RU2134120C1 - Средство для стабилизации пептидной связи в белковом препарате - Google Patents

Средство для стабилизации пептидной связи в белковом препарате Download PDF

Info

Publication number
RU2134120C1
RU2134120C1 RU95110533A RU95110533A RU2134120C1 RU 2134120 C1 RU2134120 C1 RU 2134120C1 RU 95110533 A RU95110533 A RU 95110533A RU 95110533 A RU95110533 A RU 95110533A RU 2134120 C1 RU2134120 C1 RU 2134120C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
peptide
carnosine
homocarnosine
stabilization
sterilization
Prior art date
Application number
RU95110533A
Other languages
English (en)
Other versions
RU95110533A (ru
Inventor
Е.Ю. Безрукова
Original Assignee
Безруков Михаил Васильевич
Безрукова Елена Юрьевна
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Безруков Михаил Васильевич, Безрукова Елена Юрьевна filed Critical Безруков Михаил Васильевич
Priority to RU95110533A priority Critical patent/RU2134120C1/ru
Publication of RU95110533A publication Critical patent/RU95110533A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2134120C1 publication Critical patent/RU2134120C1/ru

Links

Images

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а именно к стабилизации белковых препаратов при их термической стерилизации и хранении. Сущность изобретения: в качестве средства для стабилизации используют карнозин и/или гомокарнозин. Средство также может содержать одну или несколько аминокислот, а также один или несколько инертных наполнителей. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для стабилизации белково-пептидных препаратов. 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл.

Description

Изобретение относится к области фармацевтической и пищевой промышленности, а именно к применению карнозина и/или гомокарнозина для стабилизации белковых и пептидных препаратов при их термической стерилизации и хранении.
Известно, что для стерилизации фармацевтических и пищевых препаратов используют разнообразные виды термической обработки, асептическую фильтрацию, а также радиационное воздействие [1].
Проводить термическую стерилизацию белковых и пептидных препаратов, как правило, невозможно из-за того, что при повышенных температурах (от 40oC) пептиды и белки могут модифицироваться и превращаться в сложные смеси [2]. Аналогичные реакции модификации и распада пептидов и белков происходят и при хранении [3].
Существенную роль в разрушении первичной структуры пептидов и белков играют усиливающиеся при нагревании в присутствии нуклеофильных и электрофильных реагентов реакции транспептидации, разрыва пептидных связей, N--->O-ацильной миграции, реакции окисления ряда аминокислот и др. Особенно интенсивно эти процессы протекают при наличии в структуре белков и пептидов трифункциональных аминокислот, таких как Asn, Asp, Gln, Glu, Ser и Thr. Так, при наличии в пептидах или белках последовательностей AspGly, AspAla, AspSer и др. происходит образование циклических имидов с последующей транспептидацией аспарагиновой кислоты и дальнейшим образованием аминосукцинильных производных или разрывом пептидных связей [4].
Побочные реакции пептидов и белков, содержащих глутаминовую кислоту, также обусловлены наличием свободной карбоксильной группы: ее способностью образовывать циклические производные [5] , сложные ЭФИРЫ и дезамидировать амидные функции других аминокислот за счет протонирования.
Амиды аспарагиновой и глутаминовой кислот, содержащиеся в пептидных и белковых препаратах, способны претерпевать дезамидирование до соответствующих кислот [4] . Кроме того, под воздействием высоких температур они могут участвовать в реакциях модификации и разрыва пептидных связей [2,5,6],
При наличии в структуре белковых и пептидных препаратов серина или треонина могут протекать реакции N--->O-ацильной миграции, которые усиливаются при повышении температуры.
На сегодняшний день неизвестно средство, позволяющее подавлять реакции транспептидации, N--->O-ацильной миграции и окисления и стабилизировать белки и пептиды при термической стерилизации и хранении.
Описываемое изобретение предлагает использовать для стабилизации в твердой фазе белковых и пептидных препаратов при их термической стерилизации и хранении карнозин и/или гомокарнозин.
При этом могут быть использованы твердые композиции пептидного или белкового препарата только с карнозином и/или гомокарнозином, или с карнозином и/или гомокарнозином совместно с одной или несколькими аминокислотами; или с карнозином и/или гомокарнозином совместно с инертными наполнителями; или с карнозином и/или гомокарнозином одновременно с одной или несколькими аминокислотами и инертными наполнителями.
В качестве аминокислот могут быть использованы, в частности, глицин, валин и др.
В качестве пептидного препарата может быть использован пептид δ- -сна или его аналоги, окситоцин, аспарагиназа и др.
Карнозин β- AlaHis) [7] и гомокарнозин γ- AbuHis) [8] являются известными соединениями. Данные об их медицинских применениях широко известны и систематизированы в обзоре (9]. Карнозин и гомокарнозин применяют при полиартритах, повышенном кровяном давлении, ишемической болезни сердца, язвенных заболеваниях, нарушениях функции надпочечников, кожных заболеваниях, как ранозаживляющее средство, в качестве противовоспалительного средства, лечебного питания, при катаракте, как бактерицидное и бактериостатическое средство, в качестве противоопухолевого средства при неоперабельном раке молочной железы и др. Описано также применение карнозина и гомокарнозина в качестве антиоксидантов, предотвращающих перекисное окисление липидов и коллагена [10, 11, 12]. Считается, однако, что биологическая роль карнозина и его аналогов неясна и по сей день [13] . Использование карнозина и гомокарнозина для стабилизации первичной структуры белковых и пептидных препаратов при их стерилизации и хранении неизвестно. Стерилизация пептидных и белковых фармпрепаратов и пищевых добавок необходима в виду того, что они легко разрушаются микроорганизмами при хранении и могут быть источником размножения последних [3].
Карнозин и гомокарнозин используются для стабилизации пептидного и белкового препарата следующим образом. Готовят композиции, которые состоят из стабилизируемых пептида или белка, карнозина и/или гомокарнозина, аминокислот(ы) и общеприменимых нейтральных наполнителей (например, стеарата натрия, бензоата натрия, талька, лактозы, крахмала, метилцеллюлозы, солей и т.д.) и используют такие композиции для термической стерилизации пептидов и белков в стандартных общепринятых для стерилизации фармпрепаратов условиях [1].
Композиции, содержащие карнозин или гомокарнозин в качестве стабилизаторов, приготавливают следующим образом. Пептид или белок, карнозин и/или гомокарнозин, аминокислоту (аминокислоты) растворяют в воде, лиофилизуют и/или упаривают, а затем стерилизуют.
Содержание основного вещества и примесей в стерилизованном препарате определяют при помощи ВЖХ или других экспериментальных методов. Композиции, обеспечивающие стабилизацию пептида или белка, используют для стерилизации и хранения.
Обычный интервал работы с пептидами и белками включает температуры 0-40oC, т. к. известно, что при более высоких температурах может происходить быстрый распад пептидов и белков. Проведенные эксперименты показали, что твердые композиции, содержащие карнозин и/или гомокарнозин, позволяют проводить термическую стерилизацию пептидов и белков вплоть до температур 120-130oC без заметной транспептидации, N--->O-ацильной миграции и окисления, а кроме того, обеспечивают их хранение.
Применение карнозина и/или гомокарнозина позволяет предотвратить типичные процессы модификации пептидных связей, протекающие с участием аминокислот Asp, Asn, Glu, Gln, Ser, Thr, и окисления.
Стабилизация пептидов и белков в присутствии карнозина, гомокарнозина и аминокислоты (аминокислот) обусловлена, по-видимому, образованием в твердом состоянии сложных молекулярных ассоциатов, включающих стабилизируемый пептид или белок, карнозин и/или его аналог и аминокислоту. Стабилизация белков и пептидов в таких ассоциатах по-видимому обусловлена образованием межмолекулярных солевых и водородных связей, препятствующих модификации пептидной цепи и разрушению аминокислот (см. фиг.1). Удивительным является тот факт, что при использовании таких композиций наряду со стабилизацией пептидных связей в твердых композициях сохраняются антиоксидантные свойства карнозина и гомокарнозина, препятствующие окислению триптофана. Полученные результаты по стабилизации пептидов и белков являются неожиданными также с учетом того, что аминокислоты, употребляемые в качестве стабилизирующих добавок, обладают амфотерным характером и имеют в своем составе нуклеофильную аминогруппу и электрофильную карбоксильную группу, способные катализировать обычные реакции, протекающие с аминокислотными остатками в присутствии нуклеофилов и электрофилов. С учетом того, что имидазольный остаток гистидина является катализатором гидролиза амидов и переноса ацильных групп [14], стабильность композиций по отношению к высоким температурам представляется неочевидной.
Более высокая стабильность композиций из нескольких компонентов, наблюдаемая в ряде случаев, по-видимому свидетельствует о необходимости для стабилизации нескольких типов водородных связей. В литературе отсутствуют данные о том, что карнозин или гомокарнозин отдельно или в смеси с аминокислотами способны стабилизировать при стерилизации при 60-130oC в течение 0,5-8 часов твердые композиции в условиях, обеспечивающих обеспложивание препаратов от микроорганизмов с сохранением структуры и необходимого качества пептидных и белковых препаратов.
В качестве наиболее яркого примера для исследования стабилизирующего действия карнозина, гомокарнозина и аминокислот был выбран пептид δ- сна, структуры TrpAlaGlyGlyAspAlaSerGlyGlu, содержащий в своем составе способные модифицироваться остатки амино кислот Trp, Asp, Ser. Остаток триптофана, содержащийся в пептиде, способен легко претерпевать окислительные превращения [6], с участием аспарагиновой кислоты легко протекают реакции образования аминосукцинильных производных и транспептидации [4], с участием остатка серина могут происходить процессы N--->О-ацильной миграции [5], совокупность этих процессов приводит к быстрому разрушению пептида под действием высоких температур.
Кроме того, интерес к изучению стабилизирующего действия карнозина и/или гомокарнозина на пептид δ- сна обусловлен и широким спектром биологической активности последнего. Так, пептид δ- сна обладает противострессорным, сомногенным, противоалкогольным, антиметастатическим, антинаркотическим, противоэпилептическим, адаптогенным действием, способен усиливать иммунный ответ [15].
Эксперименты по подбору условий стерилизации, в которых вышеупомянутый пептид стабилен, проводились с использованием композиций, содержащих пептид δ- сна, состав которых приведен в таблице. Смеси, содержащие пептид δ- сна, нагревали до 60, 103, 120oС и выдерживали при этих температурах в течение времени, необходимого для стерилизации [1]. Для сравнения использовались пептид δ- сна (композиция 14) и его смесь с глицином (композиция 01). По данным ВЖХ на обращенной фазе при помощи интегратора определяли относительное увеличение количества примесей в каждой композиции и сравнивали его с количеством примесей в исходном пептиде δ- сна. Композиции, содержащие в своем составе глицин, карнозин и пептид δ- сна, оказались стабильными при проведении стерилизации при 105oC в течение 2 часов, количество примесей, появившихся в них при такой обработке, не превосходило 1%. В то же время, при нагреве исходного пептида δ- сна до 120oC в течение 2 часов общее количество примесей, образовавшихся в препарате, составляет 30-55%, что доказывает невозможность термической стерилизации пептидов в отсутствии стабилизаторов.
При помощи масс-спектрометрии и ЯМР 1H спектроскопии было показано, что примеси, возникающие при термической обработке композиций, включающих пептид δ- сна, карнозин и/или гомокарнозин и аминокислоты, в основном обусловлены образованием аминосукцинильных производных аспарагиновой кислоты и транспептидацией с ее участием. Модификаты, возникающие при окислении триптофана пептида δ- сна, элюируются перед основным пиком, а аминосукцинильные производные - после него.
Наилучшие результаты по стабилизации пептида δ- сна были получены при использовании препаратов, содержащих в качестве стабилизаторов карнозин и глицин. Такие же композиции были использованы для стабилизации окситоцина и аспарагиназы.
Результаты по изучению термической стабильности пептидов, полученные с помощью обращеннофазовой ВЖХ, приведены в таблице. Хроматографию осуществляют на колонке 0,46 • 4,5 см с Ultrasphere ODS, Детекцию производят при 226 нм. Пептиды элюируют в градиенте 0--->80% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте при скорости элюирования 1,5 мл/мин. Качество препаратов оценивают по разности площадей (в процентах) пиков, характеризующих содержание примесей, появившихся в пептидном препарате после стерилизации и имевшихся в нем до нее. Пики карнозина, гомокарнозина, аминокислот и инертных наполнителей при обсчете не учитывают. Для этого детектирование начинают после элюирования выходящих со свободным объемом аминокислот и карнозина или гомокарнозина (см. фиг. 2-4, 6).
На фиг. 1 изображены структуры, объясняющие механизм стабилизации остатков Asp и Ser в пептиде δ- сна в присутствии карнозина или гомокарнозина.
На фиг. 2 изображена хроматограмма композиции 01, содержащей пептид δ- сна и глицин до стерилизации.
На фиг. 3 помещена хроматограмма композиции 01 после стерилизации при 120oC в течение 2-х часов.
На фиг. 4 помещена хроматограмма композиции 02, содержащей пептид δ- сна, карнозин и глицин, после стерилизации при температуре 120oC в течение 2-х часов.
На фиг. 5 изображена хроматограмма композиции 10, содержащей пептид δ- сна и карнозин, после стерилизации при 120oC в течение 2-х часов, причем, в данном случае была произведена и детекция карнозина.
На фиг. 6 изображена хроматограмма композиции 02 после стерилизации при 120oC в течение 1 часа и хранения при +45oC в термостатируемом шкафу в течение 65 дней.
Пример 1. Готовят композицию 02. Для этого 0,3 мг пептида δ- сна (содержание основного вещества 98,8%) и 5 мг глицина растворяют в 0,5 мл воды, замораживают и лиофилизуют. Лиофилизат нагревают в сушильном шкафу на воздухе 2 часа при 120oC. Композицию анализируют с помощью ВЖХ: пептид элюируют в градиенте 0--->80% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте при скорости элюирования 1,5 мл/мин, как это было описано выше, и определяют увеличение содержания примесей по сравнению с исходным лиофилизатом (см. фиг. 2 и 3 и таблицу).
Пример 2. Готовят композицию 10. Для этого 2,6 мг пептид δ- сна (содержание основного вещества 98,8%) и 15 мг карнозина растворяют в 5 мл воды, затем упаривают при 22oC в вакууме и подвергают термической обработке в течение 2 часов при 119-121oC. Качество препарата анализируют аналогично примеру 1 в градиенте 0 ---> 56% ацетонитрила в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте за 7 мин (см. фиг.5 и таблицу).
Пример 3. Готовят композицию 05. Для этого 0,5 мг пептида δ- сна, 0,85 мг гомокарнозина и 3 мг глицина растворяют в 1 мл воды, замораживают в ампуле и лиофилизуют. Нагревают 2 часа при 120oC и анализируют (см. таблицу).
Пример 4. Готовят композицию 18. Для этого растворяют в 3 мл воды 3 мг 98%-ного окситоцина, 8 мг карнозина и 30 мг глицина, замораживают и лиофилизуют. Полученный препарат стерилизуют в запаянной ампуле 0,5 часа при 103oC. Контроль качества проводят аналогично примеру 1 (см. таблицу).
Пример 5. 0,3 мг Пептида δ- сна с содержанием основного вещества 98,8%, 0,8 мг карнозина и 3 мг глицина растворяют в 1 мл воды, лиофилизуют, запаивают в 3 мл ампуле под азотом, стерилизуют при 120oC 1 час и хранят при +45oC в термостатируемом шкафу в течение 65 дней. Полученный образец хроматографируют в условиях примера 1. Содержание основного вещества в препарате составляет 97,7% (см. фиг. 6), что указывает на возможность сохранения препарата в сухом прохладном месте в течение 2 лет.
Пример 6. Готовят композицию 25. Для этого 20 мг (3000 ME) аспарагиназы, 50 мг глицина и 11 мг карнозина растворяют в 5 мл воды, лиофилизуют в ампуле и запаивают. Затем препарат подвергают тиндализации: нагревают при 60oC в течение 1 часа 5 раз. Для исходного и стерилизованного тиндализацией препарата определяют ферментативную активность аспарагиназы в 1 мг композиции в соответствии с методикой [16] . Как до, так и после тиндализации получают идентичные значения активности фермента - 34 МЕ/мг композиции.
Таким образом, как следует из данных таблицы 1, 2 и фигур, карнозин и гомокарнозин стабилизируют белковые и пептидные препараты при их стерилизации и хранении.
Источники информации
1. Государственная фармакопея СССР.- М.: Медицина 1968, с. 991 и 992.
2. Шредер Э., Любке К. Пептиды. Т.2.- М.: Мир, 1969, с.65.
3. Stewart J.M., Young J.D., Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company. -1989, 48 - 50.
4. Там же, 18-27.
5. Шредер Э., Любке К. Пептиды Т.1. - М.: Мир, 1967, с. 200-280.
6. Там же, с. 36 и 204.
7. Gulewitch V.S., Amiradgibis S., Ztsch.Physiol & Chem. - 1900, v.50, p.5.
8. Pisano J.J. et.al,, J.Biol.Chem., 1961, 236, p.p. 499-502.
9. Quinn P. J, , Boldyrev A.A., Formazyuk V.E., Molec. Aspects Med. - 1992. v.13, p. 379-444.
10. Патент Японии JP 04187610-A.
11. Международная заявка WO 90/06102.
12. Boldyrev A.A., Formazyuk V.E., Sergienko V.I., Sov.Sci. Rev., D.Phisicochem.Biol. - 1994, v.13, p. 23-31.
13. Химическая энциклопедия. Т. 2. - М.: 1990, с. 332.
14. Общая органическая химия. Т. 10. - М., 1986, с.387.
15. Mendzheritsky A. M. , Mikhalyova I.I., Makletsova M.G. Delta-sleep indusing peptide. Theoretical and applied aspects. Workshop.- Rostov-on-Don: October 17-19, 1991.
Abstracts of reports.
16. L-аспарагиназа для инъекций. Фармакопейная статья ФС 42-2952-93.- М. , 1993, с.7.

Claims (3)

1. Применение карнозина и/или гомокарнозина в качестве средства для стабилизации пептидной связи в белковом препарате в твердой фазе при термической стерилизации и хранении.
2. Применение по п.1 совместно с одной или несколькими аминокислотами.
3. Применение по пп.1 и 2 совместно с инертными наполнителями.
RU95110533A 1995-06-26 1995-06-26 Средство для стабилизации пептидной связи в белковом препарате RU2134120C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU95110533A RU2134120C1 (ru) 1995-06-26 1995-06-26 Средство для стабилизации пептидной связи в белковом препарате

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU95110533A RU2134120C1 (ru) 1995-06-26 1995-06-26 Средство для стабилизации пептидной связи в белковом препарате

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU95110533A RU95110533A (ru) 1997-08-27
RU2134120C1 true RU2134120C1 (ru) 1999-08-10

Family

ID=20169216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU95110533A RU2134120C1 (ru) 1995-06-26 1995-06-26 Средство для стабилизации пептидной связи в белковом препарате

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2134120C1 (ru)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2491347C2 (ru) * 2005-10-24 2013-08-27 Вайет Способ получения белков с использованием соединений, препятствующих старению
RU2707550C2 (ru) * 2013-03-13 2019-11-27 Дженентек, Инк. Составы со сниженным окислением
US10653779B2 (en) 2013-03-13 2020-05-19 Genentech, Inc. Formulations with reduced oxidation
US11596620B2 (en) 2013-03-13 2023-03-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Formulations with reduced oxidation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Государственная фармакопея СССР. - М.: Медицина, 1968, с.991 и 992. Hipkiss A.K. et al. "Carnosin protects protein...", Biochem. Soc.Frans., 1994, 22(4), 339. *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2491347C2 (ru) * 2005-10-24 2013-08-27 Вайет Способ получения белков с использованием соединений, препятствующих старению
RU2707550C2 (ru) * 2013-03-13 2019-11-27 Дженентек, Инк. Составы со сниженным окислением
US10653779B2 (en) 2013-03-13 2020-05-19 Genentech, Inc. Formulations with reduced oxidation
US11596620B2 (en) 2013-03-13 2023-03-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Formulations with reduced oxidation

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rhinesmith et al. A quantitative study of the hydrolysis of human dinitrophenyl (DNP) globin: the number and kind of polypeptide chains in normal adult human hemoglobin
TWI341866B (en) Casein hydrolysate, method of preparing the same, and use of the same
JP5612131B2 (ja) 糖尿病の治療または予防剤
Koroleva et al. Semax as a universal drug for therapy and research
JP3727383B2 (ja) プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤
KR20060017493A (ko) Hcg 절편들을 포함하는 점막 및 경구 투여용 조성물
ATE213499T1 (de) Peptidanaloge des menschlichen, basischen myelinproteins mit substitution an position 91 zur behandlung der multiplen sklerose
Wang et al. Antihypertensive effect of rapeseed peptides and their potential in improving the effectiveness of captopril
JPH05331071A (ja) カルシトニン遺伝子関連ペプチド類の凍結乾燥組成物および安定化法
RU2134120C1 (ru) Средство для стабилизации пептидной связи в белковом препарате
Walsh et al. Bovine carboxypeptidase A variants resulting from allelomorphism.
JPS6235756B2 (ru)
KR950010321B1 (ko) 인간 트롬빈 제제의 가열처리방법
Li et al. Kinetics of the inhibition of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II by pea protein-derived peptides
US6358918B1 (en) Preparation comprising thiol-group-containing proteins
US4968696A (en) N,N'-bis-L-amino acid-L-cystine-peptide containing amino acid preparations for oral parenteral nutrition
RU2141337C1 (ru) Соединения на основе реакции амадори, их применение, способ получения и составы на их основе
EP1359934B1 (en) Tripeptides and tripeptide derivatives for the treatment of neurodegenerative diseases
US20220305090A1 (en) Hair growing agent and food or beverage product comprising same
GB2116565A (en) A fibrinolytically active agent and a method for the preparation thereof
EP0303251A2 (en) Injection composition containing modified tPA
Volkin et al. Deamidation of polyanion‐stabilized acidic fibroblast growth factor
JP2007161696A (ja) 新規なヘプタペプチド及びプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤
EP1363656B1 (en) Tripeptides and tripeptide derivatives for the treatment of postlesional diseases of the nervous system
Hider et al. The role of the phosphate group for the structure of phosphopeptide products of adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate-dependent protein kinase