TW201418455A - 用於最適化灌流細胞培養系統的方法及系統 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示方法以及灌流培養系統。該等系統以及方法與降低起始灌流速率有關，使得細胞在生物反應器以及細胞滯留裝置中的滯留時間增加，及/或伴隨增加起始生物反應器體積或降低起始細胞滯留裝置體積或兩者。其他方法具體例包括增加組織培養液的個別組分的濃度，以及添加重組型蛋白質分解的安定劑。

Description

用於最適化灌流細胞培養系統的方法及系統
本發明揭示方法以及灌流培養系統。該等系統以及方法與降低起始灌流速率有關，使得細胞在生物反應器以及細胞滯留裝置中的滯留時間增加，及/或伴隨增加起始生物反應器體積或降低起始細胞滯留裝置體積或兩者。其他方法具體例包括增加組織培養液的個別組分的濃度，以及添加重組型蛋白質分解的安定劑。
本申請案請求於2012年10月10日提申，標題為”METHODS AND SYSTEMS FOR OPTIMIZING PERFUSION CELL CULTURE SYSTEM”之美國臨時專利申請案序號61/712,190(代理人檔案編號BHC125019(BH-021L))的優先權，其在所有目的方面以其整體併入本文做為參考資料。
重組型蛋白質，諸如rhFVIII(重組型人類因子VIII蛋白，其為Kogenate® FS，或KG-FS的一個活性成分，由Bayer Healthcare，Berkeley，CA所製造)，經常在灌流連續細胞培養方法中製造。在這個系統中，關鍵的控制參數為細胞特異性灌流速率(在本文又被稱為灌流速率或CSPR)，其可以計算為每天每個細胞的經灌流培養基體積(體積/C/D)或以每天的體積計。細胞培養基明顯是整個製造費用的主因，且是為什麼要致力於使用對 細胞健康及/或產率和產品品質而言為最適化之低灌流速率的一個原因。此外，若可維持蛋白質產率，則灌流速率較低可增加設備容量並對生產彈性提供最少的設施改變。
相對高的灌流速率有助於確保供應細胞培養足夠的養分，但 其也稀釋了產物，得到較大的收取體積。另一方面，低灌流速率會降低產物稀釋度，但可能影響到其穩定性。舉例而言，分子在生物反應器條件中滯留時間增加會使得分子暴露於蛋白酶或其他可能促使其分解的因子。若養分的濃度有限(或若副產物增加)，則較低的灌流速率也可能影響細胞效能表現。因此，單單降低灌流速率是不夠的。
因此，對於蛋白質產物的最適化細胞生產而言，能提供充分 養分以及副產物廓清的最低灌流速率會導致更高的產率，同時需要較少的組織培養基(在本文中又稱為組織培養液、組織/細胞培養基，或培養基)，只要灌流速率的改變不會影響到產物穩定性。因而，應針對細胞特異性生產力以及針對產物穩定性來對灌流速率進行最適化。
灌流速率的改變也會影響滯留時間(細胞以及產物暴露於系 統的單元-操作條件的平均時間)。就生產重組型蛋白質(諸如重組型FVIII)而言，灌流生物反應器系統的兩個關鍵性單元操作發生在生物反應器以及細胞滯留裝置(在本文中又被稱為CRD)(例如沉降槽)中。生物反應器係針對理想細胞培養條件進行最適化以及控制(例如，生理學溫度以及適當氧合)，而典型的細胞滯留裝置經設計與最適化成將細胞留滯並再循環回到生物反應器中。因為CRD通常不會被設計成提供理想的生物反應器培養條件，高細胞濃度與非理想條件的組合可能會處在一個不合需要的狀態下。為了減輕這樣的情況，採用諸如冷卻的策略來減弱經濃縮之細胞質量的代謝速率。通常預期細胞滯留裝置中的條件會降低細胞代謝，復而可降低細胞生產力。
在灌流系統中，細胞(及產物/副產物)在生物反應器和細胞滯 留裝置之間連續地循環著。因此，細胞在有利於細胞生產力(亦即在生物反應器中)的條件以及生產力通常較低之條件(亦即在CRD中)之間循環。在產業界中，已充分確認在灌流系統中細胞耗費許多時間在外部次最適化環境中(例如在CRD中)的問題(參見Bonham-Carter and Shevitz,BioProcess Intl.9(9)Oct.2011,pp.24-30)。此外，細胞在CRD中越久，於細胞回到生物反應器之後可能要花更久時間來恢復。這可能導致系統生產力更為降低。
重組型蛋白質產物，諸如FVIII，可以透過連續培養基收集 予以收取。FVIII產物活性也可能在生物反應器中所用溫度下隨著時間而降低。因此，藉由減低灌流速率來增加滯留時間可能會使得活性重組型蛋白質產物堆積較少。
因此，對於具有較低灌流速率但具有高重組型蛋白質生產力 的灌流生物反應器系統以及方法存在著需要。
在一個態樣中，提供一種灌流生物反應器培養系統，其具有一生物反應器以及一細胞滯留裝置。該灌流生物反應器培養系統包含一起始灌流速率、一起始生物反應器體積，以及一起始細胞滯留裝置體積。該系統是有關於降低起始灌流速率，使得細胞在生物反應器以及細胞滯留裝置中的滯留時間增加，並且伴隨著增加起始生物反應器體積或降低起始細胞滯留體積，或兩者。該系統與改變灌流速率、生物反應器工作體積或CRD工作體積有關，以在CRD的條件下達到細胞的最適化滯留時間。
在另一個態樣中，提供一種將灌流生物反應器系統最適化的方法。該方法包含將含有細胞的組織培養液(在本文中亦被稱為組織培養基或培養基)提供至生物反應器系統，該生物反應器系統包含一生物反應器以及一細胞滯留裝置，其中該系統具有一起始灌流速率、一起始生物反應器體積，以及一起始細胞滯留裝置體積，而降低該起始灌流速率會使得加細 胞在生物反應器以及細胞滯留裝置中的滯留時間增加，並且增加起始生物反應器體積或降低起始細胞滯留體積，或兩者。該方法與改變灌流速率、生物反應器工作體積或CRD工作體積有關，以在CRD的條件下達到細胞的最適化滯留時間。
在另一個方法態樣中，提供一種將灌流生物反應器系統最適 化的方法。該方法包含將一含有細胞之第一組織培養液提供至一生物反應器系統中，該生物反應器系統包含一生物反應器以及一細胞滯留裝置，該系統具有一起始灌流速率、一起始生物反應器裝置體積，以及一起始細胞滯留體積；降低該起始灌流速率會使得細胞在生物反應器以及細胞滯留裝置中的滯留時間增加，並以第一組織培養液取代一第二組織培養液，該第二組織培養液相較於該第一組織培養液藉由取代或濃度改變來調整細胞培養物的個別組分。
在另一個方法態樣中，提供一種將灌流生物反應器系統最適 化的方法。該方法包含將一含有表現重組型蛋白質之細胞的第一組織培養液提供至一生物反應器系統中，該生物反應器系統包含一生物反應器以及一細胞滯留裝置，其中該系統具有一起始灌流速率、一起始生物反應器體積，以及一起始細胞滯留裝置體積，降低該起始灌流速率會使得細胞在生物反應器以及細胞滯留裝置中的滯留時間增加；以及添加重組型蛋白質的安定劑以降低分解。
本教示的此等與其他特徵列舉於下文中。
習於技藝者將能理解以下所述的圖式僅供舉例說明之用。在任何方面圖式都不意欲限制本教示的範疇。
第1圖顯示灌流生物反應器系統的概略具體例。
第2圖顯示就CSPR逐步減低而言，隨著1L灌流培養(X軸，以天數計)，呈Y軸的活細胞密度(菱形)以及相對CSPR(正方形)的圖式。以相對單位提供CSPR。
第3圖顯示隨著逐步減低CSPR，來自1L灌流細胞培養物之 樣品的活細胞密度(VCD，菱形)以及顯示為經常規化效力之效力(正方形)的圖式。
第4A-B圖顯示在不同CSPR下，相對於計得效力之觀察平均 效力差異(以%計)的條狀圖(A)以及圖式(B)。算得效力設為100%。
第5圖顯示葡萄糖與乳糖的代謝數據圖式，在1L灌流細胞培 養期間隨著CSPR時間框架逐步降低(以天數計)，其中CSPR的相對變化被指明。
第6圖顯示在上清液中的FVIII活性降低的圖式(用過的培養 基/收取的培養液)：實驗，在37℃下培育9小時。殘餘FVIII活性以對照組百分比顯示。
第7圖顯示使用FVIII穩定性測試之數據算得的FVIII活性以 及由CSPR降低實驗在實驗上測得的活性的比較圖式。在不同CSPR程度下算得的滴定量以%顯示，其中100%為天然FVIII的起始效力。
第8A-B圖顯示使用不同生物反應器與細胞滯留裝置比例， 活細胞密度與目標CSPR速率(A)，以及生物反應器樣品中的FVIII效力(B)的圖式。
第9A-B圖顯示麩醯胺酸以及麩胺酸的圖式。樣品中濃度(A) 以及FVIII生產細胞的比生長速率(B)。
第10A-B圖顯示生物反應器系統在不同CSPR與生物反應器 工作體積下的生產力(A)以及在不同培養CSPR下每1L培養物的算得生產力(B)。
第11A-B圖顯示添加安定劑可(劑量依賴地)因為在生物反應 器中的滯留時間增加而降低效力損失(~13-15%)，但不會抵銷總損失(~23%)。
第12圖顯示說明依據具體例之使灌流生物反應器系統最適 化之方法的流程圖。
第13圖顯示說明依據具體例之使灌流生物反應器系統最適 化之另一方法的另一流程圖。
第14圖顯示說明依據具體例之使灌流生物反應器系統最適 化之另一方法的又另一流程圖。
各種具體例的說明
本發明具體例提供用於增加灌流細胞培養系統的產能的方法以及系統。
降低灌流速率會增加細胞(與重組型蛋白質/FVIII產物)在CRD以及在生物反應器中的滯留時間，使得活性重組型蛋白質產物(諸如FVIII)的產量降低。在某些具體例中，降低灌流速率是藉由改變生物反應器對CRD的相對體積來抵銷。在一些具體例中，體積的改變與灌流速率的降低呈約相同的比例。舉例而言，降低一半的灌流速率是藉由生物反應器對CRD的體積比伴隨倍增而達到。本發明具體例的系統以及方法可使得重組型蛋白質產物穩健生產。降低灌流速率也可能藉由調整組織培養基的組分，或者是藉由添加安定劑(諸如用於重組型FVIII，亦即rFVIII，的鈣)而降低蛋白質產物(等)分解予以抵銷。
該灌流細胞培養系統包括兩個主要單元操作：生物反應器，其條件對於重組型蛋白質生產(諸如rFVIII)而言通常為最適；以及CRD(例如，沉降槽)，其條件因為缺乏氧控制以及相較於在生物反應器中的生理學溫度通常操作溫度低而對重組型蛋白質產物/rFVIII生產來說並非最適。因此，細胞培養物連續地透過配管在有助於以及較不有助於細胞生產力以及重組型蛋白質產物/rFVIII生產的環境間循環。此外，細胞在CRD中的滯留時間相對於生物反應器越長，則預期生產力損失越大，因為細胞要從較低的細胞代謝狀態轉換至較高的細胞代謝狀態。
第1圖說明灌流生物反應器培養系統100的一個具體例的方 塊圖。該灌流生物反應器培養系統100包含一生物反應器101，該生物反應器101具有一生物反應器入口105以及一生物反應器出口106。該生物反應器101包含一被裝配成容納組織培養液(TCF)以及待培養細胞的培養室。該灌流生物反應器培養系統100包含一細胞滯留裝置(CRD)102，其包括一細胞聚集體分離器或其他適當的細胞分離器。該細胞滯留裝置102具有一用以將組織培養液以及細胞再循環至生物反應器101的出口107。該細胞滯留裝置102亦具有另一出口108，其將組織培養液連同少量細胞的收取輸出物送至無細胞收取器104以供分離並純化重組型蛋白質產物之用。該灌流生物反應器培養系統100也包含一培養基容器103，其將新鮮的組織培養液經由入口105送入生物反應器。該灌流生物反應器系統100可用於生產生物製劑，諸如凝血因子。舉例而言，本文所述之該灌流生物反應器培養系統100以及方法可用於製造任一種蛋白質產物，包括重組型蛋白質產物且包括凝血因子，諸如因子VII、VIII或因子IX，或其他適當因子或物質。
在一個系統具體例中，提供一灌流生物反應器培養系統 100。此系統包含：一被裝配成容納組織培養液與待培養細胞的生物反應器101；一被裝配成容納含有來自生物反應器101之細胞的組織培養液、將一些細胞與組織培養液分離並提供組織培養液與細胞之收取輸出物，以及將組織培養液與細胞再循環輸出物提供至該生物反應器101的CRD 102。該系統100具有一起始灌流速率(第一灌流速率)、一起始生物反應器體積(第一生物反應器體積)、一起始細胞滯留裝置體積(第一起始細胞滯留裝置體積)，以及一起始生物反應器體積與一起始細胞滯留裝置體積的起始體積比(第一體積比)。在一或多個具體例中，降低起始灌流速率(至一第二灌流速率)，造成細胞在生物反應器101和細胞滯留裝置102中的滯留時間增加。此外或另外，增加起始生物反應器體積(至一第二生物反應器體積)或降低起始細胞滯留裝置體積(至一第二細胞滯留裝置體積)，或兩者會造成起始體積比增加(至一第二體積比)。
在一或多個具體例中，起始體積比增加與起始灌流速率降低 呈約相同的比例。在某些具體例中，起始灌流速率以約三分之一至約三分之二的範圍降低。在其他具體例中，該起始灌流速率降低至多約三分之一。 在其他具體例中，該起始灌流速率降低至多約一半，且又在其他具體例中，該起始灌流速率降低至多約三分之二。在一些具體例中，該起始生物反應器體積增加達約三分之一至約三分之二；在其他具體例中，該起始生物反應器體積增加至多約三分之一。在其他具體例中，該起始生物反應器體積增加至多約一半；在又其他具體例中，該起始生物反應器體積增加至多約三分之二。
在一或多個具體例中，該起始細胞滯留裝置體積降低約三分 之一至約三分之二。在一些具體例中，該起始細胞滯留裝置體積降低至多約三分之一。在一些具體例中，該起始細胞滯留裝置體積降低至多約一半，在又其他具體例中，該起始細胞滯留裝置體積降低至多約三分之二。
在一或多個具體例中，該起始體積比增加約三分之一至約三 分之二。在一些具體例中，該起始體積比增加至多約三分之一。在一些具體例中，該起始體積比增加至多約一半，在又其他具體例中，該起始體積比增加至多約三分之二。在某些具體例中，該起始灌流速率為每天約1至15倍體積。
現將參照第12圖說明使灌流生物反應器培養系統100最適化 的方法。使灌流生物反應器培養系統100最適化的方法200包含，在201中將含有細胞的組織培養液提供至含有一生物反應器與一細胞滯留裝置的生物反應器系統，該系統具有一起始灌流速率(第一灌流速率)、一起始生物反應器體積(第一生物反應器體積)、一起始細胞滯留裝置體積(第一細胞滯留裝置體積)，以及起始生物反應器體積與起始細胞滯留裝置體積的起始體積比(第一體積比)。該方法進一步包含，在202中降低該起始灌流速率(至一第二灌流速率)，使得在203中增加細胞在生物反應器以及細胞滯留裝置中的滯留 時間，及/或，在204中，增加該起始生物反應器體積(至一第二生物反應器體積)或降低該起始細胞滯留體積(至一第二細胞滯留體積)，或兩者，使得該起始體積比增加(至一第二體積比)。
在一些具體例中，起始體積比增加與起始灌流速率降低呈約 相同的比例。在一些具體例中，起始灌流速率以約三分之一至約三分之二的範圍降低。在其他具體例中，該起始灌流速率降低至多約三分之一。在其他具體例中，該起始灌流速率降低至多約一半，且在又其他具體例中，該起始灌流速率降低至多約三分之二。
在某些具體例中，該起始生物反應器體積增加約三分之一至 約三分之二。在一些具體例中，該起始生物反應器體積增加至多約三分之一。在其他具體例中，該起始生物反應器體積增加至多約一半，且又在其他具體例中，該起始生物反應器體積增加至多約三分之二。
在其他具體例中，該起始細胞滯留裝置體積降低約三分之一 至約三分之二。在一些具體例中，該起始細胞滯留裝置體積降低至多約三分之一。在其他具體例中，該起始細胞滯留裝置體積降低至多約一半，且又在其他具體例中，該起始細胞滯留裝置體積降低至多約三分之二。
在一些具體例中，該起始體積比增加約三分之一至約三分之 二。在一些具體例中，該起始體積比增加至多約三分之一。在其他具體例中，該起始體積比增加至多約一半，且又在其他具體例中，該起始體積比增加至多約三分之二。在某些具體例中，該起始灌流速率為每天約1至15倍體積。
現將參照第13圖說明使灌流生物反應器培養系統100最適化 的另一方法。使灌流生物反應器培養系統100最適化的方法300包含，在301中將含有細胞的第一組織培養液提供至含有一生物反應器與一細胞滯留裝置的生物反應器系統，其中該系統具有一起始灌流速率(一第一灌流速率)、一起始生物反應器體積，以及一起始細胞滯留裝置體積。此外，該方法300 包含，在302中，降低該起始灌流速率(至一第二灌流速率)。這造成，在303中，細胞在生物反應器和細胞滯留裝置中的滯留時間增加。該方法300進一步包含，在304中，將該第一組織培養液置換成第二組織培養液，該第二組織培養液相較於該第一組織培養液增加該第一組織培養液之個別組分濃度而未添加新組分。舉例而言，增加濃度可包括在該第一組織培養液之個別組分約1至10倍範圍內，或在該第一組織培養液之個別組份約1.2至約5倍範圍內增加濃度，並且用半胱胺酸取代胱胺酸。
在一些具體例中，該第一組織培養液可包括胺基酸，其可包 括例如天然胺基酸中的任一種。在一些具體例中，該第二組織培養液可具有濃度增加的一或多種胺基酸，諸如在該第一組織培養液中存在之約1.1至約10倍的濃度範圍內增加。在一些具體例中，該第二組織培養液可具有增加濃度的一或多種胺基酸，在該第一組織培養液中存在之約1.2至約5倍，或甚至約1.2至約2倍的濃度範圍內。在一些具體例中，增加的胺基酸可以在該第一組織培養液中存在之所有胺基酸的約50%至約75%範圍內。在一些具體例中，可用額外的半胱胺酸取代胺基酸胱胺酸，使得第二組織培養液具有比第一組織培養液濃上約1.1至約12倍的半胱胺酸。可採用其他濃度範圍及/或百分比。
在一些具體例中，該第一組織培養液可包括鹽類，其可包括 氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鎂、硫酸銅、硫酸鐵、硫酸鋅、硝酸鐵、二氧化硒、氯化鈣及/或可在組織培養液中發現的其他鹽類。在一些具體例中，該第二組織培養液可具有濃度增加的一或多種鹽類，在該第一組織培養液中存在之約1.1至約10倍濃度範圍內。在其他具體例中，該第二組織培養液可具有濃度增加的一或多種鹽類，在該第一組織培養液中存在之約1.2至約5倍或約1.2至約2倍濃度範圍內。在一些具體例中，增加的鹽類可以在該第一組織培養液中存在之所有鹽類約50%至約75%的範圍內。可採用其他濃度範圍及/或百分比。
在一些具體例中，該第一組織培養液可包括維生素，其可含 有生物素、氯化膽鹼、泛酸鈣、葉酸、次黃嘌呤、肌醇、菸鹼醯胺、維生素C、吡哆醇、核黃素、硫胺素、胸腺核苷、維生素B-12、吡哆醛、腐肉胺，及/或可在組織培養液中發現的其他維生素。在一些具體例中，該第二組織培養液可具有增加濃度的一或多種維生素，在該第一組織培養液中存在之約1.1至約5倍的濃度範圍內。在其他具體例中，該第二組織培養液可具有增加濃度的一或多種維生素，在該第一組織培養液中存在之約1.2至約3倍的濃度範圍內。在一些具體例中，增加的維生素可以在該第一組織培養液中存在之所有維生素的約50%至約75%範圍內。可採用其他濃度範圍及/或百分比。
在一些具體例中，該第一組織培養液可包括一或多種上文列 示之彼等組分以外的組分(“其他組分”)，其可包括右旋糖、甘露糖、丙酮酸鈉、酚紅、穀胱胺肽、亞麻油酸、硫辛酸、乙醇胺、巰乙醇、鄰硫酸乙醇胺及/或可在組織培養液中發現的其他組分。在一些具體例中，該第二組織培養液可具有增加濃度的一或多種”其他組分”，在該第一組織培養液中存在之約1.1至約10倍的濃度範圍內。在一些具體例中，該第二組織培養液具有增加濃度的一或多種”其他組分”，在該第一組織培養液中存在之約1.2至約5倍，或約1.2至約2倍的濃度範圍內。在一些具體例中，增加的一或多種”其他組分”可以在該第一組織培養液中存在之所有”其他組分”的約50%至約75%範圍內。可採用其他濃度範圍及/或百分比。
現將參照第14圖說明使灌流生物反應器培養系統最適化的 另一個方法400。使灌流生物反應器培養系統100最適化的方法400包含，在401中將含有表現重組型蛋白質之細胞的第一組織培養液提供至含有一生物反應器與一細胞滯留裝置的生物反應器系統，該系統具有一起始灌流速率(一第一灌流速率)、一起始生物反應器體積，以及一起始細胞滯留裝置體積。該方法400進一步包含，在402中降低該起始灌流速率(至一第二灌流速 率)，造成在403中細胞在生物反應器與細胞滯留裝置中的滯留時間增加。該方法400亦包含，在404中添加安定劑以減輕重組型蛋白質分解。在某些具體例中，該安定劑為鈣。如第11A-11B圖中所示，因為在生物反應器中的滯留時間增加，添加安定劑會降低效力損失(~13-15%)。
用於生產因子VIII的實例灌流培養系統描述於，例如US 6,338,964(標題為”Process and Medium For Mammalian Cell Culture Under Low Dissolved Carbon Dioxide Concentration)以及Boedeker,B.G.D.,Seminars in Thrombosis and Hemostasis,27(4)，第385-394頁，與於2012年1月18日提申之美國申請案第61/587,940號中，其所有揭示內容以其整體併入本文做為參考資料。生物反應器101以及細胞滯留裝置102為技藝中已知的。在某些具體例中，該細胞滯留裝置102可進一步包含一細胞聚集體分離器，其被裝配成容納組織培養液與細胞的再循環輸出物、將細胞聚集體和組織培養液及細胞的再循環輸出物分開，以及將剩餘的組織培養液與細胞送回生物反應器101。
可藉由接種來自預先生長的培養物的細胞來開始細胞培 育。在穩定條件下維持(例如自動地)典型的生物反應器參數，諸如在約37℃的溫度、約6.8的pH、約50%空氣飽和的溶氧(DO)，以及約恆定液體體積下。可使用其他生物反應器參數。DO以及pH可使用商業上可購得的探測器在線上測量。生物反應器程序可以批次或進料批次模式啟動，以容許起始細胞濃度增加。這接而為灌流階段，其中細胞培養基經由入口105被連續地泵入生物反應器101中而含有細胞的組織培養液經由出口106被泵出。組織培養液的流速可以受到控制並且隨著細胞濃度呈比例增加。當在生物反應器101中細胞濃度達到目標程度(例如大於1×106細胞/mL)且可控制在這個濃度下時，可建立穩態或穩定的灌流程序。此時，可將流速維持恆定。在灌流生物反應器系統100中可將細胞密度維持在，例如約4百萬至約4千萬細胞/毫升之間。
可採用已知的下游常規來純化使用本文所述系統及方法而 生產的重組型蛋白質。典型的純化步驟可包括細胞分離、濃縮、沉澱、層析以及過濾，或類似步驟。其他純化步驟也是可行的。
細胞可以是任一種真核或原核細胞，包括哺乳動物細胞、植 物細胞、昆蟲細胞、酵母菌細胞以及細菌細胞。細胞可以是製造任一種生物蛋白質產物的任一種細胞。細胞可以是重組型細胞，其經操作而表現一或多種重組型蛋白質產物。細胞也可以表現抗體分子。產物可以是任一種蛋白質產物，包括重組型蛋白質產物，諸如凝血因子，包括例如因子VII、因子VIII、因子IX以及因子X。在一些具體例中，細胞為哺乳動物細胞，諸如例如BHK(幼倉鼠腎)細胞、CHO(中國倉鼠卵巢)細胞、HKB(腎臟與B細胞的共溶體)細胞、HEK(人類胚胎腎)細胞，以及NS0細胞。哺乳動物細胞可以是表現因子VIII的重組型細胞。
組織培養液，亦已知為組織培養基，可以是任一種適當類型 的組織培養基。舉例而言，組織培養液可以是以商業上可購得之DMEM/F12調配物(JRH(Lenexa,Kansas)或Life Technologies(Grand Island,N.Y.)製造)為基礎的培養基組成物，補充有其他補充物，諸如鐵、普朗克F-68或胰島素，且基本上可以是不含其他蛋白質。可使用諸如組胺酸(his)及/或其他亞胺基二乙酸(IDA)的錯合劑，及/或可使用有機緩衝劑，諸如MOPS(3-[N-嗎啉基]丙烷磺酸)、TES(N-參[羥甲基]甲基-2-胺基乙烷磺酸)、BES(N,N-雙[2-羥乙基]-2-胺基乙烷磺酸)及/或TRIZMA(參[羥甲基]胺基乙烷)；其所有可得自於例如Sigma(Sigma,St.Louis,Mo.)。在一些具體例中，該組織培養液可以單獨或呈組合的方式補充有已知濃度的此等錯合劑及/或有機緩衝劑。在一些具體例中，組織培養液可含有EDTA，例如50μM，或另一種適當金屬(例如鐵)螯合劑。可使用其他組成物、調配物、補充物、錯合劑及/或緩衝劑。
起始灌流速率可以是，例如由FDA核可之生物產品的生物製劑執照所設定的灌流速率。起始灌流速率可以是，例如被認為是最適化者。 起始生物反應器體積以及起始細胞滯留裝置體積也可以是，例如在生物產品的生物製劑執照所設定者或以其他方式對特定系統來說被認為是最適化者。起始灌流速率、起始生物反應器速率，或細胞滯留裝置體積也可以是，例如系統的製造商所建議者。注意到起始灌流速率、起始生物反應器體積及/或細胞滯留裝置體積在操作期間不必然為確切數值。而是此等起始數值可以簡單地被採用以供選擇在操作時間採用的灌流速率、生物反應器體積及/或細胞滯留裝置體積。生物反應器體積及/或細胞滯留裝置體積可以被操作、或運作的體積。
滯留時間為細胞以及產物暴露在該系統100之單元操作條件的時間。兩個主要的單元操作為生物反應器101以及細胞滯留裝置102。
依據下列實例可進一步理解本教示的態樣，該等實例無論如何都不應被認為是限制本教示的範疇。
100‧‧‧灌流生物反應器培養系統
101‧‧‧生物反應器
102‧‧‧細胞滯留裝置
103‧‧‧培養基容器
104‧‧‧收取器
105‧‧‧生物反應器入口
106‧‧‧生物反應器出口
107‧‧‧出口
108‧‧‧出口
200‧‧‧方法
201‧‧‧步驟
202‧‧‧步驟
203‧‧‧步驟
204‧‧‧步驟
300‧‧‧方法
301‧‧‧步驟
302‧‧‧步驟
303‧‧‧步驟
304‧‧‧步驟
400‧‧‧方法
401‧‧‧步驟
402‧‧‧步驟
403‧‧‧步驟
404‧‧‧步驟
第1圖顯示灌流生物反應器系統的概略具體例。
第2圖顯示就CSPR逐步減低而言，隨著1L灌流培養(X軸，以天數計)，呈Y軸的活細胞密度(菱形)以及相對CSPR(正方形)的圖式。以相對單位提供CSPR。
第3圖顯示隨著逐步減低CSPR，來自1L灌流細胞培養物之樣品的活細胞密度(VCD，菱形)以及顯示為經常規化效力之效力(正方形)的圖式。
第4A-B圖顯示在不同CSPR下，相對於計得效力之觀察平均效力差異(以%計)的條狀圖(A)以及圖式(B)。算得效力設為100%。
第5圖顯示葡萄糖與乳糖的代謝數據圖式，在1L灌流細胞培養期間隨著CSPR時間框架逐步降低(以天數計)，其中CSPR的相對變化被指明。
第6圖顯示在上清液中的FVIII活性降低的圖式(用過的培養基/收取的培養液)：實驗，在37℃下培育9小時。殘餘FVIII活性以對照組百分比顯示。
第7圖顯示使用FVIII穩定性測試之數據算得的FVIII活性以及由CSPR降低實驗在實驗上測得的活性的比較圖式。在不同CSPR程度下算得的滴定量以%顯示，其中100%為天然FVIII的起始效力。
第8A-B圖顯示使用不同生物反應器與細胞滯留裝置比例，活細胞密度與目標CSPR速率(A)，以及生物反應器樣品中的FVIII效力(B)的圖式。
第9A-B圖顯示麩醯胺酸以及麩胺酸的圖式。樣品中濃度(A)以及FVIII生產細胞的比生長速率(B)。
第10A-B圖顯示生物反應器系統在不同CSPR與生物反應器工作體積下的生產力(A)以及在不同培養CSPR下每1L培養物的算得生產力(B)。
第11A-B圖顯示添加安定劑可(劑量依賴地)因為在生物反應器中的滯留時間增加而降低效力損失(~13-15%)，但不會抵銷總損失(~23%)。
第12圖顯示說明依據具體例之使灌流生物反應器系統最適化之方法的流程圖。
第13圖顯示說明依據具體例之使灌流生物反應器系統最適化之另一方法的另一流程圖。
第14圖顯示說明依據具體例之使灌流生物反應器系統最適化之另一方法的又另一流程圖。
實例1：降低起始灌流速率以及增加培養基組分的效用
在本實例中，使用濃化(enriched)培養基與在1L工作體積下操作並且配備有375mL沉降槽型細胞滯留裝置102以供細胞滯留之用的生物反應器容器101。在約25 x 106細胞/mL的細胞密度下使生產rhFVIII(KG-FS的一種活性成分)的BHK細胞生長至達到穩態。在這個具體例中，起始灌流速率(對照速率)維持在11倍體積/天的高速率下歷時5天。建立兩個系統。在實驗系統中，使用新穎的VM2培養基，依據測得的細胞密度藉由調整收取 泵速度來逐步地將灌流速率降低至起始灌流速率的0.83、0.67以及0.5分。將培養物維持在各個灌流速率程度歷時5天且收集樣品以供效力測試之用(表1)。細胞可活性(第2圖)以及代謝(第5圖)未明顯受到灌流速率改變所影響。在較低的灌流速率下，乳糖增加，但其在對照生物反應器運作時於11倍體積/D的灌流速率下於將近運作後期時也增加(第5圖)。生長速率明顯未受到灌流速率改變的影響，但不是因為清除速率未改變，也不是因為可活細胞密度(VCD)在灌流速率降低實驗時維持穩定地高之故(第2圖)。在另一個對照系統中，11倍體積/天灌流速率在整個運作期間都維持恆定(未示出)。分析收集樣品的FVIII活性。
R3為經調整之以DMEM-F12(1：1)為基礎的培養基，而VM2為一種經濃化之以DMEM-F12為基礎的培養基(包括特定增強物)。如所示，隨著灌流速率降低的每一個等級，FVIII滴定量增加(第4A-4B圖)。在5.5倍體積/天的灌流速率程度下，相較於在11倍體積/天之初始灌流速率，平均效力還高出約50%(第3圖)。在對照發酵槽中，FVIII活性維持在穩定程度(未示出)。但是，儘管當灌流速率降低一半時的效力增加~50%，但其與算出的效力並不相稱，算出的效力應有增加100%(亦即當灌流速率降低一半時，效力倍增)-以獲得相同的輸出物/單元操作。
測得以及算得的數值間的差異隨著每個減少等級而增加至比在5.5倍體積/天下所預期者還少約23%(一半的一般灌流速率，在一般灌流速率下培養基體積的一半)(第4A-4B圖)。
透過使用一半培養基體積(約一半的培養基成本)以新穎VM2培養基來降低灌流速率，相較於一般灌流發酵，在收取物中FVIII有超出50%的活性(而不是超過100%以提供相同的輸出物)。
所觀察到的滴定量以及計得的滴定量間的比較顯示，相較於計得的數值，測得的FVIII活性較低。因此，細胞培養系統的生產力被發現在較低的灌流速率下較低。
實施例2：FVIII穩定性
為了檢驗滯留時間對於FVIII活性之不穩定的影響，使用來自穩態灌流培養物的新鮮生物反應器樣品。
藉由離心移除細胞，以避免生產更多FVIII，並於37℃的培養箱中，在經細胞培養物刺激的條件下於迴轉管中培育上清液。
在規定時間點，取得樣品以供FVIII測定之用。結果顯示，FVIII活性在培育第一天內從100%大幅降低至約60%，而在進一步培育期間則降低較為緩慢(第6圖)。
增加滯留時間明顯以不利的方式影響FVIII活性。
使用FVIII活性之時間依賴性降低的數據，計算出因為在灌流速率降低實驗(實驗1)期間滯留時間增加所致FVIII活性的理論性降低，並將其與第4A-4B圖中的實驗活性相比對。比較結果顯示，所觀察到的滴定量以及計得之滴定量間的差異可能部分是因為FVIII在長滯留時間期間於灌流速率降低下的不穩定性造成(第6圖)。然而，FVIII穩定性喪失不是在灌流速率降低下效力整體降低的原因。
實例3：灌流速率降低結合增加生物反應器工作體積
實例2顯示灌流速率降低因為滯留時間較長而受到FVIII效力損失所限制。
為了要克服延長滯留時間的負面影響，測試增加生物反應器工作體積對細胞滯留裝置體積(例如沉降槽體積)之比例。
如表2中所歸納般，以灌流速率降低結合工作體積增加來進行灌流培養。在以9 x 106細胞/mL接種後約3天內，細胞生長至約24 x 106細胞/ml的穩態細胞密度。在收集設定於一般灌流速率之11倍體積/天(1X)的數據歷時約14天(時期1)後，藉由降低收取流速並維持恆定細胞密度為約24 x 106細胞/mL(時期2)，灌流速率目標為8.5倍體積/d(0.78X)歷時12天。關於細胞培養12天之後，藉由調整水平感測器，將生物反應器101的工作體積從1L增加至1.3L(時期3)。細胞密度維持在24 x 106細胞/mL且灌流速率目標為8.5倍體積/d(表2，第8A圖)。
在本實例中使用以標準DMEM-F12為基礎的生產培養基，該培養基表面上含有足夠養分在測試的灌流速率下供常規細胞培養實施之用。在灌流速率降低期間，葡萄糖濃度維持在高於0.8g/L，而在灌流速率為8.5倍體積/天(0.78X)期間，麩醯胺酸濃度為約1mM。在降低灌流速率或增加生物反應器的工作體積之後，對於細胞生長沒有明顯的影響(第9圖)。
在將灌流速率從11倍體積/天(1X)降低至8.5倍體積/天(0.78X，第8圖)之後，樣品的FVIII活性高出約10%。系統的計算生產力降低至在時期1期間生產力的約86%(第10A-10B圖，表1)。這與實例2一致(參見第4A-4B圖)。
在時期3中，生物反應器101的工作體積/CRD 102的工作體積的工作體積比從1X增加至1.3X，同時維持灌流速率降低為0.78X，且因而增加培養體積對CRD體積的比例，使得在CRD 102中的培養滯留時間降低以及細胞生產力損失。
更確切地說，FVIII活性在這個時期期間增加(參見第10A-10B圖)。
相較於使用1X工作體積以及灌流速率為11倍體積/天(1X)的系統的生產力，算出的系統的生產力顯示增加127%。這接近於針對1.3X工作體積所算出的生產力為130%(第10A-10B圖，第3圖)。
對1X培養體積進行常規化，時期3算出的生產力與在標準條件下的培養物生產力相同(98%對100%，表3)。
這證明，降低細胞特異性灌流速率CSPR達至少30%，同時維持細胞特異性與整體系統生產力是可行的，因為在收取物中的FVIII濃度按比例增加。
11倍體積/天以及8.5倍體積/天分別對應於1X以及0.78X；細胞密度為約：24x106細胞/mL。FVIII的總滯留時間由在生產生物反應器中的滯留時間(生物反應器體積Vpr中的Tpr)以及在非生產沉降槽(沉降槽體積Vnpr中的Tnpr)的滯留時間所組成。因此，FVIII的平均滯留時間(TR)如下(V培養基：每24小時的培養基總體積)：TR=Tpr+Tnpr=Vpr/V培養基x 24小時+Vnpr/V培養基x 24小時
在表4中，顯示不同發酵條件的滯留時間。生產力與Tnpr呈反比。Tpr增加的效用對生產力似乎具有較少影響。
現有FVIII生產系統的Tnpr因為沉降槽/生物反應器體積較小；使用11倍體積/天的相同灌流速率以及細胞密度僅有約1L工作體積系統之Tnpr的一半。
假設細胞密度為24x106細胞/mL。
實例4：實例1-3的材料與方法 灌流細胞培養
為了將製程擴大，使用R3生產培養基將表現重組型人類FVIII(KG-FS的一種活性成分)的重組型BHK細胞接種於震盪燒瓶中。在35.5℃及30rpm下接種燒瓶並連續地分離直到出現所需的細胞數量。
在DASGIP控制台上，由製程擴大而來的細胞以9 x 106vc/mL接種至工作體積為1L之1.5L DASGIP容器中。藉由控制培養基泵的水平感測器將工作體積維持於恆定。
使用CRD(例如，0.375mL體積的細胞沉降槽)在細胞累積期間以7.3倍體積/天的目標CSPR而根據測得細胞密度藉由調整收取泵在穩態下以11倍體積/天來建立灌流。灌流速率是由經預先校正的收取泵計得，但亦藉由收取物體積來進行檢核。實際灌流速率均與藉由校正所預測的體積相等。使用檯式恆溫器將溫度控制在35.5℃下而藉由在設定於16-18℃之冷卻水浴來冷卻通向CRD的配管將CRD溫度控制在20-23℃。通氣是由矽管通 氣機提供，其中氣體中的氧分壓受到溶氧控制器所控制。一般在穩態期間的氧分壓為70%至80%。反壓維持在0.5至0.6巴。在穩態下的細胞密度目標為25 x 106vc/mL並控制維持溶氧足量。藉由頂部空間通氣5L/小時提供補充通氣。藉由添加4%碳酸鈉溶液將培養物pH控制在目標為6.85。
關於降低灌流速率，收取泵設定成適當泵速率，而細胞密度維持恆定。調整氧氣供給以符合控制設定點。
若需要的話，藉由將水平感測器拉至適當位置而將工作體積比從1X增加至1.3X。藉由增加混合氣體中的氧分壓來調整氧氣供給，以將細胞密度維持在所需程度。
從反應器容器中使用外部取樣泵(Watson Marlow 101U/R,Watson Marlow,Inc.,Wilmington,MA)取出細胞培養物的樣品並使用細胞計數系統(Cedex XS analyzer,Innovatis,UK)以及兩個YSI 2700s(一者測量葡萄糖以及乳糖，而另一者測量麩醯胺酸以及麩胺酸)對細胞密度與可活性來進行分析。藉由添加鈣(至20mM)使得樣品中的因子VIII得以穩定、冷凍於-70度C並且稍後藉由顯色分析來分析rFVIII(重組型FVIII)效力。
顯色效力分析法包括兩個連續步驟，其中顯色強度與樣品中的因子VIII活性呈比例。在第一個步驟中，因子X藉由因子IXa與其輔因子(因子VIIIa)在最適量鈣離子以及磷脂存在下活化成因子Xa。出現過量的因子X，使得因子X的活化速率僅會視因子VIII的數量而定。在第二個步驟中，因子Xa水解顯色受質以產生發色團，並在405nm下以分光光度的方式讀取顯色強度。計算未知品的效力並使用線性回歸統計方法檢核分析的有效性。活性以國際單位/mL(IU/mL)來記述。
FVIII穩定性測試
自1L工作體積的灌流培養物收集14mL的無細胞(經離心)培養物上清液並轉移至有排氣孔蓋的50mL迴轉管，該灌流培養物以11倍體積 /天的細胞特異性灌流速率生長在普通R3培養基中。與20mM鈣一起冷凍的上清液樣品用作為對照。在37℃、5% CO2與80%濕度下以30rpm培育試管。在規定時間點取得樣品，若需要的話添加鈣以使得所有樣品的最終濃度為20mM，且儲存在-80℃下直到測試FVIII活性。所有實驗重複進行兩次。
培養基調配 濃化培養基VM2的設計
就VM2培養基而言，以2X濃度使用大多數組分。相對於標準R3培養基(其係依據DMEM/F12呈1：1比例)的改變如下。胺基酸濃度是基於其消耗速率來測定，消耗速率是在已用過培養基分析實驗中計得。低可溶性胱胺酸取代成較高濃度(較可溶)的半胱胺酸。以10mM(R3培養基的2X)加入麩醯胺酸。以與在標準R3培養基中相同的濃度使用鎂，以2X濃度使用微量元素，其中例外為以1X來使用二氧化硒。以2X濃度加入鈣。葡萄糖與甘露糖分別維持於1g/L，以及3g/L，亦即與在標準R3培養基中相同；麩醯胺酸濃度設定為10mM。以與在正常R3(DMEM/F12 1：1)培養基中相同的濃度使用油酸、膽固醇、胰島素以及任何其他添加物。重要的是，未在VM2中引入新的培養基組分(未存在於R3經修飾DMEM/F12培養基中)-僅有改變特定組分的濃度。
總結有關實例1-4的最後評論
在CSPR程度為於FVIII生產時所用之CSPR速率(11倍體積/天)的約一半下，設計濃化培養基調配物以維持充分養分含量。使用標準R3(以DMEM/F12為基礎)生產培養基養分顯示CSPR程度可以從11倍體積/天降低至8.5倍體積/天。這顯示養分限制及/或副產物毒性廢棄物累積在所測試的降低CSPR下不具有限制性。
在灌流速率降低下，假定細胞特異性生產力相同，儘管FVIII 效力增加，增加仍比計得者還低。
FVIII穩定性實驗顯示，在細胞培養系統內的滯留時間越長，會使得FVIII效力喪失，推測是因為分解之故。在(無細胞)穩定性實驗中，FVIII活性降低只能部分解釋在CSPR降低期間，理論性FVIII效力的差距。
現有1L工作體積灌流系統的體積比生物反應器/CRD為2.67，隨著生物反應器/CRD工作體積增加至1.3，體積比增加至3.47。
透過改變生物反應器對CRD體積的比例，細胞在8.5倍體積/天的CSPR下於灌流培養物中的生產力增加至接近與在CSPR為11倍體積/天的系統之生產力相同的程度。
從經濟觀點來看，這可能代表著在上游步驟中利用減少新鮮培養基體積，以及在下游步驟中利用較低的收取體積達至少1.3的因子(factor)來節省成本。
含有FVIII之培養基的滯留時間TR分成Tpr以及Tnpr。上面實例證實主要是Tnpr影響系統的生產力。
因此，另一個生產力最適化的策略可能是藉由將CRD(例如沉降槽)以及連結至其的配管體積盡可能降低而使得Tnpr降至最低。
麩醯胺酸濃度(使用R3培養基在CSPR 8.5倍體積/天下)高於0.6mM，其在先前研究中低於該濃度的生長速率會變得受到限制。在細胞密度為約24 x 106細胞/mL的所述條件下沒有觀察到生長限制。
相較於標準R3培養基中的5mM，使用含有10mM麩醯胺酸的濃化培養基VM2，即便在CRPS速率低如5.5倍體積/天下，麩醯胺酸濃度仍可成功維持在高於2mM。在這些條件下觀察到對生長沒有影響。
儘管結合各種具體例說明本教示，本教示不欲限定於此等具體例。相反地，本教示涵括各種變化、修飾以及等效物，如同習於技藝者所知悉。此外，就任何目的來說，本申請案中引用的所有文獻資料以及類 似資料，包括，但不限於專利案、專利申請案、文獻、書籍、論文明確以其整體併入本文做為參考資料。本文所用段落標題僅是供條理之用，而不欲在任何方面被視為限制所述標的。

Claims (47)

  1. 一種灌流生物反應器培養系統，其包含：一生物反應器，被裝配成容納組織培養液以及待培養細胞；一細胞滯留裝置，被裝配成容納含有來自生物反應器之細胞的組織培養液、將一些細胞與組織培養液分離並提供組織培養液與細胞之收取輸出物，以及將組織培養液與細胞再循環輸出物提供至該生物反應器；其中該系統具有一起始灌流速率、一起始生物反應器體積、一起始細胞滯留裝置體積，以及一起始生物反應器體積與一起始細胞滯留裝置體積的起始體積比；其中降低起始灌流速率，造成細胞在生物反應器和細胞滯留裝置中的滯留時間增加，或增加起始生物反應器體積或降低起始細胞滯留體積，或兩者，造成起始體積比增加。
  2. 如申請專利範圍第1項的灌流生物反應器培養系統，其中降低起始灌流速率，造成細胞在生物反應器和細胞滯留裝置中的滯留時間增加，而起始生物反應器體積增加或起始細胞滯留體積降低，或兩者，造成起始體積比增加。
  3. 如申請專利範圍第2項之灌流生物反應器培養系統，其中起始體積比增加與起始灌流速率降低呈約相同的比例。
  4. 如申請專利範圍第2項之灌流生物反應器培養系統，其中起始灌流速率降低至多約三分之一。
  5. 如申請專利範圍第2項之灌流生物反應器培養系統，其中起始灌流速率降低至多約一半。
  6. 如申請專利範圍第2項之灌流生物反應器培養系統，其中起始生物反應器體積增加約三分之一。
  7. 如申請專利範圍第2項之灌流生物反應器培養系統，其中起始生物反應器體積增加至多約一半。
  8. 如申請專利範圍第2項之灌流生物反應器培養系統，其中起始細胞滯留體積降低至多約三分之一。
  9. 如申請專利範圍第2項之灌流生物反應器培養系統，其中起始細胞滯留體積降低至多約一半。
  10. 如申請專利範圍第2項之灌流生物反應器培養系統，其中該等細胞為哺乳動物細胞。
  11. 如申請專利範圍第10項之灌流生物反應器培養系統，其中該等哺乳動物細胞是選自由下列組成之群：BHK細胞、CHO細胞、HKB細胞、HEK細胞，以及NS0細胞。
  12. 如申請專利範圍第11項之灌流生物反應器培養系統，其中該等哺乳動物細胞是BHK細胞。
  13. 如申請專利範圍第10項之灌流生物反應器培養系統，其中該等哺乳動物細胞是表現重組型因子VIII(rhFVIII)的重組型細胞。
  14. 如申請專利範圍第13項之灌流生物反應器培養系統，其中rhFVIII為KG-FS的一個活性成分。
  15. 如申請專利範圍第2項之灌流生物反應器培養系統，其中起始灌流速率為每天約1至15倍體積。
  16. 如申請專利範圍第2項之灌流生物反應器培養系統，其中起始體積比增加至多約三分之一。
  17. 如申請專利範圍第2項之灌流生物反應器培養系統，其中起始體積比增加至多約一半。
  18. 一種最適化(optimizing)灌流生物反應器系統的方法，其包含：將含有細胞的組織培養液提供至含有一生物反應器與一細胞滯留裝置的生物反應器系統，其中該系統具有一起始灌流速率、一起始生物反應器 體積、一起始細胞滯留裝置體積，與一起始生物反應器體積和一起始細胞滯留體積的起始體積比；以及降低起始灌流速率，造成細胞在生物反應器和細胞滯留裝置中的滯留時間增加，或增加起始生物反應器體積或降低起始細胞滯留裝置體積，或兩者，造成起始體積比增加。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其包含：降低起始灌流速率，造成細胞在生物反應器和細胞滯留裝置中的滯留時間增加，以及增加起始生物反應器體積或降低起始細胞滯留裝置體積，或兩者，造成起始體積比增加。
  20. 如申請專利範圍第18項之方法，其中起始體積比增加與起始灌流速率降低呈約相同的比例。
  21. 如申請專利範圍第18項之方法，其中起始灌流速率降低至多約三分之一。
  22. 如申請專利範圍第18項之方法，其中起始灌流速率降低至多約一半。
  23. 如申請專利範圍第18項之方法，其中起始生物反應器體積增加至多約三分之一。
  24. 如申請專利範圍第18項之方法，其中起始生物反應器體積增加至多約一半。
  25. 如申請專利範圍第18項之方法，其中起始細胞滯留體積降低至多約三分之一。
  26. 如申請專利範圍第18項之方法，其中起始細胞滯留體積降低至多約一半。
  27. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該等細胞為哺乳動物細胞。
  28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該等哺乳動物細胞是選自由下列組成之群：BHK細胞、CHO細胞、HKB細胞、HEK細胞，以及NS0細胞。
  29. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該等哺乳動物細胞是BHK細胞。
  30. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該等哺乳動物細胞是表現重組型人類因子VIII(rhFVIII)的重組型細胞。
  31. 如申請專利範圍第29項之方法，其中rHFVIII為KG-FS的一個活性成分。
  32. 如申請專利範圍第18項之方法，其中起始灌流速率為每天約1至15倍體積。
  33. 如申請專利範圍第18項之方法，其中起始體積比增加至多約三分之一。
  34. 如申請專利範圍第18項之方法，其中起始體積比增加至多約一半。
  35. 一種最適化灌流生物反應器系統的方法，其包含：將含有細胞的第一組織培養液提供至含有一生物反應器與一細胞滯留裝置的生物反應器系統，其中該系統具有一起始灌流速率、一起始生物反應器體積，以及一起始細胞滯留體積；以及降低該起始灌流速率，造成細胞在生物反應器和細胞滯留裝置中的滯留時間增加，以及將該第一組織培養液置換成第二組織培養液，該第二組織培養液相較於該第一組織培養液增加該第一組織培養液之個別組分濃度而未添加新組分。
  36. 如申請專利範圍第35項之方法，其中該等細胞為哺乳動物細胞。
  37. 如申請專利範圍第35項之方法，其中該等哺乳動物細胞是選自由下列組成之群：BHK細胞、CHO細胞、HKB細胞、HEK細胞，以及NS0細胞。
  38. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該等哺乳動物細胞是BHK細胞。
  39. 如申請專利範圍第35項之方法，其中該等哺乳動物細胞是表現重組型人類因子VIII(rhFVIII)的重組型細胞。
  40. 如申請專利範圍第39項之方法，其中rHFVIII為KG-FS的一個活性成分。
  41. 一種最適化灌流生物反應器系統的方法，其包含：將含有表現重組型蛋白質之細胞的第一組織培養液提供至含有一生物反應器與一細胞滯留裝置的生物反應器系統，其中該系統具有一起始灌流速率、一起始生物反應器體積，以及一起始細胞滯留裝置體積；以及 降低該起始灌流速率，造成細胞在生物反應器和細胞滯留裝置中的滯留時間增加，以及添加重組型蛋白質分解的安定劑。
  42. 如申請專利範圍第41項之方法，其中該等細胞為哺乳動物細胞。
  43. 如申請專利範圍第42項之方法，其中該等哺乳動物細胞是選自由下列組成之群：BHK細胞、CHO細胞、HKB細胞、HEK細胞，以及NS0細胞。
  44. 如申請專利範圍第42項之方法，其中該等哺乳動物細胞是BHK細胞。
  45. 如申請專利範圍第42項之方法，其中該等哺乳動物細胞是表現因子VIII(rhFVIII)的重組型細胞。
  46. 如申請專利範圍第45項之方法，其中rHFVIII為KG-FS的一個活性成分。
  47. 如申請專利範圍第41項之方法，其中該安定劑為鈣。
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