CN111748527A - 化学成分限定高效补料培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及补料培养基技术领域，具体公开了一种化学成分限定高效补料培养基，由补料培养基A和补料培养基B组成，并且两者不相互混溶，所述补料培养基A包含有总浓度为12900‑124000mg/L的氨基酸，总浓度为1210‑12560mg/mL的无机盐和微量元素，总浓度为780‑10260mg/L的维生素，以及总浓度为1300‑8020mg/mL的其它成分；所述补料培养基B包含有总浓度为18000‑180000mg/L的氨基酸。本发明补料培养基中的营养成分浓度高，特别是氨基酸和维生素含量高，因而能减少稀释效应，提高细胞密度和抗体蛋白表达，与其他商业补料培养基相比，本发明补料培养基培养效果好，生产成本低，优势明显。

Description

化学成分限定高效补料培养基及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及补料培养基技术领域，具体为一种化学成分限定高效补料培养基及该补料培养基的制备方法，以及该补料培养基在CHO细胞培养中的应用。
背景技术
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞由于其具有与人相似的抗体蛋白翻译后修饰能力，并且可以高密度悬浮生长，非常适合大规模培养，因而是生物医药产业应用最广泛的宿主细胞。细胞在离体后十分敏感脆弱，因此必须提供一个适合其生长的环境。培养基是对体内环境的模拟，其中含有丰富的营养物质，能满足细胞正常的生长和代谢。
培养基可以分为基础培养基和补料培养基。细胞首先被接种到基础培养基中，随着细胞的生长代谢，基础培养基中的营养物质被耗竭，此时需要额外添加补料培养基以支撑细胞的生长和抗体蛋白的表达。补料培养基是在基础培养基的基础上进行浓缩，其中含有细胞生长所必须的糖类、氨基酸、维生素等物质。
我国培养基市场目前被Gibco和Hyclone等国外公司所垄断，培养基的价格十分高昂严重制约着生物药行业的发展。动物细胞培养基国产化，可以打破外国公司的垄断壁垒，带动国内上游原料供应商的发展；此外，培养基成本降低，药企能将更多的资金用于新药研发，提升自主的核心技术力量。培养基国产化必将推动单抗药物价格的下跌，缓解国家医保体系以及患者个人的经济负担，使更多的患者用上廉价高效的药物，提升人民的幸福感。由于商业补料培养基的成分均属于保密信息，不同细胞株、不同克隆、甚至不同亚克隆之间代谢需求也经常存在显著差异。造成在筛选合适商业补料培养基过程中存在非常大的盲目性，而且在通过调整培养基成分改善蛋白质量指标，无法随意减少某种营养成分来考察影响，会严重影响生物仿制药项目的开发进度。申请人在中国专利CN107460159A中公开了一种无血清、无蛋白补料培养基，该补料培养基中不含有谷氨酰胺，因此不存在铵离子累积而对细胞生长引起的毒性，仍保持高细胞生长和高多肽生产力，并且该补料培养基无血清、无蛋白、无动物来源，可以大大降低病毒污染风险，利于下游纯化。但该补料培养基中含有碱溶性氨基酸，在中性pH下溶解度低，难以配制高浓度产品，另外储存时间较长或低温存放，营养物质会发生沉淀，产品稳定性一般，并且CHO细胞培养后的细胞密度和抗体蛋白表达仍有待进一步提高。因此本领域迫切需要开发新的适合各类CHO细胞高密度生长、高蛋白表达的化学成分限定补料培养基。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种化学成分限定高效补料培养基，及该补料培养基的制备方法和该补料培养基在CHO细胞培养中的应用，能有效提高氨基酸浓度，避免营养物质沉淀，提高产品稳定性，减少稀释效应，提高细胞密度和抗体蛋白表达。
本发明是通过如下的技术方案实现的：
一种化学成分限定高效补料培养基，由补料培养基A和补料培养基B组成，并且两者不相互混溶，所述补料培养基A包含有总浓度为12900-124000mg/L的氨基酸，总浓度为1210-12560mg/mL的无机盐和微量元素，总浓度为780-10260mg/L的维生素，以及总浓度为1300-8020mg/mL的其它成分；所述补料培养基B包含有总浓度为18000-180000mg/L的氨基酸。
优选的，所述补料培养基B由L-色氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸组成。
进一步优选的，所述补料培养基B中各组分具体含量如下：
Figure BDA0002493475510000031
所述补料培养基B中各组分更优选的含量如下：
Figure BDA0002493475510000032
所述补料培养基B中各组分含量最好如下：
Figure BDA0002493475510000033
作为优选的技术方案，所述补料培养基A的具体成分及其含量如下：
氨基酸部分
Figure BDA0002493475510000034
无机盐和微量元素部分
Figure BDA0002493475510000041
维生素部分
Figure BDA0002493475510000042
其它成份
Figure BDA0002493475510000043
Figure BDA0002493475510000051
进一步优选的，所述补料培养基A的具体成分及其含量如下：
氨基酸部分
Figure BDA0002493475510000052
无机盐和微量元素部分
Figure BDA0002493475510000053
Figure BDA0002493475510000061
维生素部分
Figure BDA0002493475510000062
其它成分
Figure BDA0002493475510000063
本发明还进一步公开了上述化学成分限定高效补料培养基的制备方法，其中所述补料培养基A的制备方法包括如下步骤：
1)按配制体积定量称取补料培养基A中各成分，混匀；
2)将步骤1的补料培养基混合物溶解于超纯水中，水温控制在20-30℃，并加入氢氧化钠调pH促进溶解；
3)每升培养基中加入75g葡萄糖，搅拌均匀；
4)调整pH在6.7-6.9之间，并用超纯水定容；
5)采用0.22μm滤膜过滤，2-8℃保存。
所述补料培养基B的制备方法包括如下步骤：
1)按配制体积定量称取补料培养基B中各成分，混匀；
2)加入配制体积70％的水，水温控制在20-30℃；
3)加入配制体积20％的6N氢氧化钠溶液；
4)调节pH在10.80-11.80之间，并用超纯水定容；
5)采用0.22μm滤膜过滤，2-8℃保存。
本发明还进一步提供所述化学成分限定高效补料培养基在细胞培养和/或蛋白表达中的运用，比如在CHO细胞培养和/或蛋白表达中的运用。
与现有技术相比，本发明提供的化学成分限定高效补料培养基具有如下有益效果：
1、补料培养基B中的氨基酸是高浓度的碱溶性氨基酸，它们在中性pH下溶解度低，如果按照常规方法和补料培养基A合并配制成补料培养基，长时间或低温存放后会发生沉淀。本发明将补料培养基分为两个部分，能有效避免营养物质沉淀，提高产品的稳定性。
2、补料培养基分为两部分后，使得补料培养基中的营养成分浓度高，特别是氨基酸和维生素含量高，因而能减少稀释效应，提高细胞密度和抗体蛋白表达。
3、补料培养基中的组分明确且不含有动植物来源成分，能确保批次间的一致性。
4、与其他商业补料培养基相比，本发明的补料培养基的培养效果好，生产成本低，优势明显。
附图说明
图1为本发明化学成分限定高效补料培养基和其他补料培养基培养细胞的活细胞密度随时间的变化图；
图2为本发明化学成分限定高效补料培养基和其他补料培养基培养细胞的细胞活率随时间的变化图；
图3为本发明化学成分限定高效补料培养基和其他补料培养基培养细胞第13天的抗体蛋白表达图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明配方中各组分如无特别说明，均为常规市售产品。
实施例1
选取本发明最优配方成分及含量进行配制，其中多宁补料培养基A的成分及配方：
Figure BDA0002493475510000081
Figure BDA0002493475510000091
配制多宁补料培养基A的方法如下：
(1)按配制体积定量称取补料培养基中各成分，混匀；
(2)将步骤(1)的补料培养基混合物溶解于超纯水中，水温控制在20-30℃，并加入氢氧化钠调pH促进溶解；
(3)每升培养基中加入75g葡萄糖，搅拌均匀；
(4)调整pH在6.7-6.9之间，并用超纯水定容；
(5)采用0.22μm滤膜过滤，2-8℃保存。
多宁补料培养基B的成分及配方：
氨基酸 含量mg/L 氨基酸 含量mg/L
L-色氨酸 28000 L-半胱氨酸 24400
L-酪氨酸 48300
配制多宁补料培养基B的方法如下：
(1)按配制体积定量称取补料培养基中各成分，混匀；
(2)加入配制体积70％的水，水温控制在20-30℃；
(3)加入配制体积20％的6N氢氧化钠溶液；
(4)调节pH在10.80-11.80之间，并用超纯水定容；
(5)采用0.22μm滤膜过滤，2-8℃保存。
细胞生长测试方案：
Figure BDA0002493475510000101
Figure BDA0002493475510000111
CHO-K1细胞按照3×105cell/mL密度接种，在125mL摇瓶中进行流加培养(加入补料培养基)，培养体积30mL。培养第3天、第5天、第7天、第9天、第11天取样，进行细胞计数，记录活细胞密度和活率。培养第3天、第5天、第7天、第9天、第11天分别补加一次3％体积的多宁补料培养基A0.9mL和0.3％体积的多宁补料培养基B0.09mL。培养第5天时，培养箱温度由37℃降温到31℃。培养过程根据需要补加葡萄糖，维持残糖浓度在3-6g/L，培养第13天测抗体蛋白表达。
对比例1
以Hyclone公司的补料培养基CB7a和CB7b为对比例1，进行细胞生长性能测试。
细胞生长测试方案：
基础培养基 Actipro
补料培养基 CB7a和CB7b
测试细胞 CHO-K1
培养瓶 Corning 125ml
接种密度 3×10<sup>5</sup>cell/mL
接种体积 30mL
摇床转速 110rpm
摇床温度 37℃
摇床二氧化碳 8％
收获 细胞培养至Day13全部收获。
CHO-K1细胞按照3×105cell/mL密度接种，在125mL摇瓶中进行流加培养(加入补料培养基)，培养体积30mL。培养第3天、第5天、第7天、第9天、第11天取样，进行细胞计数，记录活细胞密度和活率。培养第3天、第5天、第7天、第9天、第11天分别补加一次3％体积的CB7a液体培养基0.9mL和0.3％体积的CB7b液体培养基0.09mL。培养第5天时，培养箱温度由37℃降温到31℃。培养过程根据需要补加葡萄糖，维持残糖浓度在3-6g/L，培养第13天测抗体蛋白表达。
对比例2
以Gibco公司的补料培养基Feed C为对比例2，进行细胞生长性能测试。
细胞生长测试方案：
基础培养基 Actipro
补料培养基 Feed C
测试细胞 CHO-K1
培养瓶 Corning 125ml
接种密度 3×10<sup>5</sup>cell/mL
接种体积 30mL
摇床转速 110rpm
摇床温度 37℃
摇床二氧化碳 8％
收获 细胞培养至Day13全部收获。
CHO-K1细胞按照3×105cell/mL密度接种，在125mL摇瓶中进行流加培养(加入补料培养基)，培养体积30mL。培养第3天、第5天、第7天、第9天、第11天取样，进行细胞计数，记录活细胞密度和活率。培养第3天、第5天、第7天、第9天、第11天分别补加一次3％体积的Feed C液体培养基0.9mL。培养第5天时，培养箱温度由37℃降温到31℃。培养过程根据需要补加葡萄糖，维持残糖浓度在3-6g/L，培养第13天测抗体蛋白表达。
对比例3
以Irvine公司的补料培养基Feed 4为对比例3，进行细胞生长性能测试。
细胞生长测试方案：
基础培养基 Actipro
补料培养基 Feed 4
测试细胞 CHO-K1
培养瓶 Corning 125ml
接种密度 3×10<sup>5</sup>cell/mL
接种体积 30mL
摇床转速 110rpm
摇床温度 37℃
摇床二氧化碳 8％
收获 细胞培养至Day13全部收获。
CHO-K1细胞按照3×105cell/mL密度接种，在125mL摇瓶中进行流加培养(加入补料培养基)，培养体积30mL。培养第3天、第5天、第7天、第9天、第11天取样，进行细胞计数，记录活细胞密度和活率。培养第3天、第5天、第7天、第9天、第11天分别补加一次3％体积的Feed 4液体培养基0.9mL。培养第5天时，培养箱温度由37℃降温到31℃。培养过程根据需要补加葡萄糖，维持残糖浓度在3-6g/L，培养第13天测抗体蛋白表达。
对比例4
以Merck公司的补料培养基Advanced Feed 1为对比例4，进行细胞生长性能测试。
细胞生长测试方案：
Figure BDA0002493475510000131
Figure BDA0002493475510000141
CHO-K1细胞按照3×105cell/mL密度接种，在125mL摇瓶中进行流加培养(加入补料培养基)，培养体积30mL。培养第3天、第5天、第7天、第9天、第11天取样，进行细胞计数，记录活细胞密度和活率。培养第3天、第5天、第7天、第9天、第11天分别补加一次3％体积的Advanced Feed 1液体培养基0.9mL。培养第5天时，培养箱温度由37℃降温到31℃。培养过程根据需要补加葡萄糖，维持残糖浓度在3-6g/L，培养第13天测抗体蛋白表达。
对比例5
以本公司的现有多宁补料培养基Y(专利公开号：CN107460159A实施例1)为对比例5，进行细胞生长性能测试。
细胞生长测试方案：
Figure BDA0002493475510000142
Figure BDA0002493475510000151
CHO-K1细胞按照3×105cell/mL密度接种，在125mL摇瓶中进行流加培养(加入补料培养基)，培养体积30mL。培养第3天、第5天、第7天、第9天、第11天取样，进行细胞计数，记录活细胞密度和活率。培养第3天、第5天、第7天、第9天、第11天分别补加一次3％体积的多宁补料培养基Y液体培养基0.9mL。培养第5天时，培养箱温度由37℃降温到31℃。培养过程根据需要补加葡萄糖，维持残糖浓度在3-6g/L，培养第13天测抗体蛋白表达。
各实施例和对比例的细胞培养结果如下表：
表1培养细胞的活细胞密度、细胞活率随时间变化数据及第13天抗体蛋白表达结果
Figure BDA0002493475510000152
Figure BDA0002493475510000161
Figure BDA0002493475510000171
通过实验比较(实验结果参见表1和附图1-3)，本发明化学成分限定高效补料培养基，比目前商业上的补料培养基能达到更高的活细胞密度和细胞活率，培养细胞第13天的抗体蛋白表达量也要优于商业培养基。与申请人在先专利的多宁补料培养基Y相比，培养细胞的最高活细胞密度提高了51％，第13天细胞活率提高了5.38％，第13天的抗体蛋白表达量提高了53％。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、组分或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、组分或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种化学成分限定高效补料培养基，其特征在于，由补料培养基A和补料培养基B组成，并且两者不相互混溶，所述补料培养基A包含有总浓度为12900-124000mg/L的氨基酸，总浓度为1210-12560mg/mL的无机盐和微量元素，总浓度为780-10260mg/L的维生素，以及总浓度为1300-8020mg/mL的其它成分；所述补料培养基B包含有总浓度为18000-180000mg/L的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的化学成分限定高效补料培养基，其特征在于，所述补料培养基B由L-色氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸组成。
3.根据权利要求2所述的化学成分限定高效补料培养基，其特征在于，所述补料培养基B中各组分具体含量如下：
Figure FDA0002493475500000011
4.根据权利要求3所述的化学成分限定高效补料培养基，其特征在于，所述补料培养基B中各组分含量如下：
Figure FDA0002493475500000012
5.根据权利要求1所述的化学成分限定高效补料培养基，其特征在于，所述补料培养基A的具体成分及其含量如下：
氨基酸部分
Figure FDA0002493475500000013
Figure FDA0002493475500000021
无机盐和微量元素部分
Figure FDA0002493475500000022
维生素部分
Figure FDA0002493475500000023
Figure FDA0002493475500000031
其它成份
Figure FDA0002493475500000032
6.根据权利要求5所述的化学成分限定高效补料培养基，其特征在于，所述补料培养基A的具体成分及其含量如下：
氨基酸部分
Figure FDA0002493475500000033
无机盐和微量元素部分
Figure FDA0002493475500000034
Figure FDA0002493475500000041
维生素部分
Figure FDA0002493475500000042
其它成份
Figure FDA0002493475500000043
7.一种化学成分限定高效补料培养基，其特征在于，由补料培养基A和补料培养基B组成，并且不相互混溶，所述补料培养基A的具体成分及其含量如下：
Figure FDA0002493475500000051
Figure FDA0002493475500000061
所述补料培养基B的具体成分及其含量如下：L-色氨酸28000mg/L、L-酪氨酸48300mg/L、L-半胱氨酸24400mg/L。
8.一种如权利要求1-6任一项所述化学成分限定高效补料培养基的制备方法，其特征在于，分别制备补料培养基A和补料培养基B，所述补料培养基A的制备方法包括如下步骤：
1)按配制体积定量称取补料培养基A中各成分，混匀；
2)将步骤1的补料培养基混合物溶解于超纯水中，水温控制在20-30℃，并加入氢氧化钠调pH促进溶解；
3)每升培养基中加入75g葡萄糖，搅拌均匀；
4)调整pH在6.7-6.9之间，并用超纯水定容；
5)采用0.22μm滤膜过滤，2-8℃保存；
所述补料培养基B的制备方法包括如下步骤：
1)按配制体积定量称取补料培养基B中各成分，混匀；
2)加入配制体积70％的水，水温控制在20-30℃；
3)加入配制体积20％的6N氢氧化钠溶液；
4)调节pH在10.80-11.80之间，并用超纯水定容；
5)采用0.22μm滤膜过滤，2-8℃保存。
9.一种如权利要求1-6任一项所述化学成分限定高效补料培养基在CHO细胞培养和/或蛋白表达中的应用。
10.一种如权利要求7所述化学成分限定高效补料培养基在CHO细胞培养和/或蛋白表达中的应用。
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