WO2012017925A1 - 物質の製造方法 - Google Patents

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WO2012017925A1
WO2012017925A1 PCT/JP2011/067356 JP2011067356W WO2012017925A1 WO 2012017925 A1 WO2012017925 A1 WO 2012017925A1 JP 2011067356 W JP2011067356 W JP 2011067356W WO 2012017925 A1 WO2012017925 A1 WO 2012017925A1
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medium
cysteine
oligopeptide
cell
cells
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PCT/JP2011/067356
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小川　晃
渉 栗橋
由信 今野
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協和発酵キリン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention is a method for culturing animal cells having the ability to produce a substance, characterized in that oligopeptides other than glutathione having one or more L-cysteines are added to the medium and the animal cells are cultured.
  • Culturing the animal cells, producing and accumulating the substance in the culture, and collecting the substance from the culture, and removing glutathione having one or more L-cysteines The present invention relates to a medium containing an oligopeptide.
  • Non-patent Document 1 Glycoproteins, especially antibodies, have recently been approved as various pharmaceuticals, and many candidate antibodies are under development. In the future, it is predicted that production of substances such as antibodies using animal cells will be developed. On the other hand, it has been pointed out that the productivity of substances using animal cells is not sufficiently high.
  • Non-Patent Document 2 As host cells producing glycoproteins such as antibodies, Chinese hamster ovary tissue-derived cells (CHO cells) or animal cells such as hybridomas are selected. This is because the sugar chains bound to the glycoprotein produced from the cells are relatively close to humans (Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Document 2).
  • Non-patent Document 3 cysteine, cystine or salts thereof have problems in industrial use such as precipitation of precipitates in the medium.
  • short peptides such as dipeptides for cell culture
  • basal media supplemented with L-amino acid-L-glutamine are known for the purpose of heat sterilization of the media (Patent Documents 3 and 4).
  • Cysteine-containing oligopeptides N, N′-bis-L-alanyl-L-cystine, N, N′-bis-L-glycyl-L-cysteine, N, N′-bis-L-leucyl-L -Cystein, N, N'-bis-Examples of administration in blood, oral and parenteral administration (Patent Document 7, Non-Patent Documents 3 and 4) are known.
  • Glutathione which is one of the tripeptides containing cysteine, consists of glutamic acid, cysteine or glycine and is known to be added to the medium (Patent Document 8).
  • the present invention is as follows. 1. A method for culturing animal cells having the ability to produce a substance, wherein the animal cells are cultured by adding an oligopeptide excluding glutathione having one or more L-cysteines to the medium. Culture method. 2. The method according to item 1 above, wherein the oligopeptide having at least L-cysteine is a dipeptide or a dipeptide dimer. 3. The method according to item 2, wherein the dipeptide having one or more L-cysteines is glycyl-L-cysteine, L-alanyl-L-cysteine, ⁇ -glutamylcysteine or a salt thereof. 4.
  • the dimer having a dipeptide having one or more L-cysteines is bis- (glycyl-L-cysteine) or bis- (L-alanyl-L-cysteine). 5. 5. The method according to any one of the preceding items 1 to 4, further comprising culturing the animal cell by adding an oligopeptide having L-tyrosine or one or more L-tyrosines to the medium. 6. The method according to item 5 above, wherein the oligopeptide having L-tyrosine of 1 or more is a dipeptide. 7.
  • the dipeptide having one or more L-tyrosines is L-alanyl-L-tyrosine or a salt thereof. 8).
  • the concentration of the oligopeptide having one or more L-cysteine added to the medium is 0.01 to 100 mmol / L.
  • the concentration of L-tyrosine or one or more oligopeptides having one or more L-tyrosine added to the medium is 0.01 to 100 mmol / L. 10.
  • the animal cell is a cell derived from an animal belonging to a mammal. 11.
  • 14 13 The method according to any one of items 10 to 12, wherein the animal cell is a transformed cell into which a vector containing a gene encoding a peptide has been introduced. 15. 15.
  • the dipeptide having L-cysteine of 22.1 or more is glycyl-L-cysteine, L-alanyl-L-cysteine, ⁇ -glutamylcysteine or a salt thereof.
  • the dipeptide dimer having L-cysteine of 13.1 or more is bis- (glycyl-L-cysteine) or bis- (L-alanyl-L-cysteine).
  • the oligopeptide having L-tyrosine of 15.1 or more is a dipeptide.
  • the dipeptide having 1 or more L-tyrosine is L-alanyl-L-tyrosine or a salt thereof.
  • the concentration of the oligopeptide having one or more L-cysteine added to the medium is 0.01 to 100 mmol / L. 28. 28.
  • the method according to any one of items 24 to 27, wherein the concentration of L-tyrosine or one or more oligopeptides having one or more L-tyrosine added to the medium is 0.01 to 100 mmol / L.
  • the peptide is a glycoprotein. 35. 35. The method according to item 34 above, wherein the glycoprotein is an antibody. 36. 36. The method according to any one of 20 to 35 above, wherein the period during which the oligopeptide is added is a logarithmic growth phase of the cells. 37. 37. The method according to any one of 20 to 36 above, wherein the medium to which the oligopeptide is added is a feed medium. 38. 38. The method according to any one of 20 to 37 above, wherein the culture method is a culture method using a culture tank. A medium containing an oligopeptide excluding glutathione having 39.1 or more L-cysteine. 40.
  • the oligopeptide excluding glutathione having L-cysteine of 40.1 or more is a dipeptide or a dipeptide dimer.
  • the dipeptide having L-cysteine of 41.1 or more is glycyl-L-cysteine, L-alanyl-L-cysteine, ⁇ -glutamylcysteine or a salt thereof.
  • the dipeptide dimer having L-cysteine of 42.1 or more is bis- (glycyl-L-cysteine) or bis- (L-alanyl-L-cysteine). 43. 45.
  • the present invention is a culture of animal cells having the ability to produce a substance, wherein the animal cells are cultured by adding an oligopeptide excluding glutathione having one or more L-cysteines to the medium.
  • a method for culturing the animal cell a method for producing a substance by culturing animal cells having the ability to produce the substance, wherein an oligopeptide excluding glutathione having one or more L-cysteine is added to the medium.
  • a method for producing a substance characterized by culturing animal cells, producing and accumulating the substance in the culture, and collecting the substance from the culture, and an oligo except for glutathione having one or more L-cysteines A medium containing the peptide is provided.
  • the present invention is a culture of animal cells having the ability to produce a substance, wherein the animal cells are cultured by adding an oligopeptide excluding glutathione having one or more L-cysteines to the medium.
  • the present invention relates to a method for culturing animal cells.
  • the oligopeptide used in the present invention is not particularly limited, but is preferably a peptide consisting of 2 to 20 amino acids, more preferably a peptide consisting of 2 to 10 amino acids, such as a pentapeptide, tetrapeptide, tripeptide, dipeptide, or Examples include dimers of these peptides.
  • the oligopeptide used in the present invention may form, for example, a salt such as hydrochloride and sodium salt, and / or a solvate such as hydrate.
  • dipeptides having one or more L-cysteine include glycyl-L-cysteine (Gly-Cys), L-alanyl-L-cysteine (Ala-Cys), L-selenyl-L-cysteine (Ser-Cys).
  • dipeptide dimer having one or more L-cysteines include bis- (glycyl-L-cysteine), bis- (L-alanyl-L-cysteine), and the like.
  • the present invention relates to a medium containing an oligopeptide excluding glutathione having one or more L-cysteines.
  • L-tyrosine or one or more oligopeptides having one or more L-tyrosines can be added.
  • the L-tyrosine added to the medium of the present invention may form, for example, a salt such as hydrochloride or sodium salt and / or a solvate such as hydrate.
  • the medium containing the oligopeptide is not particularly limited, but is preferably added to at least one medium selected from an expansion culture medium, a basic (initial) medium, a perfusion medium, or a feed (fed-batch) medium.
  • the oligopeptide having one or more L-cysteines of the present invention can be produced by a known synthesis method, enzyme method or fermentation method.
  • a method for producing L-glycyl-L-cysteine, L-alanyl-L-cysteine, bis- (L-glycyl-L-cysteine), or bis- (L-alanyl-L-cysteine) for example, , Synthesis method, or fermentation method (International Publication No. 2004/058960, International Publication No. 2006/001379).
  • L-tyrosine or one or more oligopeptides having one or more L-tyrosines can be added.
  • dipeptides having one or more L-tyrosines among oligopeptides having one or more L-tyrosines include glycyl-L-tyrosine (Gly-Tyr), L-alanyl-L-tyrosine (Ala-Tyr).
  • L-selenyl-L-tyrosine (Ser-Tyr), L-valinyl-L-tyrosine (Val-Tyr), L-methionyl-L-tyrosine (Met-Tyr), L-phenylalanyl-L-tyrosine (Phe-Tyr), L-arginyl-L-tyrosine (Arg-Tyr), L-tyrosinyl-glycine (Tyr-Gly), L-tyrosinyl-L-alanine (Tyr-Ala), L-tyrosinyl-L-serine (Tyr-Ser), L-tyrosinyl-L-methionine (Tyr-Met) or L-tyrosinyl-L-arginine (Ty -Arg), and the like.
  • Oligopeptides having one or more L-tyrosines can also be produced by known synthetic methods, enzymatic methods or fermentation methods.
  • a method for producing L-alanyl-L-tyrosine a synthesis method, a fermentation method (International Publication No. 2004/058960, International Publication No. 2006/001379), or the like can be given.
  • the method for adding the oligopeptide to the medium is not particularly limited, but it is preferably added to at least one medium selected from an expansion culture medium, a basic (initial) medium, a perfusion medium, or a feed medium.
  • the feed medium means a medium added separately from the basic medium.
  • an oligopeptide having one or more L-cysteine and an oligopeptide having L-tyrosine or one or more L-tyrosine may be added simultaneously to one medium, or two or more mediums may be added. You may add to each separately.
  • the oligopeptide When added as a feed medium, the oligopeptide may be added to the medium alone as a feed medium, or may be added to the medium as a feed medium in which the oligopeptide and other medium components are mixed in advance. Further, the feed medium may be divided and discontinuously added to the medium, or the feed medium may be continuously added to the medium.
  • the method for storing the feed medium is not particularly limited as long as the medium is maintained in a sterile state, and includes a method using a stainless tank or a disposable bag.
  • the concentration of one or more L-cysteine-containing oligopeptides added to any medium is appropriately selected depending on the type of animal cells used in the culture, the type of substance to be produced, the type of oligopeptide, the timing of addition of the oligopeptide, etc. However, it is preferably 0.001 to 1000 mmol / L, more preferably 0.005 to 500 mmol / L, and particularly preferably 0.01 to 100 mmol / L.
  • the concentration of L-tyrosine or one or more oligopeptides having one or more L-tyrosine added to the medium is also determined depending on the type of animal cells used in the culture, the type of substance to be produced, the type of oligopeptide, and the timing of oligopeptide addition However, it is preferably 0.001 to 1000 mmol / L, more preferably 0.005 to 500 mmol / L, and particularly preferably 0.01 to 100 mmol / L.
  • the timing of adding the feed medium containing the oligopeptide to the basal medium is not particularly limited and may be added before or after the start of the culture, but is preferably added to the medium during the logarithmic growth phase.
  • the logarithmic growth phase varies depending on the cell line to be cultured and the culture control method, but refers to the period from the time when the number of cultured cells rises to the time when the number of cultured cells becomes constant.
  • the mixing ratio at which the feed medium containing the oligopeptide is added to the basal medium is arbitrary, but is preferably 10% to 50%, more preferably about 20% to 30%, due to restrictions on industrial equipment.
  • any medium can be used as long as it can be used for animal cell culture, and a medium used for normal animal cell culture is used.
  • Cysteine may be previously contained as a medium component, or may not be contained.
  • Examples of the medium used in the present invention include a basal medium, a serum-containing medium, a serum-free medium, a medium not containing animal-derived components, a protein-free medium, or a completely synthetic medium. Alternatively, a completely synthetic medium is preferred.
  • basal medium for example, RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 130, 432 (1959)], Dulbecco's modified MEM (DMEM) medium [DMEM] medium , 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medical, 73, 1 (1950)], F12 medium (manufactured by LTI) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288 (1965)], Iskov modified Dulbecco medium (IMDM medium) [J. Experimental Medicine, 147, 923 (1978)], EX-CELL (registered trademark) 302 medium (manufactured by SAFC Bioscience), or a modified medium or mixed medium thereof.
  • RPMI 1640 medium The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]
  • Eagle's MEM medium Science, 130, 432 (1959)]
  • DMEM Dulbe
  • RPMI 1640 medium DMEM medium, F12 medium, IMDM and EX-CELL (registered trademark) 302 medium, EX-CELL (registered trademark) 325 PF medium (manufactured by SAFC Biosciences) or EX-CELL (registered trademark) CD CHO A medium (manufactured by SAFC Bioscience) is preferred.
  • the serum-free medium examples include a medium obtained by adding a physiologically active substance that is a serum substitute, a nutrient factor, a carbon source or a nitrogen source that can be used by animal cells, to a basal medium. These additives are preferably contained in the medium in advance before culturing.
  • nutritional factors examples include glucose, amino acids or vitamins.
  • amino acids examples include L-alanine (Ala), L-arginine (Arg), L-asparagine (Asn), L-aspartic acid (Asp), L-cysteine (Cys), L-cystine, L-glutamic acid ( Glu), L-glutamine (Gln), glycine (Gly), L-histidine (His), L-isoleucine (Ile), L-leucine (Leu), L-lysine (Lys), L-methionine (Met), Examples include L-phenylalanine (Phe), L-proline (Pro), L-serine (Ser), L-threonine (Thr), L-tryptophan (Trp), L-valine (Val), etc. Used in combination of more than one species. Further, salts such as hydrochlorides and sodium salts and / or solvates such as hydrates may be used.
  • vitamins examples include d-biotin, D-pantothenic acid, choline, folic acid, myo-inositol, niacinamide, pyridoxal, riboflavin, thiamine, cyanocobalamin, DL- ⁇ -tocopherol, and the like. Used in combination. Further, salts such as hydrochlorides and sodium salts and / or solvates such as hydrates may be used.
  • physiologically active substance examples include insulin, IGF-I, transferrin, serum albumin or a serum fraction containing a growth factor.
  • substances added in place of animal-derived components in a medium not containing animal-derived components include physiologically active substances produced by genetic recombination methods, hydrolysates, or lipids that do not contain animal-derived ingredients. .
  • hydrolyzate examples include hydrolysates such as soybean, wheat, rice, peas, cottonseed or yeast extract.
  • lipids examples include cholesterol, linoleic acid, and linolenic acid.
  • salts such as hydrochlorides and sodium salts and / or solvates such as hydrates may be used.
  • protein-free medium examples include ADPF medium (Animal dehydrated protein free medium, manufactured by High Clone), EX-CELL (registered trademark) 325 PF medium (manufactured by SAFC Bioscience), and the like.
  • CD CHO Fusion medium SAFC Bioscience
  • CD-Hybridoma medium Invitrogen
  • CD-CHO medium Invitrogen
  • IS-CD-CHO medium Irvine / Scien
  • TIFIC TIFIC
  • EX-CELL registered trademark
  • a medium containing a high concentration of amino acids and vitamins for example, a medium in which RPMI 1640 medium, DMEM medium and F12 medium are mixed at a ratio of 1: 1: 1, DMEM medium and F12 medium Or a hybridoma SFM medium (manufactured by Invitrogen) or the like.
  • animal cells having the ability to produce substances used in the present invention include cells derived from mammals, birds, reptiles, amphibians, fish, insects, and the like. Among them, animal cells belonging to mammals are preferable, and animal cells derived from humans or primates such as monkeys or animal cells derived from rodents such as mice, rats or hamsters are more preferable.
  • myeloma cells As cells belonging to mammals, myeloma cells, ovarian cells, kidney cells, blood cells, uterine cell connective tissue cells, mammary gland cells, embryonic retinoblasts or cells derived from these cells are preferred, myeloma cells, More preferred are cells selected from cells derived from myeloma cells, ovarian cells, or cells derived from ovarian cells.
  • Examples of cells belonging to mammals include human cell lines HL-60 (ATCC No. CCL-240), HT-1080 (ATCC No. CCL-121), HeLa (ATCC No. CCL-2), 293 ( ECACC No. 85120602), Namalwa (ATCC CRL-1432), Namalwa KJM-1 [Cytotechnology, 1, 151 (1988)], NM-F9 (DSM ACC2605, International Publication No. 2005/017130) and PER. C6 (ECACC No. 96022940, US Pat. No. 6,855,544), VERO (ATCC No. CCL-1651) and COS-7 (ATCC No. CRL-1651), monkey cell lines, and C127I (mouse cell line) ATCC No.
  • Examples of cells belonging to birds include the chicken cell line SL-29 (ATCC No. CRL-29).
  • Examples of cells belonging to fish include zebrafish cell line ZF4 (ATCC No. CRL-2050).
  • Examples of cells belonging to insects include the Spodoptera frugiperda cell line Sf9 (ATCC No. CRL-1711).
  • Examples of primary cultured cells used for vaccine production include primary monkey kidney cells, primary rabbit kidney cells, primary chicken embryo cells, or primary quail embryo cells.
  • myeloma cells or cells derived from myeloma cells include Sp2 / 0-Ag14, NS0, Y3, Ag1.2.3. , YO, YB2 / 0, and the like.
  • ovarian cells or cells derived from ovarian cells include CHO-K1, CHO / dhfr-, CHO / DG44, and the like.
  • kidney cells examples include 293, VERO, COS-7, BHK21, and MDCK.
  • blood cells examples include HL-60, Namalwa, Namalwa KJM-1, or NM-F9.
  • Examples of uterine cells include HeLa and the like.
  • Examples of connective tissue cells include HT-1080 and NIH3T3.
  • Examples of mammary gland cells include C1271I.
  • Examples of embryonic retinoblast cells include PER. C6 etc. are mentioned.
  • animal cells having the ability to produce a substance used in the present invention include, for example, animal cells that produce a substance, and fused cells that have produced a substance.
  • animal cells that produce a substance and fused cells that have produced a substance.
  • the desired substance is an antibody
  • a hybridoma that is a fusion cell of an antibody-producing cell such as a B cell and a myeloma cell can be used.
  • animal cells that have been subjected to mutation treatment to produce substances animal cells that have been subjected to mutation treatment to increase the expression level of substances, and the like are also encompassed by the animal cells of the present invention.
  • Examples of animal cells that have been subjected to mutation treatment to produce substances include cells in which mutations have been introduced into protein modification enzymes, etc., in order to enable production of desired substances.
  • examples include cells in which mutations are introduced into various sugar chain-modifying enzymes in order to change the structure of the sugar chain.
  • animal cells that produce the substance of the present invention include, for example, animal cells transformed with a recombinant vector containing a gene involved in the production of the substance.
  • the transformed cell can be obtained by introducing a recombinant vector containing a DNA involved in the production of a substance and a promoter into an animal cell having the ability to produce the substance.
  • DNA involved in substance production examples include DNA encoding substances such as peptides, DNA encoding enzymes or proteins involved in substance biosynthesis, and the like.
  • the substance produced by the method of the present invention may be any substance that can produce animal cells, but is preferably a substance that can produce animal cells belonging to mammals.
  • biocatalytic molecules such as peptides, ribozymes, formation / retention molecules such as keratin, collagen, elastin, resilin or fibroin, pressure ulcer vaccine, polio vaccine, measles vaccine, rubella vaccine, mumps vaccine, rabies vaccine
  • examples include varicella vaccine, bovine epidemic fever vaccine, Ibaraki disease vaccine or bovine infectious tracheitis vaccine, and viruses such as adenovirus and baculovirus.
  • the peptide is preferably a eukaryotic cell-derived peptide, more preferably an animal cell-derived peptide, for example, a mammalian cell-derived peptide.
  • the peptide of the present invention may be in any form as long as it contains the desired peptide and has activity, for example, an artificially modified peptide such as a fusion peptide fused with another peptide. It may be a peptide consisting of a partial fragment.
  • peptides include glycoproteins and physiologically active peptides.
  • glycoproteins include antibodies, erythropoietin (EPO) [J. Biol. Chem. , 252, 5558 (1977)], thrombopoietin (TPO) [Nature, 369 533 (1994)], tissue type plasminogen activator, prourokinase, thrombomodulin, antithrombin III, protein C, protein S, blood coagulation factor VII, blood clotting factor VIII, blood clotting factor IX, blood clotting factor X, blood clotting factor XI, blood clotting factor XII, prothrombin complex, fibrinogen, albumin, gonadotropin, thyroid stimulating hormone, epidermal growth factor (EGF), Hepatocyte growth factor (HGF), keratinocyte growth factor, activin, osteogenic factor, stem cell factor (SCF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) [J.
  • EPO erythropoietin
  • TPO thrombopoie
  • Macrophage colony-stimulating factor [J. Exp. Med. , 173, 269 (1991)] granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) [J. Biol. Chem. , 252, 1998 (1977)], interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , interleukin-2 (IL-2) [Science, 193, 1007 (1976)], interleukin 6, interleukin 10, interleukin 11, Interleukin-12 (IL-12) [J. Leuk. Biol.
  • soluble interleukin 4 receptor soluble interleukin 4 receptor
  • tumor necrosis factor ⁇ DNase, galactosidase, ⁇ -glucosidase, glucocerebrosidase, hemoglobin or transferrin, derivatives thereof or partial fragments of these glycoproteins, etc. It is done.
  • the antibody may be any antibody having antigen-binding properties, such as an antibody recognizing a tumor-related antigen or an antibody fragment thereof, an antibody recognizing an antigen associated with allergy or inflammation, or an antibody fragment thereof, and a circulatory organ.
  • antigen-binding properties such as an antibody recognizing a tumor-related antigen or an antibody fragment thereof, an antibody recognizing an antigen associated with allergy or inflammation, or an antibody fragment thereof, and a circulatory organ.
  • examples include antibodies that recognize antigens related to diseases or antibody fragments thereof, antibodies that recognize antigens related to autoimmune diseases or antibody fragments thereof, antibodies that recognize antigens related to viral or bacterial infections, or antibody fragments thereof.
  • tumor-associated antigens examples include CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD9, CD10, CD13, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD28, CD30, CD32, CD33, CD38, CD40, CD40 ligand (CD40L), CD44, CD45, CD46, CD47, CD52, CD54, CD55, CD56, CD59, CD63, CD64, CD66b, CD69, CD70, CD74, CD80, CD89, CD95, CD98, CD105, CD134, CD137, CD138, CD147, CD158, CD160, CD162, CD164, CD200, CD227, adrenomedullin, angiopoietin related pr tein 4 (ARP4), aurora, B7-H1, B7-DC, integlin, bone marlow stromal antigen 2 (BST2), CA125, CA19.9, carbonic anhydrase 9 (CA9), cadherince
  • the antibody may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the antibody class include immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE), and immunoglobulin M (IgM). Can be mentioned. Among these, IgG is preferable.
  • examples of the IgG subclass include IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
  • the antibody includes a fragment containing a part of the antibody, for example, Fab (Fragment of antigen binding), Fab ′, F (ab ′) 2, single chain antibody (single chain Fv, scFv) and disulfide.
  • Fab Frament of antigen binding
  • Fab ′ fragment of antigen binding
  • F (ab ′) 2 single chain antibody
  • single chain Fv single chain Fv
  • scFv single chain Fv
  • disulfide single chain Fv
  • examples thereof include a stabilized antibody (disulphide stabilized Fv, dsFv), a fusion protein containing the Fc region of the antibody, and the like.
  • an antibody in addition to an antibody secreted by a hybridoma cell prepared by spleen cells of an immunized animal after immunizing the animal with an antigen, an antibody prepared by gene recombination technology, that is, an antibody expression vector into which the antibody gene is inserted And the like, and the like obtained by introducing into a host cell.
  • an antibody prepared by gene recombination technology that is, an antibody expression vector into which the antibody gene is inserted And the like, and the like obtained by introducing into a host cell.
  • Specific examples include antibodies produced by hybridomas, human-type chimerized antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and the like.
  • a human chimeric antibody is composed of an antibody heavy chain variable region of a non-human animal (hereinafter, the heavy chain is also referred to as H chain, and the variable region is also referred to as HV or VH) and an antibody light chain variable region (hereinafter, light chain is referred to as light chain).
  • CH region light chain constant region of human antibody
  • CL light chain constant region of human antibody
  • Human chimeric antibodies are obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from hybridomas producing monoclonal antibodies and inserting them into expression vectors for host cells having genes encoding human antibody CH and human antibody CL, respectively.
  • An antibody expression vector can be constructed and introduced into a host cell for expression and production.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hIg), but is preferably of the hIgG class, and further subclasses of hIgG1, hIgG2, hIgG3 or hIgG4 belonging to the hIgG class. Any of these can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • humanized antibodies include, for example, amino acid sequences of VH and VL human homology determining regions (hereinafter referred to as CDRs) of non-human animal antibodies at appropriate positions of human antibody VH and VL.
  • CDR-grafted antibody prepared by transplanting into the above.
  • the CDR-grafted antibody constructs a cDNA encoding the V region in which the CDR sequences of the VH and VL of the non-human animal antibody are grafted onto the CDR sequences of any human antibody, and the human antibody CH and human antibody
  • a CDR-grafted antibody expression vector is constructed by inserting each into a host cell expression vector having a gene encoding CL, and the CDR-grafted antibody can be expressed and produced by introducing the expression vector into the host cell. .
  • the CH of the CDR-grafted antibody may be any as long as it belongs to hIg, but is preferably of the hIgG class, and any subclass such as hIgG1, hIgG2, hIgG3, or hIgG4 belonging to the hIgG class can be used.
  • the CL of the CDR-grafted antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • the human antibody present in the human body can be cultured, for example, by isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting and immortalizing and cloning EB virus, etc.
  • the antibody can be purified.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by inserting antibody genes prepared from human B cells into the phage genes.
  • phages expressing antibody fragments having antigen-binding activity can be recovered using the binding activity to the immobilized antigen as an index.
  • the antibody fragment can be converted into a human antibody consisting of two complete H chains and two complete L chains.
  • a human antibody-producing transgenic animal refers to an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into a mouse ES cell, and transplanting the ES cell into an early embryo of the mouse, followed by generation [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722 (2000)].
  • a human antibody-producing hybridoma can be obtained from a human antibody-producing transgenic animal by a conventional method for producing a hybridoma performed in a mammal other than a human.
  • cDNAs encoding VL and VH are obtained, inserted into expression vectors for animal cells having DNAs encoding CL and CH of human antibodies, respectively, and introduced into animal cells to be expressed. Antibodies can also be produced.
  • the WT CH used for the human antibody may be any WT CH as long as it belongs to the hIg class, but is preferably an hIgG class, and any of the subclasses such as hIgG1, hIgG2, hIgG3, or hIgG4 belonging to the hIgG class can be used.
  • the CL of the human antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • antibody produced by the method of the present invention include the following antibodies.
  • antibodies that recognize tumor-associated antigens include, for example, anti-GD2 antibody [Anticancer Res. , 13, 331 (1993)], anti-GD3 antibody [Cancer Immunol. Immunother. , 36, 260 (1993)], anti-GM2 antibody [Cancer Res. , 54, 1511 (1994)], anti-HER2 antibody [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285 (1992), US5725856], anti-CD52 antibody [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285 (1992)], anti-MAGE antibody [British J. et al. Cancer, 83, 493 (2000)], anti-HM1.24 antibody [Molecular Immunol.
  • anti-parathyroid hormone related protein (PTHrP) antibody [Cancer, 88, 2909 (2000)], anti-bFGF antibody, anti-FGF-8 antibody [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911 (1989)], anti-bFGFR antibody, anti-FGF-8R antibody [J. Biol. Chem. , 265, 16455 (1990)], anti-IGF antibodies [J. Neurosci. Res. , 40, 647 (1995)], anti-IGF-IR antibody [J. Neurosci. Res. , 40, 647 (1995)], anti-PSMA antibody [J. Urology, 160, 2396 (1998)], anti-VEGF antibody [Cancer Res.
  • PTHrP anti-parathyroid hormone related protein
  • anti-VEGFR antibody [Oncogene, 19, 2138 (2000), WO 96/30046], anti-CD20 antibody [Curr. Opin. Oncol. , 10, 548 (1998), US Pat. No. 5,736,137], anti-CD10 antibody, anti-EGFR antibody (WO 96/40201), anti-Apo-2R antibody (WO 98/51793), anti ASCT2 antibody (International Publication No. 2010/008075), anti-CEA antibody [Cancer Res. 55 (23 suppl): 5935 s-5945 s, (1995)], anti-CD38 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD22 antibody, anti-EpCAM antibody or anti-A33 antibody.
  • antibodies that recognize antigens associated with allergy or inflammation include, for example, anti-interleukin 10 antibody [Immunol. Rev. , 127, 5 (1992)], anti-interleukin 6 receptor antibody [Molecular Immunol. , 31, 371 (1994)], anti-interleukin-5 antibody [Immunol. Rev. , 127, 5 (1992)], anti-interleukin 5 receptor antibody, anti-interleukin 4 antibody [Cytokine, 3,562 (1991)], anti-interleukin 4 receptor antibody [J. Immunol. Methods, 217, 41 (1998)], anti-tumor necrosis factor antibody [Lymph. Cyto. Res.
  • antibodies that recognize antigens related to cardiovascular diseases include anti-GPIIb / IIIa antibodies [J. Immunol. , 152, 2968 (1994)], anti-platelet-derived growth factor antibody [Science, 253, 1129 (1991)], anti-platelet-derived growth factor receptor antibody [J. Biol. Chem. 272, 17400 (1997)], anticoagulant factor antibody [Circulation, 101, 1158 (2000)], anti-IgE antibody, anti- ⁇ V ⁇ 3 antibody or ⁇ 4 ⁇ 7 antibody.
  • antibodies that recognize antigens associated with virus or bacterial infection include anti-gp120 antibody [Structure, 8, 385 (2000)], anti-CD4 antibody [J. Rheumatology, 25, 2065 (1998)], anti-CCR5 antibody or anti-verotoxin antibody [J. Clin. Microbiol. , 37, 396 (1999)].
  • Examples of the peptide having physiological activity include peptides that maintain the activity of the glycoprotein among the partial fragments of the glycoprotein.
  • the glycoprotein is an enzyme
  • a peptide that regulates the activity of the enzyme or a peptide that retains the structure of the enzyme is also included.
  • peptides that regulate enzyme activity include peptides that function as glycoprotein agonists or antagonists.
  • the agonist any peptide can be used as long as it has an activity to enhance the activity of glycoprotein.
  • the agonist examples include somatostatin derivatives, somatrobin, atrial natriuretic peptide, glucagon, insulin, insulin-like growth factor or gonadotropin.
  • the antagonist may be any peptide as long as it has an activity of suppressing the activity of glycoprotein. Specific examples include pegvisomatone.
  • Any animal cell may be used as the animal cell used for producing a peptide having physiological activity, as long as the above peptide can be produced.
  • a vector having a gene encoding the peptide to be produced is introduced. Transformants are used.
  • a transformed cell into which a vector having a gene encoding a peptide has been introduced can be obtained by introducing a recombinant vector containing DNA encoding a peptide and a promoter into a host cell.
  • Host cells include animal cells having the ability to produce the above substances.
  • any vector can be used as the vector used for preparing the recombinant vector as long as it functions in animal cells used in the present invention.
  • Any promoter can be used as long as it functions in the animal cells used in the present invention.
  • a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter CMV immediate early (IE) gene promoter
  • IE immediate early
  • SV40 early promoter SV40 early promoter
  • retrovirus Promoter metallothionein promoter
  • heat shock promoter SR ⁇ promoter
  • enhancer of IE gene of human CMV may be used together with a promoter.
  • any method for introducing a recombinant vector into a host cell any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the cell.
  • electroporation [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], calcium phosphate Method [Virology, 52, 456 (1973)] or lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • transformed cell of the present invention include, for example, a transformed cell 7-9-51 (FERM BP-6691) that produces an anti-GD3 human chimeric antibody, and a transformed cell that produces an anti-CCR4 chimeric antibody.
  • KM2760 (FERM BP-7054), transformed cells producing anti-CCR4 humanized antibody KM8759 (FERM BP-8129) and KM8760 (FERM BP-8130), 709 LCA-500D (FERM BP-8239), anti-IL-5 Transformed cells KM7399 (FERM BP-5649) that produce receptor ⁇ chain chimeric antibody, transformed cells KM8399 (FERM BP-5648) and KM9399 (FERM) that produce anti-IL-5 receptor ⁇ chain human CDR-grafted antibody BP-5647), anti-GM2 human CDR Transformed cells producing transplanted antibodies KM 8966 (FERM BP-5105), KM 8967 (FERM BP-5106), KM 8969 (FERM 89
  • Examples of the method for culturing animal cells include a method suitable for animal cells to be used, such as batch (batch) culture, repeat batch culture, fed-batch (semi-batch, semi-batch, fed-batch) culture or perfusion culture. Any of them may be used, but fed-batch culture is preferably used.
  • the culture is performed under conditions of pH 6 to 8, 30 to 40 ° C., for example, for 3 to 20 days for fed-batch culture and 3 to 60 days for perfusion culture.
  • antibiotics such as a gentamicin, streptomycin, and a penicillin, to a culture medium as needed during culture
  • dissolved oxygen concentration control pH control, temperature control, stirring, etc.
  • the methods used for normal animal cell culture can be used.
  • the culture volume of the culture method used in the present invention even a small culture volume of usually 10 to 1000 mL using an Erlenmeyer flask or the like can be used for commercial production of usually 1 to 20000 L using a culture tank such as a jar. It can be a large amount of culture or any amount of culture.
  • the present invention also relates to a method for producing a substance by culturing animal cells having the ability to produce a substance, culturing the animal cell by adding an oligopeptide having one or more L-cysteines to the medium,
  • the present invention relates to a method for producing a substance, wherein the substance is produced and accumulated in the culture, and the substance is collected from the culture.
  • Cultivation in which an oligopeptide having one or more L-cysteine is added can be performed by the method described above.
  • examples of the method for producing the substance of the present invention include a direct expression method for producing a peptide in a host cell or a method for secreting and producing a peptide outside a host cell (Molecular Cloning 2nd edition). Is mentioned.
  • Peptide was prepared by the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem. , 264, 17619 (1989)], the method of Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop. , 4, 1288 (1990)], or Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-336963, International Publication No. 94/23021, and the like, can be actively secreted outside the host cell. . That is, the desired peptide can be actively secreted outside the host cell by expressing it in a form in which a signal peptide is bound to the N-terminus of the desired peptide using a genetic recombination technique.
  • the desired peptide produced by the above-described method can be isolated and purified using, for example, a normal peptide isolation and purification method.
  • the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer solution, an ultrasonic crusher, a French press, a Manton Gaurin homogenizer, dynomill, etc. Crush the cells to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, a crudely purified preparation or a purified preparation can be obtained by an ordinary peptide isolation and purification method.
  • Examples of the method for isolating and purifying the peptide include solvent extraction, salting-out using ammonium sulfate, desalting, precipitation using an organic solvent, diethylaminoethyl-Sepharose, or DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei).
  • Anion exchange chromatography using a resin cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), hydrophobic chromatography using a resin such as butyl sepharose or phenyl sepharose, Examples thereof include a gel filtration method using a molecular sieve, an affinity chromatography method using a resin containing protein A or protein G, an electrophoresis method such as a chromatofocusing method or isoelectric focusing. These methods may be used alone or in combination.
  • the peptide can be recovered in the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a crudely purified sample is obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above. Alternatively, a purified sample can be obtained.
  • Example 1 The following cell culture media were prepared and the differences in precipitate formation were compared.
  • the volume of the aqueous solution was adjusted to 1 L with water and then stirred for about 20 minutes to prepare a cell culture medium.
  • L-tyrosine disodium salt and L-cystine dihydrochloride L-alanyl-L-tyrosine (manufactured by Kyowa Hakko Bio) and bis-L at an equal concentration (5.0 mmol / L).
  • Cell culture media replaced with -alanyl-L-cysteine manufactured by Kyowa Hakko Bio
  • the prepared cell culture medium was stored under three conditions of 4 ° C. (refrigerator, manufactured by Hoshizaki Co., Ltd.), 20 ° C. (e-cooling bucket, manufactured by Taitec Co., Ltd.), or room temperature.
  • the cell culture medium containing L-tyrosine disodium salt and L-cystine dihydrochloride showed formation of precipitates under all conditions after 3 days. Among them, a large amount of precipitation was observed in the group at 4 ° C. where the storage temperature was low.
  • L-tyrosine disodium salt and L-cystine dihydrochloride were replaced with L-alanyl-L-tyrosine (manufactured by Kyowa Hakko Bio) or bis-L-alanyl-L-cystein (manufactured by Kyowa Hakko Bio), respectively. No precipitate was formed in the cell culture medium.
  • Example 2 The following cell culture feed media were prepared, and fed-batch culture with CHO cells was tried and compared.
  • the feed medium was 31.6 g / L AGT Efficient Feed A (Invitrogen, catalog number: AG090231P7), 0.50 ml / L polyamine solution (Invitrogen, catalog number: AG090232P8), 27.2 g / L.
  • AGT Efficient Feed B (manufactured by Invitrogen, catalog number: AG090230P7), 5.0 g / L L-(+)-glutamine (manufactured by Wako Pure Chemicals, catalog number: 078-00525), 30.0 g / L hydrates (Manufactured by DMV, catalog number: P42474), 70.0 g / L glucose (manufactured by Wako Pure Chemicals, catalog number: 041-00595), 5.0 mmol / L L-alanyl L-tyrosine (manufactured by Kyowa Hakko Bio) and 5.0 mmol / L, 10 mmol / L or 16 mmol / L of bis-L-alanyl-L-cysteine (manufactured by Kyowa Hakko Bio), as in Example 1. Respectively.
  • EX-CELL325 manufactured by SAFC, catalog number: 14340C-
  • 4.0 mmol / L glutamine manufactured by Invitrogen, catalog number: 25030
  • the above feed medium was added to carry out fed-batch culture. The results are shown in Table 1.
  • an oligopeptide excluding glutathione having one or more L-cysteines was added to the medium, and the animal cells were cultured. It was found that the number of living cells can be increased and the survival rate can be improved.
  • Example 3 In order to confirm antibody production, the antibody titer on the 13th day of culture in the fed-batch culture of CHO cells having the antibody-producing ability of Example 2 was measured. The concentration of bis-L-alanyl-L-cysteine in the feed medium was 0.75 g / L at 5.0 mmol / L, 0.79 g / L at 10 mmol / L, and 0.78 g / L at 16 mmol / L. It was.
  • oligopeptides other than glutathione having one or more L-cysteines were added to the medium to culture the animal cells. It turns out that the substance can be produced.
  • the animal cell in the culturing of an animal cell having the ability to produce a substance, the animal cell is cultured by adding an oligopeptide excluding glutathione having one or more L-cysteines to the medium.
  • a method for culturing cells a method for producing substances by culturing animal cells having the ability to produce substances, wherein the animal cells are prepared by adding oligopeptides other than glutathione having one or more L-cysteines to the medium.
  • a method for producing a substance characterized by producing and accumulating the substance in the culture, and collecting the substance from the culture, and an oligopeptide excluding glutathione having one or more L-cysteines A containing medium can be provided.

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Abstract

　本発明は、動物細胞の培養に適した培地、それを用いた培養方法等を提供する。本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養であって、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法、物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法において、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法、及び１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地に関する。

Description

物質の製造方法
　本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養方法であって、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法、物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法であって、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法、及び１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地に関する。
　糖蛋白質、中でも抗体は、特に近年、種々の医薬品として認可され、更には多くの候補抗体が開発中である（非特許文献１）。今後、動物細胞を用いた抗体等の物質の生産が盛んになることが予測されているが、一方、動物細胞による物質の生産性はまだ充分に高くないことが問題点として挙げられている。
　抗体をはじめとする糖蛋白質を生産する宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣組織由来細胞（ＣＨＯ細胞）またはハイブリドーマ等の動物細胞が選択される。なぜならば、該細胞から生産された糖蛋白質に結合している糖鎖が相対的にヒトに近いためである（特許文献１、２、非特許文献２）。
　物質の生産性の向上を目的に、昨今培地の改良が進むが（特許文献５、６）、シスチンの低い溶解性［０．１ｇ／Ｌ（Ｈ２Ｏ、２０℃）］と（非特許文献２）、システイン塩酸塩の水溶液中での低い安定性から（非特許文献３）、システイン、シスチンまたはその塩類は、培地中での沈殿の析出等の課題となり工業的な使用においては制限がある。一方で、ジペプチド等の短鎖ペプチドの細胞培養への利用に関しては、培地の加熱滅菌を目的として、Ｌ－アミノ酸－Ｌ－グルタミンを添加した基礎培地が知られている（特許文献３、４）。
　また、システイン含有のオリゴペプチド：Ｎ，Ｎ’－ｂｉｓ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｉｎｅ、Ｎ，Ｎ’－ｂｉｓ－Ｌ－ｇｌｙｃｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｉｎｅ、Ｎ，Ｎ’－ｂｉｓ－Ｌ－ｌｅｕｃｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｉｎｅ，Ｎ，Ｎ’－ｂｉｓ　－Ｌ－ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｉｎｅの血中投与例、経口および腸管外投与例（特許文献７、非特許文献３、４）が知られる。システインを含むトリペプチドの一つであるグルタチオンは、グルタミン酸、システインまたはグリシンからなり、培地への添加が知られている（特許文献８）。
　しかし、Ｌ－システインを有するその他のオリゴペプチドの培地としての応用は知られていない。
国際公開第１９９６／３９４８８号 米国特許第４７２４２０６号明細書 日本国特開昭６１－２７１９８５号公報 欧州特許第０２２０３７９号明細書 国際公開第２００８／１３６３９８号 国際公開第２００８／１４１２０７号 国際公開第１９８８／０３１５０号 日本国特開２００２－１４２７５９号公報
Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．，３，３８３（２００４） Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２，１３９３－８（２００４） Ｊ．Ｎｕｔｒｉ．，１３１，２５６２ｓ－２５６８ｓ，（２００１） Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ　ｆｕｅｒ　Ｅｒｎａｅｈｒｕｎｇｓｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ，２８，１９１－２００（１９８９）
　動物細胞を培養し、該細胞から物質を生産させる方法において、生産される物質の生産性を向上するための方法、生産される物質の生産性を向上するため工業利用可能な培地が求められている。
　即ち、本発明は、以下の通りである。
１．物質を生産する能力を有する動物細胞の培養方法であって、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法。
２．１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドがジペプチドまたはジペプチドの二量体である、前項１に記載の方法。
３．１以上のＬ－システインを有するジペプチドがグリシル－Ｌ－システイン、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン若しくはγ－グルタミルシステインまたはその塩類である、前項２に記載の方法。
４．１以上のＬ－システインを有するジペプチドの二量体がビス－（グリシル－Ｌ－システイン）またはビス－（Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン）である、前項２に記載の方法。
５．さらにＬ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドを培地中に添加して前記動物細胞を培養することを特徴とする、前項１～前項４のいずれか１に記載の方法。
６．１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドがジペプチドである、前項５に記載の方法。
７．１以上のＬ－チロシンを有するジペプチドがＬ－アラニル－Ｌ－チロシンまたはその塩類である、前項６に記載の方法。
８．培地中に添加される１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである、前項１～前項７のいずれか１に記載の方法。
９．培地中に添加されるＬ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである、前項５～前項８のいずれか１に記載の方法。
１０．動物細胞が哺乳類に属する動物由来の細胞である、前項１～前項９のいずれか１に記載の方法。
１１．哺乳類に属する動物が霊長類またはげっ歯類である前項１０に記載の方法。
１２．動物細胞が骨髄腫細胞若しくは卵巣細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞である、前項１０または前項１１に記載の方法。
１３．物質がペプチドである、前項１～前項１２のいずれか１に記載の方法。
１４．動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞である、前項１０～前項１２のいずれか１に記載の方法。
１５．ペプチドが糖蛋白質である、前項１３または前項１４に記載の方法。
１６．糖蛋白質が抗体である、前項１５に記載の方法。
１７．オリゴペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、前項１～前項１６のいずれか１に記載の方法。
１８．オリゴペプチドを添加する培地がフィード培地である、前項１～前項１７のいずれか１に記載の方法。
１９．培養方法が培養槽を用いた培養方法である、前項１～前項１８のいずれか１に記載の方法。
２０．物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法であって、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法。
２１．１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドがジペプチドまたはジペプチドの二量体である、前項２０に記載の方法。
２２．１以上のＬ－システインを有するジペプチドが、グリシル－Ｌ－システイン、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン若しくはγ－グルタミルシステインまたはその塩類である、前項２１に記載の方法。
２３．１以上のＬ－システインを有するジペプチドの二量体がビス－（グリシル－Ｌ－システイン）またはビス－（Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン）である、前項２１に記載の方法。
２４．さらにＬ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドを培地中に添加して前記動物細胞を培養することを特徴とする、前項２０～前項２３のいずれか１に記載の方法。
２５．１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドがジペプチドである、前項２４に記載の方法。
２６．１以上のＬ－チロシンを有するジペプチドがＬ－アラニル－Ｌ－チロシンまたはその塩類である、前項２５に記載の方法。
２７．培地中に添加される１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである、前項２０～前項２６のいずれか１に記載の方法。
２８．培地中に添加されるＬ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである、前項２４～前項２７のいずれか１に記載の方法。
２９．動物細胞が哺乳類に属する動物由来の細胞である、前項２０～前項２８のいずれか１に記載の方法。
３０．哺乳類に属する動物が霊長類またはげっ歯類である前項２９に記載の方法。
３１．動物細胞が骨髄腫細胞若しくは卵巣細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞である、前項２９または前項３０に記載の方法。
３２．物質がペプチドである、前項２０～前項３１のいずれか１に記載の方法。
３３．動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞である、前項２９～前項３１のいずれか１に記載の方法。
３４．ペプチドが糖蛋白質である、前項３２または前項３３に記載の方法。
３５．糖蛋白質が抗体である、前項３４に記載の方法。
３６．オリゴペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、前項２０～前項３５のいずれか１に記載の方法。
３７．オリゴペプチドを添加する培地がフィード培地である、前項２０～前項３６のいずれか１に記載の方法。
３８．培養方法が培養槽を用いた培養方法である、前項２０～前項３７のいずれか１に記載の方法。
３９．１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地。
４０．１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドがジペプチドまたはジペプチドの二量体である、前項３９に記載の培地。
４１．１以上のＬ－システインを有するジペプチドが、グリシル－Ｌ－システイン、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン若しくはγ－グルタミルシステインまたはその塩類である、前項４０に記載の培地。
４２．１以上のＬ－システインを有するジペプチドの二量体がビス－（グリシル－Ｌ－システイン）またはビス－（Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン）である、前項４１に記載の培地。
４３．さらにＬ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドを含有する、前項３９～前項４２のいずれか１に記載の培地。
４４．１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドがジペプチドである、前項４３に記載の方法。
４５．１以上のＬ－チロシンを有するジペプチドがＬ－アラニル－Ｌ－チロシンまたはその塩類である、前項４４に記載の培地。
４６．１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである、前項３９～前項４５のいずれか１に記載の培地。
４７．Ｌ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである、前項３９～前項４５のいずれか１に記載の培地。
　本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養であって、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法、物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法であって、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法、及び１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地を提供する。
　本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養であって、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法に関する。
　本発明に用いるオリゴペプチドとしては特に限定されないが、好ましくは２～２０のアミノ酸からなるペプチド、更に好ましくは２～１０のアミノ酸からなるペプチド、例えば、ペンタペプチド、テトラペプチド、トリペプチド、ジペプチド、またはこれらのペプチドの二量体が挙げられる。また、本発明に用いるオリゴペプチドは、例えば、塩酸塩、ナトリウム塩等の塩、及び／または、例えば水和物等の溶媒和物を形成していてもよい。
　１以上のＬ－システインを有するジペプチドの具体例としては、グリシル－Ｌ－システイン（Ｇｌｙ－Ｃｙｓ）、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン（Ａｌａ－Ｃｙｓ）、Ｌ－セレニル－Ｌ－システイン（Ｓｅｒ－Ｃｙｓ）、Ｌ－シスチニル－Ｌ－システイン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）、Ｌ－リジニル－Ｌ－システイン（Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）、Ｌ－メチオニル－Ｌ－システイン（Ｍｅｔ－Ｃｙｓ）、Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－システイン（Ｐｈｅ－Ｃｙｓ）、Ｌ－チロシニル－Ｌ－システイン（Ｔｙｒ－Ｃｙｓ）、Ｌ－トリプトファニル－Ｌ－システイン（Ｔｒｐ－Ｃｙｓ）、Ｌ－グルタミル－Ｌ－システイン（Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）、Ｌ－アスパラギニル－Ｌ－システイン（Ａｓｐ－Ｃｙｓ）、Ｌ－グルタミニル－Ｌ－システイン（Ｇｌｎ－Ｃｙｓ）、Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－システイン（Ｈｉｓ－Ｃｙｓ）、Ｌ－アルギニル－Ｌ－システイン（Ａｒｇ－Ｃｙｓ）、Ｌ－シスチニル－グリシン（Ｃｙｓ－Ｇｌｙ）、Ｌ－シスチニル－Ｌ－アラニン（Ｃｙｓ－Ａｌａ）、Ｌ－シスチニル－Ｌ－セリン（Ｃｙｓ－Ｓｅｒ）、Ｌ－シスチニル－Ｌ－チロシン（Ｃｙｓ－Ｔｙｒ）、Ｌ－シスチニル－Ｌ－ロイシン（Ｃｙｓ－Ｌｅｕ）、Ｌ－シスチニル－Ｌ－イソロイシン（Ｃｙｓ－Ｉｌｅ）、Ｌ－シスチニル－Ｌ－メチオニン（Ｃｙｓ－Ｍｅｔ）、Ｌ－シスチニル－Ｌ－フェニルアラニン（Ｃｙｓ－Ｐｈｅ）、Ｌ－シスチニル－Ｌ－トリプトファン（Ｃｙｓ－Ｔｒｐ）、Ｌ－シスチニル－Ｌ－ヒスチジン（Ｃｙｓ－Ｈｉｓ）、Ｌ－シスチニル－Ｌ－アルギニン（Ｃｙｓ－Ａｒｇ）等が挙げられる（国際公開第２００４／０５８９６０号）。また、１以上のＬ－システインを有するジペプチドの二量体の具体例としては、ビス－（グリシル－Ｌ－システイン）、またはビス－（Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン）等が挙げられる。
　本発明は、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地に関する。
　さらに、本発明の培地において、さらにＬ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドを添加することが出来る。本発明の培地に添加するＬ－チロシンは、例えば、塩酸塩、ナトリウム塩等の塩、及び／または、例えば、水和物等の溶媒和物を形成していてもよい。
　オリゴペプチドを含有する培地に特に制限はないが、拡大培養培地、基本（初発）培地、灌流培地またはフィード（流加）培地から選択される少なくとも１つの培地に添加することが好ましい。
　本発明の１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドは公知の合成法、酵素法または発酵法により製造することが出来る。例えば、Ｌ－グリシル－Ｌ－システイン、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン、ビス－（Ｌ－グリシル－Ｌ－システイン）、またはビス－（Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン）を製造する方法としては、例えば、合成法、または発酵法（国際公開第２００４／０５８９６０号、国際公開第２００６／００１３７９号）等が挙げられる。
　また、本発明の動物細胞の培養方法において、さらにＬ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドを添加することが出来る。
　１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドのうち、１以上のＬ－チロシンを有するジペプチドの具体例としては、グリシル－Ｌ－チロシン（Ｇｌｙ－Ｔｙｒ）、Ｌ－アラニル－Ｌ－チロシン（Ａｌａ－Ｔｙｒ）、Ｌ－セレニル－Ｌ－チロシン（Ｓｅｒ－Ｔｙｒ）、Ｌ－バリニル－Ｌ－チロシン（Ｖａｌ－Ｔｙｒ）、Ｌ－メチオニル－Ｌ－チロシン（Ｍｅｔ－Ｔｙｒ）、Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－チロシン（Ｐｈｅ－Ｔｙｒ）、Ｌ－アルギニル－Ｌ－チロシン（Ａｒｇ－Ｔｙｒ）、Ｌ－チロシニル－グリシン（Ｔｙｒ－Ｇｌｙ）、Ｌ－チロシニル－Ｌ－アラニン（Ｔｙｒ－Ａｌａ）、Ｌ－チロシニル－Ｌ－セリン（Ｔｙｒ－Ｓｅｒ）、Ｌ－チロシニル－Ｌ－メチオニン（Ｔｙｒ－Ｍｅｔ）またはＬ－チロシニル－Ｌ－アルギニン（Ｔｙｒ－Ａｒｇ）等が挙げられる。
　１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドも公知の合成法、酵素法または発酵法により製造することが出来る。例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－チロシンを製造する方法としては、合成法、または発酵法（国際公開第２００４／０５８９６０号、国際公開第２００６／００１３７９号）等が挙げられる。
　オリゴペプチドを培地に添加する方法は特に制限はないが、拡大培養培地、基本（初発）培地、灌流培地またはフィード培地から選択される少なくとも１つの培地に添加することが好ましい。
　本発明において、フィード培地とは、基本培地とは別に添加する培地を意味する。また、１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドと、Ｌ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドとを、１つの培地に同時に添加をしてもよいし、２つ以上の培地の各々に別に添加をしてもよい。
　フィード培地として添加する場合は、オリゴペプチドを単独でフィード培地として培地へ添加してもよいし、またオリゴペプチドと他の培地成分とを予め混合されたフィード培地として培地へ添加してもよい。また、フィード培地を分割して不連続に培地に添加してもよいし、フィード培地を連続して培地に添加してもよい。
　フィード培地の保存方法としては、培地が無菌状態を保持する方法であれば特に制限されないが、ステンレスタンクまたはディスポーサブルバッグ等を用いる方法等が挙げられる。
　いずれの培地中へ添加される１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドの濃度は、培養に用いる動物細胞の種類、生産する物質の種類、オリゴペプチドの種類、オリゴペプチドの添加時期等により適宜選択すればよいが、好ましくは０．００１～１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．００５～５００ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
　また、培地中へ添加されるＬ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドの濃度も、培養に用いる動物細胞の種類、生産する物質の種類、オリゴペプチドの種類、オリゴペプチドの添加時期等により適宜選択すればよいが、好ましくは０．００１～１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．００５～５００ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
　オリゴペプチドを含有するフィード培地を基礎培地へ添加する時期は、特に制限はなく培養開始前後で添加してよいが、好ましくは対数増殖期に培地へ添加する。対数増殖期は培養する細胞株、培養の制御方法によって異なるが、培養される細胞数が上昇した時点から培養される細胞数が一定になる時点までの期間を指す。
　オリゴペプチドを含有するフィード培地を基礎培地へ添加する混合比は任意であるが、工業設備の制約から１０％から５０％であることが好ましく、２０％から３０％前後がより好ましい。
　本発明に用いられる培地としては、動物細胞の培養に用いることが出来ればいかなるものでもよく、通常の動物細胞の培養に用いられる培地が用いられる。予めシステインを培地成分として含有していてもよいし、また不含でもよい。
　本発明に用いられる培地としては、例えば、基礎培地、血清含有培地、無血清培地、動物由来成分を含まない培地、無蛋白質培地または完全合成培地等が挙げられるが、無血清培地、無蛋白質培地または完全合成培地が好ましい。
　基礎培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｆ１２培地（ＬＴＩ社製）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）［Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）］、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）またはこれらの改変培地や混合培地等が挙げられる。
　中でも、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ及びＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３２５　ＰＦ培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）またはＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ　ＣＨＯ培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）等が好ましい。
　無血清培地としては、例えば、基礎培地に、血清の代替物である生理活性物質、栄養因子、動物細胞が資化しうる炭素源または窒素源等を添加させた培地が挙げられる。これらの添加物は、培養前にあらかじめ培地に含有させることが好ましい。
　栄養因子としては、例えば、グルコース、アミノ酸またはビタミン等が挙げられる。
　アミノ酸としては、例えば、Ｌ－アラニン（Ａｌａ）、Ｌ－アルギニン（Ａｒｇ）、Ｌ－アスパラギン（Ａｓｎ）、Ｌ－アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｌ－システイン（Ｃｙｓ）、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｌ－グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、Ｌ－ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｌ－イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｌ－ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｌ－リジン（Ｌｙｓ）、Ｌ－メチオニン（Ｍｅｔ）、Ｌ－フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｌ－プロリン（Ｐｒｏ）、Ｌ－セリン（Ｓｅｒ）、Ｌ－スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｌ－トリプトファン（Ｔｒｐ）またはＬ－バリン（Ｖａｌ）等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。
　ビタミンとしては、例えば、ｄ－ビオチン、Ｄ－パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ－イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ－α－トコフェロール等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。
　生理活性物質としては、例えば、インシュリン、ＩＧＦ－Ｉ、トランスフェリン、血清アルブミンまたは増殖因子を含む血清分画物等が挙げられる。
　動物由来成分を含まない培地において、動物由来成分の代わりに添加される物質としては、遺伝子組換え法で製造された生理活性物質や、加水分解物または動物由来原料を含まない脂質等が挙げられる。
　加水分解物としては、例えば、大豆、小麦、米、えんどう豆、綿実または酵母抽出物等の加水分解物等が挙げられる。
　脂質としては、例えば、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸等が挙げられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。
　無蛋白培地としては、例えば、ＡＤＰＦ培地（Ａｎｉｍａｌ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ、ハイクローン社製）またはＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３２５　ＰＦ培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）等が挙げられる。
　完全合成培地としては、例えば、ＣＤ　ＣＨＯ　Ｆｕｓｉｏｎ培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）、ＣＤ－Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地（インビトロジェン社製）、ＣＤ－ＣＨＯ培地（インビトロジェン社製）、ＩＳ－ＣＤ－ＣＨＯ培地（アーバイン・サイエンティフィック社製）またはＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ　ＣＨＯ培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）等が挙げられる。
　長期間または高密度で培養する場合は、アミノ酸及びビタミンを高濃度に含有した培地、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地及びＦ１２培地を１：１：１の比率で混合した培地、ＤＭＥＭ培地及びＦ１２培地を１：１の比率で混合した培地またはハイブリド－マＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）等が用いられる。
　本発明に用いられる物質を生産する能力を有する動物細胞としては、例えば、哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類または昆虫類等由来の細胞等が挙げられる。中でも、哺乳類に属する動物細胞が好ましく、ヒトまたはサル等の霊長類に由来する動物細胞またはマウス、ラットまたはハムスター等のげっ歯類に由来する動物細胞がより好ましい。
　哺乳類に属する細胞としては、骨髄腫細胞、卵巣細胞、腎臓細胞、血球細胞、子宮細胞結合組織細胞、乳腺細胞、胚性網膜芽細胞またはこれらの細胞に由来する細胞等が好ましく、骨髄腫細胞、骨髄腫細胞に由来する細胞、卵巣細胞、または卵巣細胞に由来する細胞から選ばれる細胞がより好ましい。
　哺乳類に属する細胞としては、例えば、ヒト細胞株であるＨＬ－６０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－２４０）、ＨＴ－１０８０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－１２１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－２）、２９３（ＥＣＡＣＣ　Ｎｏ．８５１２０６０２）、Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１４３２）、Ｎａｍａｌｗａ　ＫＪＭ－１［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）］、ＮＭ－Ｆ９（ＤＳＭ　ＡＣＣ２６０５、国際公開第２００５／０１７１３０号）及びＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ　Ｎｏ．９６０２２９４０、米国特許第６８５５５４４号明細書）、サル細胞株であるＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－１６５１）及びＣＯＳ－７（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５１）、マウス細胞株であるＣ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６１６）、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１５８１）、ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）、ＮＳ０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１８２７）、ラット細胞株であるＹ３　Ａｇ１．２．３．（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６３１）、ＹＯ（ＥＣＡＣＣ　Ｎｏ．８５１１０５０１）及びＹＢ２／０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６６２）、ハムスター細胞株であるＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－６１）、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ－（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－９０９６）、ＣＨＯ／ＤＧ４４［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］及びＢＨＫ２１（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１０）またはイヌ細胞であるＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－３４）等が挙げられる。
　鳥類に属する細胞としては、例えば、ニワトリ細胞株ＳＬ－２９（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－２９）等が挙げられる。魚類に属する細胞としては、例えば、ゼブラフィッシュ細胞株ＺＦ４（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－２０５０）等が挙げられる。
　昆虫類に属する細胞としては、例えば、蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ９（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１７１１）等が挙げられる。また、ワクチン製造に使用される初代培養細胞としては、例えば、初代サル腎細胞、初代ウサギ腎細胞、初代ニワトリ胎児細胞または初代ウズラ胎児細胞等が挙げられる。
　骨髄腫細胞または骨髄腫細胞に由来する細胞としては、例えば、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４、ＮＳ０、Ｙ３　Ａｇ１．２．３．、ＹＯまたはＹＢ２／０等が挙げられる。卵巣細胞または卵巣細胞に由来する細胞としては、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ－またはＣＨＯ／ＤＧ４４等が挙げられる。
　また、腎臓細胞としては、例えば、２９３、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ２１またはＭＤＣＫ等が挙げられる。血球細胞としては、例えば、ＨＬ－６０、Ｎａｍａｌｗａ、Ｎａｍａｌｗａ　ＫＪＭ－１またはＮＭ－Ｆ９等が挙げられる。
　子宮細胞としては、例えば、ＨｅＬａ等が挙げられる。結合組織細胞としては、例えば、ＨＴ－１０８０またはＮＩＨ３Ｔ３等が挙げられる。乳腺細胞としては、例えば、Ｃ１２７１Ｉ等が挙げられる。胚性網膜芽細胞としては、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６等が挙げられる。
　本発明に用いられる物質を生産する能力を有する動物細胞としては、例えば、物質を産生する動物細胞の他、物質を産生するようになった融合細胞等が挙げられる。例えば、所望の物質が抗体である場合には、Ｂ細胞等の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合細胞であるハイブリドーマ等が挙げられる。
　また、変異処理を施して物質を産生するようになった動物細胞、物質の発現量を上昇させるような変異処理を施した動物細胞等も本発明の動物細胞に包含される。
　変異処理を施して物質を産生するようになった動物細胞としては、所望の物質を生産出来るようにする為に、蛋白質の修飾酵素等に変異が導入された細胞等が挙げられ、例えば、所望の物質が糖蛋白質である場合には、糖鎖の構造を変化させるために、種々の糖鎖修飾酵素に変異が導入された細胞等が挙げられる。
　さらに、本発明の物質を産生する動物細胞としては、例えば、物質の生産に関与する遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換された動物細胞も包含される。該形質転換細胞は、物質の生産に関与するＤＮＡとプロモーターを含む組換え体ベクターを、上記の物質を生産する能力を有する動物細胞に導入することによって得ることが出来る。
　物質の生産に関与するＤＮＡとしては、例えば、ペプチド等の物質をコードするＤＮＡ、物質の生合成に関わる酵素または蛋白質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。
　本発明の方法により製造される物質としては、動物細胞が生産出来る物質であればいかなるものでもよいが、哺乳類に属する動物細胞が生産できる物質が好ましい。例えば、ペプチド、リボザイム等の生体触媒分子、ケラチン、コラ－ゲン、エラスチン、レシリンまたはフィブロイン等の構造の形成／保持分子、痘瘡ワクチン、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、おたふく風邪ワクチン、狂犬病ワクチン、水痘ワクチン、ウシ流行熱ワクチン、イバラキ病ワクチンまたはウシ伝染性気管炎ワクチン等のワクチン、及びアデノウィルスまたはバキュロウィルス等のウイルス等が挙げられる。
　ペプチドとしては、真核細胞由来のペプチドが好ましく、動物細胞由来のペプチドがより好ましく、例えば、哺乳動物細胞由来のペプチドが挙げられる。また、本発明のペプチドは、所望のペプチドが含まれており、活性を有していればいかなる形状でもよく、例えば、他のペプチドと融合させた融合ペプチド等の人工的に改変されたペプチドであってもよいし、部分断片からなるペプチドであってもよい。
　ペプチドの具体例としては、糖蛋白質または生理活性を有するペプチド等が挙げられる。
　糖蛋白質としては、具体的には、例えば、抗体、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，５５５８（１９７７）］、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）［Ｎａｔｕｒｅ，３６９　５３３（１９９４）］、組織型プラスミノーゲンアクチベータ、プロウロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩ、血液凝固因子ＸＩＩ、プロトロンビン複合体、フィブリノゲン、アルブミン、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、アクチビン、骨形成因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニ－刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，９０１７（１９８３）］マクロファ－ジコロニ－刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，２６９（１９９１）］、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，１９９８（１９７７）］、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン－２（ＩＬ－２）［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９３，１００７（１９７６）］、インターロイキン６、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）［Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．，５５，２８０（１９９４）］、可溶性インターロイキン４受容体、腫瘍壊死因子α、ＤＮａｓｅｌ、ガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘモグロビン若しくはトランスフェリン、これらの誘導体またはこれらの糖蛋白質の部分断片等が挙げられる。
　抗体としては、抗原結合性を有する抗体であればいかなるものでもよく、例えば、腫瘍関連抗原を認識する抗体またはその抗体断片、アレルギー若しくは炎症に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、ウイルス若しくは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片等が挙げられる。
　腫瘍関連抗原としては、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０　ｌｉｇａｎｄ（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５８、ＣＤ１６０、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ２００、ＣＤ２２７、ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４（ＡＲＰ４）、ａｕｒｏｒａ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－ＤＣ、ｉｎｔｅｇｌｉｎ、ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　２（ＢＳＴ２）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ　９（ＣＡ９）、ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｃｃ－ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＣＲ）４、ＣＣＲ７、ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１（ＣＦＲ－１）、ｃ－Ｍｅｔ、ｃ－Ｍｙｃ、ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＣＴＡ、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）、ＣＴＬＡ－４、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ－１８、ＤＦ３、Ｅ－ｃａｔｈｅｒｉｎ、ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｅｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ３）、ＥＧＦＲ４（ＨＥＲ４）、ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＰＣＲ）、ｅｐｈｒｉｎ、ｅｐｈｒｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｅｐｈ）、ＥｐｈＡ２、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｓｅ－２（ＥＴ２）、ＦＡＭ３Ｄ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＰ）、Ｆｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｈｏｍｏｌｏｇ　１（ＦｃＲＨ１）、ｆｅｒｒｉｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ８（ＦＧＦ８）、ＦＧＦ８　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｂａｓｉｃ　ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦＧＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ｆｏｌａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　１０（ＦＺＤ１０）、ｆｒｉｚｚｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　４（ＦＺＤ－４）、Ｇ２５０、Ｇ－ＣＳＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２またはＧＭ３等）、ｇｌｏｂｏ　Ｈ、ｇｐ７５、ｇｐ８８、ＧＰＲ－９－６、ｈｅｐａｒａｎａｓｅ　Ｉ、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、ＨＧＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＨＬＡ　ａｎｔｉｇｅｎ（例えば、ＨＬＡ－ＤＲ等）、ＨＭ１．２４、ｈｕｍａｎ　ｍｉｌｋ　ｆａｔｇｌｏｂｕｌｅ（ＨＭＦＧ）、ｈＲＳ７、ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　９０（ｈｓｐ９０）、ｉｄｉｏｔｙｐｅ　ｅｐｉｔｏｐｅ、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ＩＧＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＧＦＲ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（例えば、ＩＬ－６またはＩＬ－１５等）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＩＬ－６ＲまたはＩＬ－１５Ｒ等）、ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－４（ＩＲＴＡ－４）、ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ　１、ＫＤＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＳ１／４、ｌａｍｐ－１、ｌａｍｐ－２、ｌａｍｉｎｉｎ－５、Ｌｅｗｉｓ　ｙ、ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅｗｉｓ　ｘ、ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ－ｂｅｔａ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＴＢＲ）、ＬＵＮＸ、ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ（ＭＣＳＰ）、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＩＣＡ、Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＭＩＳＩＩＲ）、ｍｕｃｉｎ、ｎｅｕｒａｌ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＮＣＡＭ）、Ｎｅｃｌ－５、Ｎｏｔｃｈ１、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｆａｃｔｏｒ－４（ＰＦ－４）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）、Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＴＨｒＰ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ－ｋａｐｐａＢ　ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍｏｔｉｌｉｔｙ（ＲＨＡＭＭ）、ＲＯＢＯ１、ＳＡＲＴ３、ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ　４Ｂ（ＳＥＭＡ４Ｂ）、ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＬＰＩ）、ＳＭ５－１、ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ－７２（ＴＡＧ－７２）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴｆＲ）、ＴＧＦ－ｂｅｔａ、Ｔｈｙ－１、Ｔｉｅ－１、Ｔｉｅ２　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｔ　ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｄ　ｍｕｃｉｎ　ｄｏｍａｉｎ　１（ＴＩＭ－１）、ｈｕｍａｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ（ｈＴＦ）、Ｔｎ　ａｎｔｉｇｅｎ、ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）、Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＴＦ　ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＮＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＲＡＩＬ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＤＲ４またはＤＲ５等）、ｓｙｓｔｅｍ　ＡＳＣ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　２（ＡＳＣＴ２）、ｔｒｋＣ、ＴＲＯＰ－２、ＴＷＥＡＫ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｆｎ１４、ｔｙｐｅ　ＩＶ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３等）、ｖｉｍｅｎｔｉｎまたはＶＬＡ－４等が挙げられる。
　抗体としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれでもよく、抗体のクラスとしては、例えば、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）及びイムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）が挙げられる。これらの中でも、ＩｇＧが好ましい。更にＩｇＧのサブクラスとしては、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４が挙げられる。
　また、抗体としては、抗体の一部分を含む断片等が包含され、例えば、Ｆａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ、ｓｃＦｖ）及びジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ　Ｆｖ、ｄｓＦｖ）、または抗体のＦｃ領域を含む融合蛋白質等が挙げられる。
　更に、抗体としては、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体の他、遺伝子組換え技術により作製された抗体、即ち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体等が挙げられる。具体的には、例えば、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト型キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体等を挙げることが出来る。
　ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）及び抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）と、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨとも称す）及びヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスターまたはラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることが出来る。
　ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマよりＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することが出来る。
　ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと称す）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましく、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることが出来る。
　ヒト化抗体としては、例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト型相同性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ、以下、ＣＤＲと称す）のアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植して作製されたＣＤＲ移植抗体等が挙げられる。
　ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することが出来る。
　ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましく、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また、ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることが出来る。
　ヒト体内に存在するヒト抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、当該培養物より該抗体を精製することが出来る。
　ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。
　前記ライブラリーより、固相化した抗原に対する結合活性を指標にして、抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することが出来る。該抗体断片より、２本の完全なＨ鎖及び二本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体へ変換することが出来る。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することが出来る［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，７２２（２０００）］。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物から、ヒト抗体産生ハイブリドーマは、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法により取得出来る。
　ヒト抗体産生ハイブリドーマより、ＶＬ及びＶＨをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＬ及びＣＨをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入し、動物細胞へ導入することにより発現させ、ヒト抗体は製造することも出来る。
　ヒト抗体に用いるＷＴのＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましく、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また、ヒト抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることが出来る。
　本発明の方法により製造される抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられる。
　腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ＧＤ２抗体［Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，１３，３３１（１９９３）］、抗ＧＤ３抗体［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０（１９９３）］、抗ＧＭ２抗体［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５４，１５１１（１９９４）］、抗ＨＥＲ２抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５（１９９２）、ＵＳ５７２５８５６］、抗ＣＤ５２抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５（１９９２）］、抗ＭＡＧＥ抗体［Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３（２０００）］、抗ＨＭ１．２４抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７（１９９９）］、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体［Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９（２０００）］、抗ｂＦＧＦ抗体、抗ＦＧＦ－８抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１（１９８９）］、抗ｂＦＧＦＲ抗体、抗ＦＧＦ－８Ｒ抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５（１９９０）］、抗ＩＧＦ抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗ＩＧＦ－ＩＲ抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗ＰＳＭＡ抗体［Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６（１９９８）］、抗ＶＥＧＦ抗体［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５７，４５９３（１９９７）］、抗ＶＥＧＦＲ抗体［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８（２０００）、国際公開第９６／３００４６号］、抗ＣＤ２０抗体［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１０，５４８（１９９８）、米国特許第５７３６１３７号明細書］、抗ＣＤ１０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体（国際公開第９６／４０２０１号）、抗Ａｐｏ－２Ｒ抗体（国際公開第９８／５１７９３号）、抗ＡＳＣＴ２抗体（国際公開第２０１０／００８０７５号）、抗ＣＥＡ抗体［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５５（２３　ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ－５９４５ｓ，（１９９５）］、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗Ａ３３抗体等が挙げられる。
　アレルギーまたは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗インターロイキン１０抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン６受容体抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１（１９９４）］、抗インターロイキン５抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体［Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２（１９９１）］、抗インターロイキン４受容体抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１７，４１（１９９８）］、抗腫瘍壊死因子抗体［Ｌｙｍｐｈ．Ｃｙｔｏ．Ｒｅｓ．，１３，１８３（１９９４）］、抗腫瘍壊死因子受容体抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７（２０００）］、抗ＣＣＲ４抗体［Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６，（１９９９）］、抗ケモカイン抗体［Ｐｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９，（１９９４）］または抗ケモカイン受容体抗体［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３（１９９７）］等が挙げられる。
　循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８（１９９４）］、抗血小板由来増殖因子抗体［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９（１９９１）］、抗血小板由来増殖因子受容体抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００（１９９７）］、抗血液凝固因子抗体［Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８（２０００）］、抗ＩｇＥ抗体、抗αＶβ３抗体またはα４β７抗体等が挙げられる。
　ウイルスまたは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ｇｐ１２０抗体［Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５（２０００）］、抗ＣＤ４抗体［Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５（１９９８）］、抗ＣＣＲ５抗体または抗ベロ毒素抗体［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６（１９９９）］等が挙げられる。
　生理活性を有するペプチドとしては、例えば、上記の糖蛋白質の部分断片のうち、該糖蛋白質の活性を維持しているペプチド等が挙げられる。また、糖蛋白質が酵素である場合には、酵素の活性を調節するペプチドまたは酵素の構造を保持するペプチド等も包含される。
　酵素の活性を調節するペプチドとしては、具体的には、例えば、糖蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するペプチド等が挙げられる。アゴニストとしては、糖蛋白質の活性を亢進する活性を有するペプチドであればいかなるものでもよい。
　アゴニストとしては、具体的には、例えば、ソマトスタチン誘導体、ソマトロビン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、グルカゴン、インスリン、インスリン様成長因子または性腺刺激ホルモン等が挙げられる。アンタゴニストとしては、糖蛋白質の活性を抑制する活性を有するペプチドであればいかなるものでもよく、具体的には、例えば、ペグビソマトン等が挙げられる。
　生理活性を有するペプチドを産生する場合に用いられる動物細胞としては、上記のペプチドが産生出来ればいずれの動物細胞を用いてもよいが、好ましくは産生するペプチドをコードする遺伝子を有するベクターが導入された形質転換体が用いられる。
　ペプチドをコードする遺伝子を有するベクターが導入された形質転換された細胞は、ペプチドをコードするＤＮＡとプロモーターを含む組換え体ベクターを、宿主細胞に導入することによって取得することが出来る。
　宿主細胞としては上記の物質を生産する能力を有する動物細胞が挙げられる。
　前記組換え体ベクターを調製するために用いられるベクターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが出来る。例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０６［日本国特開平３－２２９７９号公報］、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］またはｐＡＧＥ２１０等が挙げられる。
　プロモーターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが出来、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のイミディエイトアーリー（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターまたはＳＲαプロモーター等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサー等をプロモーターと共に用いてもよい。
　宿主細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、当該細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが出来、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等が挙げられる。
　本発明の形質転換細胞としては、具体的には、例えば、抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換細胞７－９－５１（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６９１）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ２７６０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７０５４）、抗ＣＣＲ４ヒト化抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８７５９（ＦＥＲＭ　ＢＰ－８１２９）及びＫＭ８７６０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－８１３０）、７０９　ＬＣＡ－５００Ｄ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－８２３９）、抗ＩＬ－５受容体α鎖キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ７３９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５６４９）、抗ＩＬ－５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８３９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５６４８）及びＫＭ９３９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５６４７）、抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８９６６（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５１０５）、ＫＭ８９６７（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５１０６）、ＫＭ８９６９（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５５２７）、ＫＭ８９７０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５５２８）、抗ＣＤ２０抗体を生産する形質転換株Ｍｓ７０４－ＣＤ２０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１００９２）及びアンチトロンビンＩＩＩを生産する形質転換細胞Ｍｓ７０５－ｐＫＡＮ－ＡＴＩＩＩ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－８４７２）等が挙げられる。
　動物細胞を培養する方法としては、例えば、バッチ（回分）培養、リピートバッチ培養、フェドバッチ（セミバッチ、半回分、流加）培養またはパーフュージョン（潅流）培養等、用いる動物細胞に適した方法であればいずれでもよいが、好ましくはフェドバッチ培養が用いられる。
　通常ｐＨ６～８、３０～４０℃等の条件下で、例えば、フェドバッチ培養では３～２０日間、パーフュージョン培養では３～６０日間、培養を行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌等は通常の動物細胞の培養に用いられる方法を用いることが出来る。
　本発明において用いられる培養方法の培養量としては、三角フラスコ等を用いた通常１０～１０００ｍＬの少量の培養量でも、ジャー等の培養槽等を用いた通常１～２００００Ｌの商用生産に用いることが出来る大量の培養量でも、いかなる培養量でもよい。
　また、本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法において、１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法に関する。
　１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドを添加する培養は、上述の方法により行うことが出来る。
　物質がペプチドである場合、本発明の物質の製造方法としては、例えば、宿主細胞内にペプチドを生産させる直接発現方法または宿主細胞外にペプチドを分泌生産させる方法（モレキュラー・クローニング第２版）等が挙げられる。
　ペプチドは、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または日本国特開平５－３３６９６３号公報、国際公開第９４／２３０２１号等に記載の方法を利用することにより、宿主細胞外へ積極的に分泌させることが出来る。即ち、遺伝子組換えの手法を用いて、所望のペプチドのＮ末端にシグナルペプチドを結合させた形で発現させることにより、所望のペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることが出来る。
　また、日本国特開平２－２２７０７５号公報に記載されている、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用することにより、所望のペプチドの生産量を上昇させることも出来る。
　上述の方法により製造される所望のペプチドは、例えば、通常のペプチドの単離精製法等を用いて単離精製することが出来る。
　所望のペプチドが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のペプチドの単離精製法により、粗精製標品または精製標品を得ることが出来る。
　前記ペプチドの単離精製法としては、例えば、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル－セファロース若しくはＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－セファロースＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース若しくはフェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、プロテインＡ若しくはプロテインＧ等を含むレジンを用いたアフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法または等電点電気泳動等の電気泳動法等が挙げられる。これらの方法は、単独または組み合わせて用いてもよい。
　所望のペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ペプチドを回収することができる。即ち、当該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、粗精製標品または精製標品を得ることができる。
　以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］
　以下の細胞培養用培地を調製し、沈澱形成の相違を比較した。
　７００ｍＬの水に、３１．６ｇのＡＧＴ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｆｅｅｄ　Ａ（インビトロジェン社製、カタログ番号：ＡＧ０９０２３１Ｐ７）、０．５０ｍＬのｐｏｌｙａｍｉｎｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社製、カタログ番号：ＡＧ０９０２３２Ｐ８）、２７．２ｇのＡＧＴ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｆｅｅｄ　Ｂ（インビトロジェン社製、カタログ番号：ＡＧ０９０２３０Ｐ７）、３０．０ｇのＨｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（ＤＭＶ社製、カタログ番号：Ｐ４２４７４）、７０．０ｇのｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬社製、カタログ番号：０４１－００５９５）、及び５．０ｇのＬ－（＋）－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（和光純薬社製、カタログ番号：０７８－００５２５）または７．４ｇのＬ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）を混合した。
　約３０分間攪拌後、７．０ｍＬの５ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ水溶液（和光純薬社製、カタログ番号：０８１－０５４３５）を加え、更に約２０分間攪拌してｐＨを６．５にした。その後、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ（純正化学社製、カタログ番号：３９１５５－０３０１）、１００ｍｍｏｌ／ＬのＬ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（シグマ社製、カタログ番号：Ｔ１１４５－１００Ｇ）、および１００ｍｍｏｌ／ＬのＬ－ｃｙｓｔｉｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（和光純薬社製、カタログ番号：０３４－０５３２２）を含む５０ｍＬのアルカリ溶液を上記調製したｐＨ６．５の水溶液に加えた。
　水溶液の容量を水で１Ｌに合わせた後、約２０分間攪拌し、細胞培養用培地を調製した。また、上記細胞培養用培地のうち、Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔおよびＬ－ｃｙｓｔｉｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを、等濃度（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）のＬ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）およびｂｉｓ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）に置換した細胞培養用培地をそれぞれ調製した。調製した細胞培養用培地を４℃（冷蔵庫、ホシザキ社製）、２０℃（ｅ－Ｃｏｏｌｉｎｇ　Ｂｕｃｋｅｔ、タイテック社製）、または室温の３条件でそれぞれ保存した。
　その結果、Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔおよびＬ－ｃｙｓｔｉｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを含む細胞培養用培地は、３日後以降全ての条件で沈澱の生成を認めた。中でも保存温度が低い４℃の群で沈澱が多く認められた。
　一方で、Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔおよびＬ－ｃｙｓｔｉｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを、それぞれＬ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）またはｂｉｓ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）に置換した細胞培養用培地は沈澱が生成しなかった。
　この結果から、細胞培養用培地に１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加することにより、培地中の沈殿の生成を抑制できることが分かった。
［実施例２］
　以下の細胞培養用フィード培地を調製し、ＣＨＯ細胞によるフェドバッチ培養を試み比較した。
　フィード培地は、３１．６ｇ／ＬのＡＧＴ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｆｅｅｄ　Ａ（インビトロジェン社製、カタログ番号：ＡＧ０９０２３１Ｐ７）、０．５０ｍｌ／Ｌのｐｏｌｙａｍｉｎｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社製、カタログ番号：ＡＧ０９０２３２Ｐ８）、２７．２ｇ／ＬのＡＧＴ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｆｅｅｄ　Ｂ（インビトロジェン社製、カタログ番号：ＡＧ０９０２３０Ｐ７）、５．０ｇ／ＬのＬ－（＋）－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（和光純薬社製、カタログ番号：０７８－００５２５）、３０．０ｇ／Ｌのｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（ＤＭＶ社製、カタログ番号：Ｐ４２４７４）、７０．０ｇ／Ｌのｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬社製、カタログ番号：０４１－００５９５）、５．０ｍｍｏｌ／ＬのＬ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）、および５．０ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌまたは１６ｍｍｏｌ／Ｌのｂｉｓ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ（協和発酵バイオ社製）からなり、実施例１と同様の方法によりそれぞれ調製した。
　抗体Ｘを発現するＣＨＯ細胞を用いた培養において、主培養培地として、４．０ｍｍｏｌ／Ｌのｇｌｕｔａｍｉｎｅ（インビトロジェン社製、カタログ番号：２５０３０）を含むＥＸ－ＣＥＬＬ３２５（ＳＡＦＣ社製、カタログ番号：１４３４０Ｃ－１０００ＭＬ）を用いた。上記フィード培地を加えてフェドバッチ培養を実施した。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示す通り、ｂｉｓ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅの濃度を５．０ｍｍｏｌ／Ｌから１０ｍｍｏｌ／Ｌまたは１６ｍｍｏｌ／Ｌに変更すると培養１３日目において５．０ｍｍｏｌ／Ｌでは生細胞数２８．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率５５．０％、１０ｍｍｏｌ／Ｌでは生細胞数４４．１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率７８．７％、１６ｍｍｏｌ／Ｌでは生細胞数５８．１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率８６．６％となり、ｂｉｓ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅの濃度依存的に生細胞数の増加及び生存率の上昇が認められた。
　この結果から、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養において、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することにより、該動物細胞の生細胞数を増加し、生存率を向上できることが分かった。
［実施例３］
抗体生産を確認するため、実施例２の抗体生産能を有するＣＨＯ細胞のフェドバッチ培養における培養１３日目の抗体力価を測定した。フィード培地中のｂｉｓ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅの濃度が５．０ｍｍｏｌ／Ｌでは０．７５ｇ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌでは０．７９ｇ／Ｌ、そして１６ｍｍｏｌ／Ｌでは０．７８ｇ／Ｌであった。
　この結果から、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養において、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することにより、動物細胞により該物質を生産できることが分かった。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１０年８月２日付で出願された日本特許出願（特願２０１０－１７３５４６）に基づいており、その全体が引用により援用される。
　本発明により、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養において、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法、物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法であって、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法、及び１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地を提供することができる。

Claims (47)

  1. 　物質を生産する能力を有する動物細胞の培養方法であって、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養することを特徴とする該動物細胞の培養方法。
  2. 　１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドがジペプチドまたはジペプチドの二量体である、請求項１に記載の方法。
  3. 　１以上のＬ－システインを有するジペプチドがグリシル－Ｌ－システイン、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン若しくはγ－グルタミルシステインまたはその塩類である、請求項２に記載の方法。
  4. 　１以上のＬ－システインを有するジペプチドの二量体がビス－（グリシル－Ｌ－システイン）またはビス－（Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン）である、請求項２に記載の方法。
  5. 　さらにＬ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドを培地中に添加して前記動物細胞を培養することを特徴とする、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドがジペプチドである、請求項５に記載の方法。
  7. 　１以上のＬ－チロシンを有するジペプチドがＬ－アラニル－Ｌ－チロシンまたはその塩類である、請求項６に記載の方法。
  8. 　培地中に添加される１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　培地中に添加されるＬ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項５～請求項８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　動物細胞が哺乳類に属する動物由来の細胞である、請求項１～請求項９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　哺乳類に属する動物が霊長類またはげっ歯類である請求項１０に記載の方法。
  12. 　動物細胞が骨髄腫細胞若しくは卵巣細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞である、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
  13. 　物質がペプチドである、請求項１～請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞である、請求項１０～請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　ペプチドが糖蛋白質である、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
  16. 　糖蛋白質が抗体である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　オリゴペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、請求項１～請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 　オリゴペプチドを添加する培地がフィード培地である、請求項１～請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　培養方法が培養槽を用いた培養方法である、請求項１～請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 　物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法であって、１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを培地中に添加して該動物細胞を培養し、当該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法。
  21. 　１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドがジペプチドまたはジペプチドの二量体である、請求項２０に記載の方法。
  22. 　１以上のＬ－システインを有するジペプチドが、グリシル－Ｌ－システイン、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン若しくはγ－グルタミルシステインまたはその塩類である、請求項２１に記載の方法。
  23. 　１以上のＬ－システインを有するジペプチドの二量体がビス－（グリシル－Ｌ－システイン）またはビス－（Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン）である、請求項２１に記載の方法。
  24. 　さらにＬ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドを培地中に添加して前記動物細胞を培養することを特徴とする、請求項２０～請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 　１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドがジペプチドである、請求項２４に記載の方法。
  26. 　１以上のＬ－チロシンを有するジペプチドがＬ－アラニル－Ｌ－チロシンまたはその塩類である、請求項２５に記載の方法。
  27. 　培地中に添加される１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項２０～請求項２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 　培地中に添加されるＬ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項２４～請求項２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 　動物細胞が哺乳類に属する動物由来の細胞である、請求項２０～請求項２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 　哺乳類に属する動物が霊長類またはげっ歯類である請求項２９に記載の方法。
  31. 　動物細胞が骨髄腫細胞若しくは卵巣細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞である、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
  32. 　物質がペプチドである、請求項２０～請求項３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 　動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞である、請求項２９～請求項３１のいずれか１項に記載の方法。
  34. 　ペプチドが糖蛋白質である、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
  35. 　糖蛋白質が抗体である、請求項３４に記載の方法。
  36. 　オリゴペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、請求項２０～請求項３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 　オリゴペプチドを添加する培地がフィード培地である、請求項２０～請求項３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 　培養方法が培養槽を用いた培養方法である、請求項２０～請求項３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 　１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドを含有する培地。
  40. 　１以上のＬ－システインを有するグルタチオンを除くオリゴペプチドがジペプチドまたはジペプチドの二量体である、請求項３９に記載の培地。
  41. 　１以上のＬ－システインを有するジペプチドが、グリシル－Ｌ－システイン、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン若しくはγ－グルタミルシステインまたはその塩類である、請求項４０に記載の培地。
  42. 　１以上のＬ－システインを有するジペプチドの二量体がビス－（グリシル－Ｌ－システイン）またはビス－（Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン）である、請求項４１に記載の培地。
  43. 　さらにＬ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドを含有する、請求項３９～請求項４２のいずれか１項に記載の培地。
  44. 　１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドがジペプチドである、請求項４３に記載の方法。
  45. 　１以上のＬ－チロシンを有するジペプチドがＬ－アラニル－Ｌ－チロシンまたはその塩類である、請求項４４に記載の培地。
  46. 　１以上のＬ－システインを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項３９～請求項４５のいずれか１項に記載の培地。
  47. 　Ｌ－チロシンまたは１以上のＬ－チロシンを有するオリゴペプチドの濃度が、０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項３９～請求項４５のいずれか１項に記載の培地。
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