KR101402634B1 - 항-노화 화합물을 이용한 단백질 제조 방법 - Google Patents

항-노화 화합물을 이용한 단백질 제조 방법 Download PDF

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Abstract

항산화제인 카르노신과 같은 항-노화 화합물을 포함하는 세포 배양 배지에서 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 본 발명의 교시에 따르면, 항-노화 화합물을 포함하는 세포 배양 배지에서 성장한 세포는 증가된 생존력 및 생산성을 나타낸다. 게다가, 항-노화 화합물의 존재하에 성장한 세포 배양물은 세포 배양 배지 중에 감소된 수준의 고분자량 응집체를 나타낸다.
항-노화 화합물, 카르노신, 아세틸-카르노신, 호모-카르노신, 안세린, β-알라닌

Description

항-노화 화합물을 이용한 단백질 제조 방법{Methods of protein production using anti-senescence compounds}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 2005년 10월 24일 출원된 미국 임시출원 제60/729,573호에 대해 우선권을 주장하며, 적어도 1명 이상의 발명자를 공유하며, 공동 계류중이고, 이의 전문은 참조로서 본원에 인용된다.
본 발명은 넓게는 포유동물 세포 배양으로 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상세히, 본원은 항-노화 화합물, 예를 들어 카르로신 (carnosine)의 존재하에서 포유동물 세포를 배양하여, 생존력을 유지시키고 생산성을 증가시키면서 월등한 품질을 제공하는 방법에 관한 것이다. 세포 배양으로 다수의 단백질 생성물이 생산되었다. 이들 생성물, 예를 들어 하이브리도마-생산된 모노클로날 항체는 치료, 연구 또는 기타 목적으로 사용될 수 있다. 동물 세포, 특히 포유동물 세포는 종종 단백질을 생산하는데 사용된다. 불행히도, 동물 세포를 사용하면, 제조 공정이 시간 소모적이 되고 고비용이 든다.
화학 제제를 세포 배양 배지에 첨가하면, 세포가 생성물을 생산하도록 유도되어 전체적인 수율을 증가시킴으로써, 세포 생산성을 증가시킬 수 있다. 사용하기에 최적인 제제는 수많은 요인, 예를 들어 목적하는 단백질 생성물 및 세포 유형에 따라 달라진다. 유사한 요인이 또한 선택된 제제의 첨가량 및 제제가 세포 배양 배지에 첨가되는 시기에 영향을 미친다. 제제의 예로는 알칸산 또는 염, 우레아 유도체 또는 디메틸설폭시드 (DMSO)를 들 수 있다. 나트륨 부티레이트와 같은 화학 제제가 단백질 제조에 다양한 영향을 줄 수 있다. 제제의 첨가가 세포의 비생산성(specific productivity)을 증가시킬 수 있으나, 또한 세포 독성을 가질 수 있고, 세포 성장 및 생존력을 억제할 수 있다.
세포가 단백질을 생산할 때, 통상적으로 단백질은 세포 배양 배지 속으로 분비된다. 그러나, 이러한 특정 단백질은 배지에서 유일한 물질이 아니다; 고분자량 응집체, 산성 종, 및 기타 물질이 종종 배지 내에 존재하여, 정제 공정을 힘들게 하고 비용이 많이들게 한다. 특히, 생물반응기의 조건을 변화시키거나 상이한 세포주를 사용하는 등, 보다 효율적인 단백질 정제를 가능하게 하여 제품의 품질을 향상시키는 기술 및 방법이 이용될 수 있다. 그러나, 단백질 제조의 기술 및 방법 분야에서 정제 공정을 개선하기 위한 필요성이 여전히 남아있다.
그러므로, 높은 세포 생존력을 유지시키면서 목적하는 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는, 세포 배양 배지에 첨가되는 화학 제제가 요구된다. 또한, 세포 배양 배지 중의 고분자량 응집체 및 산성 종의 양을 감소시킴으로써 단백질의 제품 품질을 증가시키는 제제가 요구된다.
발명의 개요
특정 양태에서, 본 발명은 단백질 생성물의 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 특정 양태에서, 본 발명은, 목적하는 단백질의 전반적인 생산이 증가되도록, 항-노화 화합물을 포함하는 배지에서 목적하는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 이러한 항-노화 화합물은 카르노신을 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명은 목적하는 단백질의 생산을 증가시키는 조성물을 제공한다. 예를 들면, 특정 양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 발현되는 목적하는 단백질의 생산을 증진시키는 항-노화 화합물을 포함하는 세포 배양 배지를 제공한다. 특정 양태에서, 이러한 항-노화 화합물은 카르노신을 포함한다. 특정 양태에서, 유전자 조작된 숙주 세포를 접종 배지와 배합하여 세포 배양 배지를 형성시키고, 이를 생물반응기에서 성장시킨다. 목적하는 단백질 생성물의 생산 공정을 수행하는 동안에, 생물반응기의 조건을 변화시키고/시키거나 보충물을 첨가하여, 생산성을 증가시키고/시키거나 생존력을 유지할 수 있다. 보충물은 공급 배지 및/또는 하나 이상의 첨가물, 예를 들어 본 발명의 경우, 카르노신 및/또는 기타 항-노화 화합물을 포함할 수 있다.
포유동물 숙주 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포는 생물반응기 내에서의 생산 공정의 말엽에 생존력의 감소를 경험할 수 있다. 세포 배양 배지에 항-노화 제제, 예를 들어 카르노신 및 이의 유사체를 첨가하면, 단백질이 수거될 때까지, 생존 세포 수 및 세포 생존력을 보다 높게 유지하는데 도움이 된다는 것이 발견되었다.
또한, 생산성을 증가시키기 위한 방법, 예를 들어 생산 공정의 수행 중의 성장기 후에 및/또는 생산기 도중에 온도를 변화시키는 방법이 본 발명에 있어서 사용될 수 있다. 단지 일례로서, 단백질 생성물, 특히 성장 분화 인자-8 (GDF-8)에 대한 항체의 생산 도중에, 온도를 하향 전이시켜 생산을 개시하고 생산성을 증가시키는데 도움을 주었다. 특정 양태에서, 항-노화 화합물, 예를 들어 카로노신의 첨가는 세포 배양의 생산성을 증가시키는데 도움을 준다. 특정 양태에서, 항-노화 화합물은 상기와 같은 온도 전이의 전, 도중 및/또는 후에 첨가될 수 있다.
세포 배양 배지에 카르노신과 같은 항-노화 화합물을 첨가하면, 단백질 생성물의 전반적인 품질이 증가된다는 것이 또한 발견되었다. 단백질의 생산 도중에, 고분자량 응집체들이 다른 원치 않는 종과 함께, 세포 배양 배지 중에 존재한다. 카르노신의 첨가가 고분자량 응집체의 양을 감소시키고 생성물의 품질을 증가시킨다. 특정 양태에서, 카르노신을 제외한 항-노화 화합물의 첨가는 이러한 고분자량 응집체의 축적을 증가시키고 생성물의 품질을 향상시킨다. 특정 양태에서, 카르노신은 하나 이상의 추가적 항-노화 화합물과 함께 첨가된다.
세포 배양 배지에 첨가되는 항-노화 화합물 (예: 카르노신)의 농도는 다수의 공정 요인, 예를 들어 특히 세포 유형, 목적하는 단백질, 및 생물반응기의 조건에 따라 달라질 수 있다. 또한, 카르노신은 이의 유사체; 아세틸-카르로신, 호모-카르노신, 안세린(anserine), 및 β-알라닌로 대체될 수 있다. 특정 양태에서, 카르노신은 하나 이상의 다른 항-노화 화합물과 배합되어 제공된다. 특정 양태에서, 세포 배양 배지 중의 항-노화 제제 (예: 카르노신)의 농도는 약 5 mM 내지 약 100 mM이다. 특정 양태에서, 상기 농도는 약 10 mM 내지 약 40 mM이다. 특정 양태에서, 상기 농도는 약 20 mM이다.
단백질 생산의 공정에서, 임의의 적당한 배양 절차 및 접종 배지를 사용하여 세포를 배양할 수 있다. 혈청 배지 및 무혈청 배지 모두 사용될 수 있다. 또한, 특정 세포 유형 및 단백질 생성물에 적당한 배양 방법을 사용하여 세포를 배양할 수 있다. 이러한 절차는 세포 배양 분야의 당업자에게 공지되었고 익히 알려졌다.
본원의 다른 특징 및 이점은 아래의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명해질 것이다.
도 1a. MYO-29에 대한 산성 피크에 미치는 카르노신의 효과.
도 1b. 고분자량 응집체에 미치는 카르노신의 효과.
도 1c. 상이한 날들에 첨가된 카르노신이 산성 피크에 미치는 효과.
도 1d. 상이한 날들에 첨가된 카르노신이 고분자량 응집체에 미치는 효과.
도 2a. 1일 생존 세포 밀도에 카르노신이 미치는 효과.
도 2b. 1일 세포 생존력에 카르노신이 미치는 효과.
도 2c. 1일 역가에 미치는 카르노신의 효과.
도 2d. 누적 특이적 세포 생산성에 미치는 카르노신의 효과.
도 2e. 고분자량 응집체에 미치는 카르노신의 효과.
도 3a. 생존 세포 밀도에 미치는 상이한 농도의 카르노신의 효과.
도 3b. 1일 세포 생존력에 미치는 상이한 농도의 카르노신의 효과.
도 3c. 1일 역가에 미치는 상이한 농도의 카르노신의 효과.
도 3d. 누적 특이적 세포 생산성에 미치는 상이한 농도의 카르노신의 효과.
도 3e. 고분자량 응집체에 미치는 상이한 농도의 카르노신의 효과.
정의
오랫동안 유지된 관례에 따라, 청구범위를 포함한 본 출원에서 사용된 단수를 나타내는 관사는 '하나 이상'을 의미한다. 비록 본 발명이 어느 정도 상세히 기재되었다고는 하나, 많은 변화, 변경 및 변동이 본 명세서의 견지에서 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 취지 및 범위에 속하는 이러한 모든 변화, 변경, 및 변동을 한정된 청구범위에 포함시키고자 한다.
본원에 사용된 "항-노화 화합물"이란 용어는 세포 배양물에 첨가했을 때, 그곳에서 성장하는 세포의 생존력, 성장 및/또는 수명을 증진하는 모든 제제 또는 화합물을 말한다. 특정 양태에서, 세포 배양물 중에 이러한 항-노화 화합물을 사용하면, 항-노화 화합물이 결여된 것 말고는 동일한 배양 조건하에서 관찰된 것보다, 역가가 증가하고/하거나, 세포 비생산성이 증가하고/하거나, 세포 생존력이 증가하고/하거나, 통합된 생존 세포 밀도가 증가하고/하거나, 고분자량 응집체의 축적이 감소하고/하거나 산성 종의 축적이 감소한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 항-노화 화합물의 비-제한적 실시예로는 카르노신, 아세틸-카르노신, 호모-카르노신, 안세린, 및 β-알라닌이 포함된다. 특정 양태에서, 2 이상의 항-노화 화합물이 본 발명의 조성물 및 방법에 따라 사용될 수 있다.
"숙주 세포"란 표현은 유전자 조작될 수 있고/있거나 세포 배양 배지에서 성장 및 생존가능한 세포를 말한다. 통상적으로, 상기 세포는 내인성 또는 이종성 목적 단백질을 다량으로 발현할 수 있고 당해 단백질을 보유하거나 이를 세포 배양 배지로 분비할 수 있다.
숙주 세포는 통상적으로 "포유동물 세포"이며, 이에는 척추동물 세포의 비-제한적 예, 예를 들어 아기 햄스터 신장 (BHK), 중국 햄스터 난소 (CHO), 사람 신장 (293), 정상 태아 붉은털 원숭이(rhesus) 이배체 (FRhL-2), 및 쥐 골수종 (예: SP2/0 및 NSO) 세포가 포함된다. 당업자는 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 다른 숙주 세포를 알 것이다.
"세포 배양 배지"란 용어는 세포가 성장하여 목적하는 단백질을 생산하는 조건하에서 세포 생존을 유지하기 위한 영양물을 함유하는 용액을 말한다. "접종 배지"란 용어는 세포 배양을 개시시키는 영양물을 함유하는 용액 또는 물질을 말한다. 특정 양태에서, "공급 배지"는 접종 배지와 유사한 영양물을 함유하나, 배양 개시 후 세포에 공급되는 용액 또는 물질이다. 특정 양태에서, 공급 배지는 접종 배지에 존재하지 않는 하나 이상의 성분들을 함유한다. 특정 양태에서, 공급 배지에는 접종 배지에 존재하는 하나 이상의 성분들이 결여된다. 세포 배양 분야의 당업자는 과도한 실험 없이 접종 배지 및 공급 배지를 구성하는 성분이 무엇인지 알 것이다. 통상적으로, 이들 용액은 성장 및 생존을 위해 세포에 의해 요구되는 필수 및 비-필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질 및 미량 원소를 제공한다. 특정 태양에서, 접종 배지, 공급 배지 또는 이 둘 모두는 항-노화 화합물을 포함한다.
본원에 사용된 "세포 배양 특징 "이란 표현은 세포 배양물의 관찰가능하고/하거나 측정가능한 특징을 말한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 하나 이상의 세포 배양 특징을 개선하는데 유리하게 사용된다. 특정 양태에서, 세포 배양 특징의 개선은 세포 배양 특징의 규모의 증가를 포함한다. 특정 양태에서, 세포 배양 특징의 개선은 세포 배양 특징의 규모의 감소를 포함한다. 비-제한적인 예로서, 세포 배양 특징은 역가, 세포 비생산성, 세포 생존력, 통합된 생존 세포 밀도, 고분자량 응집체의 축적, 및/또는 산성 종의 축적일 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 개선할 수 있는 다른 세포 배양 특징을 알 것이다.
본원에 사용된 "규정된 배지"란 용어는 배지의 조성이 알려지고 또한 제어된 배지를 말한다. 규정된 배지는 미공지 및/또는 미제어된 성분들을 함유하는 혈청 또는 가수분해물과 같은 복합 첨가물을 함유하지 않는다.
본원에 사용된 "복합 배지"란 용어는 정체 또는 분량이 미공지되거나 미제어된 하나 이상의 성분들을 함유하는 배지를 말한다.
"세포주"란 표현은 일반적으로, 목적하는 단백질을 발현하는 1차 숙주 세포를 말한다. 일부 양태에서, 세포를 목적하는 단백질을 암호화하고/하거나 내인성 또는 이종성인 연결된 서열의 발현을 활성화하는 제어 서열을 함유하는 외인성 DNA로 형질감염시켰다. 특정 양태에서, 이러한 유전자 변형된 세포들로부터 유래된 세포들이 세포주를 형성하고, 세포 배양물에 넣고 성장시켜 단백질 생성물을 생산한다. 특정 양태에서, 세포주는 외인성 DNA로 형질감염되지 않고 내인성 목적 단백질을 발현하는 1차 숙주 세포를 포함한다.
세포 배양 배지의 "성장기"란 세포가 빠른 분열을 겪으면서 기하급수적으로 또는 거의 기하급수적으로 성장하는 때의 기간을 말한다. 통상적으로, 세포는 세포 성장을 위한 최적 조건하에서 일반적으로 1 내지 4일 동안 배양한다. 성장기 조건은 약 35℃ 내지 42℃, 일반적으로 약 37℃를 포함할 수 있다. 성장기의 길이 및 성장기의 배양 조건은 다양하나, 세포 배양 분야의 당업자에게 일반적으로 공지되어있다. 특정 양태에서, 성장기의 세포 배양 배지는 공급 배지로 보충된다.
"전이기"란 세포 배양 배지가 성장기와 일치하는 상태로부터 생산기와 일치하는 상태로 전이되는 때의 기간 동안 나타난다. 전이기 동안에, 특히 온도와 같은 요인이 종종 변화된다. 특정 양태에서, 전이기의 세포 배양 배지는 공급 배지로 보충된다.
"생산기"란 성장기 및 전이기 둘 후에 나타난다. 세포의 기하급수적 성장이 끝나고 단백질 생산이 주요 목적이다. 세포 배양 배지는 생산을 개시하도록 보충될 수 있다. 특정 양태에서, 생산기의 세포 배양 배지는 공급 배지로 보충된다. 또한, 생산기 동안의 세포 배양 배지의 온도는, 통상적으로 생산을 촉진하는 성장기 동안 보다도, 일반적으로 더 낮을 수 있다. 생산기는 목적하는 결과가 달성될 때까지 계속된다.
"생존 세포 밀도"란 표현은 특정 용적, 일반적으로 ml 당 세포 배양 배지에서 생존하는 세포의 총수를 말한다. "세포 생존력"이란 표현은 죽었거나 살아있는 세포 모두를 포함한 세포의 총수에 비교하여 살아있는 세포의 수를 말하며, %로서 표현된다.
"통합된 생존 세포 밀도", "IVCD (integrated viable cell density)": 본원에 사용된 "통합된 생존 세포 밀도" 또는 "IVCD"란 용어는 배양이 수행된 총 시간 량을 곱한, 배양 과정 동안의 생존 세포의 평균 밀도를 말한다. 생산된 단백질의 양이 배양 과정 동안에 존재하는 생존 세포의 수에 비례하는 경우에, 통합된 생존 세포 밀도는 배양 과정 동안에 생산된 단백질의 양을 추정하는데 유용한 도구이다.
"고분자량 응집체"란 용어는 일반적으로, 2 이상의 폴리펩티드의 잘못 폴딩된 단백질 또는 부적절한 회합을 말한다. 회합은 공유, 비-공유, 이황화 또는 비-환원성 가교 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 방법에 의해 일어날 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 고분자량 응집체의 축적을 감소시키는데 유리하게 사용된다.
"항산화제"란 용어는 유리 라디칼을 차단함으로써 지질, 단백질, DNA 및 기타 필수 고분자에 대한 산화적 손상을 방지할 수 있는 화합물을 말한다.
본원에 사용된 "항체"란 용어는 하나 이상, 통상적으로 2개의 VH 도메인 또는 이의 부분 및/또는 하나 이상, 통상적으로 2개의 VL 도메인 또는 이의 부분을 포함하는 단백질을 포함한다. 특정 양태에서, 항체는 2개의 중쇄 면역글로불린 쇄 및 2개의 경쇄 면역글로불린 쇄의 4량체이며, 이때 중쇄 및 경쇄는, 예를 들어 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 항체 또는 이의 부분은 설치류, 영장류 (예: 사람 및 비-사람 영장류), 낙타뿐만 아니라 재조합에 의해 생성된, 예를 들어 키메라, 사람화 및/또는 시험관내 생성된 것들을 포함한 비-제한적인 모든 기원으로부터 수득될 수 있으며, 이는 본원에서 더욱 상세히 설명될 것이다.
항체의 "항원-결합 단편"이란 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 (hinge) 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; (vi) 낙타 또는 낙타화된 가변 도메인; (vii) 단일 쇄 Fv (scFv); (viii) 2-특이적 항체; 및 (ix) Fc 영역에 융합된 면역글로불린 분자의 하나 이상의 단편이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 게다가, Fv 단편의 2개의 도메인인, VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 암호화될지라도, 이들을 재조합 방법으로 합성 링커에 의해 연결하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 일가 분자 (단일 쇄 Fv (scFv)로 알려짐)를 형성하는 단일 단백질로 만들 수 있다 [참조 문헌: Bird et al. (1988) Science 242:423-26; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83]. 또한, 이러한 단일 쇄 항체는 항체의 "항원-결합 단편"이란 용어에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기법을 사용하여 수득할 수 있으며, 당해 단편을 온전한 항체와 동일한 방식으로 기능에 대해 평가한다.
"항원-결합 단편"은 임의로, 안정성, 효과기 세포 기능 또는 보체 고정의 하나 이상을 증가시키는 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 항원 결합 단편은 페길화 잔기, 알부민, 또는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
"2-특이적" 또는 "2-기능적" 항체 이외에, 항체는 이의 결합 부위가 각각 동일한 것으로 이해된다. "2-특이적 항체" 또는 "2-기능적 항체"는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 2-특이적 항체는 다양한 방법, 예를 들어 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결에 의해 제조될 수 있다 [참조 문헌: Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)].
당업자에게 공지된 다수의 방법이 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수득하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 공지된 방법에 따른 하이브리도마의 생성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법으로 생성된 하이브리도마를 통상적으로 표준 방법, 예를 들어 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 및 표면 플라즈몬 공명 (BiacoreTM) 분석을 사용하여 스크리닝하여, 특정 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하나 이상의 하이브리도마를 확인한다. 특정 항원의 모든 형태, 예를 들어 재조합 항원, 천연 형태, 이의 모든 변이체 또는 단편, 및 이의 항원성 펩티드가 면역원으로서 사용될 수 있다.
항체를 제조하는 한가지 예시적 방법은 단백질 발현 라이브러리, 예를 들어 파아지 또는 리보좀 디스플레이 라이브러리의 스크리닝을 포함한다. 파아지 디스플레이는 예를 들어 문헌 [Ladner et al., 미국 특허 제5,223,409호; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271 ; WO 92/20791 ; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; 및 WO 90/02809]에 기재되어 있다.
디스플레이 라이브러리를 사용하는 것 외에, 특정 항원을 사용하여 비-사람 동물, 예를 들어 설치류, 예컨대 마우스, 햄스터, 또는 래트를 면역화시킬 수 있다. 특정 양태에서, 비-사람 동물은 사람 면역글로불린 유전자의 적어도 일부를 포함한다. 예를 들어, 마우스 항체 생산에 결함이 있는 마우스 종을 조작하여 사람 Ig 유전자좌의 큰 단편을 갖도록 할 수 있다. 하이브리도마 기법을 사용하여, 목적하는 특이성을 가진 유전자들로부터 유래된 항원-특이적 모노클로날 항체를 제조하여 선별할 수 있다 [참조 문헌: XENOMOUSETM, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21 , US 2003-0070185, WO 96/34096 (1996년 10월 31일 공개), 및 PCT 출원 제PCT/US96/05928호 (1996년 4월 29일 출원)].
특정 양태에서, 모노클로날 항체는 비-사람 동물로부터 수득한 다음, 당업계에 공지된 재조합 DNA 기법을 사용하여 변형된, 예를 들어 사람화, 탈면역화, 키메라화 항체를 제조할 수 있다. 키메라 항체를 제조하는 각종 시도가 예를 들어 하기 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 :6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., 미국 특허 제4,816,567호; Boss et al., 미국 특허 제4,816,397호; Tanaguchi et al., 유럽 특허 공보 제171496호; 유럽 특허 공보 제0173494호, 영국 특허 제GB 2177096B호]에 기재되어 있다. 또한, 사람화 항체는, 예를 들어, 사람 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현하지만, 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 없는 유전자전이된 (transgenic) 마우스를 사용하여 제조할 수 있다. 윈터(Winter)는 본원에 기술된 사람화 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 CDR-이식 (grafting) 방법을 기술한다 (미국 특허 제5,225,539호). 특정 사람 항체의 모든 CDR은 비-사람 CDR의 적어도 일부로 대체될 수 있거나, 또는 CDR의 단지 일부가 비-사람 CDR로 대체될 수 있다. 사람화 항체를 예정된 항원에 결합하는데 요구되는 수의 CDR만을 대체할 필요가 있을 뿐이다.
사람화 항체 또는 이의 단편은, 항원 결합에 직접적으로 관련되지 않은 Fv 가변 도메인의 서열을 사람 Fv 가변 도메인 유래의 동등한 서열로 대체함으로써 제조될 수 있다. 사람화된 항체 또는 이의 단편을 제조하는 예시적 방법이 문헌 [Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; 및 US 5,585,089; US 5,693,761 ; US 5,693,762; US 5,859,205; 및 US 6,407,213]에 제공된다. 이러한 방법은 중쇄 또는 경쇄의 하나 이상으로부터의 면역글로불린 Fv 가변 도메인의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열을 분리하고, 조작하고, 발현함을 포함한다. 이러한 핵산은, 상기한 바와 같이, 예정된 표적에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마, 및 기타 공급원으로부터 수득될 수 있다. 이어서, 사람화 항체 분자를 암호화하는 재조합 DNA는 적당한 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다.
특정 양태에서, 사람화 항체는 보존적 치환, 컨센서스 서열 치환, 배선 (germline) 치환, 및/또는 역돌연변이의 도입에 의해 최적화된다. 이러한 변형된 면역글로불린 분자는 당업계에 공지된 임의의 여러 기법 [참조 문헌: Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982]에 의해 제조될 수 있거나, PCT 공보 제WO92/06193호 또는 EP 0239400의 교시된 내용에 따라 제조될 수 있다.
항체 또는 이의 단편은 또한 사람 T 세포 에피토프의 특정 결실 또는 문헌 [WO 98/52976 및 WO 00/34317]에 기재된 방법에 의한 "탈면역화 (deimmunization)"에 의해 변형될 수 있다. 요약하면, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 MHC 클라스 II에 결합하는 펩티드에 대해 분석될 수 있다; 이들 펩티드는 잠재적 T-세포 에피토프 (WO 98/52976 및 WO 00/34317에 규정)를 나타낸다. 잠재적 T-세포 에피토프의 검출을 위하여, "펩티드 트레딩 (peptide threading)"으로 명명된 컴퓨터 모델링 접근법이 적용될 수 있으며, 추가적으로, 사람 MHC 클라스 II 결합 펩티드의 데이터베이스가 VH 및 VL 서열에 존재하는 모티프에 대해 검색될 수 있다 [참조: WO 98/52976 및 WO 00/34317]. 이들 모티프는 18개의 주요 MHC 클라스 II DR 알로타입 (allotype) 중의 어느 하나에 결합하므로, 잠재적 T 세포 에피토프를 구성한다. 검출된 잠재적 T-세포 에피토프는 가변 도메인 중의 소수의 아미노산 잔기, 또는 바람직하게는 단일 아미노산 치환에 의해 제거될 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환이 이루어진다. 전적으로는 아니지만, 종종 사람 배선 항체 서열 중의 위치에 공통적인 아미노산이 사용될 수 있다. 사람 배선 서열은, 예를 들면 문헌 [Tomlinson, et al. (1992) J. MoI. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. MoI. Biol. 227:799-817; and Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638]에 공개되어 있다. V BASE 디렉토리가 사람 면역글로불린 가변 영역 서열의 종합 디렉토리를 제공한다 (편집: Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). 이들 서열은, 예를 들어 주쇄(framework) 영역 및 CDR에 대한 사람 서열의 공급원으로서 사용될 수 있다. 컨센서스 사람 주쇄 영역이 또한 미국 특허 제6,300,064호 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 항체는 변형된 면역글로불린 불변 또는 Fc 영역을 함유할 수 있다. 예를 들면, 본원에 교시된 바와 같이 제조된 항체가 더 강하게 또는 더 특이적으로, 효과기 세포 활성, 용해, 보체-매개된 활성, 항체 제거, 및 항체 반감기와 같은 항체의 여러 면역 기능을 제어할 수 있는, 보체 및/또는 Fc 수용체와 같은 효과기 분자에 결합할 수 있다. 항체 (예: IgG 항체)의 Fc 영역에 결합하는 통상의 Fc 수용체로는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII의 수용체, 및 이들 수용체의 대립형질 변이체 및 선택적으로 스플라이싱된 형태를 포함한 FcRn 아부류가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. Fc 수용체는 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92, 1991; Capel et al., lmmunomethods 4:25-34,1994; and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41, 1995)에서 검토되었다.
"생물반응기"란 용어는 세포 배양 배지가 함유되고 내부 조건, 예를 들어 pH 및 온도가 배양기간 동안 제어될 수 있는 용기를 말한다.
"공급 배치 (fed batch) 배양"이란, 먼저, 접종 배지를 함유하는 생물반응기에 세포를 접종하여 세포를 배양하는 방법을 말한다. 이어서, 세포 배양 배지에, 생산 공정을 수행하는 동안에 1회 이상의 시점에, 영양 성분 및/또는 기타 보충물을 함유하는 공급 배지를 보충한다.
"배치 배양"이란, 생산 전 공정에 필요한 영양물 및 보충물을 모두 함유하는 생물반응기 중에 세포를 접종하여 세포를 배양하는 방법을 말한다. 생산 도중에 세포 배양 배지에 영양물이 첨가되지 않는다.
"관류 배양"이란, 발현된 목적 단백질을 분리하고/하거나 정제하기 전에 배양이 종료되지 않거나, 또는 반드시 종료되지 않으며, 발현된 단백질이 주기적으로 또는 계속적으로 수거되는 동안 새로운 영양물 및 다른 성분들이 주기적으로 또는 계속적으로 첨가되는, 배치 또는 공급 배치 배양 방법과는 상이한 세포 배양 방법을 말한다. 첨가되는 영양물의 조성은, 세포의 요구, 최적 단백질 생산을 위한 요건 및/또는 당업자에게 공지된 기타 각종 인자에 따라, 세포 배양의 과정 동안에 변화될 수 있다.
"발현"이란 표현은 숙주 세포 내에서 일어나는 전사 및 해독을 말한다. 발현의 수준은, 일반적으로, 숙주 세포에 의해 생산되는 단백질의 양을 말한다.
"단백질" 또는 "단백질 생성물"이란 표현은 아미노산의 하나 이상의 쇄를 말한다. 본원에 사용된 "단백질"이란 용어는 폴리펩티드와 동의어이며, 당업계에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, 연속적 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산의 하나 이상의 쇄를 말한다. 특정 양태에서, "목적하는 단백질"은 숙주 세포 내로 형질전환된 외인성 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질이다. 특정 양태에서, "목적하는 단백질"은 숙주 세포에 내인성인 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질이다. 특정 양태에서, 이러한 내인성 목적 단백질의 발현은, 예를 들어 하나 이상의 조절 서열을 함유하고/하거나 목적 단백질의 발현을 증가시키는 단백질을 암호화하는 외인성 핵산 분자로 숙주 세포를 형질감염시키는 방법으로 변경시킬 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여, 치료학적, 약제학적, 진단학적, 농학적 특성, 및/또는 상업적, 실험적 및/또는 기타 용도로 유용한 기타 각종 특성을 가진 단백질들을 포함한 비-제한적인 모든 목적 단백질을 생산할 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법 및/또는 조성물을 사용하여 생산된 단백질은 프로세싱 및/또는 변형될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라 생산된 단백질은 글리코실화될 수 있다.
"세포 비생산성" 등은 세포당, 특이적인 생성물 발현 속도를 말한다. 세포 비생산성은 일반적으로, 1일당 106개의 세포당 생성된 단백질 (mg)로 측정되거나, 또는 1일당 106개의 세포당 생성된 단백질 (pg)로 측정된다.
본원에 사용된 "역가"란 용어는 소정량의 배지 용적 중에서 세포 배양에 의해 생성된 재조합 발현 단백질의 총량을 말한다. 역가는 통상적으로, 배지의 ml당 단백질의 mg 또는 ㎍ 단위로 표현된다.
본원에 기재된 방법이 당업계에서 통상적으로 사용되고 배양되는 익히 공지된 다수의 포유동물 세포를 배양하는데 사용될 수 있다는 것을 당업자가 인식할 것이다. 즉, 본원에 기재된 방법만이 본 발명에 사용되는 것으로 제한되지 않는다.
본 발명의 특정 양태의 상세한 설명
카르노신과 같은 항-노화 화합물을 사용하면, 세포 배양물의 생존력 및 생산성이 변화된다는 것이 발견되었다. 예를 들면, 카르노신의 첨가가 세포 생존력을 유지시키고, 세포의 생산성을 향상시키고, 목적하는 단백질 생성물의 제품 품질을 향상시킨다. 카르노신은, 동물의 근육 및 신경 조직 내에 고수준 (최대 20 mM)으로 존재하는 천연의 디펩티드인 항산화제이자 항-노화 화합물이다. 항산화제인 카르노신은 또한 유리 라디칼 스캐빈저이자 글리케이션 (glycation) 억제제이다. 일반적으로, 카르노신은 반응성 종을 비-반응성 종으로 변환시켜, 단백질, DNA, 및 기타 필수 고분자를 보호한다. 항-노화 화합물로서, 카르노신은, 배양 배지 중의 20mM의 농도에서, 사람 이배체 섬유아세포 및 사람 태아 폐 (1차 세포주)의 수명을 연장시킬 수 있다. 본 발명은, 세포 배양에 항-노화 화합물 (카르노신을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)을 사용하여 목적 단백질을 생산하는 것이 유리하다는 놀라운 발견을 포함한다. 특정 양태에서, 목적 단백질을 생산하기 위하여 세포 배양물에 이러한 항-노화 화합물을 사용하면, 하나 이상의 개선된 세포 배양 특징, 예를 들어 역가의 증가, 세포 비생산성의 증가, 세포 생존력의 증가, 통합된 생존 세포 밀도의 증가, 고분자량 응집체의 축적 감소, 및/또는 산성 종의 축적 감소가 달성된다.
1ml 피루베이트를 함유하는 둘베코 변형된 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM, Sigma)에서는 아니나, 글루코스 농도가 낮은 최소 필수 배지 (Minimal Essential Medium) (MEM, Sigma)에서, 카르노신이 형질전환된 사람 또는 설치류의 신생물성 세포에 세포 독성이라는 것이 입증되었다 [참조: Holliday et al, Biochemistry (Moscow), 65:843-848,846]. 추가로, 저분자량 화합물이 제거된 투석된 태아 송아지 혈청은 카르노신의 세포독성 효과를 증가시켰다. 상기 문헌 참조. 또한, 1mM 옥살로아세테이트 및 1 mM α-케토글루타레이트 (이 둘 모두 카르노신 실시예와 함께 사용된 접종 또는 공급 배지의 성분이 아니다)가 피루베이트에 필적할만한 효과를 가진다는 것이 측정되었다. 상기 문헌 참조. 그러나, 나트륨 피루베이트는 접종 배지에 0.5mM의 농도로 존재하는 원래의 성분이며, 카르노신 첨가를 위한 것이 아니라, 차라리, 생물반응기 시스템의 생체내 상태를 흉내 내기에, 그리고 잠재적 대체 에너지원으로서 바람직한 것이다. 접종 배지는 또한 무혈청이며, 이는 카르노신이 세포독성 효과를 가질 것이라는 것을 의미한다. 상기 참조문헌에 따르면, 세포 배양 배지에 카르노신을 첨가하는 것이, 할리데이(Holliday)의 문헌에서 MEM 배지에서 관측되는 바와 같이 유사한 세포독성 효과를 가질 것이다. 본 발명의 방법 및/또는 조성물을 이용함으로써, 이러한 세포독성이 감소되거나 제거되고, 세포 생존력 및 단백질 생산이 향상된다.
특정 양태에서, 카르노신은 세포 배양 배지 중에 약 5 mM 내지 약 100 mM의 농도로 제공된다. 특정 양태에서, 카르노신은 세포 배양 배지에서 약 10 mM 내지 약 40 mM의 농도, 예를 들어 약 20 mM의 농도로 제공된다. 특정 양태에서, 카르노신은 세포 배양 배지에서 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mM, 또는 그 이상의 농도로 제공된다. 특정 양태에서, 카르노신의 이러한 농도는 카르노신을 세포 배양 공정 중에 수회, 예를 들어 하나 이상의 공급 배지에 첨가함으로써 달성된다. 이용된 카르노신의 농도는, 세포주 또는 생성물에 미치는 목적하는 효과를 포함한 기타 요인 중에서 사용된 세포 배양 배지 및 세포주에 따라 결정된다. 카르노신의 유사체, 예를 들어 아세틸-카로노신, 호모-카르노신, 안세린, 및 β-알라닌이 또한 유사한 효과를 위해 세포 배양 배지에 제공될 수 있다. 이들 유사체의 하나 이상이 세포 배양 배지 중에 제공될 수 있다. 특정 양태에서, 이러한 유사체는 카르노신이 결핍된 세포 배양 배지에 제공된다. 특정 양태에서, 이러한 유사체는 카르노신과 함께 세포 배양 배지에 제공된다. 특정 양태에서, 이러한 유사체는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mM, 또는 그 이상의 농도로 제공된다.
특정 양태에서, 목적하는 단백질을 생산하기 위하여, 처음에, 숙주 세포를 단백질을 암호화하는 외인성 DNA로 형질감염 또는 형질전환시켜, 목적하는 단백질 생성물을 구성적으로 생산하는 형질전환된 세포를 공급한다. 특정 양태에서, 세포 속으로 도입된 핵산 분자는 본 발명에 따라 발현될 목적하는 단백질을 암호화한다. 특정 양태에서, 핵산은 조절 서열을 함유하거나, 또는 세포에 의한 목적 단백질의 발현을 유도하거나 증강시키는 유전자 산물을 암호화한다. 비-제한적 예로서, 이러한 유전자 산물은 목적 단백질의 발현을 증가시키는 전자 인자일 수 있다.
특정 양태에서, 단백질의 발현을 지시하는 핵산은 숙주 세포 속으로 안정하게 도입된다. 특정 양태에서, 단백질의 발현을 지시하는 핵산은 일시적으로 숙주 세포 속으로 도입된다. 당업자는 실험적, 상업적 또는 기타 필요성에 따라 핵산을 세포 속으로 안정하게 도입할 건지 또는 일시적으로 도입할 건지 선택할 수 있을 것이다.
목적하는 단백질을 암호화하는 유전자는 임의로, 하나 이상의 조절성 유전자 제어 요소에 연결될 수 있다. 일부 양태에서, 유전자 제어 요소는 단백질의 구성적 발현을 지시한다. 일부 양태에서, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자의 유도성 발현을 제공하는 유전자 제어 요소가 사용될 수 있다. 유도성 유전자 제어 요소 (예: 유도성 프로모터)를 사용하면, 세포 내에서 단백질의 생산을 조절할 수 있다. 진핵생물 세포에서 사용하기에 잠재적으로 유용한 유도성 유전자 제어 요소의 비-제한적 예로는 호르몬-조절된 요소 (참조: Mader, S. and White, J. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607, 1993), 합성 리간드-조절된 요소 (참조: Spencer, D.M. et al., Science 262:1019-1024, 1993), 및 이온화 방사선-조절된 요소 (참조: Manome, Y. et al., Biochemistry 32:10607-10613, 1993; Datta, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10149-10153, 1992)가 포함된다. 당업계에 공지된 추가적 세포-특이적 또는 다른 조절 시스템이 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
세포 배양 및 단백질의 발현을 허용하는 모든 숙주 세포가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 숙주 세포는 일반적으로 포유동물 세포, 보다 상세히 동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 포유동물 세포의 다른 비-제한적 예로는 BALB/c 마우스 골수종 계통 (NSO/I, ECACC No: 85110503); 사람 망막아세포 (PER.C6 (CmCeII, Leiden, The Netherlands)); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통 (COS-7, ATCC CRL 1651 ); 사람 배아 신장 계통 (현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포 +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리(Sertoli) 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 사람 자궁경부 암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 사람 간암 계통 (Hep G2)이 포함된다.
숙주 세포에서 발현될 수 있는 모든 단백질은 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 생산될 수 있다. 당해 단백질은 숙주 세포에 내인성인 유전자로부터, 또는 숙주 세포 내로 도입된 이종성 유전자로부터 발현될 수 있다. 당해 단백질은 천연에 존재하는 것일 수 있거나, 또는 달리 인공적으로 조작되거나 선별된 서열을 가질 수 있다. 생산될 단백질은, 천연에 개별적으로 존재하는 단백질 단편들로부터 조합될 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 조작된 단백질은 천연에 존재하지 않는 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 약제학적으로 또는 상업적으로 관련있는 효소, 수용체, 항체, 호르몬, 조절인자, 항원, 결합제 등을 발현하는데 사용된다. 본 발명의 예로서, 유전자 조작된 세포가 성장 분화 인자-8 (GDF-8)에 대한 항체를 생산한다. 비-제한적 예시적 양태는 Myo29, Myo28, 및 Myo22으로 명명된다. 이들 예시적 양태는 사람 IgG 동종형의 형태로 제공된다. 공개된 비-제한적 예는, 본원에 참조로 인용된 WO 2004/037861 (발명의 명칭: GDF-8에 대한 중화 항체 및 이의 용도)에 의해 보호되는 MYO29를 사용한다. 당업자는 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 발현될 수 있는 다른 유용하고/하거나 바람직한 단백질을 알 것이다.
세포주를 각종 기법을 사용하여 배양하여 목적하는 단백질을 생산할 수 있다. 세포 배양은 세포 배양 배지의 목적 또는 생성물의 용도에 따라 소규모 또는 대규모로 수행될 수 있다. 예를 들면, 세포를 생물반응기 내에서 성장시킬 수 있다. 특정 양태에서, 생물반응기의 용적은 1 리터 이상이며, 10, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 8,000, 10,000, 12,000 리터 또는 그 이상일 수 있거나, 또는 그 사이의 임의의 용적일 수 있다. 또한, 사용될 수 있는 생물반응기로는 교반 탱크 생물반응기, 유동층 반응기, 중공 섬유 생물반응기, 또는 롤러 병이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당해 시스템은 또한 배치식, 공급-배치식, 또는 연속/관류식으로 작동할 수 있다. 세포 배양 배지를 제어하고 모니터하기 위한 생물반응기 및 방식은 세포 배양 분야의 당업자에게 알려져 있다. 본 발명의 실시예에서, 사용된 시스템은 교반 탱크 생물반응기이고, 공급-배치식으로 작동된다.
생물반응기는 일반적으로, 접종 배지 및 선택된 세포주, 예를 들어 목적하는 단백질 생성물을 안정하게 발현하여 생산하도록 형질감염될 수 있는 MYO-29 세포주로 시딩(seeding)한다. 시판 배지, 예를 들어 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium) (MEM, Sigma), Ham's F10 (Sigma), 또는 둘베코 변형된 이글 배지( Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM, Sigma)가 기본 배지로서 사용될 수 있다. 이후에, 이들 기본 배지에 아미노산, 비타민, 미량원소 및/또는 기타 성분을 보충하여, 생산 공정의 수행 중에 사용되는 접종 배지 또는 공급 배지를 제조할 수 있다. 특정 양태에서, 기본 배지는, 카르노신의 존재하에서, 왕성한 세포 성장을 허용하도록, 세포 생존력을 증가시키도록, 세포 생산성을 증가시키도록, 통합된 생존 세포 밀도를 증가시키도록, 및/또는 생산된 단백질의 품질을 향상시키도록 변경된다. 예를 들면, 기본 배지에는 피루베이트, 옥살로아세테이트 및/또는 α-케토글루타레이트가 보충될 수 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 사용하기 위하여 기본 배지를 변경시킬 수 있을 것이다.
특정 양태에서, 세포는 항-노화 화합물을 함유하는 화학적으로 규정된 각종 배지 (당해 배지의 성분들은 공지되어 있고 또한 제어된다) 중의 어느 하나에서 배양된다. 예를 들면, 규정된 배지는 통상적으로 혈청 또는 가수분해물과 같은 복합 첨가물을 함유하지 않는다. 특정 양태에서, 세포는 항-노화 화합물을 함유하는 각종 복합 배지 (당해 배지의 모든 성분들이 공지되고/되거나 제어되는 것은 아니다) 중의 어느 하나에서 배양된다. 특정 양태에서, 이러한 항-노화 화합물은 카르노신을 포함한다.
생물반응기의 조건은 통상적으로 pH 약 6.5 내지 7.5로 제어된다. pH는 산, 일반적으로 CO2, 또는 염기, 예를 들어 중탄산나트륨을 사용하여 조정한다. 성장기 동안에, 용존 산소는 약 5 내지 90%의 공기 포화도로 제어되고, 온도는 3O℃ 내지 42℃로 유지된다. 세포 배양 분야의 당업자는, 과도한 실험 없이, 목적하는 결과를 달성하기 위하여 사용된 세포주 및 방법에 따라 생물반응기의 조건을 변화시킬 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 단백질의 발현에 적합한 모든 세포 배양 방법 또는 시스템과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 목적하는 단백질을 발현하는 세포는 배치 또는 공급-배치 배양으로 성장시킬 수 있는데, 이때 배양은 단백질의 충분한 발현 후 종료되고, 이 후에, 발현된 단백질을 수거하고, 임의로 정제한다. 달라, 목적하는 단백질을 발현하는 세포는 관류 배양으로 성장시킬 수 있는데, 이때 배양은 종료하지 않으며, 발현된 단백질을 주기적으로 또는 계속적으로 수거하는 동안에, 새로운 영양물 및 다른 성분들을 주기적으로 또는 계속적으로 배양물에 첨가한다.
세포들을 시딩한 후, 이들은 성장기를 거치며, 이 동안에 세포들의 수는 기하급수적으로 증가한다. 성장기 동안에, 세포 배양의 온도 또는 온도 범위는, 주로 세포 배양물이 생존을 유지하는 온도 또는 온도 범위, 고 수준의 단백질이 생산되는 온도 또는 온도 범위, 대사 폐기물의 생산 또는 축적이 최소화되는 온도 또는 온도 범위, 및/또는 이들 요인 또는 실험자에게 중요하다고 생각되는 기타 요인의 임의의 조합에 근거하여 선택될 것이다. 하나의 비-제한적 예로서, CHO 세포는 37℃에서 잘 성장하고 고 수준의 단백질을 생산한다. 일반적으로, 대부분의 포유동물 세포는 약 25℃ 내지 42℃의 범위 내에서 잘 성장하고/하거나 고 수준의 단백질을 생산하지만, 본원에 교시된 방법들이 이들 온도에 제한되지 않는다. 특정 포유동물 세포는 약 35℃ 내지 40℃의 범위 내에서 잘 성장하고/하거나 고 수준의 단백질을 생산할 수 있다. 특정 양태에서, 세포 배양물은, 성장기 동안에 1회 이상, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 또는 45℃에서 성장시킨다. 당업자는 세포의 필요성 및 실험자의 제조 요건에 따라 세포를 성장시키기에 적당한 온도 또는 온도 범위를 선택할 수 있을 것이다.
성장기 후는 세포가 주변에서 일어나는 모든 변화, 예를 들어 온도 변화에 적응하는 전이기이다. 일어난 변화는 통상적으로 생산기를 위한 매개변수이다. 본 발명의 실시예에서, 4일째에, 온도는 약 37℃로부터 약 31℃로 감소하였다. 그러나, 온도 전이는 1회 이상 일어날 수 있고, 반드시 하향으로 일어날 필요는 없다. 더구나, 전이기 및 온도 전이는 생산 공정의 수행 중의 어느 날에도 일어날 수 있다. 비록 대부분의 생산 방법이 다중-기 공정을 포함하지만, 카르노신은 단일기 공정에서 이용될 수도 있다.
배양 온도가 전이될 때, 온도 전이는 비교적 점진적일 수 있다. 예를 들면, 온도 변화가 끝나는데 수 시간 또는 수일이 걸릴 수 있다. 달리, 온도 전이는 비교적 갑작스러울 수 있다. 온도는 배양 공정 중에 꾸준히 증가하거나 또는 감소할 수 있다. 달리, 온도는 배양 공정 중 다양한 시기에 불연속적 양으로 증가하거나 감소할 수 있다. 후속적 온도 또는 온도 범위는 최초 또는 이전 온도 또는 온도 범위보다 더 낮거나 더 높을 수 있다. 당업자는 다중 불연속 온도 전이가 이들 양태에 포함된다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 온도가 일단 전이 (더 높거나 낮은 온도 또는 온도 범위로)되면, 세포가 이 온도 또는 온도 범위에서 일정 기간 동안 유지될 것이며, 이 후에 온도가 이전 온도 또는 온도 범위보다 더 높거나 낮은 새로운 온도 또는 온도 범위로 다시 전이될 수 있다. 각각의 불연속 전이 후 배양 온도는 일정할 수 있거나 일정 범위의 온도 내에서 유지될 수 있다.
최종적으로, 세포 수는 실질적으로 증가하지 않으나, 세포가 목적하는 단백질 생성물을 생산하는 생산기가 있다. 그러나, 당업자는 특정 양태에서 생산기 동안에 세포가 성장을 계속하여, 수가 증가될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 생산기 동안에, 생물반응기의 환경은 세포가 더 생산적일 수 있는 조건에서 제어된다. 예를 들면, 온도는 일반적으로 성장기에서와는 상이한, 단백질 생성물의 생산에 유리한 온도, 예를 들면 31℃에서 유지된다. 생산 공정의 수행 전반에 걸쳐, 세포가 필요로 하는 영양물 및 보충물을 함유하는 공급 배지에 세포가 공급될 수 있다. 예를 들면, 특정 경우에, 후속적 생산기 동안에, 세포에 의해 고갈되었거나 대사된 영양물 또는 다른 배지 성분들을 세포 배양물에 보충하는 것이 유리하거나 필요할 수 있다. 비-제한적 예로서, 세포 배양물에 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 특정 이온 (예: 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충물, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량원소 (통상적으로 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질, 글루코스 또는 다른 에너지원을 보충하는 것이 유리하거나 필요할 수 있다. 이들 보충 성분들은 전부 한 번에 세포 배양물에 첨가될 수 있거나, 일련의 첨가로 세포 배양물에 제공될 수 있다. 특정 양태에서, 항-노화 화합물은 생산기 동안에 1회 이상 공급 배지에 제공된다.
특정 양태에 따르면, 항-노화 화합물, 예를 들면 카르노신을 생산기 동안에 접종 배지 또는 공급 배지로 제공되는 세포 배양 배지 중에 사용하면, 세포 생존력 및/또는 특이적 단백질 생산이 증가되므로, 생산된 단백질의 전체 수율이 향상된다.
단백질 생산 공정의 양상은 세포 배양 분야의 당업자에 의해 측정된다. 위에 언급된 것들을 포함하여, 특히 시드(seed) 밀도, 생산 배양의 기간, 수거 중의 작업 조건과 같은 매개변수가 세포주 및 세포 배양 배지의 함수이다. 그러므로, 매개변수들은 과도한 실험 없이 세포 배양 분야의 당업자에 의해 측정될 수 있다.
성장기 동안의 온도 또는 온도 범위와 같이, 생산기 동안의 세포 배양의 온도 또는 온도 범위는 주로, 세포 배양물이 생존을 유지하는 온도 또는 온도 범위, 고 수준의 단백질이 생산되는 온도 또는 온도 범위, 대사 폐기물의 생산 또는 축적이 최소화되는 온도 또는 온도 범위, 및/또는 이들 요인 또는 실험자에게 중요하다고 생각되는 기타 요인의 임의의 조합에 근거하여 선택될 것이다. 일반적으로, 대부분의 포유동물 세포는 약 25℃ 내지 42℃의 범위 내에서 생존을 유지하고 고 수준의 단백질을 생산하지만, 본원에 교시된 방법들이 이들 온도에 제한되는 것은 아니다. 특정 양태에서, 포유동물 세포는 약 25℃ 내지 35℃의 범위 내에서 생존을 유지하고 고 수준의 단백질을 생산한다. 특정 양태에서, 세포 배양물은, 생산기 동안에 1회 이상, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45℃의 온도에서 성장시킨다. 당업자는, 세포의 특정 필요성 및 실험자의 특정 제조 요건에 따라, 생산기 동안에 세포를 성장시킬 수 있는 적당한 온도 또는 온도 범위를 선택할 수 있을 것이다. 세포는 실험자의 필요성 및 세포 자체의 요건에 따라 임의의 시간 동안 성장될 수 있다.
특정 양태에서, 배치 배양 또는 공급-배치 배양은, 실험자의 필요에 의해 측정시, 배양물이 하나 이상의 관련 배양 조건을 달성하면, 종료된다. 특정 양태에서, 배치 배양 또는 공급-배치 배양은, 발현된 단백질이 충분히 높은 역가에 도달하고/하거나, 세포 밀도가 충분히 높은 수준에 도달하고/하거나, 발현된 단백질이 충분히 높은 세포 밀도에 도달하고/하거나, 원치 않는 대사 폐기물 (예: 락테이트 및/또는 암모늄)의 생산 또는 축적을 방지하게 되면, 종료된다. 당업자는, 실험적, 상업적 및/또는 기타 고려 사항을 토대로 하여 언제 배치 배양 또는 공급-배치 배양을 종료해야 하는지를 결정하는데 사용될 수 있는 기타 관련 배양 조건을 알 것이다.
특정 양태에서, 생산 공정의 수행 후, 단백질 생성물을 세포 배양 배지로부터 회수하고, 전통적인 분리 기법을 사용하여 추가로 분리한다. 예를 들면, 단백질은 처음에 원심분리에 의해 분리되어, 단백질을 함유하는 상청액이 보유될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 단백질 생성물은 숙주 세포의 표면에 결합될 수 있다. 이러한 양태에서, 배지가 제거되고, 단백질을 발현하는 숙주 세포를 정제 공정 중의 제1 단계로서 용출시킨다. 포유동물 숙주 세포의 용해는 당업자에게 공지된 수많은 임의의 수단, 예를 들어 유리 구슬에 의한 물리적 파괴 및 높은 pH 상태에의 노출에 의해 달성될 수 있다.
통상의 단백질 정제 방법을 사용하여, 단백질을 추가로 분리할 수 있다. 목적하는 단백질을 분리하고 정제하는 방법은 세포 배양 분야에 공지되어 있다. 구체적 방법은 사용된 세포주 및 추구하는 생성물에 따라 정해진다.
항-노화 화합물, 예를 들어 카르노신은 특정 세포 배양 공정에 최적인 시기에 배양 배지에 첨가될 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 카르노신의 첨가는 성장기가 실질적으로 완료된 후 전이기에 있을 때 이루어진다. 첨가 중에, 세포 배양 배지는 온도 전이로 인한 새로운 온도에 적응한다. 전이기는 일반적으로, 생산기를 개시시키기 위하여 제제를 첨가하는 때이다. 그러나, 카르노신은, 성장기 및 생산기를 포함하여, 최적 결과를 낳는 생산 공정의 수행 중에 임의의 시점에 첨가될 수 있다. 또한, 카르노신은 다른 성분, 예를 들어 공급 배지와 함께 첨가될 수 있다. 특정 양태에서, 항-노화 화합물은 접종 배지 중에 제공되고, 세포 배양 전체 공정 동안에 세포 배양물에 존재한다. 특정 양태에서, 2 이상의 항-노화 화합물이 세포 배양 배지에 제공된다. 특정 양태에서, 2 이상의 항-노화 화합물이 접종 배지에 제공되고, 세포 배양 전체 공정 동안 세포 배양물에 존재한다. 특정 양태에서, 2 이상의 항-노화 화합물이 제공되는데, 이때 하나의 항-노화 화합물은 접종 배지에 제공되어 세포 배양 전체 공정 동안에 세포 배양물에 존재하는 한편, 다른 항-노화 화합물은 세포 배양이 시작된 후 제공된다.
특정 양태에서, 세포 배양물에 존재하는 항-노화 화합물의 농도는 다양한 세포 유형 및 생성물에 따라 상이하다. 특정 양태에서, 존재하는 카르노신의 농도는 다양한 세포 유형 및 생성물에 따라 상이하다. 일반적으로, 농도는 독성 효과 없이 생산성 및 품질을 향상시키기에 충분하다. 본 발명의 실시예에서, 상기 범위는 5 mM 내지 100 mM을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 사용된 카르노신의 농도는 세포 배양 배지에 따라 달라질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 특정 세포주에 대한 카르노신의 적당한 농도는 통상의 소규모 실험, 예를 들어 2L 생물반응기를 이용한 통상의 방법에 의해 측정할 필요가 있을 수 있다. 당업자는, 당업계에 공지된 세포 배양 기법 및 진단 방법을 사용하여 과도한 실험 없이 카르노신 또는 다른 항-노화 화합물의 유리한 또는 최적 농도를 결정할 수 있을 것이다.
다른 화학 제제가 아닌 카르노신 또는 다른 항-노화 화합물을 첨가하는 한 가지 이점은 생존력에 대한 효과이다. 통상적으로, 나트륨 부티레이트와 같은 화학 제제를 첨가하면, 세포 성장은 중지되고 생존 세포 수는 감소한다 [참조 문헌: Kim et al. Biotechnol Bioeng, 71 : 184-193,184]. 그러나, 후술하는 실시예는 세포 배양 배지에 카르노신을 첨가하면, 카르노신과 같은 항-노화 화합물의 부재하에 성장시킨 세포 배양물에서 관찰되는 것보다 수거시에 생존력이 더 높아진다는 것을 입증한다. 게다가, 이러한 카르노신-함유 세포 배양물은 비생산성의 증가를 나타낸다. 세포 생존력 및 비생산성에 미치는 양성 효과 덕택에, 전반적인 수율이 높아진다.
또 다른 이점은, 카르노신과 같은 항-노화 화합물이 고분자량 응집체의 양 및/또는 산성 종의 수를 감소시킨다는 것이다. 고분자량 응집체 및 산성 종의 감소는 단백질 생성물의 정제를 단순화한다. 단백질을 보다 효율적으로 분리할 수 있게 되면, 단백질 생성물을 제조하는 비용이 절감된다. 특정 양태에서, 카르노신 이외의 항-노화 화합물을 사용하여 고분자량 응집체 및/또는 산성 종의 양을 감소시킨다. 특정 양태에서, 2 이상의 항-노화 화합물을 사용하여 고분자량 응집체 및/또는 산성 종의 양을 감소시킨다.
특정 양태에서, 세포를, 2005년 8월 25일에 각기 출원된 미국 특허 제11/213,308호, 제11/213,317호 및 제11/213,633호에 기재되고, 본원에 참조로서 전문이 인용된 세포 배양 방법들 중의 어느 하나에 따라 성장시킨다. 예를 들면, 특정 양태에서, 세포를 누적 아미노산 농도가 약 70 mM을 초과하는 배양 배지에서 성장시킬 수 있다. 특정 양태에서, 세포를 누적 글루타민 대 누적 아스파라긴 몰비가 약 2 미만인 배양 배지에서 성장시킬 수 있다. 특정 양태에서, 세포를 누적 글루타민 대 누적 총 아미노산 몰비가 약 0.2 미만인 배양 배지에서 성장시킬 수 있다. 특정 양태에서, 세포를 누적 무기 이온 대 총 아미노산 몰비가 약 0.4 내지 1인 배양 배지에서 성장시킬 수 있다. 특정 양태에서, 세포를 누적 글루타민 및 누적 아스파라긴 배합 농도가 약 16 내지 36 mM인 배양 배지에서 성장시킬 수 있다. 특정 양태에서, 세포를 전술한 배지 조건 중의 2, 3, 4 또는 5개 모두를 함유하는 배양 배지에서 성장시킬 수 있다. 이러한 배지를 사용하면, 단백질을 고 수준으로 생산할 수 있고, 원치 않는 특정 인자, 예를 들어 암모늄 및/또는 락테이트의 축적을 감소시킬 수 있다.
일부 양태에서, 세포는, 2006년 7월 13일에 출원된 미국 임시 출원 제60/830,658호에 기재되고, 본원에 참조로 인용된 하나 이상의 조건하에 성장시킨다. 예를 들면, 일부 양태에서, 세포는 약 10 내지 600 nM 농도의 망간을 함유하는 배양 배지에서 성장시킨다. 일부 양태에서, 세포는 약 20 내지 100 nM 농도의 망간을 함유하는 배양 배지에서 성장시킨다. 일부 양태에서, 세포는 약 40 nM 농도의 망간을 함유하는 배양 배지에서 성장시킨다. 당단백질을 증식하는데 이러한 배지를 사용하면, 글리코실화 패턴 (예컨대, 하나 이상의 올리고당 쇄 중에 대단히 많은 수의 공유결합된 당 잔기)이 향상된 당단백질이 생산된다.
본 발명의 특정 양태에서, 하나 이상의 본 발명의 방법에 따라 제조된 단백질은 약리학적 활성을 가질 것이며, 약제를 제조하는데 유용할 것이다. 하나 이상의 본 발명의 방법에 따라 제조된 단백질은 피험자에게 투여될 수 있거나, 또는 먼저, 이용가능한 경로, 예를 들어 비경구 (예: 정맥내), 피내, 피하, 경구, 경비, 기관지, 안내, 경피 (국소), 경점막(transmucosal), 직장 및 질 경로 등에 의한 투약을 위해 제형화될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 통상적으로, 포유동물 세포주로부터 발현된 정제된 단백질, 및 전달제 (즉, 상기한 바와 같은 양이온성 중합체, 펩티드 분자 수송체, 계면활성제 등)를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함한다. 본원에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"란 표현은 약제 투여에 적합한 용매, 분산 매질, 피복재, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 또한, 보충 활성 화합물들이 당해 조성물 중에 혼입될 수 있다.
약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로에 적합하게 제형화된다. 이러한 제형은 당업자에게 공지되어 있다. 특정 양태에서, 본 발명에 따라 생산된 단백질은 경구 및/또는 비경구 형으로 제형화된다. 특정 양태에서, 투여를 용이하게 하고 용량을 균일하게 하기 위하여, 이러한 경구 및/또는 비경구 형은 단위 용량형으로 제형화되는데, 이때 각 단위는 요구된 약제학적 담체와 관련하여 목적하는 치료 효과를 일으키도록 계산된 활성 단백질의 예정량을 함유한다. 당업자는 본 발명에 따라 생산된 단백질에 적당한 단위 용량 제형을 알 것이다.
특정 양태 및 양상이 위에서 상세히 설명되었다. 본 발명은 아래의 비-제한적 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다. 그러나, 당업자는 이들 앙태에 대한 다양한 변형이 첨부된 청구범위의 범위에 속한다는 것을 이해할 것이다. 카르노신 및/또는 다른 항-노화 화합물의 첨가가 다른 포유동물 세포 배양 및 단백질 생성물에 마찬가지로 적용될 수 있다는 점에 유념한다. 본 발명의 범위를 한정하는 청구범위 및 이의 균등물은 상기와 같은 특정 양태의 설명에 또는 이에 의해 제한되지 않으며 제한되어서도 안된다.
실시예 1
디쉬 스케일 카르노신 실험
MYO-29 세포주를, 1 L 작업 용적의 생물반응기 내의 무혈청 생산 배지에서 배양하였고, 4일째에 온도를 37℃로부터 31℃로 전이시켰다. 생물반응기의 pH를 7.00에서 유지하였고, 용존 산소는 30% 공기 포화도였다. 이어서, 세포 배양 배지를 4일째, 7일째, 및 10일째에 생물반응기로부터 채취하여, 8 ml 작업 용적의 배양 디쉬 속에 넣고, 31℃ 항온처리기(incubator) 속에 두었으며, 이곳에서 디쉬 배양물을 12일까지 배양하였다. 5일 및 7일째에, 세포에 공급 배지를 보충하였다. 5일째에, 10 %(v/v)의 공급 배지를 세포 배양물에 첨가하고, 7일째에, 5%(v/v)의 공급 배지를 세포 배양물에 첨가하였다. 10 mM의 카르노신을 4일, 7일, 및 10일째에 각각 디쉬에 첨가하고, 세포 배양 배지를 12일째에 수거하였다.
도 1a는 7일째의 배양물에서 산성 피크의 양에 미치는 카르노신의 첨가 효과를 보여준다. 도 1b는 배양 7일째에 고분자량 응집체에 미치는 카르노신의 효과를 보여준다. 도 1c는 4일째, 7일째, 10일째에, 산성 피크에 미치는 카르노신의 효과를 보여준다. 도 1d는 고분자량 응집체를 제외하고는 동일한 실험 결과를 보여준다. 전반적으로, 카르노신은 배양 디쉬에서 산성 피크 및 고분자량 응집체 둘 모두를 감소시키는 양성 효과를 가졌다.
실시예 2
카르노신을 세포 배양 배지에 첨가한 효과
5개의 생물반응기에, 무혈청 접종 배지 중의 1 L 작업 용적의 MYO-29 세포를 이용하여 0.9 x106 세포/ml로 접종하였다. 모든 생물반응기에, 14일간의 수행 중 3, 5, 7, 및 12일째에 5% (v/v)의 공급 배지를 공급하였다. 10일째에, 5% (v/v)의 공급 배지를 2개의 대조군 생물반응기 및 카르노신을 함유하는 생물반응기에 첨가하였다. 생물반응기의 조건은 온도 37℃, pH 7.00, 및 용존 산소 수준 30% 공기 포화도로 유지되었다. 교반 속도는 200 rpm이고, 살포 가스는 공기와 7% 이산화탄소의 배합물을 함유하였다.
모든 세포를 4일간 배양하였으며, 이 시점에 20 mM의 카르노신을 2개의 생물반응기에 첨가하였으며, 대조군에는 카르노신이 첨가되지 않았고, 또한 4일째에 모든 생물반응기에서 온도를 31℃로 전이시켰다. 생산 공정의 수행 중의 14일째에 생물반응기를 수거하였다. 샘플을 작업 수행 내내 채취하여 세포 배양 배지의 진행을 모니터하였다. 대조군은 기대한 바와 같이 수행되었다.
도 2a는 1일 생존 세포 밀도를 보여준다. 도 2b는 카르노신을 함유한 생물반응기의 1일 세포 생존력이, 카르노신을 함유하지 않는 2개의 생물반응기에 비해, 수거시에 더 높다는 것을 보여준다. 도 2c는 생물반응기의 1일 역가를 보여주고, 카르노신이 존재하는 2개의 생물반응기가 수거시에 더 높은 역가를 가진다는 것을 보여준다. 카르노신을 함유한 배양물은 도 2d에 제시된 바와 같이 우수한 누적 특이적 세포 생산성을 가졌다. 도 2e는 고분자량 응집체의 양을 보여주고, 또한 카 르노신이 존재하는 생물반응기 내에서 고분자량 응집체가 감소함을 보여준다.
실시예 3
상이한 농도의 카르노신 첨가의 효과
4개의 생물반응기에, 무혈청 접종 배지 중의 1 L 작업 용적의 MYO-29 세포주를 이용하여 0.4 x 106 세포/ml로 접종하였다. 모든 생물반응기에, 14일간의 수행 중 7일째에 5% (v/v)의 공급 배지를 공급하였다. 생물반응기의 조건을 온도 37℃, pH 7.00, 및 용존 산소 수준 30% 공기 포화도로 유지하였다. 교반 속도는 200 rpm이였고, 살포 가스는 공기와 7% 이산화탄소의 배합물을 함유하였다.
모든 세포를 4일간 배양하고, 이 시점에 모든 생물반응기에서 온도를 31℃로 전이시켰다. 또한, 4일째에, 20 mM의 카르노신을 하나의 생물반응기에 첨가하고, 또 다른 생물반응기에는 40 mM의 카르노신을 첨가하고, 대조군에는 카르노신을 전혀 첨가하지 않았다. 모든 생물반응기를 생산 공정의 수행 중의 12일째에 수거하였다. 샘플을 작업 수행 내내 채취하여 세포 배양 배지의 진행을 모니터하였다. 하나의 대조군이 전에 관측된 것보다 1일 생존력이 다소 낮아졌다는 것을 제외하고는, 대조군들은 기대된 바와 같이 수행되었다.
도 3a는 1일 생존 세포 밀도를 보여주며, 상이한 생물반응기가 40 mM의 카르노신을 함유하는 생물반응기를 제외하고는, 상당히 유사하다. 도 3b는 카르노신을 함유하는 생물반응기의 1일 세포 생존력이, 카르노신을 함유하지 않는 2개의 대조 군 생물반응기에 비해, 수거시에 더 높은 생존력을 가졌다는 것을 보여준다. 도 3c는 1일 역가를 보여준다; 카르노신이 첨가된 생물반응기와 하나의 대조군이 유사하였다. 40 mM의 카르노신을 함유하는 생물반응기가 더 높은 누적 특이적 세포 생산성을 가졌다 (도 3d). 도 3e는 고분자량 응집체의 양을 보여준다; 전반적으로, 대조군에 비해 카르노신이 첨가된 경우에, 고분자량 응집체가 감소되었다.
비록 본 발명의 일부 양태가 본원에 기재되었지만, 상기한 내용은 단지 설명을 위한 것이다. 본원에 기재된 양태의 추가적 변형이 세포 배양 분야의 당업자에게는 명백하며, 이러한 모든 변형이 첨부된 청구범위에 의해 한정된 바와 같은 양태의 범위에 속한다고 생각된다.

Claims (51)

  1. 목적 단백질을 암호화하며 세포 배양의 조건하에 발현되는 유전자로 형질전환된 포유동물 세포를, 카르노신(carnosine), 아세틸-카르노신, 호모-카르노신, 안세린(anserine), 및 β-알라닌으로부터 선택되는 항-노화 화합물을 5mM 내지 100mM의 농도로 포함하는 세포 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 단백질을 발현하기에 충분한 조건 및 시간하에 배양물을 유지하는 단계를 포함하고,
    이때, 상기 세포 배양물이 항-노화 화합물이 결여된 것 말고는 동일한 배지의 동일한 조건하에 관찰되는 상응하는 세포 배양 특징과는 상이한 개선된 세포 배양 특징을 나타내고, 상기 개선된 배양 특징이 역가의 증가, 세포 비생산성(specific productivity)의 증가, 고분자량 응집체의 축적 감소, 산성 종(acidic species) 축적의 감소, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 세포 배양으로 단백질을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-노화 화합물이 카르노신인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 CHO 세포인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질이 항체인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체가 IgG 동종형인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 항체가 재조합 사람 항체인, 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 항체가 성장 분화 인자-8 (GDF-8) 또는 이의 에피토프와 특이적으로 반응하는 것인, 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 재조합 항체가 BMP-11에 특이적으로 결합하는 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항-노화 화합물의 농도가 10 mM 내지 4O mM인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항-노화 화합물의 농도가 2O mM인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항-노화 화합물이 공급 배지와 함께 첨가되는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 수거시에 세포 생존력이 유지되는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질의 생산이 증가되는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질의 세포 비생산성이 증가되는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질의 품질이 고분자량 응집체가 감소됨으로써 증가되는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질의 품질이 산성 종이 감소됨으로써 증가되는, 방법.
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