacteria, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc., but is preferably bacteria, more preferably bacteria.
  • the method for culturing the above transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a medium for culturing a transformant obtained by using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be used by the organism.
  • a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast
  • a eukaryote such as yeast
  • a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be used by the organism.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently culture the transformant.
  • Any carbon source may be used as long as the organism can assimilate; glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid, propionic acid, and ethanol. And alcohols such as propanol.
  • nitrogen source examples include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and the like, ammonium salts of inorganic or organic acids, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, and corn starch. Plyka, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, and digested cells thereof can be used. '
  • potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, carbonated calcium carbonate and the like can be used.
  • the cultivation is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culturing temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culturing time is usually 5 hours to 7 days.
  • the culture maintain the pH at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin-tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium.
  • an inducer may be added to the medium.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • a medium for culturing the transformant obtained using animal cells as a host commonly used RPMI1640 medium [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)], Eagle's MEM Medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)] ⁇ 199 medium [Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)] or a fetal calf A medium or the like to which serum or the like has been added can be used.
  • Culture is usually at pH 6-8, 25-4Q ° C! Performs 5% C 0 2 present 1 to 7 days under conditions such as lower. If necessary, antibiotics such as kanamycin, penicillin, and streptomycin may be added to the medium during the culturing.
  • Cultivation is usually carried out at pH 6-7, 25-30 ° C, etc. for 1-5 days.
  • an antibiotic such as genyumycin may be added to the medium during the culturing.
  • the transformant obtained using the plant cell as a host may be differentiated as a cell or into a plant cell or organ. And can be cultured.
  • the medium for culturing the transformant may be a commonly used Murashige 'and' Skoog (MS) medium, a white medium, or a medium to which plant hormones such as auxin and cytokinin are added. Etc. can be used.
  • the cultivation is usually performed at pH 5 to 9 and 20 to C for 3 to 60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • the DNA of the present invention or the DNA used in the production method of the present invention must be expressed.
  • a transformant derived from a microorganism, insect cell, animal cell, or plant cell having the recombinant DNA linked to a vector is cultured according to a conventional culture method to produce and accumulate the protein of the present invention. By collecting the protein, the protein can be produced.
  • Methods for producing the protein of the present invention include a method for production in a host cell, a method for secretion outside the host cell, and a method for production on the host cell outer membrane. It can change the structure of proteins.
  • a protein containing the active site of the protein of the present invention is produced by adding a signal peptide in front of the protein using the technique of gene recombination, whereby the protein is actively secreted outside the host cell. be able to.
  • the production amount can be increased by using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • the cells of the transgenic animal or plant are subdivided to produce an animal (transgenic non-human animal) or plant (trans digenic plant) into which the gene has been introduced. Can be used to produce the protein of the present invention.
  • the transformant producing the protein of the present invention is an animal or plant individual, it is bred or cultivated to produce and accumulate the protein according to a conventional method, and the protein is collected from the animal or plant individual. Thus, the protein can be produced.
  • the protein of the present invention is produced and accumulated in the animal, and the protein can be collected from the animal to produce the protein.
  • a place where the protein is produced and accumulated in the animal include milk of the animal (JP-A-63-309192), eggs and the like.
  • the promoter used in this case any promoter that functions in animals can be used.
  • the casein promoter, casein promoter, which is a promoter specific to mammary gland cells can be used. Lactoglobulin promoter overnight, whey acidic protein promoter overnight, and the like are preferably used. .
  • a transgenic plant into which a DNA encoding the protein of the present invention has been introduced can be prepared by a known method [tissue culture, ⁇ (1994), tissue culture, 21 ( 1995), Trends Biotechnol., 15, 45 (1997)], producing and accumulating the protein in the plant, and collecting the protein from the plant to produce the protein. There is a method.
  • the cell when the protein of the present invention is produced in a lysed state in a cell, the cell is recovered by centrifugation after completion of the culture, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, French press, Menton. The cells are disrupted using a Gaulin homogenizer, Dynomill or the like to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using a resin such as ethylaminoethyl (DEAE) '-Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Kasei), and a resin such as S-Sepharose (Pharmacia) Cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose, phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing
  • a purified sample can be obtained by using techniques such as electrophoresis alone or in combination.
  • the cells are similarly recovered. After the protein is recovered from the precipitate fraction obtained by crushing and centrifuging, the protein is recovered by a conventional method, and the insoluble form of the protein is dissolved with a protein denaturant.
  • a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein of the present invention or a derivative thereof such as a modified sugar thereof is secreted extracellularly, the protein or a derivative such as a sugar adduct thereof can be recovered in the culture supernatant.
  • a soluble fraction is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified preparation is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. Obtainable.
  • Examples of the protein thus obtained include a protein having the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 8.
  • the protein of the present invention can be produced as a fusion protein with another protein, and purified by affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein. Natl. Acad. Sci., USA, 86> 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], et al., JP-A-5-336963, WO94 / 23021. According to the method, the protein of the present invention can be produced as a fusion protein with protein A and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G.
  • the protein of the present invention can be produced as a fusion protein with an F1ag peptide and purified by affinity chromatography using an anti-F1ag antibody [Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)]. Furthermore, the protein can be purified by affinity chromatography using an antibody against the protein itself.
  • the present invention can be carried out by a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), etc.
  • Protein can be produced.
  • Chemical synthesis using peptide synthesizers such as Advanced ChemTech, Nokinkin Enorema, Pharmacia, Protein Technology Instrument ⁇ Synthecel l-Vega, PerSeptive, and Shimadzu Corporation. It can also be synthesized.
  • the method for enzymatic production of a dipeptide includes the steps of causing the protein of the present invention, one or more amino acids, and ATP to be present in an aqueous medium and producing and accumulating the dipeptide represented by the formula (I) in the medium. And collecting the dipeptide from the medium.
  • one or more amino acids, preferably one or two amino acids, used as a substrate are amino acids, preferably L-amino acids, and glycine, unless L-alanine is used as one amino acid. Any amino acid may be used in any combination as long as it is an amino acid selected from the group consisting of (Gly) and /?-Alanine (? Ala).
  • L-amino acids examples include L-alanine (L-Ala), L-glutamic acid (L-Gin), L-glutamic acid (L-Glu), L-valine (L-Val), and L-leucine (L-leucine).
  • More preferred amino acids used in the above production method include one amino acid selected from L-Ala, Gly, L-Met, L-Ser, L-Thr and 5-Ala, and L-Ala, L-Gln , L-Glu ⁇ Gly, L-Val, L-Leu ⁇ L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L- Ser ⁇ L-Thr ⁇ L-Cys, L-Asn , L-Tyr s L-Lyss L - Arg, L-His N L-Asp s L- - ⁇ s -?
  • L-Azaserine s L-theanine Ala, L-Azaserine s L-theanine, L- 4- HYP, L-3- HYP, L -0m, a combination of one amino acid selected from L-Cit and L-6-diazo-5-oxo-norleucine (however, excluding a combination of L-Ala), a combination of L-Gin and L-Phe, And a combination of L-H-AB and L-Gln, L-Arg or L-H-AB, more preferably L-Ala and L-Gin ⁇ Gly ⁇ L-Val, L-Leu, L-lye ⁇ L- Phe, L-Trp ⁇ L- Met, L- Ser, One amino acid selected from L-Thr s L-Cys, L-Asn, L-Tyr N L-Lys L-Arg, L-His, L-a AB, L-Azaserine s L-Cit and L
  • the protein of the present invention is added in an amount of 0.01 to 100 mg, preferably 0.1 to 10 mg, per mg of amino acid used as a substrate.
  • the amino acid used as a substrate is added to an aqueous medium initially or during the reaction so as to have a concentration of 0.1 to 500 g / L, preferably 0.2 to 200 g / L.
  • ATP used as an energy source is used at a concentration of 0.5 mol / L or more; LOmol / L.
  • the aqueous medium used in the above production method may be an aqueous medium of any component and composition as long as it does not inhibit the production reaction of the peptide, for example, water, phosphate, carbonate, acetate, Examples include buffers such as borate, citrate, and tris. Further, they may contain alcohols such as methanol and ethanol, esters such as ethyl acetate, ketones such as acetone, and amines such as acetamide.
  • the dipeptide formation reaction is carried out in an aqueous medium at pH 5 to II, preferably ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 6 to 10, 20 to 50 ° C, and preferably 25 to 45 ° C, for 2 to 150 hours, preferably 6 to 120 hours.
  • Examples of the dipeptide produced by the above method include a dipeptide represented by the formula (I).
  • R 1 and R 2 are simultaneously or different from each other, and L-Ala ⁇ L -.
  • Dipeptide which is an amino acid selected from L-6-diazo-5-oxo-norleucine (however, R 1 And R 2 are not L-Ala at the same time) and more preferably R 1 is L-Ala ⁇ Gly, L-Met, L-Ser, L-Thr or /?-Ala If R 2 is L-Gln, L-Glu, Gly ⁇ L-VaK L- Leu ⁇ L-, Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L- Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr s L-Lys s L-Arg L-His, L-Asp s La-AB,?
  • L-Ala L-Azaserine s L-theanine, L + HYP ⁇ L -3-HYPs L-0rn, L-Cit or L-6-diazo-5-oxo-norleucine, and more preferably, when: 1 is L-Ala, R is 2 L- Gln, Gly, L- Val, L-Leu N L- I le, L- Phe, L-Trp s L- Met, L-Ser N L-Thr, L- Cys, L- Asn, L -Tyr, L-Lys N L- Arg L_His, L- ⁇ - ⁇ , L-Azaserine s L - theanine or L - if di peptide is Cit, R 1 is Gly, R 2 is L-Gln, Gly , L-Phe, L-Trp s L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Tyr ⁇ L-L
  • Dipeptide For Met is L- Phe, L-Met N L- Cys, L-Tyr ⁇ L- Lys or L- His
  • R 1 is L-
  • Ser is a dipeptide which is L-Gln, Gly ⁇ L-Phe ⁇ L-Met ;, L- Ser, L- Thr ⁇ L-Tyr ⁇ L-His or L-hy-AB, R 1 Is L-Thr
  • R 2 is a dipeptide that is L-Gln, L-Leu, L-Phe L-Met, L-Ser, L-Thr or L-hy-AB
  • R 1 is L-Gin
  • R 2 is a dipeptide that is L-Phe or L- ⁇ - ⁇
  • R 1 is L-Phe
  • R 2 is a peptide that is L-Gln
  • R 1 is L-Trp
  • R 2 is a dipeptide is Gly
  • R 1 is L-Cys
  • R 1 is L-C
  • R 2 is a dipeptide that is L-Phe, L-Met or L-His, and R 1 is L-Arg If R 2 is L- - di peptidyl de is AB, if R 1 is L- His, R 2 is a dipeptide is L-Met, and R 1 is L- Fei - For AB, R 2 is L- Ala, it can be mentioned a AB Jipepu tide - L- Gln, Gly, L T Ser, L- Thr, L-Arg or L-.
  • a transformant having the ability to produce the protein of the present invention, or the protein of the present invention is produced.
  • a culture of a microorganism having the ability or a processed product of the culture is used as an enzyme source, and the enzyme source and one or more amino acids are present in an aqueous medium.
  • Examples of the method for producing the peptide include sampling the peptide.
  • Examples of the transformant used in the above production method include a transformant that produces the protein of the present invention, which can be produced by the method (ii) above.
  • Examples of the host of the transformant include bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and the like, plant cells, and the like, and preferably bacteria, more preferably microorganisms belonging to the genus Escherichia, Bacillus, or Corynebacterium. Can be.
  • the microorganism belonging to the genus Escherichia can be preferably a microorganism belonging to the genus Escherichia coli, and the microorganism belonging to the genus Bacillus can be preferably a microorganism belonging to Bacillus subtilis or Bacillus megaterium, and the like.
  • Preferable examples of the microorganism belonging to the genus Corynebacterium include microorganisms belonging to Corynebacterium glutamicum or Corynebacterium ammonia ammoniagenes.
  • the microorganism used in the above production method may be any microorganism as long as it is a microorganism capable of producing the protein of the present invention, preferably a microorganism belonging to the genus Bacillus, more preferably a Bacillus having a basilicin synthesizing activity.
  • a microorganism belonging to the genus more preferably a microorganism selected from the group consisting of Bacillus subtilis, Bacillus amilorike fascientus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium and Bacillus pumilus, most preferably.
  • Bacillus subtilis ATCC15245 Bacillus subtilis ATCC6633, Bacillus subtilis IAM1213, Bacillus subtilis IAM1107, Bacillus subtilis IAM1214, Bacillus subtilis ATCC9466, Bacillus' subtilis IAM1033, Bacillus subtilis ATCC It is possible to increase the microorganisms that are selected Bareru stock from the group consisting of Luz-Ami opening Li Kefashiensu IFO3022 and Bacillus pumilus NRRL B- 12025.
  • Examples of the processed product of the culture include a concentrate of the culture, a dried product of the culture, cells obtained by centrifuging the culture, a dried product of the cells, a lyophilized product of the cells, and a lyophilized product of the cells.
  • Surfactant treated product ultrasonically treated product of the cells, mechanically milled product of the cells, solvent-processed product of the cells, enzyme-processed product of the cells, protein fractionation of the cells Products, immobilized products of the cells, and enzyme preparations obtained by extraction from the cells.
  • the type of amino acid used as the substrate, the concentration used and the timing of addition , And the dipeptide produced are the same as those in the enzymatic production method of (1) in (iii) above.
  • the aqueous medium used in the production method using the culture of the microorganism or the processed product of the culture as an enzyme source includes, in addition to the aqueous medium used in the enzymatic production method (1) of the above (iii), A culture of a transformant or a microorganism used as an enzyme source can also be used as an aqueous medium.
  • ATP or a compound capable of producing ATP by metabolism of a transformant or a microorganism for example, a sugar such as glucose, an alcohol such as ethanol, Organic acids such as acetic acid can be added to the aqueous medium.
  • a surfactant or an organic solvent may be added to the aqueous medium.
  • the surfactant include nonionic surfactants such as polyoxyethylene octadecylamine (for example, Nimin S-215, manufactured by NOF Corporation), and cetyltrimethylammonium-promide-alkyldimethyl.benzylammonium.
  • Cationic surfactants such as muchloride (eg, Cation F2-40E, manufactured by NOF Corporation), anionic surfactants such as lauroyl'sarcosine, alkyldimethylamine (eg, tertiary amine FB, NOF Corporation)
  • anionic surfactants such as lauroyl'sarcosine, alkyldimethylamine (eg, tertiary amine FB, NOF Corporation)
  • Any of the tertiary amines, such as tertiary amines, which promotes the production of dipeptides, may be used alone or in combination of one or more.
  • the surfactant is usually used at a concentration of 1 to 50 g.
  • the organic solvent include xylene, toluene, aliphatic alcohol, acetone, and ethyl acetate, which are usually used at a concentration of 0.1 to 50 ml.
  • the amount of the enzyme source varies depending on the specific activity of the enzyme source.
  • the wet cell weight is 5 to 1000 mg per mg of the amino acid used as the base.
  • 10 to 400 mg is added.
  • the dipeptide formation reaction is carried out in an aqueous medium at pH 5 to II, preferably pH 6 to 10, 20 to 65 ° C, preferably 25 to 55 ° C, more preferably 30 to 45 ° C, usually for 1 minute.
  • the reaction is performed for up to 150 hours, preferably for 3 minutes to 120 hours, more preferably for 30 minutes to 100 hours.
  • the diptide generated and accumulated in the aqueous medium can be collected by a usual method using activated carbon or an ion exchange resin, or It can be performed by extraction with an organic solvent, crystallization, thin-layer chromatography, high-performance liquid chromatography, or the like.
  • FIG. 1 is a diagram showing the construction process of plasmid pPE43.
  • FIG. 2 is a diagram showing the construction process of plasmid pQE60ywfE.
  • l represents the E gene derived from Bacillus subtilis 168 strain
  • PkE represents the tryptophan promoter overnight gene
  • T5 promoter overnight gene represents the E gene derived from Bacillus subtilis 168 strain
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33, 34 or 35 which is the D-Ala-D-Ala ligase motif [Biochemistry, 30, 1673 (1991)] was coded.
  • SEQ ID NO: 33, 34 or 35 which is the D-Ala-D-Ala ligase motif [Biochemistry, 30, 1673 (1991)] was coded.
  • SEQ ID NO: 9 shows the nucleotide sequence of l
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of the protein encoded by the nucleotide sequence.
  • Bacillus subtilis 168 strain (ATCC 23857) was inoculated into an LB medium [10 ⁇ 1 bactotributone (Difco), 5 g / l yeast extract (Difco), 5 g / l sodium chloride] at 30 ° C. For 10 minutes. After culturing, the microorganism can be isolated from the microorganism by a method using a saturated phenol described in the current “Protocols in Molecular Biology”. Chromosomal DNA was isolated and purified.
  • Primer A is obtained by adding a nucleotide sequence containing an l recognition sequence to the 5 'end of a region containing the initiation codon of l of Bacillus' subtilis chromosome DNA.
  • Primer B is obtained by adding a base sequence containing a recognition sequence to the 5 'end of a base sequence complementary to a sequence containing a stop codon of l.
  • Primer C is the 5 'end of the nucleotide sequence of the i £ promoter overnight region of the expression vector pTrS30 (prepared from Escherichia coli JM109 / pTrS30 (FERM BP-5407)) containing the i
  • Primer D is a sequence obtained by adding a nucleotide sequence containing a 1 I recognition sequence to the 5 'end of a sequence complementary to the sequence of the il promoter region of the expression vector pTrS30 containing the t promoter.
  • the above primers A and B were used for the amplification of the gene fragment, and the chromosomal DNA of Bacillus subtilis was used as type II.
  • the primers C and D were used for the amplification of the promoter region fragment.
  • PCR was performed using pTrS30 as a ⁇ type.
  • the PCR was 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA or 10 ng of pTrS30 as a type III, each primer of ⁇ . ⁇ /, 2.5 units of DNA polymerase (manufactured by Stratagene), and 4 ⁇ L of ⁇ DNA polymerase.
  • the DNA was dissolved in 20 / L of TE. Using 5 L of each of the lysates, the DNA amplified with the primer A and the primer B was digested with the restriction enzymes I and ⁇ , and the DNA amplified with the primers C and D was digested with the restriction enzymes and l. After separating the DNA fragments by agarose gel electrophoresis, using a Geneclean II kit (GENECLEAN II kit, manufactured by BIO 101), the DNA fragment of 1.4 kb containing l and 0.3 kb of DNA containing the ii £ promoter page area was used. Fragments were each recovered.
  • the 1.4 kb fragment containing l, the 0.3 kb fragment and the 4.5 kb fragment containing the ii ⁇ promoter region obtained above were reacted at 16 ° C for 16 hours using a ligation kit (Takara Shuzo). Connected.
  • the reaction mixture was used to transform Escherichia coli 522 (Stratagene) by a method using calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]. Then, the transformant was spread on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin, and then cultured at 30 ° C. overnight.
  • a plasmid was extracted from the grown transformant colonies according to a known method, and its structure was analyzed using restriction enzymes to obtain PPE43, an expression vector in which ywfE was linked downstream of the trp promoter. Confirmed that '( Figure 1).
  • Escherichia coli E. coli 522 (Escherichia coli 522 / pPE43 strain) harboring pPE43 obtained in Example 2 was inoculated into a large test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin. And cultured at 28 ° C for 17 hours.
  • the culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • the wet cells at a final concentration of 60 mg / ml, 120 g / l gallium phosphate buffer (pH 7.4), 60 mmol / L magnesium chloride, Prepare 0.1 ml reaction mixture consisting of ATP of ol / L, 30 ol / L of L-Ala, 30 L of ol / L, L-Gln of 30 ol / L, and 0.4% of Nimeen S-215 at 37 ° C. For 3 minutes. After completion of the reaction, the reaction product was derivatized by the dinitrophenolation method and then analyzed by the HPLC method.
  • the analysis by the HPLC method uses a separation column, Kanto Chemical Co., Ltd., Lichrosorb-RP-18 'column, 1% ( ⁇ / ⁇ ) phosphoric acid, 25% (v / v) acetonitrile as eluent, and 0,
  • the flow rate was 7 ml / min.
  • 12 Omg / L of L-aralanyl-L-glucamine L-Ala-L-Gin
  • primers E and primer F DNAs having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 23 and 24 (hereinafter, referred to as primers E and primer F, respectively) were synthesized.
  • Primer I; E is a nucleotide sequence containing a region in which the start codon (atg) of l has been replaced by an I recognition sequence (cc gg).
  • Primer F is a nucleotide sequence containing a region in which the stop codon of 1 has been replaced with an SHI recognition sequence (gg ⁇ tcc).
  • PCR was performed using the chromosome DNA of Bacillus subtilis 168 strain (ATCC 23857) as type III and the above-mentioned primers E and F as a set of primers.
  • PCR is 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of Pfu DNA polymerase, 4 ⁇ 1 ⁇ ££] 10 buffer for polymerase, 200 ⁇ niol
  • a reaction solution containing / L of each dNTP was prepared, and the process was repeated 30 times at 94 ° C for 1 minute, at 55 ° C for 2 minutes, and at 72 ° C for 3 minutes 30 times.
  • the amplified DNA was cleaved with restriction enzymes l and SHI using 5 zL of the lysate, DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and then a 1.4 kb DNA fragment containing zi was separated using Geneclean 11 kit. Was recovered.
  • CQ-terminal His-tagged recombinant expression vector PQE60 (manufactured by Qiagen) 0.2 g was digested with restriction enzymes l and ⁇ ⁇ , and DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis. A 3.4 kb DNA fragment was recovered in the same manner as described above.
  • the 1.4 kb DNA fragment containing l and the 3.4 kb DNA fragment obtained above were ligated by reacting at 16 ° C for 16 hours using a ligation kit.
  • the Escherichia coli coli 522 strain was transformed by a method using calcium ions, and the transformant was spread on an LB agar medium containing 50 g / ml of ampicillin. Cultured overnight.
  • a plasmid was extracted from the grown transformant colonies according to a known method, and its structure was analyzed using restriction enzymes to obtain pQE60ywfE, a C-terminal His-added yfl expression vector. ( Figure 2).
  • ⁇ 522 / pQE60ywfE was inoculated into a large test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 ig / ml of ampicillin, and cultured at 28 ° C. for 17 hours.
  • the culture was inoculated into a 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin, cultured at 30 ° C. for 3 hours, and then treated with isopropyl acetate so that the final concentration became lmmol / L. /? — D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added, and the cells were further cultured at 30 ° C for 4 hours.
  • IPTG D-thiogalactopyranoside
  • the culture was centrifuged to obtain wet cells, and the His cells were purified from the cells using HisTrap (His-tagged protein purification kit, manufactured by Amersham Pharmasia Biotech) according
  • the reaction product was analyzed in the same manner as in Example 3 above, and was added to the reaction solution at a concentration of 7.0 g / L L-alanyl-L-phenylalanine (L-Ala-L-Phe).
  • reaction products were analyzed in the same manner as in Example 3 described above, and 5.2 g / L of queryl-L-phenylalanine (Gly-L-Phe) or 1.lg was added to the reaction solution. It was confirmed that / L glycyl L-methionine (Gly-L-Met) was produced and accumulated.
  • the l gene product was obtained from L-Ala and L-Gln, L-Phe, L-Met N L-Leu or L-Val in the presence of ATP, and L-Ala—L-Gin and L -Ala—L-Ala, L-Ala—L-Phe, L-Ala- L-Met and L-Al a -L-Al a, L-Al a -L-Leu and L-Al a—L-Al a, or L-Ala-L-Val and L-Ala—L-Ala-forming activity, Gly—L-Phe or Gly—L-Met from Gly and L-Phe or L-Met Was found to have the activity of producing
  • L-amino acids Two types (or one type) of L-amino acids, Gly or /?-Ala, listed in the first row and leftmost column of Table 1, are used as substrates to react with the dipeptides generated in the frame. Described. ⁇ indicates that the sequence was not determined but the peptide was generated, X indicates that the generation of the peptide was not confirmed, and the blank column indicates that the operation was not performed.
  • the Escherichia coli strain 522 / pQE60ywfE obtained in Example 4 was inoculated into a large test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin, and cultured at 28 ° C. for 17 hours. After inoculating the culture solution into a 25 Oml triangular flask containing 5 Oml LB medium containing 50 ⁇ g / ml ambivisin, and culturing at 30 ° C for 3 hours, the final concentration becomes 1 tmol / L. As described above, isopropyl-/?-D-thiogalactobilanoside (IPTG) was added, and the cells were further cultured at 30 ° C for 4 hours.
  • IPTG isopropyl-/?-D-thiogalactobilanoside
  • the culture solution was centrifuged to obtain wet cells. 200 g / L wet cells, 50 g / L glucose, 5 g / L phytic acid (diluted to neutrality with 33% concentrated sodium hydroxide solution), 15 g / L dihydrogen phosphate Potassium, 5 g / L magnesium sulfate 'heptahydrate, 4 g / L Nimeen S-215, 10 ml / L xylene, 200 mmol / L L-Ala, 200 t ol / L L-Gin 20 ml Put the reaction solution (pH7, 2) into a 50ml beaker and place it at 32 ° C! The reaction was carried out at 900 rpm for 2 hours. During the reaction, the pH of the reaction solution was maintained at 7.2 using 2 mol / L of lithium hydroxide.
  • Example 8 Cloning and analysis of the gene corresponding to the ywfE gene from various microorganisms belonging to the genus Bacillus
  • Primer G is a sequence of a region of the chromosome DNA of Bacillus subtilis strain 168 containing ⁇ above the start codon of ywfE.
  • Primer-H is a sequence complementary to a sequence including downstream from the stop codon of ywfE.
  • the 1.4 kb fragment derived from the chromosome DNA of each strain obtained above and pCR-blunt (manufactured by Invitrogen) were ligated by reacting at 16 ° C for 16 hours using a Reigesion kit.
  • Escherichia coli 522 strain was transformed by a method using calcium ions, and the transformant was spread on an LB agar medium containing 50 Adg / ml ampicillin, and then cultured at 30 ° C. did.
  • Plasmids were extracted from the grown transformants in accordance with a known method from the colonies, and their structures were analyzed using restriction enzymes, whereby plasmid pYWFEl (ATCC15245 strain) containing a gene corresponding to the gene was obtained.
  • Bacillus pumilus NRRL B-12025 DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 was obtained as follows.
  • chromosomal DNA of the NRRL B-1225 strain prepared above was transformed into type I, and PCR was performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 27 and 28 as a primer set. went. PCR was performed using 0.1 ⁇ of chromosome 0, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units' of Z-taq polymerase (manufactured by Takara Shuzo), and 5 ⁇ L of X10 buffer for Z-taq polymerase.
  • the 0.8 kb fragment derived from the chromosome DNA of each strain obtained above and pGEM T-easy (promega) were reacted at 16 ° C. for 16 hours using a ligation kit and ligated.
  • Escherichia coli DH5 strain was transformed by a method using calcium ions, and the transformant was spread on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin, and then applied at 30 ° C. Overnight.
  • the plasmid was extracted from the transformant obtained above, and the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of about 0.8 kb was determined. A nucleotide sequence consisting of No. 1 to No. 160 was confirmed.
  • the plasmid was digested with EcoRI, and then DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis.
  • the DNA fragment was purified using GeneClean II kit. About 0.5 ⁇ g of the purified DNA fragment was DIG-labeled using DIG-high-prime DNA labeling and detection kit I (Roche's Diagnostics). DIG labeling was performed according to the instructions attached to the kit.
  • the chromosomal DNA of the NRRL B-12025 strain is completely digested with IHI, ECOR Hindi 11, Kpnl Pstl, Sacl, Sail and il, and the DNA fragments are separated by agarose gel electrophoresis. Transferred to Charge (Roche Diagnostics).
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 29 and 30 were designed and synthesized, and P was performed using the cyclized DNA obtained above as the ⁇ type. .
  • PCR was performed using 10 ng of cyclized DNA, 0.5 mol / L of each primer, 2.5 units of pyrobest polymerase (manufactured by Takara Shuzo), 5 l of pyrobest polymerase x10 buffer (Takara Shuzo) Prepare a 50 ⁇ L reaction mixture containing 200 zmol / L of each dNTP, and repeat the process at 98 ° C for 5 seconds, at & 5 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 3 minutes 30 seconds 30 times It was done by doing.
  • the DNA fragment obtained above and the Zero Blunt PCR Cloning Kit (Invitrogen) were ligated using a ligation kit.
  • Escherichia coli 522 strain was transformed by a method using calcium ions, and the transformant was applied to LB: agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin, and then applied at S0 ° C. Cultured overnight.
  • a plasmid was extracted from a colony of the transformant that had grown according to a known method, By analyzing the structure using a restriction enzyme, pYWFElO (DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 16), a plasmid containing the gene corresponding to the ywfE gene, was obtained. Confirmed that.
  • nucleotide sequence of each of the genes corresponding to those contained in pYWFEl to pYWFE10 obtained above was determined using a nucleotide sequence analyzer 373A 'DNA sequencer.
  • amino acid sequence of the protein encoded by the genes contained in pYWFEl, pYWFE6 and pYWFE7 was identical to the amino acid sequence of the protein encoded by the ywfE gene, but pY ⁇ FE2, pYWFE3, pYWFE4 N pYWFE5 N pY ⁇ FE8
  • amino acid sequence of the protein encoded by the genes contained in pYWFE9 and pYWFElQ was different from the amino acid sequence of the protein encoded by the ywfE gene.
  • pYWFE2, pYWFE3, pY ⁇ FE4, pYWFE5, pY ⁇ FE8, pYWFE9 s pYWFElO and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene corresponding to l contained in pYWFEl and pYWFE7 are shown in SEQ ID NOs: 2 to 8 and 1, The nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOS: 10 to 16 and 36, respectively.
  • PCR was performed using 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of £
  • the amplified DNA is cut with restriction enzymes l and, DNA fragments are separated by agarose gel electrophoresis, and the gene corresponding to DNA fragments were recovered.
  • the Cz-terminal His-added recombinant expression vector pQE60 0.2 z was digested with restriction enzymes l and IHI, the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and the 3.4 kb DNA fragment was isolated in the same manner as described above. The fragments were recovered.
  • Escherichia coli thigh 522 was transformed by a method using calcium ions, and the transformant was spread on an LB agar medium containing 50 g / ml of ampicillin, followed by culturing at 30 ° C. did.
  • Plasmids were extracted from colonies of the transformants that had grown according to a known method, and their structures were analyzed using restriction enzymes, whereby the C-terminal His-tagged gene expression vector pQE60ywfEl.
  • a vector containing a gene pQE60ywfE2 (a vector containing a gene derived from ATCC6633), pQE60ywfE3 (a vector containing a gene derived from IAM1213), pQE60ywfE4 (a vector containing a gene derived from IAM1107), pQE60ywfE5 (a vector containing a gene derived from IAM1214), QE60ywfE6 (a vector containing a gene derived from ATCC9466), pQE60ywfE7 (a vector containing a gene derived from IAM1033), pQE60ywfE8 (a vector containing a gene derived from ATCC21555) ), PQE60ywf
  • Escherichia coli ⁇ 522 / pQE60ywfEl to ⁇ 5222 / pQE60ywfE10 strains obtained above were inoculated into a large test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin at 28 ° C. Culture was performed for 17 hours. After inoculating the culture solution into a 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin, and culturing at 30 ° C. for 3 hours, the final concentration is 1 tmol / L.
  • the mixture was supplemented with isopropyl 1 /?-D-thiogalactobilanoside and incubated at 30 ° C for 4 hours. From the wet cells obtained by centrifuging the culture, HisTrap was used to purify the His-tagged recombinant enzyme.
  • Example 8 all of the gene products obtained in Example 8 were obtained by converting L-Ala and L-Gin in the presence of ATP from L-Ala-L-G.ln and L-Ala-L-Ala. It was clearly found to have the activity to produce. ,
  • L-Ala a protein having an activity of synthesizing a peptide other than L-Ala, for which no enzymatic synthesis method was known, can be produced, and the protein or the ability to produce the protein can be produced.
  • L-Ala Dipeptides other than L-Ala can be produced using a transformant or a microorganism having the same.
  • SEQ ID NO: 26 Description of artificial sequence: Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 28 Description of artificial sequence: Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 29 Description of artificial sequence: Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 33 Description of artificial sequence: amino acid sequence used for database search
  • SEQ ID NO: 34 Description of artificial sequence: amino acid sequence used for database search
  • SEQ ID NO: 35 Description of artificial sequence: used for data pace search Amino acid sequence

Abstract

本発明によれば、L-Ala-L-Ala以外のジペプチド合成活性を有する蛋白質および該ジペプチド合成用蛋白質、該ジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、該ジペプチド合成活性を有する蛋白質または該ジペプチド合成用蛋白質を用いた該ジペプチドの製造法、および該ジペプチド合成活性を有する蛋白質または該ジペプチド合成用蛋白質を生産する微生物の培養物等を酵素源に用いた該ジペプチドの製造法が提供される。

Description

明 細 書
ジペプチドの製造法
技術分野
本発明は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質およびジペプチド合成用蛋白質、ジ ぺプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジぺプチド合成活性を有する蛋白質また はジぺプチド合成用蛋白質を用いたジぺプチドの製造法、ジぺプチド合成活性を有す る蛋白質またはジぺプチド合成用蛋白質を'生産する微生物または形質転換体、および 薛微生物または形質転換体を用いたジぺプチドの製造法に関する。
背景技術 ， '
ペプチドの大量合成法については、 化学合成法（液相法、 固相法）、 酵素的合成法 および D NA組換え法を用いた生物学的合成法が知られている。現在、 50残基以上の 長鎖のぺプチドに関しては酵素的合成法あるいは生物学的合成法が用いられ、ジぺプ チドに関しては化学合成法と酵素的合成法が主に用いられている。
化学合成法によるジぺプチドの合成では、官能基の保護'脱保護などの操作が必要 であり、 また.ラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法と はいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい 方法ではない。
酵素法によるジ プチドの合成に関しては、 タンパク質分解酵素 （プロテアーゼ） の逆反応を利用した方法 [J . BioL Chem. , 119 , 707-720 (1937)参照] 、 耐熱性ァ ミノァシル t-RNA合成酵素を利用する方法 [特閧昭 58- 146539号公報、 特閧昭
58- 2Q9991号公報、 特開昭 58-209992号公報および特開昭 59- 1Q6298号公報参照] 、 非 リボゾームぺプチドシンセ夕ーゼ '（以下、 NRPSと称す）を利用する方法 [Chem. Biol . , 7, 373-384 (2000 )、 FEBS Lett . , 4985 42-45 (2001 )、 米国特許第 5795738号および 米国特許第 5652116号参照] が知られている。
しかし、タンパク分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官 能基の保護'脱保護が必要であり、ぺプチド形成反応の効率化およびぺプチド分解反 応の阻止が困難といった問題点がある。 耐熱性アミノアシル t-RNA合成酵素を利用す る方法には、酵素の発現、 目的産物以外の副生反応の阻止が困難という問題点がある 。 NRPS を利用する方法に関しては、 酵素分子が巨大なために D N A組換え法を用い て該酵素を発現することが困難であること、 補酵素 である 一ホスフォパンテティ ン (4 ' -phosphopantetheine) の供給が必要であり、 効率的な製造法とはいえない。 一方、酵素分子量が NRPSより小さく、補酵素 である 4 ' -phosphopantetheineを必要 としな ヽァーク、ソレ夕ミノレシスティンシンセ夕——ゼ ァ一glutamyl cysteine synthetase ) 、 グル夕チオンシンセ夕一ゼ （glutathione synthetase)、 D-ァラニル一 D-ァラニ ン (D-Ala-D-Ala) リガ一ゼ (D-Ala-D-Ala ligase) 、 ポリ一ァ—グルタミン酸シ ンセ夕ーゼ （poly-ァ- glutamate synthetase)等の一群のペプチドシンセ夕ーゼも知 られている。これらの酵素の殆どは D—アミノ酸を基質に用いる、 またはァ位のカル ボキシル基でのぺプチド結合の形成を触媒する等の特徴を有するため、 L—アミノ酸 のひ位カルボキシル基でぺプチド結合するジぺプチドの合成に用いることはできな い。
L—アミノ酸のひ位カルボキシル基でのぺプチド結合形成活性によるジぺプチド 生成が知られているのはバチルス属に属する微生物由来のジぺプチド抗生物質であ るバシリシン合成酵素のみである。バシリシン合成酵素は、 バシリシン （L-ァラニル 一 L-アンチカプシン、 L-Ala— L- anticapsin) 及び L-ァラニル一 L-ァラニン （L-Ala -L-Ala) を合成する活性を有することは知られているが、 その他のジペプチドの合 成活性については知られていない [J . Ind . Microbiol . , 2 , 201-208 (1987 )および Enzyme . Microbial . Techno 1 , , 29 , 400-406 (2001 )参照] 。
一方、 全ゲノム情報の解明されたバチルス 'サチリス .(Baci llus subtil is) 168 株 [Nature , 390 > 249-256 (1997 ) ] におけるバシリシン生合成酵素遺伝子群に関し. ては、 ywfA〜Fの 0RFを含むバシリシンオペ口ンを増幅するとバシリシンの生産性が増 加することが知られている [国際公開特許第 00- 03009号パンフレツト参照]。 しかし これらの 0RFの中に 2種以上のアミノ酸をペプチド結合で連結する活性を有する蛋白 質をコードする Fが含まれているか、含まれているとすれば、 どの 0RFが該蛋白質を コードするかについては知られていない。
発明の開示
本発明の目的は、ぺプチドシンセ夕一ゼ等による酵素的合成法が知られていなかつ た L一ァラニルー L—ァラニン（L- Ala— L-Ala)以外のジぺプチドの合成活性を有す る蛋白質およぴ該ジペプチド合成用蛋白質、該ジペプチドの合成活性を有する蛋白質 をコードする DNA、該 DNAを含有する組換え体 DNA、該組換え体 DNAを保有 する形質転換体、該ジぺプチドの合成活性を有する蛋白質の製造法、該ジぺプチドの 合成活性を有する蛋白質または該ジぺプチド合成用蛋白質を用いた該ジぺプチドの 酵素的合成法、該ジぺプチドの合成活性を有する蛋白質または該ジぺプチド合成用蛋 白質を生産する能力を有する微生物の培養物等を酵素源に用いたジぺプチドの製造 法を提供することにある。
本発明は、 以下の （1) 〜.（21) に関する。
(1) 以下の [1]〜 [4]のいずれかに記載の蛋白質 （ただし、 配列番号 1で 表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く） 。
[1]配列番号 2〜 8のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[ 2 ]配列番号 1〜 8のいずれかで表されるアミノ酸配列において、 1以上のァミノ 酸が欠失、 置換または付加したアミノ酸配列からなり、 かつ式 （I)
R1— R2 (I)
(式中、 R1および R2は、 同一または異なってアミノ酸を表すが、 同時に L—ァラニ ンを表すことはない） で表されるジぺプチドの合成活性を有する蛋白質
[ 3 ]配列番号 1〜 8のいずれかで表されるァミノ酸配列と 65 %以上の相同性を有 するアミノ酸配列からなり、 かつ式（I)で表されるジペプチドの合成活性を有する 蛋白質 '
[ 4 ]配列番号 17で表されるァミノ酸配列と 80 %以上の相同性を有するァミノ酸 配列を有し、 かつ式 （I) で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
(2) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する、 式 （I)
R1 - R2 (I)
(式中、 R1および は、 同一または異なってアミノ酸を表すが、 同時に L—ァラニ ンを表すことはない） で表されるジペプチドの合成用蛋白質。
(3) 以下の [1]〜 [4]のいずれかに記載の DN A (ただし、 配列番号 9で 表される塩基配列からなる DNAを除く） 。
[1]上記 （1) の蛋白質をコードする DNA
[2]配列番号 10〜16および 36のいずれかで表される塩基配列を有する DNA [3]配列番号 9〜16および 36のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配 列を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ式 （I) R1 -: R2 (I)
(式中、 R1および R2は、 同一または異なってアミノ酸を表すが、 同時に L一ァラニ ンを表すことはない）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードする D NA
[4]配列番号 18で表される塩基配列と 80%以上の相同性を有する塩基配列を有 する DNAであり、 かつ式（I)で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコ ードする DNA
(4) 上記 （3) の DNAを含有する 換え体 DNA。
(5) 上記 （4) の組換え体 DNAを有する形質転換体。
(6) 形質転換体が、 微生物を宿主として得られる形質転換体である上記 （5) の形質転換体。
(7) 微生物が、 ェシエリヒア (Escherichia)属に属する微生物である上記 （ 6) の形質転換体。
(8) 上記 （ 5 )〜 （ 7 ) のいずれか 1項に記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に上記（1)の蛋白質を生成、 蓄積させ、 該培養物より該蛋白質を採取する 上記 （1) の蛋白質の製造法。 .
(9) 上記（ 1 ) の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、 培養 物中に該蛋白質を生成、 蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（1)の蛋 白質の製造法。
(10) 微生物がバチルス (Bacillus)属に属する微生物である上記（ 9 ) の製 造法 0 '
(11) バチルス属に属する微生物が、バシリシンを生産する能力を有するバチ ルス属に属する微生物である上記 （10) の製造法。
(12) バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物が、 バチ ルス.サチリス (Bacillus subtilis)、バチルス 'アミ口リケファシエンス (Bacillus amyloliguefaciens)、 バチルス ·コアギュランス (Bacillus coagulans)、 バチル ス ·リケニフォルミス（Bacillus licheniformis)、バチルス'メガテリゥム (Bacillus megaterium)およびバチルス ·プミルス (Bacillus pumilus からなる群より選ばれ る種に属する微生物である上記 （11) の製造法。
(13) 上記（1)の蛋白質または上記（2)のジペプチドの合成用蛋白質、 1 種以上のアミノ酸、 および ATPを水性媒体中に存在せしめ、 該媒体中に式 （I)
R^R2 (I)
(式中、 R1および R2は、 同一または異なってアミノ酸を表すが、 同時に L—ァラニ ンを表すことはない）で表されるジペプチドを生成、 蓄積させ、該媒体から該ジぺプ チドを採取する該ジぺプチドの製造法。
(14) 以下の [1]〜 [3]から選ばれる培養物または該培養物の処理物を酵 素源に用い、該酵素源、 1種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に 式 （I)
R1— R2 (I)
(式中、 R1および R2は、 同一または異なってアミノ酸を表すが、 同時に L—ァラニ ンを表すことはない）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジぺプ チドを採取する該ジぺプチドの製造法。
[1]上記（5)〜（7)のいずれか 1項に記載の形質転換体の培養物または該培養 物の処理物 [2]上記（ 1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または 該培養物の処理物 [3]上記（2)のジぺプチドの合成用蛋白質を生産する能力を有 する微生物の培養物または該培養物の処理物
(15) 上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物がバチルス属に属す る微生物である上記 （14) の製造法。
(16) バチルス属に属する微生物が、バシリシンを生産する能力を有するバチ ルス属に属する微生物である上記 （15) の製造法。
(17) バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物が、バチ ルス 'サチリス、 バチルス 'アミロリケファシエンス、 バチルス 'コアギュランス、 バチルス ·リ ニフォルミス、 バチルス ·メガテリゥムおよびバチルス ·プミルスか らなる群より選ばれる種に属する微生物である上記 （16) の製造法。
(18) 上記（2)のジペプチドの合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物 が配列番号 9で表される塩基配列を有する DN Aを含む組換え体 DNAを含有する 微生物、 またはバチルス 'サチリスに属する微生物である上記 （14) の製造法。 (19) 配列番号 9で表される塩基配列を有する DN Aを含む組換え体 DN Aを 含有する微生物が、 ェシヱリヒア属に属する微生物である上記 （18) の製造法。
(20) 培養物の処理物が、 培養物の濃縮物、 培養物の乾燥物、 培養物を遠心分 離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処 理物、 該菌体の超音波処理物、 該菌体の機械的摩砕処理物、 該菌体の溶媒処理物、 該 菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽 出して得られる酵素標品であることを特徴とする、 上記（14)〜 （19)の製造法
(21) ジペプチドが式 （I I)
R3-R4 (I I)
(式中、 ： R3および R4は同一または異なって、 L—ァラニン、 L—グルタミン、 L— グルタミン酸、 グリシン、 L一バリン、 L一口イシン、 L—イソロイシン、 L—プロ リン、 L—フエ二ルァラニン、 L—トリプトファン、 L一メチォニン、 L—セリン、 L—スレオニン、 L—システィン、 Lーァスパラギン、 L—チロシン、 L—リジン、 L—アルギニン、 L—ヒスチジン、 Lーァスパラギン酸、 L—ひ一ァミノ酪酸、 β- ァラニン、 L一ァザセリン、 L—テアニン、 L一 4—ヒドロキシプロリン、 L— 3—ヒ ドロキシプロリン、 L—オル二チン、 Lーシトルリンおよび L— 6—ジァゾ -5-ォキソ ノルロイシンから選ばれるアミノ酸を表すが、同時に Lーァラニンを表すことはない ) で表されるジペプチドである上記 （13) 〜 （20) の製造法。
本発明の蛋白質としては、
[ 1 ]配列番号 2〜 8のいずれかで表されるァミノ酸配列を有する蛋白質、
[ 2 ]配列番号 1〜 8のいずれかで表されるァミノ酸配列において、 1以上のアミノ 酸が欠失、 置換または付加したアミノ酸配列からなり、 かつ式 （I)
R1 -： R2 (I)
(式中、 R1および： R2は、 同一または異なってアミノ酸を表すが、 同時に L—ァラニ ンを表すことはない） で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
[ 3 ]配列番号 1〜 8のいずれかで表されるァミノ酸配列と 65 %以上の相同性を有 するアミノ酸配列からなり、 かつ式（I)で表されるジペプチドの合成活性を有する 蛋白質、 [ 4：]配列番号 1 7で表されるァミノ酸配列と 8 0 %以上の相同性を有するァミノ酸 配列を有し、 かつ式 （I ) で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質、 をあげることができる（ただし、配列番号 1で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質 を除く） 。
また、 本発明の式（I )で表されるジペプチドの合成用蛋白質としては、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
以下、上記本発明の蛋白質および式（I )で表されるジペプチドの合成用蛋白質を 合わせて本発明の蛋白質と称する場合もある。
上記において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列から なり、 かつ式 （I ) で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質は、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989 ) (以下、モレキュラー 'クロ一 ング第 2版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons (1987-1997 ) (以下、 カレント 'プロト コールズ ·ィン 'モレキュラー ·バイオロジーと略す）、 Nucleic Acids Research, 10 , 6487 (1982 )、 Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 79 , 6409 (1982 )、 Gene , 34 , 315 (1985 ) 、 Nucleic Acids Research, 13 , 4431 (1985 )ヽ Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 82 , 488 (1985 )等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号 1〜 8のい れか で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする D N Aに部位特異的変異を導 入することにより、 取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異 的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の'数であり、 1個か ら数十個、好ましくは 1〜2 0個、 より好ましくは 1〜 1 0個、 さらに好ましくは 1 〜5個である。
配列番号 1〜 8のいずれかで表されるァミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が 欠失、置換または付加されたとは、 同一配列中の任意の位置において、 1または複数 のアミノ酸が欠失、 置換または付加されていてもよい。 - ァミノ酸の置換が可能なアミノ酸としては、例えば配列番号 1〜 8で表されるアミ ノ酸配列を公知のァライメントソフトウエアを用いて比較したときに、すべてのアミ ノ酸配列において保存されていなぃァミノ酸をあげることができる。公知のァライメ ントソフトウェアとしては、 例えば遺伝子解析ソフトウェァ Genetyx (ソフトウェア 開発株式会社）に含まれるァライメント解析ソフトをあげることができる。該解析ソ フトの解析パラメ一夕としては、 デフオルト値を用いることができる。
また、 アミソ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番 号 1〜 8のいずれかで表されるアミノ酸配列の N末端側および C末端側をあげるこ とができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天 然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、 L—ァラニン、 L—ァスパ ラギン、 Lーァスパラギン酸、 L—グルタミン、 L—グルタミン酸、 グリシン、 L - ヒスチジン、 L—イソロイシン、 L—ロイシン、 L—リジン、 L—メチォニン、 L— フエ二ルァラニン、 L—プロリン、 L—セリン、 Lースレオニン、 L—トリプトファ ン、 L—チロシン、 Lーバリン、 L一システィンなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互 に置換可能である。 ，
A群：ロイシン、 イソロイシン、 ノルロイシン、 ノ リン、 ノルパリン、 ァラニン、 2-アミノブタン酸、 メチォニン、 0 -メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t-ブチルァ ラニン、 シクロへキシルァラニン
' B群：ァスパラギン酸、 グル夕ミン酸、 ィソァスパラギン酸、 ィソグル夕ミン酸、 2-アミノアジビン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、 グルタミン
D群： リジン、 アルギニン、 オル二チン、 2，4-ジァミノブタン酸、 2 , 3-ジアミノブ ロビオン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、 スレオニン、 ホモセリン
G群：フエ二ルァラニン、 チロシン
' また、 本発明の蛋白質が式（I )で表され ¾ジペプチド合成活性を有するためには 、配列番号 1〜 8のいずれかで表されるァミノ酸配列、好ましくは配列番号 1で表さ れるアミノ酸配列との相同性が 6 5 %以上、好ましくは 7 5 %以上、 より好ましくは 8 5 %以上、 さらに好ましくは 9 0 %以上、特に好ましくは 9 5 %以上、 最も好まし くは 98 %以上の相同性を有していることが望ましい。
ァミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Karl in and Altschulによるァルゴリズム BLAST[Pro. Natl. Acad. Sci ..USA, 90, 5873 (1993)] FASTA[Methods Enzymol. , 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。 このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLASTNや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol. , 15, 403(1990)]。 BLASTに基づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメ —夕は例えば Score = 100、 wordlengt'h=12とする。 また、 BLASTに基づいて BLASTXに よってアミノ酸配列を解析する場合には ラメ一夕は例えば score = 50、wordlength =3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各プログラムのデフ オルトパラメ一夕一を用いる。 これらの解析方法の具体的な手法は公知である （ http://ww.ncbi .nlm.nih.gov. ) 0
また、配列番号 1〜8のいずれかで表されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号 1 で表されるアミノ酸配列と 65%以上、好ましくは 75%以上、 より好ましくは 85 %以上、 さらに好ましくは 90 %以上、特に好ましくは 95 %以上、最も好ましく (ま 98%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 かつ式（I)で表されるジぺプ チドの合成活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である（ただし、配列番号 1,で 表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。アミノ酸配列の相同性は、上記した ように BLASTや FASTAを用いて決定することができる。
配列番号 17で表されるァミノ酸配列は、配列番号 1〜 7で表されるァミノ酸配列 を有する蛋白質の間で保存されている領域であり、かつ各種微生物の Ala-Alaリガ一 ゼ活性を有する蛋白質のコンセンサス配列に対応する領域である。
配列番号 17で表されるアミノ酸配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、さら に好ましくは 95 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつ 式（I)で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質であ る （ただし、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く） 。
配列番号 17で表されるアミノ酸配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、さら に好ましくは 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質が、 式 （I) で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質であるためには、該蛋白質のァミノ 酸配列と配列番号 1 ~ 8のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が、少なくと も 80%以上、通常は 90%以上、特に 95%以上の相同性を有していることが好ま しい。
アミノ酸配列の相同性は、上記したように BLASTや FASTAを用いて決定することがで きる。
本発明の蛋白質が、上記式（I)で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質で あることを確認する手段としては、例えば D N A組換え法を用いて本発明の蛋白質を 発現する形質転換体を作製し、 該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、 本発明の蛋白質、 1種以上の L—アミノ酸（ただし、 L一ァラニンは他の L—ァミノ 酸とともに用いる）、および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に上記 式（I)で表されるジペプチドが生成、蓄積するか否かを H PLC等により分析する 方法をあげることができる。
本発明の DN Aとしては、
[5]上記 [1]〜 [4]記載の本発明の蛋白質をコードする DNA、
[6]配列番号10〜16および 36のいずれかで表される塩基配列を有する DN A
[7]配列番号 9~16および 36のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配 列を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 かつ式（ I )で 表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードする DNA (ただし、配列番号 9で表される塩基配列からなる DNAを除き、好ましくは配列番号 1で表されるァミ ノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNAを除く） 、
[ 8 ]配列番号 18で表される塩基配列と 80 %以上の相同性を有する塩基配列を有 する DNAであり、 かつ式（I)で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコ —ドする DNA (ただし、配列番号 9で表される塩基配列からなる DNAを除き、好 ましくは配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DN Aを 除く） 、
をあげることができる。 .
また、本発明の式（I)で表されるジペプチドの製造法に用いることができる DN Aとしては、 上記 [5：]〜 [8]記載の DN Aおよび配列番号 9で表される塩基配列 からなる DN Aをあげることができる。 上記のストリンジヱントな条件下でハイブリダイズ可能な D N Aとは、配列番号 9 〜 1 6および 3 6のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する D N Aの一部、 または全部をプローブとして、.コロニ一'ハイブリダィゼ一シヨン法、 プ ラーク ·ハイブリダイゼ一ション法ぁるいはサザンブロットハイプリダイゼ一ション 法等を用いることにより得られる D NAを意味し、具体的には、コロニーあるいはプ ラーク由来の D NAを固定ィ匕したフィルタ一を用いて、 0 . 7 ： L . Q mol/1の塩化 ナトリウム存在下、 6 5 °Cでハイプリダイゼーシヨンを行った後、 0 . 1〜 2倍濃度 の S S C溶液（ 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 1 5 0腿 ol/l塩化ナトリウム、 1 5 腿 ol/lクェン酸ナトリウムよりなる）を用い、 6 5 °C条件下でフィルタ一を洗浄する ことにより同定できる D NAをあげることができる。ハイブリダィゼーシヨンは、モ レキユラ一 ·クロ一ニング第 2版、 カレント 'プロトコ一ルズ ·ィン 'モレキュラー • ノ、、ィォロジ一、 DNA Cloning 1 : Core Techniques , A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995 )等に記載されている方法に準じて行うことがで きる。 ハイプリダイズ可能な D N Aとして具体的には、 上記した BLASTおよび FASTA 等 用いて、上記パラメ一夕に基づいて計算したときに、配列番号 9〜 1 6のいずれ かで表される塩基配列と少なくとも 7 5 %以上、好ましくは 8 5 %以上、さらに好ま しくは 9 0 %以上、特に好ましくは 9 5 %以上の相同性を有する D N Aをあげること ができる。
配列番号 9〜 1 6および 3 6のいずれかで表される塩基配列を有する D N Aとス トリンジェントな条件下でハイプリダイズする D NAが、 式（I )で表されるジぺプ チドの合成活性を有する蛋白質をコードする D N Aであることは、例えば上記したよ うに、組換え D N A法を用いて該 D N Aにコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質の 活性を測定することにより確認することができる。
(i) 本発明の D NA、 および本発明の蛋白質またはジペプチドの製造法に用いられ る D NAの調製
本発明の D NA、 および本発明の蛋白質またはジペプチドの製造法（以下、単に本 発明の製造法ともいう） に用いられる D NAは、例えば、配列番号 9〜 1 6および 3 6で表される塩基配列に基づき設計することができるプロ一ブを用いた チルス属 に属する微生物の染色体 D N Aライブラリーに対するサザンハイプリダイゼ一ショ スまたは配列番号 9〜16および 36で表される塩基配列に基づき設計することが できるプライマー D N Aを用いた、バチルス属に属する微生物の染色体 D N Aを錡型 とした P CR[PCR Protocols, Academic Press ,(1990 )]により取得することができる また、各種の遺伝子配列デ一夕ベースに対して配列番号 1〜 8および 17のいずれ かで表されるァミノ酸配列をコードする D N Aの塩基配列と 75 %以上、好ましくは 85 %以上、 より好ましくは 90 %以上、 さらに好ましくは 95 %以上、特に好まし くは 98 %以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に 基づき、該塩棊配列を有する生物の染色体 DNA、 cDNAライブラリ一等から上記 した方法により本発明の DNA、または本発明の製造法に用いられる DNAを取得す ることもできる。 _
取得した DNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりべ クタ一に組み込み、得られた組換え体 DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられ る塩基配列解析方法、 例えばジデォキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci,, USA, 74> 5463 (1977)]あるいは 373A.DNAシークェンサ一 (パーキン■エルマ一社製）等の塩基配 列分析装置を用いて分析することにより、該 D N Aの塩基配列を決定することができ る。
塩基配列を決定した結果、取得された DN Aが部分長であった場合は、該部分長 D N Aをプローブに用いた、染色体 D N Aライブラリ一に対するサザンハイブリダイゼ —シヨン法等により、 全長 DNAを取得することができる。
更に、決定された DN Aの塩基配列に基づいて、パ一セプティブ'バイオシステム ズ社製 8905型 DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とする DNA を調製することもできる。
上記のようにして取得される DNAとして、例えば、配列番号 9〜16および 36 で表される塩基配列を有する D N Aをあげることができる。
本発明の D N Aおよび本発明の製造法に用いられる D N Aを組み込むぺク夕一と しては、 Bluescriptll KS (+) (ストラタジーン社製）、 DIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990 )]、 pCR-Script Amp SK (+) (ストラタジーン社製） 、 T7Blue (ノバ ジェン社製）、 PCRII (インビトロジェン社製） および pCR- TRAP (ジーンハン夕一社 製） などをあげることができる。
宿主細胞としては、ェシエリヒア属に属する微生物などをあげることができる。ェ シエリヒア属に属する微生物としては、 例えば、 ェシエリヒア 'コリ (Escherichia coli) XLl-Blue, ェシエリヒア 'コリ XL2- Blue、 ェシエリヒア 'コリ DH1、 ェ、ンェ リヒア .コリ MC1000、 ェシエリヒア .コリ ATCC 12435、 ェシエリヒア 'コリ WU85 、ェシエリヒア'コリ JM109、ェシエリヒア'コリ HB101、ェシエリヒア'コリ No.49 、 ェシエリヒア ·コリ W3110、 ェシエリヒア'コリ NY49、 ェシエリヒア'コリ MP347 、ェシエリヒア.コリ 匪 522、ェシエリヒア'コリ ME8415等をあげることができる。 組換え体 D N Aの導入方法としては、上記宿主細胞へ D N Aを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、 プロトプラスト法 （特開昭 63- 248394) 、 エレ クトロポレ シヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることがで きる。
上記方法によって得られる本発明の製造法に用いられる DN Aを保有する微生物， としては、例えば配列番号 1で表される配列を有する D N Aを含有する組換え体 D N Aを保有する微生物であるェシエリヒア 'コリ 丽 522/PPE43をあげることができる。 (ii) 本発明の蛋白質の製造法
本発明の蛋白質は、 モレキュラー 'クロ一ニング第 2版、 カレント ·プロトコ一ル ズ ·イン 'モレキュラー ·バイオロジー等に記載された方法等を用い、 例えば以下の 方法により、 上記 （i) の方法により取得した本発明の DNAおよび本発明の製造法 に用いられる DN Aを宿主細胞中で発現させて、 製造することができる。
本発明の DN Aまたは本発明の製造法に用いられる DN Aをもとにして、必要に応 じて、 本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。 また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなる'よ うに、 塩基を置換することにより、 該蛋白質の生産率を向上させることができる。 該 D N A断片を適当な発現べクタ一のプロモー夕一の下流に挿入することにより、 組換え体 DN Aを作製する。
該組換え体 D N Aを、 該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、 本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。 宿主細胞としては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞等、 植物細胞等、 目的とする 遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現べクタ一としては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への 組込が可能で、本発明の D N Aまたは本発明の製造法に用いられる D N Aを転写でき る位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の DN Aまたは本発明の 製造法に用いられる DN Aを有する組換え体 DN Aは、原核生物中で自立複製可能で あると同時に、 プロモー夕一、 リボソーム結合配列、 本発明の DNAまたは本発明の 製造法に用いられる D N A、転写終結配列より構成された組換え体 D N Aであること が好ましい。 プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。 .
' 発現べクタ一としては、 pBTrp2、 pBTacls pBTac2 (いずれもベーリンガーマンハイ ム社製） 、 pHelixl (ロシュ ·ダイァグノスティクス社製) 、 PKK233-2 (アマシャム 'フアルマシア 'バイオテク社製） 、 pSE280 (インビトロジェン社製） 、 pGEM -l (プロメガ社製） 、 pQE- 8 (キアゲン社製） 、 pET-3 (ノバジヱン社製） 、 pKYPIO (特 開昭 58-110600)、pKYP200[Agric. Biol. Chem. , 48> 669 (1984)] pLSAl[Agric. Biol. Chem. , 53/277 (1989)]、 pGELl[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82> 4306 (1985)]、 pBluescriptll SK(+)、 pBluescript II KS (-) (ストラタジーン社製) 、 TrS30 [ェ シエリヒア ·コリ JM109/pTrS30(FERM BP- 5407)より調製]、 pTrS32 [ェシェリヒア · コリ JM109/pTrS32(FE腿 BP-5408)より調製]、 pPAC31 (W098/12343),pUC19 [Gene, 33 > 103 (1985 )]、 pSTV28(宝酒造社製)、 UC118 (宝酒造社製) 、 pPAl (特開昭 63- 233798 ) 等を例示することができる。
プロモー夕一としては、ェシエリヒア'コリ等の宿主細胞中で機能するものであれ ばいかなるものでもよい。例えば、 ii卫プロモ一夕一 （ptra)、 1 プロモーター （P o) PLプロモー夕一、 Ρβプロモーター、 PSEプロモーター等の、 大腸菌やファ一ジ 等に由来するプロモーター、 SP01プロモ一夕一、 SP〇 2プロモーター、 pen Pプロモーター等をあげることができる。 また Ptrpを 2つ直列させたプロモ一夕一、 プロモーター、 lacT7プロモーター、 let Iプロモー夕一のように人為的に設計改 変されたプロモー夕一等も用いることができる。
さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるための xylAプロモーター [Appl. Microbiol . Biotechnol . , 35 ) 594-599 (1991 ) ] ゃコリネバクテリゥム （
Conmebacterium)属に属する微牛物中で発現させるための P54- 6プロモータ一「Appl . Microbiol .' Biotechnol . , 53 , 674-679 (2000 ) ] なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャインーダルガノ （Shine- Dalgarno)配列と開始コド ンとの間を適当な距離（例えば 6〜18塩基）に調節したプラスミ ドを用いることが好 ましい。
本発明の D N Aまたは本発明の製造法に用いられる D N Aを発現ベクターに結合 させた組換え体 D N Aにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺 伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体 D N Aとしては、 例えば pPE43をあげることができる。
原核生物としては、 ェシエリヒア属、 セラチア (Serratia)属、 バチルス属、 ブレ ビバクテリウム (Brevibacteriuin)属、 コリネパクテリゥム (Corynebacterium)属、 ミクロノ クテリゥム属 (Microbacterium) 、 シュ一ドモナス (Pseudomonas) 属、 ァ グロバクテリゥム (Agrobacterium) 属ヽ アリシクロバチルス属 (Alicyclobaci llus ) 、 アナべナ (Anabena) 属、 アナシスティス (Anacystis) .属、 ァスロバクタ一 （ Arthrobacter) 属、 ァゾトノ クタ一 (Azotobacter) 属、 クロマチゥム (Chromatium ) 属、 エルビニァ (Erwinia) 属、 メチロバクテリウム (Methylobacterium) 属、 フ オルミディウム (Phormidium) '属ゝ ロドバク夕一 (Rhodobacter) 属、 ロドシユード モナス (Rhodopseudomonas)属、 口ドスピリゥム (Rhodospirillum)属、 セネデスム ス (Scenedesmus) 属、 ストレプトマイセス (Streptomyces) 属、 シネコッカス ( Synechoccus)属、 ザィモモナス (Zymomonas)属等に属する微生物、 例えば、 ェシェ リヒア 'コリ XL1- Blue、 ェシエリヒア 'コリ XL2- Blue、 ェシエリヒア .コリ DH1、 ェシエリヒア 'コリ DH5ひ、ェシエリヒア'コリ MC1000、ェシエリヒア'コリ KY3276 、ェシエリヒア'コリ W1485、 ェシエリヒア'コリ 109、ェシエリヒア 'コリ HB101 、 ェシエリヒア 'コリ No .49、 ェシエリヒア 'コリ W3110、 ェシエリヒア .コリ NY49 、 ェシエリヒア 'コリ MP347 、 ェシエリ.ヒア 'コリ 丽 522、 バチルス 'サチリス ATCC33712、バチルス 'メガテリゥム ^;'チルス'エスピ一（Baci llus sp . ) FERM BP- 6030 、 バチルス 'アミロリケファスエンス、 バチルズ 'コアギュランス、 バチルス . リケ ニフォルミス、 バチルス ·プミルス、 ブレビパクテリゥム ·アンモニアゲネス （ Brevibacterium ammoniagenes) 、 ブレビノ クテリゥム 'イマリオフイノレム ( Brevibacterium immariophil而) ATCC14068、 ブレビパクテリゥム 'サヅカロリティ カム (Brevibacterium saccharolyticum) ATGC14066, ブレビパクテリゥム 'フラバ ム (Brevibacterium flav而) ATCC14067、 ブレビパクテリゥム 'ラクトフアーメン タム (Brevibacterium. lactof ermentum) ATCC13869 コリネバクテリゥム .グル夕 ミカム (Corynebacteri蘭 glutamicum) ATCC13032, コリネバクテリゥム ·グル夕ミ カム ATCC14297、 コリネバクテリウム ·ァセトァシドフィ ム (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870、 ミクロバクテリゥム 'アンモニアフィルム （ ' Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354、セラチア-フイカリァ (Serratia f icaria ) 、 セラチア ·フォンチコラ (Serratia fonticola) 、 セラチア · リケファシエンス
(Serratia l iquef aciens) 、 セラチア ·マレセッセンス (Serratia marcescens) 、 シュ一ドモナス ·エスピー （Pseudomonas SP . ) D-0110、 ァグロパクテリゥム 'ラジ ォバク夕一 (Agrobacterium radiobacter) ·、 ァグロバクテリウム . リゾジーンズ ( Agrobacterium rhizogenes) 、 ァグロノ クテリゥム .リレビ (Agrobacterium rubi ) 、 アナペナ 'シリンドリカ (Anabaena cylindrical、 アナペナ · ドリオルム (Anabaena doliolum) ヽ アナべナ ·フロスアクア (Anabaena f los-aquae) 、 アースロバクタ一
•ォ一レツセンス (Art robacter aurescens) 、 アースロバクタ一 ·シトレウス ( Arthrobacter citreus) 、 アースロバクタ一'グロプフォルミス (Arthrobacter globformis) 、 アースロバクタ一■ヒドロ力一ボグルタミカス (Arthrobacter hydrocarboglutamicus) 、 アースロノ クタ一 . ミソレンス (Arthrobacter mysorens ) 、 アースロバクタ一 ·ニコチアナ (Arthrobacter nicotianae) ヽ 'アースロバクタ ― ·パラフイネウス (Arthrobacter paraff ineus) 、 アースロバクタ一 ·プロトフ,ォ ルミエ (Arthrobacter protophormiae)-ヽ アースロバクタ一'ロセォパラフィナス （ Arthrobacter roseoparaff inus) 、 アースロノ ク夕一.スノレフレウス (Arthrobacter sulfureus) 、 アースロノ、'ク夕一.ウレァファシエンス (Arthrobacter ureafaciens ) クロマチゥム ·ブデリ (Ghromatium buderi)、クロマチゥム 'テビダム (Chromatium- tepidum) 、 クロマチゥム · ビノサム (Chromatium vinosum) 、 クロマチゥム ·ヮー ミンギ (Chromatium warmingi i) 、 クロマチゥム .フルビア夕ティレ (Chromatium f luviatile) 、 エレビニァ ·ウレドバラ (Erwinia uredovora) 、 エルビニァ ·カロ トノ ラ (Erwinia carotovora) 、 エノレビニァ ·ァナス (Erwinia ananas) 、 エレビ二 ァ 'ヘリコラ (Erwinia herbicola) ヽ ェソレビニァ ' ノ ンク夕夕 (Erwinia punctata • ) 、 エルビニァ 'テレウス (Erwinia terreus) 、 メチロバクテリゥム ·口デシアナ ム (Methylobacterium rhodesianum) 、 メチロバクテリゥム 'ェクソトルクエンス ( Methylobacterium extorguens) 、 フォソレミディゥム ·エスピー (Phormidium sp . ) ATCC29409N 口ドバク夕一 '力プスラ夕ス' (Rhodobacter capsulatus) 、 口ドバク夕 — 'スフエロイデス (Rhodobacter sphaeroides) 、 ロドシュ一ドモナス 'プラスチ 力 (Rhodopseudomonas blastica)、'口ドシユードモナス .マリナ (Rhodopseudomonas marina) 、 ロドシュ一ドモナス - ノ レストリス (Rhodopseudomonas palustris) ·、 口 ドスピリゥム ' リプラム (Rhodospiri llum rubrum) 、 口ドスピリゥ'ム ·サレキシゲ ンス (Rhodosuim lum salexigens)、 口ドスピリウム .サリナラム (Rhodospiri llum salinarum)、 ストレプトマイセス .アンボファシエンス (Streptomyces ambofaciens ) 、 ストレプトマイセス ·才ーレ才ファシエンス (Streptomyces aureof aciens) 、 ストレプトマイセス ·ァゥレウス (Streptomyces aureus) 、 ストレプトマイセス · フンジシディカス (Streptomyces fungi cidicus) 、 ストレプトマイセス ·グリセォ クロモゲナス (Streptomyces griseochromogenes) 、 ストレプトマイセス ·グリセゥ ス（Streptomyces griseus)、ストレプトマイセス ·リビダンス（Streptomyces l ividans 、 ストレプトマイセス ·ォリボグリセウス (Streptomyces olivogriseus) 、 ス，トレ プトマイセス ·ラメウス (Streptomyces rameus) 、 ストレプトマイセス ·夕ナシェ ンシス (Streptomyces tanashiensis) 、 ストレプトマイセス ·ビナセウス ( Streptomyces vinaceus) 、 ザィモモナス .モビリス (Zymomonas mobi l is) 等をあげ ることができる。
組換え体 D N Aの導入方法としては、上記 主細胞へ D N Aを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、 例えば、 カルシウム オンを用いる方法 [Proc . Natl . Acad . Sci . , USA, 69 > 2110 (1972 ) ]、 プロトプラスト法 （特開昭 63- 248394) 、 エレ クトロポレーシヨン法 [Nucleic Acids Res ,, 16 , 6127 (1988 ) ]等をあげることがで さる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 YEpl3 (ATCC37H5) 、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC37419) 、 pHS19、 pHS15等を用い ることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いて もよく、 例えば、 PH05プロモ一夕一、 PGKプロモ一夕一、 GAPプロモーター、 ADHプロ モー夕一、 gal 1プロモー夕一、 gal 10プロモー夕一、 ヒートショックポリペプチド プロモ一夕一、 MF :l プロモーター、 CUP 1プロモー夕一等のプロモーターをあげる ことができる。
宿主細胞とじでは、 サッカロマイセス (Saccharomyces) 属、 シゾサヅカロマイセ ス (Schizosaccharomyces)属、 クルイベロマイセス (Kluyveromyces)属、 トリコス ボロン（Trichosporon)属、シヮニォマイミセス (Schwanniomyces)属、ピチア (Pichia ) 属、 またはキャンディダ (Candida) 属等に属する酵母菌株をあげることができ、 具体的には、 サッカロマイセ.ス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)、 シゾサ ヅカロマイセス ·ボンべ (Schizosaccharomyces pombej 、 クフレイぺロマイセス ·ラ クテイス (Kluyveromyces lactis) 、 トリコスポロン · 'プレランス (Trichosporon pullulans)、 シヮニォマイセス ·アルビウス (Sc wanniomyces alluvius)、 ピチア •パストリス (Pichia pastoris) 、 キャンディダ ·ゥティ リス (Candida utilis) 等をあげることができる。
組換え体 DN Aの導入方法としては、酵母に DN Aを導入する方法であればいずれ も用いることができ、 例えば、 エレクトロボレ一シヨン法 [Methods Enzymol . , 194, 182 (1990)]、 スフエロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)] 、 酢酸リチウム法 [J. Bacteriol,, 153, 163 (1983 )]等をあげることができる。 動物細胞を宿主として用いる場合には、発現べクタ一として、例えば、 pcDNAI、 pcDM8
(フナコシ社より市販) 、 PAGE107 (特開平 3-22979) 、 pAS3-3 (特開平 2- 227075) 、 pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)]、 pcDNAI/Amp (インビトロジェン社製) 、 EP4 ( インビトロジェン社製） 、 pAGE103[J. Biochem, 101, 1307 (1987)]、 pAGE210、 pAMo 、 pAMoA等を用いることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが でき、 例えば、 サイ トメガロウィルス (CMV) の IE (immediate early)遺伝子のプロ モーター、 SV40の初期プロモーターあるいはメタロチォネィンのプロモー夕一、 レト ロウィルスのプロモー夕一、 ヒートショヅクプロモー夕一、 SRひプロモー夕一等を あげることができる。 また、 ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモー夕一と共 に用いてもよい。 ， 宿主細胞としては、 マウス ·ミエ'ローマ細胞、 ラヅ ト · ミエローマ細胞、 マウス · ハイプリ ドーマ細胞、 ヒトの細胞であるナマルバ （Namalwa) 細胞またはナマルバ · KJM- 1細胞、 ヒト胎児腎臓細胞、 ヒト白血病細胞、 アフリカミ ドリザル腎臓細胞、 チ ャィニーズ 'ハムスターの糸田胞である CH0細胞、 HBT5637 (特開昭 63-299)等をあげる ことができる。
マウス · ミエ口一マ細胞としては、 SP2/0、 NS0等、 ラット ' ミエローマ細胞として は YB2/0等、 ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293 (ATCC CRL-1573 )、 ヒト白血病細胞とし ては BALL- 1等、 アフリカミ ドリザル腎臓細胞としては COS- 1、 COS- 7等をあげることが できる。 '
組換え体 D N Aの導入方法としては、動物細胞に D N Aを導入する方法であればい ずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology， 3 , 133 (1990 )' ]、リン酸カルシウム法（特開平 2- 227075)、リポフエクシヨン法 [Proc . Natl . Acad , Sci . , USA, 8 > 7413 (1987) ]、 Virology, 52 , 456 (1973 )に記載の方法等を あげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば Baculovirus Expression Vectors , A Laboratory Manual , W. H. Freeman and Company, New York (1992 )、 力'レント -プ 口トコ一ノレズ'ィン ·モレキュラー'ノ イォロジ一、 Molecular Biology, A Laboratory Manuaレ Bio/Technology, 6 , 47 (1988 )等に記載された方法によって、 蛋白質を生産 することができる。
即ち、組換え遺伝子導入べクタ一およびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して 昆虫細胞培養上清中に組換えゥィルスを得た後、さらに組換えゥィルスを昆虫細胞に 感染させ、 蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、例えば、 pVL1392、pVL1393 、 pBlueBacI I I (いずれもインビトロジェン社製） 等をあげることができる。
バキュロウィルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるァゥ トグラファ '力リフォルニ力 ·ヌクレア一 'ポリへドロシス ·ウィルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus ) 等を用いることができる。 昆虫細胞としては、 スポドプテラ ·フルギベルダ (Spodoptera frugiperda) の卵 巣細胞、 .トリコプルシア ·二 (Trichoplusia ni ) の卵巣細胞、 カイコ卵巣由来の培 養細胞等を用いることができる。
スポドプテラ ·フルギベルダの卵巣細胞としては Sf 9、 Sf21 (バキュロウィルス . ィグスプレツシヨン ·ベクタ一ズ ァ 'ラボラトリ一 'マニュアル） 等、 トリコプル シァ .二の卵巣細胞としてば High 5、 BTI-TN-5B1-4 (インビトロジェン社製） 等、 力 ィコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス 'モリ (Bomby mori ) N4等をあげるこ とができる。
組換えゥィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べク夕一と 上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、 リン酸カルシウム法（特開平 2-227075). リポフエクシヨン法 [Proc . Natl . Acad . Sci . , USA, 84 , 741-3 ( 1987 ) ] 等をあげることができる。 · '
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、例えば、 T iプ ラスミ ド、 タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモ一夕一としては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いて もよく、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス （CaMV) の 35Sプロモ一夕一、 イネ ァクチン 1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、 タバコ、 ジャガイモ、 トマト、 ニンジン、 ダイズ、 アブラナ、 アルフアルファ、 イネ、 コムギ、 ォォムギ等の植物細胞等をあげることができる。 組換えベクターの導入方法としては、植物細胞に D NAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、 例えば、 ァグロパクテリゥム (Agrobacterium) を用いる 方法 （特開昭 59-140885、 特開昭 60- 70080、 WO94/00977) 、 エレクトロボレ一シヨン 法（特開昭 60- 251887)、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第 2606856 、 特許第 2517813) 等をあげることができる。
酵母、 動物細胞、 昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、 糖あるいは 糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質 を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができ
^ o 本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、 動 物細胞、 昆虫細胞等、 植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌、 より好 ましくはェシェリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはェシエリヒア'コリに属 する微生物をあげることができる。
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従 つて行うことができる。
ェシエリヒア.コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた 形質転換体を培養する培地と.しては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類 等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地の いずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラクトー ス、スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加水分解物等の 炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノール等のアルコ一 ル類等を用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、 酢酸アンモ 二ゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、その他の 含窒素化合物、 並びに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチ一プリカ一、 カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消 化物等を用いることができる。 '
無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシウム 、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸力 ルシゥム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度 は 15~40°Cがよく、培養時間は、通常 5時間〜 7日間である。培養中 pHは 3.0〜9.0に保 持する。 pHの調整は、 無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンゃテトラサイクリン等の抗生物質を培地 に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモー夕一を用いた発現べクタ一で形質転換した 微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデューサ一を培地に添加してもよい。 例えば、 l プ Pモー夕一を用いた発現べクタ—で形質転換した微生物を培養すると きにはイソプロピル一 5— D—チォガラクトビラノシド等を、 ii£プロモ一夕一を用 いた発現べクタ一で形質転換した微生物を培養するときにはィンドールァクリル酸 等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている RPMI1640培地 [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)]、 イーグル (Eagle ) の MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)]、 DMEM培地 [Virology, 8, 396 (1959 )]ヽ 199 培地 [Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添 加した培地等を用いることができる。 . 培養は、 通常 pH6〜8、 25〜4Q°C！、 5% C 02存在下等の条件下で 1〜7日間行う。 また、培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン、 ストレプトマイシン等の 抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている TNM- FH培地（ファーミンジェン社製)、 Sf-900 II SFM培地 （ライフ 'テクノ 口ジ一ズ社製） 、 ExCell400、 ExCell405 [いずれも JRHバイオサイエンシーズ社製]、 Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962 )]等を用いることができる。
培養は、 通常 pH6〜7、 25〜30°C等の条件下で 1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲン夕マイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい 植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、 または植物の細胞や器 官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般 に使用されているムラシゲ 'アンド 'スクーグ (MS)培地、 ホワイト（White)培地、 ま たはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を 用いることができる。
培養は、 通常 pH5〜9、 20〜 Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、 カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地 に添加してもよい。
上記のとおり、本発明の D N Aまたは本発明の製造法に用いられる DNAを発現べ クタ一に連結した組換え体 DNAを保有する微生物、 昆虫細胞、動物細胞、 あるいは 植物細胞由来の形質 換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明の蛋白質を生 成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造すること ができる。 '
'本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に 分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に 応じて、' 生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソ ンらの方法 [J. Biol. Chem.5 264> 17619 (1989)]、 ロウらの方法 [Pro Natl . Acad. Sci.， USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)]、 または特開平 05 - 336963、 WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、 該蛋白質を宿主細胞 外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質 の手前にシグナルべプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細 胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平 2- 227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝 子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入レた動物または植物の細胞を再分ィヒさせることにより、遺伝子 が導入された動物個体（トランスジエニック非ヒト動物）または植物個体（トランス ジエニック植物）を造成し、 これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することも できる。 ，
本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の 方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物 個体より該蛋白質を採取することにより、 該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法 [Am. J. Clin, Nutr., 63> 639S (1996)、 Am. J. Clin. Nutr., 63> 627S (1996)、 Bio/Technology, 9, 830 (1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明 の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明の DNAまたは本発明の製造法に用いられる D N Aを導入した下ランスジエニック非ヒト動物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中 に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、 該蛋白質を製造す ることができる。該動物中の該蛋白質を生成、 蓄積させる場所としては、 例えば、 該 動物のミルク （特開昭 63- 309192) 、 卵等をあげることができる。 この際に用いられ るプロモ一夕一としては、動物で機能するものであればいずれも用いることができる が、例えば、乳腺細胞特異的なプロモ一夕一であるひカゼインプロモーター、 カゼ インプロモーダー、 ラクトグロブリンプロモ一夕一、ホエー酸性プロテインプロモ 一夕一等が好適に用いられる。 .
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質 をコードする D N Aを導入したトランスジエニック植物を公知の方法 [組織培養， ^ (1994 )、 組織培養， 21 (1995 )、 Trends Biotechnol . , 15 , 45 ( 1997 ) ]に準じて栽培 し、該蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することに より、 該蛋白質を生産する方法があげられる。
本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単離 -精製する方法としては、 通常の酵素の単離、 精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後 、細胞を遠心分離により回収し、 水系緩衝液にけん濁後、超音波破碎機、 フレンチプ レス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞 抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精 製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジ ェチルアミノエチル （DEAE) '—セファロ一ス、 DIAION HPA-75 (三菱化成社製)等レジ ンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S-Sepharose (フアルマシア社製 )等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、 プチルセファロース、 フ ェニルセファロ一ス等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィ一法、分子篩を用い たゲルろ過法、 ァフィ二ティークロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品 を得ることができる。
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収 後破碎し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋 白質を回収後、 該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変 性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構 成させた後、 上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培 養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性 画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精 製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号 1〜 8のいずれかで表 されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質 に親和性をもつ物質を用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィ一を利用して精製す ることもできる。 例えば、 ロウらの方法 [Proc . Natl . Acad . Sci . , USA, 86 > 8227 ( 1989 )、 Genes Develop . , 4 , 1288 (1990 ) ]、 特閧平 5- 336963、 WO94/23021に記載の 方法に準じて、本発明の蛋白質をプロティン Aとの融合タンパク質として生産し、ィ ムノグロブリン Gを用いるァフィ二ティ一クロマトグラフィーにより精製すること. ができる。
また、本発明の蛋白質を F 1 a gぺプチドとの融合蛋白質として生産し、抗 F 1 a g抗体を用いるァフィ二ティ一クロマトグラフィーにより精製することができる [Proc . Natl . Acad . Sci . , USA, 86 , 8227 ( 1989 )、 Genes Develop .， 4 , 1288 (1990 ) ] 。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィーで精 製することもできる。
' 上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、 F m o c法（フルォレニルメ チルォキシカルボニル法）、 t B o c法（t一ブチルォキシカルボニル法）等の化学 合成法により、 本発明の蛋白質を製造することができる。 また、 Advanced ChemTech 社、 ノ 一キン ·エノレマ一社、 Pharmacia社、 Protein Technology Instrument^ Synthecel l-Vega社、 PerSeptive社、 島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学 合成することもできる。
(iii) 本発明のジペプチドの製造法
( 1 ) 酵素的製造法
ジペプチドの酵素的製造法としては、本発明の蛋白質、 1種以上のアミノ酸、およ ぴ A T Pを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（I )で表されるジペプチドを生 成、 蓄積させ、 該媒体から該ジペプチドを採取する方法をあげることができる。 ' 上記製造法において、基質に用いられる 1種以上のアミノ酸、好ましくは 1または 2種のアミノ酸としては、 1種のアミノ酸として L—ァラニンを用いる場合を除き、 アミノ酸、 好ましくは L—アミノ酸、 グリシン （Gly) および/?—ァラニン （ ?Ala )からなる群より選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸をいずれの組み合わ せで用いてもよい。 L—アミノ酸としては、 例えば L-ァラニン （L- Ala) 、 L-グル夕 ミン （L- Gin)、 L -グルタミン酸（L- Glu) .、 L-バリン （L-Val)、 L-ロイシン （L- Leu ) 、 L-イソロイシン （L-Ile) 、 L-プロリン （L-Pro) 、 L-フ： π二ルァラニン （L-Phe ) 、 L-トリブトファン （L-Trp) 、 L-メチォニン （L- Met) 、 L-セリン （L- Ser) 、 L- スレオニン (L-Thr) 、 L -システィン (L-Cys) 、 L-ァスパラギン (L-Asn) 、 L -チロ シン （L- Tyr)、 L-リジン （L-Lys)、 L-アルギニン （L-Arg)、 L-ヒスチジン （L- His )、 L-ァスパラギン酸 （L-Asp) 、 L- α-ァミノ酪酸 （L-ひ- AB) 、 L-ァザセリン （L - Azaserine)、 L-テアニン（L- theanine)、 L-4-ヒドロキシプロリン（L-4- HYP)、 L-3- ヒドロキシプロリン （L- 3- HYP) 、 L-オル二チン （L- Orn) 、 L-シトルリン （L- Cit) および L-6-ジァゾ -5-ォキソノルロイシン （L- 6- diazo-5-oxo-norleucine) などをあ げることができる。 ， 上記製造法に用いられる、 より好ましいアミノ酸としては、 L-Ala、 Gly、 L-Met 、 L - Ser、 L - Thrおよび 5 - Alaから選ばれる 1種のアミノ酸と L-Ala、 L- Gln、 L-Gluヽ Gly 、 L-Val、 L-Leuヽ L- Ile、 L-Pro、 L- Phe、 L - Trp、 L - Met、 L- Serヽ L-Thrヽ L-Cys, L-Asn 、 L-Tyrs L-Lyss L - Arg、 L-HisN L-Asps L- -ΑΒ s ? - Ala、 L-Azaserines L-theanine 、 L- 4- HYP、 L-3- HYP、 L- 0m、 L- Citおよび L- 6-diazo- 5- oxo-norleucineから選ばれる 1種のアミノ酸の組み合わせ（ただし、 L- Ala同士の組み合わせを除く）、 L- Ginと L-Phe の組み合わせ、および L-ひ- ABと L- Gln、 L-Argまたは L-ひ- ABの組み合わせ、 さらに好 ましくは L- Alaと L - Ginヽ Glyヽ L- Val、 L-Leu, L- l ieヽ L- Phe、 L-Trpヽ L- Met、 L - Ser、 L-Thrs L-Cys、 L - Asn、 L-TyrN L-Lys L - Arg、 L - His、 L - a AB、 L-Azaserines L-Cit および L- theanineから選ばれる 1種のアミノ酸の組み合わせ、 Glyと L-Gln、Gly、 L-Phe 、 L-Trps L-Met、 L-Sers L - Thrヽ L-Cys, L- Tyr、 L- Lys、 L-Arg、 L -ひ- ABおよび L- Cit から選ばれる 1種のアミノ酸の組み合わせ、 L- Metと L- Phe、 L-Met、 L- Ser、 L- Thr、 L-Cyss L-Tyr, L - Lysおよび L- Hisから選ばれる 1種のアミノ酸の組み合わせ、 L-Ser と L-Gln、 L-Phe、 L-Ser, L- Thr、 L-Tyrヽ L-Hisおよび L -ひ - ABから選ばれる 1種のァ ミノ酸の組み合わせ、 L-Thrと L- Gln、 L- Phe、 L-Leu、 L- Thrおよび L-ひ -ABから選ばれ る 1種のアミノ酸の組み合わせ、 L-Glnと L-Pheの組み合わせ、 ?-Alaと L- Phe、 L-Met 、 L- Hisおよび L-Citから選ばれる 1種のアミノ酸の組み合わせ、 および L- cc-ABと L-Glns L-Argまたは L- - ABの組み合わせをあげることができる。
上記製造法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるアミノ酸 lmgあたり 0.01 〜100mg、 子ましくは 0.1mg〜10mg添加する。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、 0.1〜500g/L、好ましくは 0.2 〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記製造法において、エネルギー源として用いる A T Pは、 0.5腿 ol〜； LOmol/Lの濃 度で用いる。
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジぺプチドの生成反応を阻害しない限 り、 いかなる成分、 組成の水性媒体であってもよく、 例えば、 水、 りん酸塩、 炭酸塩 、 酢酸塩、 ほう酸塩、 クェン酸塩、 トリスなどの緩衝液などをあげることができる。 また、 メタノール、 エタノールなどのアルコール類、 酢酸ェチルなどのエステル類、 ァセトンなどのケトン類、 ァセトアミドなどのアミ 類を含有していてもよい。 ジペプチドの生成反応は水性媒体中、 pH5〜ll、 好ましくは ρΗ6〜10、 20〜50°C、好 ましくは 25〜45°Cの条件で 2〜150時間、 好ましくは 6〜120時間行う。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、 式（I )で表されるジペプチドをあげ ることができ、 好ましくは、 式 （I ) において R1および R2が同時にまたは異なって 、 L- Alaヽ L- Gln、 L- Gluヽ Gly、 L-Vak L- Leu、 L-Ile、 L-Pros L-Phe. L- Trp、 L-Met, L- Serヽ L-Thrヽ L- Cys、 L-Asnヽ L-TyrN L- Lys、 L-Args L- His、 L-Asp、 L- α-ΑΒ 、 β -Ala, L-Azaserineヽ L-theanineヽ L+HYPヽ L - 3 - HYPヽ L- 0rn、 L-Citおよび
L- 6- diazo - 5- oxo-norleucineから選ばれるアミノ酸であるジペプチド （ただし、 R1 および R2は、 同時に L- Alaである場合を除く） をあげることができ、 より好ましくは R1が L- Alaヽ Gly、 L- Met、 L-Ser、 L-Thrまたは/? -Alaの場合は、 R2が L- Gln、 L- Glu、 Glyヽ L-VaK L- Leuヽ L- ,Ile、 L-Pro, L- Phe、 L- Trp、 L- Met、 L- Ser、 L-Thr, L- Cys、 L- Asn、 L-Tyrs L-Lyss L-Arg L - His、 L-Asps L-a-AB、 ? - Ala、 L-Azaserines L-theanine 、 L+HYPヽ L-3-HYPs L-0rn、 L-Citまたは L- 6-diazo- 5-oxo- norleucineであるジぺプ チドをあげることができ、 さらに好ましくは、 ： 1が L- Alaの場合は、 R2は L- Gln、 Gly 、 L- Val、 L-LeuN L- I le、 L- Phe、 L-Trps L- Met、 L-SerN L-Thr、 L- Cys、 L- Asn、 L-Tyr 、 L-LysN L-Arg L_His、 L- α-ΑΒ、 L-Azaserines L - theanineまたは L - Citであるジ ペプチド、 R1が Glyの場合は、 R2は L- Gln、 Gly、 L-Phe、 L-Trps L - Met、 L-Ser, L-Thr 、 L - Cys、 L - Tyrヽ L-Lys、 L-Args L-ひ- ABまたは L-Citであるジペプチド、 H1が L - Met の場合は、 は L- Phe、 L-MetN L- Cys、 L-Tyrヽ L- Lysまたは L- Hisであるジペプチド、 . R1が L- Serの場合は、 R2は L- Gln、 Glyヽ L-Pheヽ L - Met；、 L- Ser、 L- Thrヽ L-Tyrヽ L-His または L-ひ- ABであるジペプチド、 R1が L- Thrの場合は、 R2は L- Gln、 L-Leu、 L-Phe L-Met、 L- Ser、 L-Thrまたは L-ひ- ABであるジペプチド、 R1が L- Ginの場合は、 R2は L - Pheまたは L- α-ΑΒであるジペプチド、 R1が L- Pheの場合は、 R2は L-Glnであるジぺ プチド、 R1が L-Trpの場合は、 R2は Glyであるジペプチド、 R1が L- Cysの場合は、 R2 は L- Ala、 L-Gln, Gly, または L-Metであるジペプチド、 R1が L- Lysの場合は、 R2は L-Ala、 Glyまたは L- Metであるジペプチド、 R1が ? -Alaの場合は、 R2は L-Phe、 L-Met または L-Hisであるジペプチド、 R1が L-Argの場合は、 R2は L-ひ- ABであるジぺプチ ド、 R1が L- Hisである場合は、 R2は L-Metであるジペプチド、 および R1が L-ひ- ABの 場合は、 R2は L- Ala、 L- Gln、 Gly、 LTSer、 L- Thr、 L-Argまたは L- - ABであるジぺプ チドをあげることができる。
( 2 )形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用い る製造法
形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる ジぺプチドの製造法としては、 本発明の蛋白質を生産する能力を有する形質転換体、 または本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは培養物の処 理物を酵素源に用い、該酵素源、および 1種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せし め、 該媒体中に式（I )で表されるジペプチドを生成、 蓄積させ、 該媒体から該ジぺ プチドを採取する該ジぺプチドの製造法をあげることができる。
上記製造法に用いられる形質転換体としては、上記（i i )の方法により製造するこ とができる、本発明の蛋白質を生産する形質転換体をあげることができる。該形質転 換体の宿主としては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞等、 植物細胞等をあげること ができ、好ましく細菌、 より好ましくはェシエリヒア属、バチルス属またはコリネバ クテリウム属に属する微生物をあげることができる。
ェシエリヒア属に属する微生物としては、好ましくはェシヱリヒア 'コリに属する 微生物等をあげることができ、バチルス属に属する微生物としては好ましくはバチル ス ·サチリスまたはバチルス ·メガテリゥム等に属する微生物をあげることができ、 コリネバクテリゥム属に属する微生物としては好ましく（まコリネバクテリゥム ·グル タミカムまたはコリネバクテリウ Α ·アンモニアゲネス等に属する微生物をあげるこ とができる。.
上記製造法に用いられる微生物は、本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物 であれば、 いずれの微生物であってもよく、 好ましくはバチルス属に属する微生物、 より好ましくはバシリシン合成活性を有するバチルス属に属する微生物、さらに好ま しくはバチルス ·サチリス、 バチルス ·ァミロリケファシエンス、 バチルス ·コアギ ュランス、 バチルス · リケニフォルミス、 バチルス ·メガテリゥムおよびバチルス · プミルスからなる群より選ばれる種に属する微生物、最も好ましくは、バチルス，サ チリス ATCC15245、 バチルス ·サチリス ATCC6633、 バチルス ·サチリス IAM1213、 バチ ルス ·サチリス IAM1107、 バチルス ·サチリス IAM1214、 バチルス ·サチリス ATCC9466 、 バチルス 'サチリス IAM1033、 バチルス ·サチリス ATCC21555、 バチルス ·アミ口リ ケファシエンス IFO3022およびバチルス ·プミルス NRRL B- 12025からなる群より選 ばれる株である微生物をあげることができる。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離し て得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物 、 該菌体の超音波処理物、 該菌体の機械的摩砕処理物、 該菌体の溶媒処理物、 該菌体 の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出し て得られる酵素標品などをあげることができる。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸の種類、使用濃度および添加時期 、 並びに生産されるジペプチドは、 上記 （ii i) の （1 )の酵素的製造法のものと同 様である。
また、微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源とした製造法において用い られる水性媒体としては、 上記 （iii) の （1 ) の酵素的製造法に用いられる水性媒 体に加え、酵素源として用いた形質転換体または微生物の培養液も水性媒体として用 いることができる。
また上記製造法においては、 必要に応じて、 A T Pの供給源として、 A T Pまたは 形質転換体もしくは微生物が代謝して A T Pを生産し得る化合物、例えばグルコース のような糖類、エタノールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを水性 媒体中に加えることができる。
さらに必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい 。界面活性剤としては、 ポリオキシエチレン 'ォク夕デシルァミン （例えばナイミ一 ン S-215、 日本油脂社製） などの非イオン界面活性剤、 セチルトリメチルアンモニゥ ム -プロマイドゃアルキルジメチル.ベンジルアンモニゥムクロライド （例えばカチ オン F2-40E、 日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、 ラウロイル 'ザルコシネ —トなどのァニオン系界面活性剤、 アルキルジメチルァミン （例えば三級アミン FB、 日本油脂社製）などの三級アミン類など、ジぺプチドの生成を促進するものであれば いずれでもよく、 1種または数種を混合して使用することもできる。 界面活性剤は、 通常 l〜50 g八の濃度で用いられる。 有機溶剤としては、 キシレン、 トルエン、 脂 肪族アルコール、 アセトン、 酢酸ェチルなどがあげられ、 通常 0.1〜50 ml八の濃度で 用いられる。
培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は、当該 酵素源の比活性等により異なるが、 例えば、 基 として用いるアミノ酸 lmgあたり湿 菌体重量として 5〜1000mg、 好ましくは 10〜400mg添加する。 ' ジペプチドの生成反応は水性媒体中、 pH5〜ll、 好ましくは pH6〜10、 20〜65°C、 好 ましくは 25〜55°C、 より好ましくは 30〜45°Cの条件で通常 1分間〜 150時間、好ましく は 3分間〜 120時間、 より好ましくは 30分間〜 100時間行う。
上記 （iii) の （1 ) または （2 ) の製造法において、 水性媒体中に生成、 蓄積し たジぺプチドの採取は、 活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、 有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロ トグラフィ —等により行うことができる。 - 図面の簡単な説明 ，
第 1図はプラスミド pPE43の構築過程を示す図である。
第 2図はプラスミド pQE60ywfEの構築過程を示す図である。
また、 図中の lは、 バチルス ·サチリス 168株由来の E遺伝子、 PkEはトリプ トフアンプロモ一夕一遺伝子、 は T 5プロモ一夕一遺伝子を表す。
発明を実施するための最良の形態
以下に、 実施例を示すが、 本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例 1 デ一夕べ一スを利用したジぺプチド合成活性を有する蛋白質の検索
バチルス■サチリス 168株由来の D-Ala- D- Ala リガーゼ遺伝子のアミノ酸配列 [ Nature, 390 , 249-256 (1997 ) ] をクエリーとして、 バチルス ·サチリス 168株のゲ' ノム; D NAのデ一夕ペースである Subtilist (http：〃 genolist .pasteur .
fr/SubtiList/ )のホモロジ一検索機能を用いて、バチルス 'サチリス 168株のゲノム D N A配列中に存在する相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子を検索した。
その結果抽出された配列のうち、 D- Ala- D-Alaリガ一ゼモチーフ [Biochemistry, 30 , 1673 (1991) ]である配列番号 3 3、 3 4または 3 5で表されるアミノ酸配列をコー ドし、かつ既にその機能が同定されている蛋白質をコードする遺伝子を排除したもの のうち、 D- Ala- D-Ala リガ一ゼモチーフと最も高い相同性 （29.1%) を示すものとし て機能未知遺伝子 lを選択した。
lの塩基配列を配列番号 9、該塩基配列にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を 配列番号 1に示した。
実施例 2 l遺伝子発現株の造成
実施例 1で得られた塩基配列情報に従い、ノ チルス ·サチリスの l遺伝子断片を 以下のようにして取得した。
まず、 バチルス 'サチリス 168株 （ATCC 23857) を LB培地 [10^1 バクトトリブト ン （ディフコ社製） 、 5g/lイーストエキス （ディフコ社製） 、 5g/l塩化ナトリウム ]に植菌し 30°Cで一晚静置培養した。 培養後、 カレント 'プロトコールズ ·イン .モ レキユラ一'バイオロジーに記載の飽和フエノールを用いる方法により、該微生物の 染色体 D N Aを単離精製した。
パーセプティブ.バイオシステムズ （Perseptlve Biosystems)社製 8905型 DNA 合成機を用いて、配列番号 19〜22で表される塩基配列を有する DNA (以下、 そ れそれプライマー A、 プライマ一 B、 プライマ一 Cおよびプライマ一 Dと呼ぶ）を合 成した。プライマ一 Aは、バチルス 'サチリスの染色体 DN Aの lの開始コドンを 含む領域の 5 '末端に l認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマ一 Bは、 lの終止コドンを含む配列と相補的な塩基配列の 5'末端に ま1認識配列を 含む塩基配列を付加したものである。 またプライマ一 Cは、 i|卫プロモー夕一を含む 発現べクタ一pTrS30 [ェシエリヒア 'コリ JM109/pTrS30(FERM BP- 5407)より調製] の i£プロモ一夕一領域の塩基配列の 5'末端に RI認識配列を含む塩基配列を付加 したものである。プライマ一 Dは、 t£プロモ一夕一を含む発現ベクター pTrS30の il£ プロモーター領域の配列と相補的な配列の 5'末端に 1 I認識配列を含む塩基配列を 付加したものである。
l遺伝子断片の増幅には上記のプライマ一 Aおよびプライマ一 B、錶型どしてバ チルス ·サチリスの染色体 DNAを用い、 ii£プロモーター領域の断片の増幅にはプ ライマー Cおよびプライマ一 D、錶型として pTrS30を用いて P CRを行った。 P CR は、錶型として 0.1〃gの染色体 DNAまたは 10ngの pTrS30、 Ο.δ ΠΐοΙ/の各プライマ ―、 2.5 unitsの DNAポリメラ一ゼ（ストラタジーン社製）、 4〃Lの ϋ DNAポリメ ラ一ゼ用 X10緩衝液（ストラタジーン社製)、各 200〃mol/Lの dNTP (dATP、 dGTP、 dCTP および dTTP)を含む反応液 40 Lを調製し、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間 72°Cで 3分間 の土程を 30回繰り返すことにより行った。
該反応液の 1 / 10量をァガロースゲル電気泳動し、プライマー Aおよびプライマー B を用いた PCRでは l遺伝子断片に相当する約 1.4kb、 プライマー Cおよびプライ マー Dを用いた反応では ii卫プロモー夕一領域の DNA断片に相当する約 0.3kbの D NA断片がそれそれ増幅していることを確認した後、 残りの反応液と等量の TE [10 mmol/L ris-HCl(pH8.0)s lmmol/L EDTA]飽和フエノール/クロ口ホルム (lvol/lvol )溶液を添加し、 混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の冷ェ タノ一ルを加えて混合し、 -80°Cに 30分間放置した。 該溶液を遠心分離して DN Aを 沈殿させた後、 該 DNAを 20 /Lの TEに溶解した。 該溶解液それそれ 5 iLを用い、ブラィマー Aおよびプライマ一 Bで増幅した D N A を制限酵素 Iおよび πΐΗΙで、 またブライマ一 Cおよびブライマ一 Dで増幅した D Ν Αを制限酵素 および lで切断し、 ァガロースゲル電気泳動により D NA断 片を分離した後、 ジーンクリーン IIキヅト （GENECLEAN II kit, BIO 101社製） を用 いて、 lを含む 1.4kbおよび ii£プロモーター頁域を含む 0.3kbの D NA断片をそれ それ回収した。
il£プロモーターを含む発現べクタ ·一 pTrS30 [ェシエリヒア .コリ
JM109 /pTrS 30 ( FERM BP- 5407 )より調製] 0.2〃 gを制限酵素 および i lHIで切断後 、ァガロースゲル電気泳動により D N A断片を分離し、上記と同様の方法により 4.5kb の D NA断片を回収した。
上記で得られた lを含む 1.4kb断片、 ii卫プロモーター領域を含む 0.3kb断片およ び 4.5kbの断片をライゲーシヨンキット （宝酒造社製） を用いて、 16°Cで 16時間反応 させ連結した。
該反応液を用いてェシエリヒア'コリ 丽 522株（ストラタジーン社製） を、 カルシ ゥムイオンを用いる方法 [Proc . Natl . Acad. Sci .， USA, 69 , 2110 (1972 )] によつ て形質転換し、該形質転換体を 50〃g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布した 後、 30°Cで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってブラスミドを抽出し、 制限酵素を用いてその構造を解析することにより、 trpプロモーター下流に ywfEが連 結された発現べクタ一である PPE43が取得されていることを確認した '(図 1 ) 。
実施例 3 ジペプチドの生産
実施例 2で得られた pPE43を保有するェシエリヒア 'コリ 丽 522 (ェシエリヒア · コリ 匪 522/pPE43株） を 50〃g/mlのアンピシリンを含む 8mlの L B培地が入った太型 試験管に接種し、 28°Cで 17時間培養した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した 終濃度 60mg/mlの該湿菌体、 120腿 ol/Lのリン酸ガリウムバッファ一 (pH7.4) 、 60mmol/Lの塩化マグネシウム、 60匪 ol/Lの ATP、 30腿 ol/Lの L- Ala、 30匪 oI/Lの L-Gln、 0.4%のナイミーン S— 2 1 5からなる 0.1mlの反応液を調製し、 37°Cで 3分間反応を 行った。 反応終了後、反応生成物をジニトロフヱノ一ル化法で誘導体化した後に HPLC法によ り分析した。 HPLC法による分析は、 分離カラムに関東化学社製の Lichrosorb- RP- 18 ' カラムを用い、溶離液として 1%(ν/ν)リン酸、 25%(v/v)ァセトニトリルを用い、 0,7ml /分の流動速度で行つた。 その結果反応液中に 12 Omg/Lの L-ァラニルー L-グル 夕ミン （L- Ala-L- Gin) が生成蓄積していることを確認した。
対照菌株であるべクタ一のみを含むェシエリヒア ·コリ 匪 522/pTrS31株の菌体で は L-Al a- L- Ginの生成は認められなかった。
実施例 4 C末端 His夕グ付加型組換え型ジぺプチド合成酵素の精製
上記 DNA合成機を用いて、配列番号 2 3および 24で表される塩基配列を有する DNA (以下、 それそれズライマ一 E、 プライマー Fと呼ぶ） を合成した。 プライマ 一; Eは、 lの開始コドン （atg)を I認識配列 （cc gg)に置換した領域を含む 塩基配列である。 プライマー Fは、 lの終止コ 'ドンを S HI認識配列 （gg^tcc)に 置換した領域を含む塩基配列である。
バチルス ·サチリス 168株 （ATCC 23857) の染色体 D N Aを錶型とし、 上記プライ マ一 Eおよびプライマー Fをプライマ一セットとして用いて P CRを行った。 P CR は、 0.1〃gの染色体DNA、 0.5〃mol/Lの各プライマ一、 2.5 unitsの Pfu DNAポリメ ラ一ゼ、 4〃1^の££]^^ポリメラーゼ用 10緩衝液、 200〃niol/Lの各 dNTPを含む反応 液 を調製し、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間の工程を 30回繰り返すこ とにより行った。
該反応液の 1八 0量をァガロースゲル電気泳動し、 ywfE断片に相当する約 1.4kbの断 片が増幅していることを確認後、 残りの反応液と等量の TE飽和フエノール/クロロホ ルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の冷 エタノールを加えて混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。 該溶液を遠心分離して得られ た D N Aの沈殿を 20 Lの TEに溶解した。
該溶解液 5 zLを用い、 増幅した DNAを制限酵素 lおよび SHIで切断し、 ァガ ロースゲル電気泳動により D N A断片を分離した後、ジーンクリーン 11キットを用い て、 zi を含む 1.4kbの DNA断片を回収した。
C末端 Hisタグ付加型組換え体発現べクタ一 PQE60 (キアゲン社製） 0.2gを制限酵素 lおよび Ι ΗΙで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、 上 記と同様の方法により 3.4kbの： D N A断片を回収した。
上記で得られた lを含む 1.4kbの D N A断片と 3.4kbの D N A断片をラィゲ一シ ヨンキヅトを用いて、 16°Cで 16時間反応させ連結した。
該連結反応液を用いてェシエリヒア'コリ 画 522株をカルシウムイオンを用いる方 法によって形質転換し、該形質転換体を 50 g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に 塗布した後、 30°Cで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、 制限酵素を用いてその構造を解析することにより、 C末 His夕グ付加型 y fl発現べク夕 —である pQE60ywfEが取得されていることを確認した （図 2 ) 。
pQE60ywfE を保有するェシェリヒア 'コリ 匪 522 (ェシエリヒア 'コリ
丽 522/pQE60ywfE株）を、 50 ig/mlのアンピシリンを含む 8mlの L B培地の入った太型 試験管に接種し 28°Cで 17時間培養した。 該培養液を 50〃g/mlのアンピシリンを含む 50mlの L B培地の入つた 250ml容三角フラスコに接種し 30°Cで 3時間培養した後、終濃 度が lmmol/Lになるようにィソプロピル一/?— D—チォガラクトピラノシド（IPTG)を 添加し、 さらに 30°Cで 4時間培養した。 該培養液を遠心分離して湿菌体を取得し、 該 湿菌体から、 HisTrap (Hisタグ付加タンパク精製キヅト、 Amersham Pharmasia Biotech 社製） を用いて、 説明書に従い Hisタグ付加組換え型酵素を精製した。
実施例 5 Hisタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産 （1 )
(1) 実施例 4で取得した精製した His夕グ付加組換え型酵素 0.04mg、 100mmol/Lの Tris-HCl (pH8.0 )、 60匪 ol/Lの塩化マグネシウム、 60匪 ol/Lの ATP、 30腿 ol/Lの L-Ala、 30mmol/Lの L-Glnからなる 0.1mlの反応液を調製し、 37°Cで 16時間反応を行った。 ' 反応終了後、 上記実施例 3と同様の方法により反応生成物を分析し、 反応液中に 3.7g/Lの L- Ala— L-Glnと 0.3g/Lの L-ァラニルー L-ァラニン（L-Ala— L- Ala)が生成蓄 積していることを確認した。 · '
(i.i) 酵素を 0.01mg、 L - Ginの代わりに L-Phe、 L - Met、 L - Leuまたは L- Valを含有する 以外は、 上記 (i)の反応液の組成と同じ反応液を調製し、 上記 (i)の反応条件で反 応させた。
反応終了後、上記実施例 3と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそ れそれ、 7.0g/Lの L-ァラニルー L-フエ二ルァラニン （L-Ala—L- Phe) のみ、 7.0g/L の L-ァラニルー L-メチォニン (L-Ala—L- Met)および 0.03g/Lの L-Ala—L- Ala、 5.0g/L の L-ァラニルー L-ロイシン (L-Ala-L-Leu) および' 0.2g/Lの L- Ala— L- Ala、 または 1.6g/Lの L-ァラニル— L-バリン (L-Ala-L-Val)および 0.3g/Lの L-Ala— L-Alaが生成 蓄積していることを確認した。
(iii)酵素を 0.01mg、 L - Alaの代わりに Gly、 L - Ginの代わりに L- Pheまたは L- Metを含 有する以外は、 上記（1 )の反応液の組成と同じ反応液を調製し、 上記（1 ) の反応 条件で反応させた。
反応終了後、上記実施例 3と同様の方法により反応生成物を分析し、反応液中にそ れそれ 5.2g/Lのク"リシル— L -フェニルァラニン (Gly-L-Phe)または 1. lg/Lのグリシ ルー L-メチォニン （Gly— L- Met) が生成蓄積していることを確認した。
上記反応液組成から ATPを除くとジぺプチドは全く生成されなかった。
以上の結果から、 l遺伝子産物は、 ATP存在下において、 L-Alaと L-Gln、 L-Phe、 L-MetN L- Leuまたは L- Valとから、 L- Ala— L- Ginおよび L-Ala—L- Ala、 L-Ala— L- Phe、 L-Ala- L-Metおよび L-Al a - L-Al a、 L-Al a - L- Leuおよび L-Al a— L-Al a、 または L- Al a - L-Valおよび L- Al a— L-Al aを生成する活性、 Gl yと L- Pheまたは L-Metとから Gl y— L-Pheまたは Gly— L- Metを生成する活性を有することが明らかになった。
実施例 6 Hisタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産 （2 )
実施例 4で得られた精製した Hisタグ付加組換え型酵素 0.04mg、 100腿 ol/Lの
Tris-HCl (pH8.0 )、 60腿 ol/Lの塩化マグネシゥム、 60腿 ol /Lの ATPからなる 0.1mlの反 応液を調製し、表 1の第 1行目と最左列のアミノ酸の組み合わせからなる各種 L—ァ ミノ酸、 Glyまたは/?- Alaをそれそれ 30腿 ol/Lずつになるように反応液に添加し、 37 °Cで 16時間反応を行った。反応終了後、反応生成物を HPLC分析したところ、第 1表に 示すジぺプチドが生成していることが確認された。
Figure imgf000038_0001

Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
第 1表の第 1行目と最左列に記載の 2種類（もしくは 1種類）の L—アミノ酸、 Gly または/? - Al aを基質として反応した場合に生成したジぺプチドを枠内に記載した。〇 は配列は未確定だがジぺプチドが生成したこと、 Xはジぺプチドの生成が確認されな かったこと、 および空欄は未実施を示す。
実施例 7 Hisタグ付加組換え型酵素発現株を用いたジぺプチドの生産
実施例 4で得られたェシエリヒア'コリ 履 522/pQE60ywfE株を 50〃g/mlのアンピシ リンを含む 8mlの L B培地の入った太型試験管に接種し、 28°Cで 17時間培養した。 該 培養液を 50〃 g/mlのアンビシリンを含む 5 Omlの L B培地の入つた 25 Oml容三角フラス コに接種し 30°Cで 3時間培養した後、終濃度が 1腿 ol/Lになるようにィソプロピル—/? —D—チォガラクトビラノシド（IPTG)を添加し、 さらに 30°Cで 4時間培養した。 該培 養液を遠心分離し湿菌体を取得した。 200g/Lの湿菌体、 50g/Lのグルコース、 5g/Lのフィチン酸 （33 %の濃水酸化ナトリ ゥム溶液を用いて中性になるよう希釈） 、 15g/Lのリン酸二水素カリウム、 5g/Lの硫 酸マグネシウム ' 7水和物、 4g/Lのナイミーン S- 215、 10ml/Lのキシレン、 200mmol/L の L- Ala、 200腿 ol/Lの L- Ginからなる 20mlの反応液 (pH7 , 2) を 50ml容量のビーカーに 入れ、 32°C！、 900rpmの条件下で 2時間反応を行った。 反応中は 2mol/Lの水酸化力リウ ムを用いて反応液の pHを 7. 2に保った。
反応生成物を実施例 3記載の方法と同様の方法で分析したところ、 25mg/Lの L-Ala — L-Glnの蓄積が確認された。
実施例 8 バチルス属に属する各種微生物からの ywfE遺伝子に相当する遺伝子のク ローニングとその解析
配列番号 9で表される塩基配列に基づ バチルス ·サチリス ATCC15245、ATCC6633 、 IAM1213、 IAM1107, IAM1214、 ATCC9466、 IAM1033S ATCC21555, バチルス · 7ミノ リケファシエンス IFO3022、 およびバチルス ·プミルス NRRL B- 1202.5に存在する l遺伝子に相当する遺伝子を以下のようにして取得した。
まず、 バチルス 'サチルス ATCC15245、 ATCC6633, ΙΑΜ1213、 ΊΑΜ1107、 IAM1214S ATCC9466S IAM1033 ATCC21555, バチルス ·アミノリケファシエンス IFO3022、 およ びバチルス ·プミルス NRRL B-12025をそれそれ LB培地に植菌し 30°Cで一晚静置培 養した。培養後、 カレント 'プロトコールズ ·ィン 'モレキュラー ·バイオロジーに 記載の飽和フヱノールを用いる方法により、該微生物の染色体 D N Aをそれそれ単離 精製した。 '
パ一セプティブ ·バイオシステムズ社製 8905型 DNA合成機を用いて、 配列番号 2 5および 2 6で表される塩基配列を有する D N A (以下、 それぞれプライマー G、 プ ライマー Hと呼ぶ） を合成した。 プライマー Gは、 バチルス ·サチリス 168株の染 色体 D N Aの ywfEの開始コドンより上^を含む領域の配列である。プライマ一 Hは、 ywfEの終始コドンより下流を含む配列と相補的な配列である。
バチルス ·サチルス ATCC15245, ATCC6633S IAM1213, 1獵107ヽ I皿 214、 ATGC9466, IAM1033S ATCC21555, またはバチルス 'アミノリケファシエンス IFO3022の染色体 D N Aを銪型とし、上記ブライマ一 Gおよびプライマ一 Hをプライマーセットとして 用いて P C Rを行った。 P C Rは、 0 . 1〃gの染色体 D N A、 0 . 5 zmol/Lの各プライ マ一、 2 . 5 unitsの Ei DNAポひメラ一ゼ、 4〃Lの Pfu DNAポリメラーゼ用 x 10緩 衝液、 200 zmol/Lの各 dNTPを含む反応液 40〃Lを調製し、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2 分間、 72°Cで 3分間の工程を 30回繰り返すことにより行った。
該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、 断片に相当する約 1 . 6kbの 断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量の TE飽和フエノール/クロ口 ホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の 冷エタノールを加えて混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して得ら れた D N Aの沈殿を 20 Lの TEに溶角军した。
上記で得られた各菌株染色体 D N A由来の 1 .4kb断片と pCR- blunt (ィンビトロジ ェン社製）を、 ライゲ一シヨンキットを用いて、 16°Cで 16時間反応を行い連結した。 該反応液を用いてェシエリヒア ·コリ 舰 522株をカルシウムイオンを用いる方法 によって形質転換し、該形質転換体を 50Adg/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に 塗布した後、 30°Cでー晚培養した。
生育してきた形質転換体のコロニ一より公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、 制限酵素を用いてそれそれの構造を解析することにより、 遺伝子に相当する遺 伝子を含むプラスミドである pYWFEl (ATCC15245株由来、配列番号 3 6で表される塩 基配列を有する D N A；)、 pYWFE2 (ATCC6633株由来、 配列番号 1 0で表される塩基配 列を有する D N A：)、 pYWFE3 (IA 1213株由来、 配列番号 1 1で表される塩基配列を 有する D N A)、 pYWFE4 (IAM1107株由来、 配列番号 1 2で表される塩基配列を有す' る D N A)、 pYWFE5 ( IAM1214株由来、 配列番号 1 3で表される塩基配列を有する D N A)、 pYWFE6 (ATCC9466株由来、配列番号 9で表される塩基配列を有する D N A：)、 PYWFE7 ( IAM1033株由来、配列番号 3 6で表される塩基配列を有する D N A)、 pYWFE8 (ATCC21555株由来、 配列番号 1 4で表される塩基配列を有する D N A)、 pYWFE9 ( IFO3022株由来、 配列番号 1 5で表ざれる塩基配列を有する D N A) が取得されて いることを確認した。
一方、 バチルス ·プミルス NRRL B-12025由来の に相当する遺伝子 （配列番 号 1 6で表される塩基配列を有する D N A) は以下のように取得した。
上記で調製した NRRL B- 12025株の染色体 D N Aを錶型にし、 配列番号 2 7および 2 8で表される塩基配列からなる D N Aをプライマ一セヅトとして用いて、 P C Rを 行った。 P C Rは、 0.1〃 の染色体0 、 0.5〃mol/Lの各プライマ一、 2. 5 units' の Z-taqポリメラ一ゼ（宝酒造社製)、 5〃Lの Z- taqポリメラーゼ用 X 10緩衝液（宝 酒造社製)、 00 mol/Lの各 dNTPを含む反応液 50 /Lを調製し、 98°Cで 5秒間、 55°C で 30秒間、 72°Cで 1分間の工程を 30回繰り返すことにより行った。
該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、 約 0.8kbの断片が増幅している ことを確認後、残りの反応液と等量の TE飽和フエノール /ク口口ホルム溶液を添加し、 混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の冷エタノールを加え て混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られた D N Aの沈殿を 20 zLの TEに溶解した。 '
上記で得られた各菌株染色体 D N A由来の 0.8kb断片と pGEM T-easy (プロメガ社 製）を、 ライゲーシヨンキットを用いて、 16°Cで 16時間反応を行い連結した。
該反応液を用いてェシヱリヒア 'コリ DH5ひ株をカルシウムイオンを用いる方法に よって形質転換し、該形質転換体を 50〃g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗 布した後、 30°Cで一晩培養した。
上記で得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、約 0.8kbの揷入 D N A断片 の塩基配列を決定したところ、配列番号' 1 6で表される塩基配列中の塩基番号 3 5 8. 〜 1 1 6 0番からなる塩基配列が確認された。
次に該プラスミドを EcoRIで切断した後、ァガロースゲル電気泳動により D N A断 片を分離した。 該 D NA断片をジーンクリーン IIキットを用いて精製した。 約 0.5 〃gの該精製 D NA断片を、 DIG-ハイプライム DNAラベリング &デテクシヨン ス夕 一夕ーキット I (ロシュ'ダイァグノステイクス社製)を用いて、 DIGラベル化した。 DIGラベル化は、 該キット添付の説明書に従って行った。
上記で得られた DIGラベル化 D N Aを用いて、 NRRL B-12025株の染色体 D N Aの サザン解析を行った。
NRRL B-12025株の染色体 D N Aを I HI、 ECOR Hindi 11, Kpnl Pstl、 Sacl、 Sail および ilを用いてそれそれ完全消化し、 ァガロース電気泳動により D N A断片を 分離した後、常法に従いナイロンメンブレンプラスチャージ（ロシュ ·ダイァグノス テイクス社製） に転移させた。
UVを照射することにより、 該ナイロン膜に D NA断片を固定した後、 上記プロ一： ブ D N Aおよび該ナイロン膜を用いてサザンハイブリダィゼ一シヨンを行った。 ハイブ.リダイゼーションは、該プローブ D N Aと該ナイ口ン膜を 65°Cで 16時間接触 させ、 その後該ナイロン膜を、 0.1 %SDSおよび 2 X SSCからなる溶液を用い、 室温で 5分間、 2回洗浄し、 さらに 0.1 %SDSおよび 0. 5 XSSCからなる溶液を用い、 65°Cで 15分間、 2回洗浄することで行い、 その他の操作、条件およびハイブリダィズした D N Aの検出は、 上記した DIG-ハイプライム DNAラベリング &デテクシヨン スター 夕一キット Iに添付されている説明書に準じて行った。
その結果、 Hindi IIおよび MIの完全消化断片の 3 . 5kb 付近に発色が見られた。 次に、 8-12025株の染色体0 八を (1111ぉょび£^1を用いてそれそれ完 全消化し、ァガロースゲル電気泳動により D N A断片を分離した。それそれの制限酵 素消化 D NAから 3-4kbpの断片をジ一ンクリーン I Iキヅトを用いて精製し、ライゲ ーシヨンキヅトを用いて自己環^!させた。
上記で決定した 0.8kbの D N A断片の塩基配列に基づき、配列番号 2 9および 3 0 で表される塩基配列を設計、合成し、上記で取得した環化 D NAを鎵型として P を行った。 P C Rは、 10ngの環化 D NA、 0.5〃mol/Lの各プライマ一、 2.5 units の pyrobestポリメラ一ゼ（宝酒造社製）、 5〃Lの pyrobestポリ ラ一ゼ用 x 10緩衝 液 （宝酒造社製)、 200 zmol/Lの各 dNTPを含む反応液 50〃Lを調製し、 98°Cで 5秒 間、 &5°Cで 30秒間、 72°Cで 3分 30秒間の工程を 30回繰り返すことにより行った。 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、 約 3. Okbの断片が増幅している ことを確認後、残りの反応液と等量の TE飽和フエノール /ク口口ホルム溶液を添カロし、 混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の冷エタノールを加え て混合し、 - 8ひ°〇に 30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られた D N Aの沈殿を 20〃Lの TEに溶解した。
上記で得られた D N A断片と Zero Blunt PCR Cloning Kit (インビトロジェン社 製） とをライゲ一シヨンキヅ トを用いて連結した。
該反応液を用いてェシエリヒア ·コリ 丽 522株をカルシウムイオンを用いる方法 によって形質転換し、該形質転換体を 50〃g/mlのアンピシリンを含む LB:寒天培地に 塗布した後、 S0°Cで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、 制限酵素を用いてその構造を解析することにより、 ywfE遺伝子に相当する遺伝子を 含むプラスミドである pYWFElO (NRRL B- 12025株由来、 配列番号 1 6で表される塩基 配列を有する D N A) が得られていることを確認した。
上記で得られた pYWFEl〜pYWFE10に含まれる に相当する各遺伝子の塩基配列 を塩基配列分析装置 373A' D N Aシークェンサ一を用いて決定した。
pYWFEl, pYWFE6および pYWFE7に含まれる遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸 配列は、 ywfE遺伝子にコードされる蛋白質のァミノ酸配列と同一であったが、 pY¥FE2、 pYWFE3、 pYWFE4N pYWFE5N pY¥FE8、 pYWFE9および pYWFElQに含まれる遺伝子にコー 'ドされる蛋白質のアミノ酸配列は、 ywfE遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配 列と異なっていた。
pYWFE2、 pYWFE3、 pY¥FE4、 pYWFE5、 pY¥FE8、 pYWFE9s pYWFElOおよび pYWFElと pYWFE7 に含まれる lに相当する遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号 2〜 8および 1に、該遺伝子の塩基配列を配列番号 1 0〜1 6および 3 6にそれそれ 示した。
実施例 9 C末端 His夕グ付加型組換え型ジぺプチド合成酵素の精製
バチルス'サチルス ATCC15245, ATCC6633, 1厘213、 I厘 107、 IAM1214, ATCC9466N 1厘033ヽ ATCC21555, またはバチルス 'アミノリケファシエンス IFO3022 の染色体 D N Aを鎵型とし、実施例 2記載のプラィマ一 Aおよびプライマ一； Bをプライマ一セ ヅ トとして用いて P を行った。 P C Rは、 0 . 1〃gの染色体 D N A、 0 . 5〃mol/L の各プライマー、 2 . 5 unitsの £|M DNAポリメラーゼ、 4 Lの Pf u DNAポリ'メラーゼ 用 X 10緩衝液、 200〃mol/Lの各 dNTPを含む反応液 40〃Lを調製し、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間の工程を 30回繰り返すことにより行った。
バチルス ·プミルス NRRL B-12025の染色体 D N Aを錶型とした場合は、 配列番号. 3 1および 3 2で表される塩基配列を有する D N Aをプライマ一セヅ トとして用い、 上記と同様の条件で P C Rを行った。
該反応液の 1八 0量をァガロースゲル電気泳動し、 l断片に相当する約 1 .4kbの D N A断片がそれそれ増幅していることを確認後、 残りの反応液と等量の TE飽和フ ェノール/クロ口ホルム溶液を添カ卩し、 混合した。 該混合液を遠心分離して得られた 上層に、 2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、 -80°Cに 30分間放置した。該溶液 を遠心分離して得られた DN Aの沈殿を 20 Lの TEに溶解した。
該溶解液のそれそれ 5〃Lを用い、 増幅した D N Aを制限酵素 lおよび で切断し、ァガロースゲル電気泳動により D N A断片を分離した後、ジーンクリ一ン IIキットを用いて、 に相当する遺伝子を含む の DNA断片を回収した。 次に C末端 His夕グ付加型組換え体発現ベクター pQE60 0.2 z を制限酵素 lお よび I HIで切断後、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、上記と同 様の方法により 3.4kbの DNA断片を回収した。
上記で得られたバチルス，サチルス 168株の lに相当する遺伝子を含む 1.4kb の DNA断片、および 3.4kbの DNA断片をライゲ一シヨンキヅトを用いて、 16°Cで 16時間反応を行いそれそれ連結した。
該反応液を用いて大腸菌腿 522株をカルシウムイオンを用いる方法により形質転 換し、該形質転換体を 50 g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布した後、 30°C でー晚培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、 制限酵素を用いてそれらの構造を解析することにより、 C末 Hisタグ付加型遺伝子発 現ベクターである pQE60ywfEl .(ATCC15245由来の遺伝子を含有するべクタ一)、 pQE60ywfE2 (ATCC6633由来の遺伝子を含有するベクター）、 pQE60ywfE3 (IAM1213由 来の遺伝子を含有するべクタ一)、 pQE60ywfE4 (IAM1107由来の遺伝子を含有するべ クタ一)、 pQE60ywfE5 (IAM1214由来の遺伝子を含有するべクタ一）、 QE60ywfE6 (ATCC9466由来の遺伝子を含有するベクター)、 pQE60ywfE7 (IAM1033由来の遺伝子 を含有するベクター)、 pQE60ywfE8 (ATCC21555由来の遺伝子を含有するべクタ一）、 pQE60ywfE9 (IFO3022由来の遺伝子を含有するベクター)、および pQE60ywfE10 (NRRL B - 12025由来の遺伝子を含有するべクタ一） が取得されていることを確認した。 上記で得られたェシエリヒア 'コリ '丽 522/pQE60ywfEl〜丽 522/pQE60ywfE10株を、 それぞれ 50〃g/mlのアンピシリンを含む 8mlの L B培地の入った太型試験管に接種 し、 28°Cで 17時間培養した。 該培養液を 50〃g/mlのアンピシリンを贪む 50mlの L B培地の入った 250ml容の三角フラスコに接種し 30°Cで 3時間培養した後、 終濃度 が 1腿 ol/Lになるようにイソプロピル一/?— D—チォガラクトビラノシドを添カロし、 さらに 30°Cで 4時間培養した。該培養液を遠心分離して得られた湿菌体から、 HisTrap をその使用説明書に従って用いて、 Hisタグ付加組換え型酵素を精製した。
実施例 1 0 精製酵素を用いたジぺプチドの生産
実施例' 9で得られた組換え型酵素 0.04mg、 100mmol/Lの Tris- HC1 (pH8.0 )、 60腿 ol/L の塩化マグネシウム、 60腿 ol/Lの ATP、 30mmol/Lの L- Alaおよび 30mmol/Lの L- Gin からなる 0.1mlの反応液を調製し、 37°Cで 16時間反応を行った。
反応終了後、 実施例 3記載の方法により反応液を分桥し 結果、 それそれ、 3.0〜 3.5g/Lの L-Ala-L-Glnおよび 0.25〜0.3g/Lの L-Ala-L-Alaが生成蓄積しているこ とが確認された。
また、上記反応液組成から ATPを除くと L- Al a-L-Glnおよび L-Al a-L-Al aは全く生 成されなかった。
以上の結果から、実施例 8で得られた遺伝子の産物は、いずれも ATP存在下で L- Ala と L- Ginとから L-Ala-L- G.lnおよび L-Ala-L-Alaを生成する活性を有することが明ら かになつた。 ，
産業上の利用可能性
本発明により、酵素的合成法が知られていなかった L-Ala— L-Ala以外のジぺプチド を合成する活性を有する蛋白質を製造することができ、該蛋白質または該蛋白質を生 産する能力を有する形質転換体もしくは微生物を用いて L-Ala— L- Ala以外のジぺプ チドを製造することができる。
「配列表フリ一テキスト」 1
配列番号 1 9一人工配列の説明 ：合成 D NA
配列番号 2 0一人工配列の説明 ：合成 D NA
配列番号 2 1一人工配列の説明 ：合成 D NA
配列番号 2 2一人工配列の説明 ：合成: D NA
配列番号 2 3一人工配列の説明 ：合成 D NA
配列番号 2 4一人工配列の説明 ：合成 D NA
配列番号 2 5一人工配列の説明 ：合成 D NA
配列番号 2 6 —人工配列の説明 ：合成 D NA
配列番号 2 7一人工配列の説明 ：合成 D NA
配列番号 2 8 —人工配列の説明 ：合成 D NA 配列番号 2 9—人工配列の説明：合成 D NA
配列番号 3 0—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 3 1一人工配列の説明：合成 D NA
配列番号 3 2—人工配列の説明：合成 D NA
配列番号 3 3一人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列 配列番号 3 4—人工配列の説明：データベースサーチに用いたアミノ酸配列 配列番号 3 5一人工配列の説明：データペースサーチに用いたアミノ酸配列

Claims

請求の範囲 '
1. 以下の [1]〜 [4] のいずれかに記載の蛋白質 （ただし、 配列番号 1で 表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く） 。
[ 1 ] 配列番号 2〜 8のいずれかで表されるァミノ酸配列を有する蛋白質
[ 2 ]配列番号 1〜 8のいずれかで表されるァミノ酸配列において、 1以上のアミノ 酸が欠失、 置換または付加したアミノ酸配列からなり、 かつ式 （I)
Figure imgf000049_0001
(式中、 R1および: は、 同一または異なってアミノ酸を表すが、 同時に L—ァラニ ンを表すことはない） で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
[ 3 ]配列番号 1〜 8のいずれかで表されるァミノ酸配列と 65 %以上の相同性を有 するアミノ酸配列からなり、 かつ式（I)で表されるジぺプチ 'の合成活性を有する 蛋白質
[ 4 ]配列番号 17で表されるァミノ酸配列と 80 %以上の相同性を有するァミノ酸 配列を有し、 かつ式 （I) で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
2. 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する、 式 （I)
R1— R2 (I)
(式中、 R1および R2は、 同一または異なってアミノ酸を表すが、 同時に L一ァラニ ンを表すことはない） で表されるジペプチドの合成用蛋白質。
3. 以下の [1]〜 [4] のいずれかに記載の DN A (ただし、 配列番号 9で 表される塩基配列からなる DNAを除く） 。
[1]請求項 1記載の蛋白質をコードする DNA
[2]配列番号10〜16および 36のいずれかで表される塩基配列を有する DN A [3]配列番号9〜16および 36のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配 列を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ式 ( I) R1 - R2 (I)
(式中、 R1および は、 同一または異なってアミノ酸を表すが、 同時に L—ァラニ ンを表すことはない）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードする D NA
[4]配列番号18で表される塩基配列と 80%以上の相同性を有する塩基配列を有 する D NAであり、 かつ式（I )で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコ ードする D NA
4. 請求項 3記載の D N Aを含有する組換え体 D N A。
5. 請求項 4記載の組換え体 D N Aを有する形質転換体。
6. 形質転換体が、 微生物を宿主として得られる形質転換体である請求項 5記 載の形質転換体。
7. 微生物が、 ェシエリヒア (Escherichia)属に属する微生物である請求項 6 記載の形質転換体。
8. 請求項 5〜 7のいずれか 1項に記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物 中に請求項 1記載の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求 項 1記載の蛋白質の製造法。
9. 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、 培 養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項 1記載 の蛋白質の製造法。
10. 微生物がバチルス (Bacillus)属に属する微生物である請求項 9記載の製 造法。
11. バチルス属に属する微生物が、バシリシンを生産する能力を有するバヂル ス属に属する微生物である請求項 1 0記載の製造法。 、
12. バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物が、バチル ス -サチリス (Bacillus subtilis) 、 バチルス ·アミ口リケファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) ヽ ノ チ レス .コアギュランス (Bacillus coagulans)■、 ノ チノレ ス -リケニフオルミス (Bacillus lichenif ormis)、バチルス 'メガテリゥム (Bacillus megaterium) およびバチルス ·プミリレス (Bacillus pumilus) からなる群より選ばれ る種に属する微生物である請求項 1 1記載の製造法。
13. 請求項 1記載の蛋白質または請求項 2記載のジぺプチドの合成用蛋白質、 1種以上のアミノ酸、 および A T Pを水性媒体中に存在せしめ、 該媒体中に式 （I )
R 1 - R 2 ( I )
(式中、 R1および: R2は、 同一または異なってアミノ酸を表すが、 同時に L—ァラニ ンを表すことはない）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジぺプ チドを採取する該ジぺプチドの製造法。
14. 以下の [ 1 ] 〜 [ 3 ] から選ばれる培養物または該培養物の処理物を酵素 源に用い、該酵素源、 1種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式
( I )
R ' - R 2 ( I )
(式中、 R1および R2は、 同一または異なってアミノ酸を表すが、 同時に L一ァラニ ンを表すことはない）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジぺプ チドを採取する該ジぺプチドの製造法。
[ 1：]請求項 5〜 のいずれか 1項に記載の形質転換体の培養物または該培養物の処 理物
[ 2 ]請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物 の処理物
[ 3 ]請求項 2記載のジペプチドの合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物の培 養物または該培養物の処理物
15. 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物がバチルス属に属す る微生物である請求項 1 4記載の製造法。 .
16. バチルス属に属する微生物が、バシリシンを生産する能力を有するバチル ス属に属する微生物である請求項 1 5記載の製造法。
17. バシリシンを生産する能力を有するバチルス属に属する微生物が、バチル ス ·サチリス、 バチルス ·アミ口リケファシエンス、 バチルス ·コアギュランス、 バ チルス ·リケニフォルミス、 バチルス ·メガテリゥムおよびバチルス ·プミルスから なる群より選ばれる種に属する微生物である請求項 1 6記載の製造法。
18. 請求項 2記載のジぺプチドの合成用蛋白質を生麁する能力を有する微生物 が、配列番号 9で表される塩基配列を有する D N Aを含む組換え体 D N Aを含有する 微生物、 またはバチルス ·サチリスに属する微生物である請求項 1 4記載の製造法。
19. 配列番号 9で表される塩基配列を有する D N Aを含む組換え体 D N Aを含 有する微生物が、 ェシヱリヒア属に属する微生物である請求項 1 8記載の製造法。
20. 培養物の処理物が、 培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、 培養物を遠心分離 して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理 物、 該菌体の超音波処理物、 該菌体の機械的摩砕処理物、 該菌体の溶媒処理物、 該菌 体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出 して得られる酵素標品であることを特徴とする、 請求項 1 4〜1 9記載の製造法。
21. ジペプチドが式 （I I ) ' R 3 - R 4 ( I I )
(式中、 R3および R4は同一または異なって、 L—ァラニン、 L—グルタミン、 L— グルタミン酸、 グリシン、 L—バリン、 L—ロイシン、 L—イソロイシン、 L—プロ リン、 L—フエ二ルァラニン、 L—トリプトファン、 L—メチォニン、 L—セリン、 L—スレオニン、 L一システィン、 L—ァスパラギン、 Lーチロシン、 L—リジン、 L—アルギニン、 L—ヒスチジン、 L—ァスパラギン酸、 L—ひーァミノ酪酸、 β— ァラニン、 L—ァザセリン、 L—テアニン、 L— 4—ヒドロキシプロ'リン、 L— 3—ヒ ドロキシプロリン、 L—オル二チン、 L—シトルリンおよび L— 6—ジァゾ -5-ォキソ ノルロイシンから選ばれるアミノ酸を表すが、同時に L—ァラニンを表すことはない ) で表されるジペプチドである請求項 1 3〜2 0記載の製造法。
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