KR20150063541A - 관류 세포배양 시스템을 최적화하기 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

관류 세포배양 시스템을 최적화하기 위한 방법 및 시스템 Download PDF

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유발 시모니
볼커 묄레
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바이엘 헬스케어 엘엘씨
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Abstract

관류배양 시스템과 방법을 기술하였다. 본 시스템과 방법은 출발 관류속도를 저감하여 바이오반응기와 세포 체류장치에서 세포의 체류시간을 증가하거나/하고, 부수적으로 출발 바이오반응기 부피를 증가하거나 출발 세포 장류장치 부피를 감소하거나 둘 다를 수행하는 것에 관한 것이다. 다른 방법과 구체예는 조직배양액의 개별 성분 농도를 증가하고, 재조합 단백질 분해 안정화제를 첨가하는 것을 포함한다.

Description

관류 세포배양 시스템을 최적화하기 위한 방법 및 시스템{METHODS AND SYSTEMS FOR OPTIMIZING PERFUSION CELL CULTURE SYSTEM}
본 원은 2012년 10월 10일자로 제출된 "관류 세포배양 시스템을 최적화하기 위한 방법 및 시스템" 제하의 미국 가특허출원 제61/712,190호(대리인 서류 번호 BHC125019(BH-021L))에 대해 우선권을 주장하며, 이 출원은 본 원에서 다목적으로 그 전체가 참고로 인용되었다.
재조합 단백질, 예컨대 rhFVIII(재조합인간인자 VIII 단백질, 미국 캘리포니아주 버클리 소재의 Bayer Healthcare가 제조하는 Kogenate® FS, 또는 KG-FS의 활성성분)은 대개 관류 연속 세포배양방법으로 생산된다. 이 시스템의 중요한 제어 매개변수는 세포 특이적 관류속도(본 원에서는 관류속도 또는 CSPR이라고도 칭함)이며, 이것은 일일 세포당 관류된 배지 부피(부피/C/D) 또는 일일 부피로 계산될 수 있다. 세포 배양배지는 전체 생산비용에 상당히 기여하며, 세포 활력 및/또는 생산 수율과 생산 품질과 관련하여 최적인 관류속도를 낮게 사용하는데 노력하는 이유 중 하나이다. 또한, 단백질 수율이 유지될 수 있다면, 더 낮은 관류속도가 설비 용량을 증가할 수 있고 기반시설에 대한 최소한의 변화로 생산의 가동성을 제공할 수 있다.
상대적으로 높은 관류속도는 충분한 영양분이 확실하게 세포 배양에 제공되도록 하지만, 또한 생성물을 희석하여 수확 부피가 더 늘어난다. 반면, 낮은 관류속도는 생성물 희석을 줄이지만 그의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 바이오반응기 조건 하 분자의 증가된 체류시간은 프로테아제 또는 분해를 촉진할 수 있는 다른 인자에 분자를 노출할 수 있다. 낮은 관류속도는 또한 영양분이 그의 농도로 제한되면(또는 부산물이 생성되면) 세포 기능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 단순히 관류속도를 저감하는 것은 충분하지 않다.
그러므로, 단백질 생성물의 최적 세포 생산을 위한 부산물 소거와 충분한 영양분을 제공하는 가장 낮은 관류속도는 수율이 높지만 -관류속도의 변화가 생성물 안정성에 영향을 미치지 않는 한- 더 적은 조직 배양 배지(본 원에서는 조직 배양 유동액, 조직/세포 배양배지, 또는 배지들/배지로도 칭함)를 필요로 한다. 따라서, 관류속도는 세포 특이적 생산성 및 생성물 안정성에 대해 최적화되어야 한다.
관류속도의 변화는 또한 체류시간(세포와 생성물이 시스템의 단위-작동 조건에 노출되는 평균시간)에 영향을 미친다. 재조합 단백질, 예컨대 재조합 FVIII을 제조하기 위한 관류 바이오반응기 시스템의 두 가지 중요한 단위 작동은 바이오반응기와 세포 체류장치(본 원에서는 CRD라고도 칭함), 예를 들어 침강수조(settler)에서 발생한다. 이 바이오반응기는 최적화되어 이상적인 세포 배양조건(예를 들어, 생리적 온도와 적절한 산소화)으로 조절되지만, 일반적인 세포 체류장치는 세포를 유지하고 바이오반응기로 재순환하도록 설계 및 최적화된다. CRD는 일반적으로 바이오반응기의 이상적 배양조건을 제공하도록 설계되지 않기 때문에 높은 세포 농도와 비이상적 조건의 조합은 바람직하지 않은 상태에 있을 수 있다. 이러한 조건을 완화하기 위해 냉각과 같은 방법을 적용하여 농축된 세포 덩어리의 대사속도를 저하한다. 전형적으로, 세포 체류장치 내의 조건은 세포 대사를 저하하여, 결과적으로 세포 생산성을 감소할 것으로 예상된다.
관류 시스템에 있어서, 세포(및 생성물/부산물)는 바이오반응기와 세포 체류장치 사이를 연속 순환한다. 따라서, 세포는 세포 생산성에 유리한 조건(즉, 바이오반응기)과 생산성이 일반적으로 낮은 조건(예를 들어, CRD) 사이를 순환한다. 외부적 차선 환경(예를 들어, CRD 내)에서 상당한 시간을 소모하는 관류 시스템에서 세포의 문제는 당 분야에서 잘 알려져 있다(Bonham-Carter and Shevitz, BioProcess Intl. 9(9) Oct. 2011, pp. 24-30 참조). 또한, 세포가 CRD에서 더 오래 체류할수록 세포가 바이오반응기로 돌아왔을 때 회복이 더 오래 걸릴 수 있다. 이것으로 시스템 생산성이 추가 감소할 수 있다.
재조합 단백질 생성물, 예컨대 FVIII은 연속 배지 수집에 의해 수확될 수 있다. FVIII 생성물의 활성은 또한 바이오반응기에서 사용된 온도에서 시간에 따라 감소한다. 그러므로, 관류속도를 저감하여 체류시간을 증가시키는 것은 활성인 재조합 단백질 생성물의 축적을 저하시킬 수 있다.
따라서, 여전히 낮은 관류속도를 갖는 관류 바이오반응기 시스템과 방법이 높은 재조합 단백질 생산성을 갖는 것이 필요하다.
요약
일 측면에서, 바이오반응기와 세포 체류장치를 갖는 관류 바이오반응기 배양 시스템이 제공된다. 관류 바이오반응기 배양 시스템은 출발 관류속도, 출발 바이오반응기 부피, 및 출발 세포 체류장치 부피를 포함한다. 본 시스템은 출발 관류속도를 감소하여 바이오반응기와 세포 체류장치(retention device)에서 세포의 체류시간을 증가하고, 부수적으로 출발 바이오반응기 부피를 증가하거나 출발 세포 체류부피를 감소하는 것 또는 이들 모두에 관한 것이다. 본 시스템은 CRD 조건에서 세포의 최적 체류시간을 얻기 위해 관류속도, 바이오반응기 작업 부피(working volume) 또는 CRD 작업 부피를 변화하는 것에 관한 것이다.
다른 측면에서, 관류 바이오반응기 시스템을 최적화하는 방법을 제공한다. 본 방법은 세포를 함유하는 조직배양액(본 원에서는 조직 배양배지라고도 칭함)을, 바이오반응기와 세포 체류장치를 포함하는 바이오반응기 시스템(여기서 시스템은 출발 관류속도, 출발 바이오반응기 부피, 및 출발 세포 체류장치 부피를 갖는다)에 제공하여 출발 관류속도를 저감하고, 그 결과 바이오반응기와 세포 체류장치에서 세포의 체류시간을 증가하여 출발 바이오반응기 부피를 증가하거나 출발 세포 체류부피를 감소하거나 둘다를 포함한다. 본 방법은 CRD 조건에서 세포의 최적 체류시간을 얻기 위해 관류속도, 바이오반응기 작업 부피 또는 CRD 작업 부피를 변화하는 것에 관한 것이다.
다른 방법 측면에서, 관류 바이오반응기 시스템을 최적화하는 방법을 제공한다. 본 방법은 세포를 함유하는 제1 조직배양액을 바이오반응기와 세포 체류장치를 포함하는 바이오반응기 시스템에 제공하고(여기서 시스템은 출발 관류속도, 출발 바이오반응기 장치 부피, 및 출발 세포 체류부피를 갖는다); 출발 관류속도를 저감하여 바이오반응기와 세포 체류장치에서 세포의 체류시간을 증가하고, 제1 조직배양액과 비교하여 대체 또는 농도 변화로 세포 배양의 개별 성분들을 조절하는 제2 조직배양액을 제1 조직배양액으로 대체하는 것을 포함한다.
다른 방법 측면에서, 관류 바이오반응기 시스템을 최적화하는 방법이 제공된다. 본 방법은 재조합 단백질을 발현하는 세포를 함유하는 제1 조직배양액을 바이오반응기와 세포 체류장치를 포함하는 바이오반응기 시스템에 제공하고(여기서 시스템은 출발 관류속도, 출발 바이오반응기 부피, 및 출발 세포 체류장치 부피를 갖는다); 출발 관류속도를 저감하여 바이오반응기와 세포 체류장치에서 세포의 체류시간을 증가하고, 재조합 단백질의 안정화제를 첨가하여 분해를 감소하는 것을 포함한다.
본 발명 요지의 이러한 특징과 다른 특징을 본 원에 기재하였다.
당업자들이라면 이하에 기술된 도면들이 단지 예시를 목적으로 하는 것을 이해할 것이다. 도면들은 어떠한 이유로도 본 발명의 범위를 제한하지 않아야 한다.
도 1은 관류 바이오반응기 시스템의 도해적 구체예를 나타낸 것이다.
도 2는 CSPR의 단계적 감소 동안 1L 관류 배양(X-축, 기간(일))에 따른 상대적 CSPR(사각형)과 생균밀도(마름모)(Y-축)의 그래프를 나타낸 것이다. CSPR은 상대적 단위로 제공되었다.
도 3은 CSPR의 단계적 감소에 따른 1L 관류 세포배양으로부터 샘플의, 정규화된 포텐시로 나타낸 포텐시(사각형)와 생균밀도(VCD, 마름모)의 그래프를 나타낸 것이다.
도 4A-B는 상이한 CSPR에서 계산 포텐시에 대해 관찰된 평균 포텐시 차이(%)의 막대 (A) 및 그래프 (B)를 나타낸 것이다. 계산 포텐시는 100%로 설정하였다.
도 5는 CSPR 시간(일) 내에 단계적 감소하면서 1L 관류 세포배양 동안 글루코스와 락테이트의 대사 결과의 그래프를 나타낸 것으로, CSPR의 상대적 변화를 표시하였다.
도 6은 상징액(소모된 배지/수확된 배양액)에서 FVIII 활성 감소의 그래프를 나타낸 것이다: 실험, 37℃, 9시간 동안 인큐베이션. 잔류 FVIII 활성은 대조군의 백분율로 나타내었다.
도 7은 FVIII 안정성 시험의 데이터를 사용한 계산된 FVIII 활성과 CSPR 감소 실험으로부터 실험적으로 측정된 활성의 비교 그래프이다. 상이한 CSPR 농도에서의 계산된 역가를 %로 기재하였고 100%는 발생기 FVIII의 초기 포텐시이다.
도 8A-B는 상이한 비율의 바이오반응기와 세포 체류장치를 사용하는 바이오반응기 샘플에서 생균 밀도와 표적화 CSPR 속도 (A) 및 FVIII 포텐시 (B)의 그래프를 나타낸 것이다.
도 9A-B는 글루타민과 글루타메이트의 그래프를 나타낸 것이다. (A) 샘플의 농도 및 (B) FVIII 생산 세포의 특이적 생장율.
도 10A-B는 (A) 상이한 CSPR에서 바이오반응기 시스템의 생산성과 바이오반응기 작업 부피 및 (B) 상이한 배양 CSPR에서 1L 배양 당 계산된 생산성의 그래프를 나타낸 것이다.
도 11A-B는 첨가된 안정화제가 바이오반응기에서 체류시간 증가로 인해 포텐시 손실(~ 13-15%)을 (용량 의존적으로)줄일 수 있지만 전체 손실(~ 23%)을 보상하지 않는 것을 나타내고 있다
도 12는 구체예에 따른 관류 바이오반응기 시스템의 최적화 방법을 나타낸 흐름도이다.
도 13은 구체예에 따른 관류 바이오반응기 시스템의 다른 최적화 방법을 나타낸 흐름도이다.
도 14는 구체예에 따른 관류 바이오반응기 시스템의 또다른 최적화 방법을 나타낸 흐름도이다.
다양한 구체예의 설명
본 발명의 구체예는 관류 세포배양 시스템의 생산 용량을 증가하는 방법 및 시스템을 제공한다.
관류속도 감소는 바이오반응기에서뿐만 아니라 CRD에서도 세포 (및 재조합 단백질/FVIII 생성물) 체류시간을 증가하여 활성 재조합 단백질 생성물, 예컨대 FVIII의 생산을 감소한다. 특정 구체예에서, 관류속도의 감소는 바이오반응기의 상대적 부피를 CDR로 변화시켜서 보충된다. 일부 구체예에서, 부피의 변화는 대략 관류속도의 감소와 동일한 비율이다. 예를 들어, 관류속도의 절반 감소는 바이오반응기 대 CRD의 부피비의 부수적 더블링으로 얻어진다. 본 발명의 구체예에 따른 시스템과 방법은 재조합 단백질 생성물을 왕성하게 생산할 수 있다. 관류속도의 감소는 또한 조직 배양배지 성분들의 조절, 또는 단백질 생성물(들)의 분해를 저감하는 안정화제(예컨대, 재조합 FVIII, 즉 rFVIII를 위한 칼슘)를 첨가하여 보충할 수 있다.
관류 세포배양 시스템은 2가지 중요한 단위 작업기: 즉 일반적으로 재조합 단백질 생산(예컨대 rFVIII)에 조건이 최적인 바이오반응기 및, 산소 제어 결손과 바이오반응기의 생리적 온도와 비교하여 일반적으로 낮은 작업 온도로 인해 재조합 단백질 생성물/rFVIII 생산에 조건이 최적화되지 않은 CRD(예를 들어, 침강수조)를 포함한다. 따라서, 세포배양은 세포 생산성과 재조합 단백질 생성물/rFVIII 생산에 도움이 되는, 및 도움이 되지 않는 환경 사이의 튜빙(tubing)을 통해 연속적으로 순환한다. 또한, 바이오반응기에 비하여 CRD 내에서 세포의 체류시간이 길수록 낮은 세포 대사상태에서 높은 상태로의 세포 전이로 인해 생산성의 예상 손실이 더 늘어난다.
도 1은 관류 바이오반응기 배양 시스템 (100)의 구체예의 블록 다이아그램을 나타낸 것이다. 관류 바이오반응기 배양 시스템 (100)은 바이오반응기 유입구 (105)와 바이오반응기 배출구 (106)를 갖는 바이오반응기 (101)을 포함한다. 바이오반응기 (101)은 조직배양액(TCF)과 배양될 세포를 담기 위해 설치된 배양 챔버를 포함한다. 관류 바이오반응기 배양 시스템 (100)은 세포 체류장치 (CRD) (102)를 포함하고, 이것은 세포 응집 트랩 또는 다른 적합한 세포 분리기를 포함할 수 있다. 세포 체류장치 (102)는 조직배양액과 세포를 바이오반응기 (101)로 재순환하는 배출구 (107)을 갖는다. 세포 체류장치 (102)는 또한 다른 배출구 (108)을 가지며, 이것은 단지 소량의 세포를 포함하는 조직배양액의 수확 배출물을 재조합 단백질 생성물의 단리와 정제를 위한 무세포 하베스트 (cell-free harvest)(104)로 보낸다. 관류 바이오반응기 배양 시스템 (100)은 또한 배지 용기 (103)를 포함하며, 이것은 새로운 조직배양액을 바이오반응기로 유입구 (105)를 통해서 보낸다. 관류 바이오반응기 시스템 (100)은 응고제 인자 같은 생물학적 물질의 생산에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 원에 기술된 관류 바이오반응기 배양 시스템 (100)과 방법은 단백질 생성물, 예를 들어 재조합 단백질 생성물과 응고제 인자, 예컨대 Factor VII, VIII, 또는 Factor IX, 또는 다른 적합한 인자 또는 물질을 제조하는데 사용될 수 있다.
시스템 구체예에 있어서는 관류 바이오반응기 배양 시스템 (100)이 제공된다. 본 시스템은: 조직배양액과 배양될 세포를 함유하도록 설치된 바이오반응기 (101); 바이오반응기 (101)에서 세포를 함유하는 조직배양액을 수용하여 조직배양액으로부터 일부 세포를 분리하고 조직배양액과 세포의 수확 배출물을 제공하고, 바이오반응기 (101)에 조직배양액과 세포의 재순환 배출물을 제공하도록 설치된 CRD (102)를 포함한다. 시스템 (100)은 출발 관류속도 (제1 관류속도), 출발 바이오반응기 부피 (제1 바이오반응기 부피), 출발 세포 체류장치 부피 (제1 출발 세포 체류장치 부피), 및 출발 바이오반응기 부피와 출발 세포 체류장치 부피의 출발 부피비(제1 부피비)를 갖는다. 하나 이상의 구체예에서는, 출발 관류속도가 (제2 관류속도로)감소하여, 그 결과 바이오반응기 (101)와 세포 체류장치 (102)에서 세포의 체류시간이 증가한다. 추가적으로 또는 선택적으로, 출발 바이오반응기 부피는 (제2 바이오반응기 부피로)증가하거나, 출발 세포 체류장치 부피가 (제2 세포 체류장치 부피로) 감소하거나, 이들 모두가 발생하여 출발 부피비가 (제2 부피비로) 증가한다.
하나 이상의 구체예에서, 출발 부피비의 증가는 대략 출발 관류속도의 감소와 같은 비율 내이다. 특정 구체예에서, 출발 관류속도는 약 1/3에서 약 2/3까지의 범위로 감소한다. 다른 구체예에서, 출발 관류속도는 최대 약 1/3까지 감소한다. 다른 구체예에서, 출발 관류속도는 최대 약 1/2까지, 그리고 또다른 구체예에서 출발 관류속도는 최대 약 2/3까지 감소한다. 일부 구체예에서, 출발 바이오반응기 부피는 약 1/3 내지 약 2/3까지 증가하고; 다른 구체예에서, 출발 바이오반응기 부피는 최대 약 1/3까지 증가한다. 다른 구체예에서, 출발 바이오반응기 부피는 최대 약 1/2까지, 그리고 또다른 구체예에서 출발 바이오반응기 부피는 최대 약 2/3까지 증가한다.
하나 이상의 구체예에서, 출발 세포 체류장치 부피는 약 1/3 내지 약 2/3까지 감소한다. 일부 구체예에서, 출발 세포 체류장치 부피는 최대 약 1/3까지 감소한다. 일부 구체예에서, 출발 세포 체류장치 부피는 최대 약 1/2까지, 그리고 또다른 구체예에서 출발 세포 체류장치 부피는 최대 약 2/3까지 감소한다.
하나 이상의 구체예에서, 출발 부피비는 약 1/3 내지 약 2/3까지 증가한다. 일부 구체예에서, 출발 부피비는 최대 약 1/3까지 증가한다. 일부 구체예에서, 출발 부피비는 최대 약 1/2까지, 그리고 또다른 구체예에서 출발 부피비는 최대 약 2/3까지 증가한다. 특정 구체예에서, 출발 관류속도는 일일 약 1 내지 15 부피이다.
관류 바이오반응기 배양 시스템 (100)을 최적화하는 방법을 이하에서 도 12를 참조로 설명하였다. 관류 바이오반응기 배양 시스템 (100)을 최적화하는 한 방법 (200)은, (201)에서 세포를 함유하는 조직배양액을 바이오반응기와 세포 체류장치를 포함하는 바이오반응기 시스템에 제공하는 것을 포함하고, 여기서 본 시스템은 출발 관류속도 (제1 관류속도), 출발 바이오반응기 부피 (제1 바이오반응기 부피), 출발 세포 체류장치 부피(제1 세포 체류장치 부피), 및 출발 바이오반응기 부피와 출발 세포 체류장치 부피의 출발 부피비 (제1 부피비)를 갖는다. 본 방법은 또한 출발 관류속도를 (제2 관류속도로)감소하여, 그 결과 (203)에서 바이오반응기와 세포 체류장치 내에서 세포의 체류시간을 증가하거나/하고, (204)에서 출발 바이오반응기 부피를 (제2 바이오반응기 부피로)증가하거나 출발 세포 체류부피를 (제2 세포 체류부피로)감소하거나 둘다에 의해 출발 부피비를 (제2 부피비로) 증가하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 출발 부피비의 증가는 출발 관류속도의 감소와 대략 같은 비율이다. 일부 구체예에서, 출발 관류속도는 약 1/3 내지 약 2/3의 범위 내로 감소한다. 다른 구체예에서, 출발 관류속도는 최대 약 1/3까지 감소한다. 다른 구체예에서, 출발 관류속도는 최대 약 1/2까지, 그리고 또다른 구체예에서 출발 관류속도는 최대 약 2/3까지 감소한다.
특정 구체예에서, 출발 바이오반응기 부피는 약 1/3 내지 약 2/3까지 증가한다. 일부 구체예에서, 출발 바이오반응기 부피는 최대 약 1/3까지 증가한다. 다른 구체예에서, 출발 바이오반응기 부피는 최대 약 1/2까지, 그리고 또다른 구체예에서 출발 바이오반응기 부피는 최대 약 2/3까지 증가한다.
다른 구체예에서, 출발 세포 체류장치 부피는 약 1/3 내지 약 2/3까지 감소한다. 일부 구체예에서, 출발 세포 체류장치 부피는 최대 약 1/3까지 감소한다. 다른 구체예에서, 출발 세포 체류장치 부피는 최대 약 1/2까지, 그리고 또다른 구체예에서 출발 세포 체류장치 부피는 최대 약 2/3까지 감소한다.
일부 구체예에서, 출발 부피비는 약 1/3 내지 약 2/3까지 증가한다. 일부 구체예에서, 출발 부피비는 최대 약 1/3까지 증가한다. 다른 구체예에서, 출발 부피비는 최대 약 1/2까지, 그리고 또다른 구체예에서 출발 부피비는 최대 약 2/3까지 증가한다. 특정 구체예에서, 출발 관류속도는 일일 약 1 내지 15 부피이다.
관류 바이오반응기 배양 시스템 (100)을 최적화하는 또다른 방법을 이하에서 도 13을 참조로 설명하였다. 관류 바이오반응기 배양 시스템 (100)을 최적화하는 한 방법 (300)은, (301)에서 세포를 함유하는 조직배양액을 바이오반응기와 세포 체류장치를 포함하는 바이오반응기 시스템에 제공하는 것을 포함하고, 여기서 본 시스템은 출발 관류속도 (제1 관류속도), 출발 바이오반응기 부피, 및 출발 세포 체류장치 부피를 갖는다. 또한, 본 방법 (300)은 (302)에서 출발 관류속도를 (제2 관류속도로)감소하는 것을 포함한다. 그 결과, (303)에서 바이오반응기와 세포 체류장치 내에서 세포의 체류시간이 증가한다. 본 방법 (300)은 또한 (304)에서 제1 조직배양액과 비교하여 증가된 농도의 제1 조직배양액의 개별 성분을 갖고 새로운 성분 추가가 없는 제2 조직배양액을 제1 조직배양액으로 대체하는 것을 포함한다. 예를 들어, 증가된 농도는 제1 조직배양액의 개별 성분의 약 1 내지 10배의 범위, 또는 제1 조직배양액의 개별 성분의 약 1.2 내지 약 5배 범위로 농도를 증가하는 것을 포함할 수 있고, 시스틴은 시스테인으로 대체할 수 있다.
일부 구체예에서, 제1 조직배양액은 아미노산을 포함할 수 있고, 아미노산은, 예를 들어 자연적으로 발생하는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 조직배양액은 증가된 농도의 하나 이상의 아미노산, 예컨대 제1 조직배양액에 존재하는 농도의 약 1.1 내지 약 10배 범위로 증가할 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 조직배양액은 제1 조직배양액 내에 존재하는 농도 약 1.2 내지 약 5배, 또는 약 1.2 내지 약 2배 범위로 하나 이상의 아미노산의 증가된 농도를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 증가된 아미노산은 제1 조직배양액에 존재하는 모든 아미노산의 약 50% 내지 약 75% 범위 내일 수 있다. 일부 구체예에서, 아미노산인 시스틴을 추가 시스테인으로 대체하여 제2 조직배양액이 제1 조직배양액보다 약 1.1배 내지 약 12배 더 많은 시스테인을 가질 수 있다. 다른 농도 범위 및/또는 백분율을 적용할 수 있다.
일부 구체예에서, 제1 조직배양액은 염, 예를 들어 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 인산나트륨, 염화마그네슘, 황산구리, 황산제일철, 황산아연, 질산제2철, 이산화셀레늄, 염화칼슘 및/또는 조직배양액에서 발견할 수 있는 다른 염들을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 조직배양액은 제1 조직배양액에 존재하는 농도 약 1.1 내지 약 10배 범위로 하나 이상의 염의 증가된 농도를 가질 수 있다. 다른 구체예에서, 제2 조직배양액은 제1 조직배양액에 존재하는 농도 약 1.2 내지 약 5배 또는 약 1.2 내지 약 2배 범위로 하나 이상의 염의 증가된 농도를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 증가된 염은 제1 조직배양액에 존재하는 모든 염의 약 50% 내지 약 75% 범위 내일 수 있다. 다른 농도 범위 및/또는 백분율을 사용할 수 있다.
일부 구체예에서, 제1 조직배양액은 비타민, 예를 들어 비오틴, 염화콜린, 칼슘 판토테네이트(calcium pantothenate), 엽산, 하이포잔틴, 이노시톨, 나이아신아미드, 비타민 C, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 티미딘, 비타민 B-12, 피리독살, 퓨트레신 및/또는 조직배양액에서 발견할 수 있는 다른 비타민을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 조직배양액에서는 제1 조직배양액에 존재하는 농도 약 1.1 내지 약 5배 범위로 하나 이상의 비타민의 농도를 증가할 수 있다. 다른 구체예에서, 제2 조직배양액은 제1 조직배양액에 존재하는 농도 약 1.2 내지 약 3배 범위로 하나 이상의 비타민의 증가된 농도를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 증가된 비타민은 제1 조직배양액에 존재하는 모든 비타민의 약 50% 내지 약 75% 범위 내일 수 있다. 다른 농도 범위 및/또는 백분율을 사용할 수 있다.
일부 구체예에서, 제1 조직배양액은 상기한 것들 이외의 하나 이상의 성분("기타 성분"), 예를 들어 덱스트로스, 만노스, 소듐 피루베이트, 페놀 레드, 글루타티온, 리놀레산, 리포산, 에탄올아민, 머켑토에탄올, 오르토 포스포릴에탄올아민 및/또는 조직배양액에서 발견할 수 있는 기타 성분들을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 조직배양액은 제1 조직배양액에 존재하는 농도 약 1.1 내지 약 10배 범위로 하나 이상의 "기타 성분"의 증가된 농도를 갖는다. 일부 구체예에서, 제2 조직배양액은 제1 조직배양액에 존재하는 농도 약 1.2 내지 약 5배 또는 약 1.2 내지 약 2배 범위로 하나 이상의 "기타 성분"의 증가된 농도를 갖는다. 일부 구체예에서, 증가된 하나 이상의 "기타 성분"은 제1 조직배양액에 존재하는 모든 "기타 성분"의 약 50% 내지 약 75% 범위 내일 수 있다. 다른 농도 범위 및/또는 백분율을 사용할 수 있다.
관류 바이오반응기 배양 시스템 (400)을 최적화하는 또다른 방법을 이하에서 도 14를 참조로 설명하였다. 관류 바이오반응기 시스템 (100)을 최적화하는 방법 (400)은, (401)에서 재조합 단백질을 발현하는 세포를 함유하는 제1 조직배양액을 바이오반응기와 세포 체류장치를 포함하는 바이오반응기 시스템에 제공하는 것을 포함하고, 여기서 본 시스템은 출발 관류속도 (제1 관류속도), 출발 바이오반응기 부피, 및 출발 세포 체류장치 부피를 갖는다. 또한, 본 방법 (400)은 (402)에서 출발 관류속도를 (제2 관류속도로)감소하는 것을 포함하여, 그 결과 (403)에서 바이오반응기와 세포 체류장치 내에서 세포의 체류시간을 증가한다. 본 방법 (400)은 또한 (404)에서 재조합 단백질의 분해를 완화하는 안정화제 첨가를 포함한다. 특정 구체예에서, 안정화제는 칼슘이다. 도 11A-11B에서 보이는 바와 같이, 안정화제 첨가는 바이오반응기에서의 체류시간 증가로 인한 포텐시 손실을 감소한다(~13-15%).
Factor VIII을 제조하기 위한 예시적인 관류 배양 시스템은, 예를 들어 미국 특허 제6,338,964호("낮은 농도의 용존 이산화탄소 하에서 포유동물 세포 배양을 위한 방법 및 배지"), Boedeker, B.G.D., Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 27(4), pages 385-394, 및 미국 특허출원 제61/587,940호(2012년 1월 18일 출원)에 기술되어 있다(상기한 문헌들의 내용은 본 원에 참조로 포함되었다). 바이오반응기 (101)와 세포 체류장치 (102)는 당 분야에 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 세포 체류장치 (102)는 조직배양액과 세포의 재순환 배출물을 수용하고, 조직배양액과 세포의 재순환 배출물로부터 세포 응집물을 분리하여 남은 조직배양액과 세포를 바이오반응기 (101)로 돌려보내기 위해 설치된 세포 응집 트랩을 추가로 포함할 수 있다.
세포 배양은 미리 생육된 배양물의 세포를 접종하여 시작할 수 있다. 전형적인 바이오반응기 매개변수를 안정한 조건, 예컨대 약 37℃의 온도, 약 6.8의 pH, 약 50% 공기 포화의 용존산소(DO), 및 대략적으로 일정한 액체 부피 하에 (예를 들어, 자동적으로)유지할 수 있다. 다른 바이오반응기 매개변수를 사용할 수 있다. DO 및 pH는 상업적으로 입수가능한 프로브를 사용하여 온라인으로 측정할 수 있다. 바이오반응기 공정은 뱃치식 또는 초기 세포 농도를 증가할 수 있는 유가배양식(fed batch mode)으로 시작할 수 있다. 이후, 관류 스테이지가 이어질 수 있고, 여기에서 세포 배양배지는 유입구 (105)를 통해 바이오반응기 (101)로 연속적으로 펌핑되고 세포를 함유하는 조직배양액은 배출구 (106)를 통해 배출된다. 조직배양액의 유속을 제어하고 세포 농도와 비례하여 증가시킬 수 있다. 세포 농도가 바이오반응기 (101)에서 목표 농도(예를 들어, 1 x 106 세포/mL 초과)에 이르면 정상상태 또는 안정한 관류공정이 구축될 수 있고 이 농도로 조절될 수 있다. 이 시점에서 유속은 일정하게 유지될 수 있다. 세포 밀도는, 예를 들어 밀리리터 당 약 400만 내지 약 4000만 세포를 관류 바이오반응기 시스템 (100)에서 유지할 수 있다.
공지된 하부 과정을 본 원에 기술된 시스템과 방법을 사용하여 생산된 재조합 단백질을 정제하기 위해 사용할 수 있다. 전형적인 정제방법은 세포 분리, 농축, 침전, 크로마토그래피 및 여과 등을 포함할 수 있다. 다른 정제방법도 가능하다.
세포는 진핵세포 또는 원핵세포, 예를 들어 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 및 박테리아 세포일 수 있다. 세포는 생물학적 단백질 생성물을 만드는 세포일 수 있다. 세포는 하나 이상의 재조합 단백질 생성물을 발현하기 위해 조작된 재조합 세포일 수 있다. 세포는 항체 분자를 발현하는 것일 수 있다. 생성물은 단백질 생성물, 예를 들어 재조합 단백질 생성물, 예컨대 응집인자, 예를 들어 factor VII, factor VIII, factor IX 및 factor X일 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 포유동물 세포, 예컨대 BHK(새끼 햄스터 신장) 세포, CHO(중국 햄스터 난소) 세포, HKB(신장과 B 세포의 하이브리드) 세포, HEK(인간배아신장) 세포, 및 NSO 세포이다. 포유동물 세포는 factor VIII을 발현하는 재조합 세포일 수 있다.
조직배양액은 조직 배양배지로도 알려져 있으며 적합한 종류의 조직 배양배지일 수 있다. 예를 들어, 조직배양액은 철, 플루로닉(Pluronic) F-68, 또는 인슐린 등의 다른 보충물이 공급된 상업적으로 입수가능한 DMEM/F12 제제[JRH (Lenexa, Kansas, US) 또는 Life Technologies(Grand Island, N.Y. US) 제조]를 포함하는 배지 조성물일 수 있고, 본질적으로 다른 단백질을 포함하지 않을 수 있다. 히스티딘 (his) 및/또는 이미노디아세트산(IDA) 같은 착화제를 사용하거나/하고 유기 완충제, 예컨대 MOPS(3-[N-모폴리노]프로판설폰산), TES(N-트리스[하이드록시메틸]메틸-2-아미노에탄설폰산), BES(N,N-비스[2-하이드록시에틸]-2-아미노에탄설폰산) 및/또는 TRIZMA(트리스[하이드록시메틸]아미노에탄)를 사용할 수 있고; 이들 모두는, 예를 들어 Sigma (Sigma., St. Louis, Mo., US)로부터 입수할 수 있다. 일부 구체예에서, 조직배양액에는 기지 농도의 착화제 및/또는 유기 완충제를 각각 또는 조합하여 보충할 수 있다. 일부 구체예에서, 조직배양액은 EDTA, 예를 들어 50 μM, 또는 다른 적합한 금속(예를 들어, 철) 착화제를 함유할 수 있다. 다른 조성물, 제제, 보충물, 착화제 및/또는 완충제를 사용할 수 있다.
출발 관류속도는, 예를 들어 FDA가 승인한 생물 제품의 생물학적 라이센스에 의해 설정된 관류속도일 수 있다. 출발 관류속도는, 예를 들어 최적화된 것으로 생각되는 것일 수 있다. 출발 바이오반응기 부피 및 출발 세포 체류장치 부피 또한, 예를 들어 생물 제품의 생물학적 라이센스에서 설정된 것일 수 있고, 또는 특정 시스템에 대해 최적화된 것이 고려된다. 출발 관류속도, 출발 바이오반응기 부피, 또는 세포 체류장치 부피는 또한, 예를 들어 시스템 제조업체가 요구하는 것일 수 있다. 출발 관류속도, 출발 바이오반응기 부피, 및/또는 세포 체류장치 부피는 작동하는 동안 적용된 실제값일 필요는 없다. 그보다, 이러한 출발값은 작동하는 동안 적용된 관류속도, 바이오반응기 부피 및/또는 세포 체류장치 부피의 선택에서 단순하게 적용될 수 있다. 바이오반응기 부피 및/또는 세포 체류장치 부피는 작동 또는 작업 부피일 수 있다.
체류시간은 세포와 생성물이 시스템 (100)의 단위 작동기 조건에 노출된 평균시간이다. 중요한 단위 작동기 두 가지는 바이오반응기 (101)와 세포 체류장치 (102)이다.
본 발명의 측면은 어떤 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는, 이하의 실시예에 비추어 더 잘 이해될 수 있다.
실시예
실시예 1: 출발 관류속도를 감소하고 배지 성분을 증가하는 효과
본 실시예에서는, 강화 배지와 1L 작업 부피로 작동되고 375 mL 침강수조형 세포 체류장치 (102)가 구비된 바이오반응기 용기 (101)를 세포 체류에 사용하였다. KG-FS의 활성성분인 rhFVIII를 생산하는 BHK 세포를 약 25 x 106 세포/mL의 세포 밀도로 정상 상태에 이를 때까지 배양하였다. 본 구체예에서, 출발 관류속도(대조군 속도)는 5일 동안 11 부피/일의 높은 속도로 유지하였다. 두 시스템을 설정하였다. 신규한 VM2 배지를 사용하는 실험 시스템에서, 관류속도는 측정된 세포 밀도에 기초한 하베스트 펌프 속도를 조절하여 0.83, 0.67 및 0.5 분율의 초기 관류속도로 단계적 감소하였다. 각각의 관류속도 수준에서 5일 동안 배양하였고 샘플을 포텐시 시험을 위해 수집하였다(표 1). 세포 생존력(도 2)과 대사(도 5)는 관류속도의 변화에 의해 크게 영향을 받지 않았다. 락테이트는 낮은 관류속도에서 증가하였지만, 또한 대조용 바이오반응기 실행에서 11 부피/D의 관류속도로 실행의 후단 쪽으로 증가하였다(도 5). 퍼지율이 변하지 않았고 살아있는 세포 밀도(VCD)가 관류속도-감소 실험을 따라 일정하게 높이 유지되므로 성장률은 분명히 관류속도로 만들어진 변화에 의해 영향을 받지 않았다(도 2). 다른 대조 시스템에서는, 11 vol/일의 관류속도가 전체 실행 동안 유지되었다(미도시). 모아진 샘플을 FVIII 활성에 대해 분석하였다.
시험 및 대조 시스템의 목표 관류속도
기간 시스템 1
VM2 배지		 시스템 2
R3 생산 배지
1일 내지 10일 정상상태까지 생육 정상상태까지 생육
10일 내지 15일 관류속도 11 부피/일 관류속도 11 부피/일
15일 내지 21일 관류속도 9 부피/일 관류속도 11 부피/일
21일 내지 26일 관류속도 7.3 부피/일 관류속도 11 부피/일
26일 내지 31일 관류속도 5.5 부피/일 관류속도 5.5 부피/일
R3는 개질 DMEM-F12 (1:1) 포함 배지이고 VM2는 농축 DMEM-F12 포함 배지 (특이적 보강물 포함)이다. 보이는 바와 같이, 관류속도 감소의 매 단계마다 FVIII 역가가 증가하였다(도 4A-4B). 관류속도 레벨 5.5 부피/일에서, 평균 포텐시 (potency)는 초기 관류속도 11 부피/일에서보다 약 50% 더 높았다. 대조 발효기에서 FVIII 활성은 일정한 수준으로 유지되었다(미도시). 그러나, 관류속도가 절반으로 줄었을 때 포텐시는 ~50%까지 증가하였지만 계산된 포텐시와 부합하지 않았으며, 이것은 단위 작동기에 대해 동일한 결과를 얻기 위해 100% 증가(즉, 관류속도가 절반으로 감소한 경우 2배 포텐시)여야 한다.
측정값과 계산값 간의 차이는 5.5 부피/일에서 예상한 것보다 약 23% 미만으로 모든 감소 단계마다 증가하였다(정상 관류속도의 절반, 정상 관류속도에서와 같은 배지 부피의 절반)(도 4A-4B).
정상적 관류 발효와 비교하여 신규한 VM2 배지로 배지 부피 절반(약 절반의 배지 비용)을 사용하여 관류속도를 감소하므로써 하베스트에서 FVIII의 활성은 약 50% 더 많았다(동일 배출물을 제공하는데 100% 더 많은 대신).
관찰된 역가와 계산된 역가 간의 비교는 측정된 FVIII 활성이 계산값보다 더 낮은 것을 나타내고 있다. 따라서, 세포 배양 시스템의 생산성은 낮은 관류속도 비율에서 더 낮다는 것을 확인하였다.
실시예 2: FVIII 안정성
FVIII 활성의 불안정화에 대한 체류시간의 영향 실험에서, 정상상태 관류 배양으로부터 새로운 바이오반응기 샘플을 사용하였다.
세포를 원심분리에 의해 제거하여 FVIII의 추가 생산을 방지하고, 상징액을 롤러 튜브 내의 세포 배양 시뮬레이팅 조건 하에 37℃, 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.
규정된 시기에 FVIII 측정을 위해 샘플을 취하였다. 그 결과, 인큐베이션 제1일 이내에 100%에서 약 60%로 FVIII 활성의 대량 감소와, 추가 인큐베이션 동안 더 느린 감소를 나타내었다(도 6).
명백하게, 체류시간의 증가는 FVIII 활성에 불리하게 작용한다.
FVIII 활성에서 시간 의존적 감소의 데이터를 사용하여, 관류속도 감소 실험(실시예 1) 동안 체류시간 증가로 인한 FVIII 활성의 이론적 감소를 계산하고 도 4A-4B에 나타낸 실험 활성과 비교하였다. 비교 결과, 관찰된 역가와 계산된 역가 간의 차이가 부분적으로, 감소된 관류속도의 연장된 체류시간 동안 FVIII 불안정성의 결과일 수 있는 것으로 나타났다(도 6). 그러나, FVIII 안정성 손실은 감소된 관류속도에서 포텐시의 전반적 감소를 설명하지 못하였다.
실시예 3: 바이오반응기 작업 부피 증가와 결합된 관류속도 감소
실시예 2는 관류속도 감소가 장기 체류시간으로 인한 FVIII 포텐시 손실로 제한된 것을 나타내고 있다.
연장된 체류시간의 부정적 효과를 해소하기 위햐여 바이오반응기 작업 부피 대 세포 체류장치 부피(예를 들어, 침강수조 부피) 비율의 증가를 시험하였다.
관류 배양을 수행하였고 관류 속도 감소는 표 2에 요약된 바와 같이 작업 부피 증가와 결부되었다. 9 x 106 세포/mL 접종 후 약 3일 이내에 약 24 x 106 세포/mL의 정상상태 세포 밀도까지 세포를 생육하였다. 약 14일 동안 11 vol/일 (1X)의 정상 관류속도로 세팅된 데이터를 수집한 후(기간 1), 하베스트 유속을 감소하고 약 24 x 106 세포/mL의 일정 세포 밀도를 유지하여 12일 동안 관류속도는 8.5 vol/d (0.78X)를 목표로 하였다(기간 2). 후속하는 12일의 세포 배양 동안, 바이오반응기 (101)의 작업 부피는 1 L에서 1.3 L로 레벨 센서 조절에 의해 증가하였다(기간 3). 세포 밀도는 24 x 106 세포/mL로 유지하였고, 관류속도는 8.5 vol/d를 목표로 하였다(표 2, 도 8A).
표준 DMEM-F12 포함 생산 배지가 본 실시예에서 사용되었고, 이것은 시험된 관류속도에서 정상 세포 배양 수행에 충분한 영양분을 포함한다. 글루코스 농도는 감소된 관류속도에서 0.8 g/L 초과를 유지하였고 글루타민 농도는 관류속도가 8.5 vol/일(0.78X)인 기간 동안 약 1 mM이었다. 세포 성장률에 대한 영향은 관류속도를 저하하거나 바이오반응기의 작업 부피를 증가하는데 있어서 명확하지 않았다(도 9).
바이오반응기의 목표 관류속도와 작업 부피
기간 기간 관류속도
(vol/일)		 작업부피비
바이오반응기/세포 체류장치
1일 내지 3일 정상 상태까지 생육
기간 1 3일 내지 17일 11 1 리터
기간 2 17일 내지 29일 8.5 1 리터
기간 3 29일 내지 41일 8.5 1.3 리터
샘플의 FVIII 활성은 관류속도를 11 vol/일 (IX)에서 8.5 vol/일로 감소한 후에 약 10% 더 높았다(0.78X, 도 8B). 시스템의 계산된 생산성은 기간 1 동안 생산성이 약 86%로 감소하였다(도 10A-10B, 표 1). 이것은 실시예 2에 따른 것이다(도 4A-4B 참조).
기간 3에서, 0.78X의 감소된 관류속도를 유지하고, 그에 따라 배양 부피 대 CRD 부피의 비율을 증가하면서 바이오반응기 (101)의 작업 부피/CRD (102)의 작업 부피의 작업 부피 비율을 1X에서 1.3X로 증가한 결과, CRD (102)에서의 배양물 체류시간과 세포 생산성의 손실이 감소하였다.
실제로, FVIII 활성은 이 기간 동안 증가하였다(도 10A-10B 참조).
시스템의 계산된 생산성은 1X 작업 부피와 11 vol/일 (1X)의 관류속도를 갖는 시스템의 생산성과 비교하여 127%의 증가를 나타냈다. 이것은 1.3X 작업 부피에 대한 130%의 계산된 생산성에 근접하는 것이다(도 10A-10B, 표 3)
1X 배양 부피에 대해 정규화하면, 기간 3의 계산된 생산성은 표준 조건 하에서의 배양 생산성과 거의 동일하였다(98% vs. 100%, 표 3).
이것은 하베스트 내에서 FVIII의 농도가 비례적으로 증가했기 때문에 세포 특이적인 전체 시스템 생산성을 유지하면서 적어도 30%까지 세포 특이적 관류속도 CSPR을 감소하는 것이 가능한 것을 입증한다.
상이한 세포 배양 CSPR 및 바이오반응기/세포 체류장치 작업 부피에서의 생산성
작업부피
(L)		 관류속도
(vol/d)		 체류시간
(h)		 반응기 당
평균 생산성 (%)		 1L 배양물 당
평균 생산성 (%)
1 11 3.06 100 100
1 8.5 3.93 85.9 85.9
1.3 8.5 3.68 127.4 98
11 vol/일과 8.5 vol/일은 각각 1X와 0.78X에 해당하고; 세포밀도는 대략: 24xl06 세포/mL였다. FVIII의 전체 체류시간은 생산성 바이오반응기에서의 체류시간(바이오반응기 부피 Vpr에서의 Tpr)과 비생산성 침강수조에서의 체류시간(침강수조 부피 Vnpr에서의 Tnpr)으로 이루어진다. 따라서, FVIII의 평균체류시간(TR)은 다음과 같다(V매질: 매 24시간 마다 매질의 전체 부피):
TR = Tpr + Tnpr = = Vpr / V매질 x 24 시간 + Vnpr / V매질 x 24 시간
표 4에 상이한 발효 조건의 체류시간을 나타내었다. 생산성은 Tnpr과 반비례적으로 상관하였다. Tpr 증가 효과는 생산성에 거의 영향이 없는 것으로 보인다.
현재 FVIII 생산 시스템의 Tnpr은 작은 침강수조/바이오반응기 부피 때문이고: 1L 작업 부피 시스템의 Tnpr 약 절반만이 11 vol/일의 동일한 관류속도와 세포 밀도를 사용한다.
상이한 FVIII 발효 조건에서 FVIII 체류시간 비교
작업부피비율
바이오반응기/
세포체류장치
(X)		 관류속도
(X)		 Tpr
(h)		 Tnpr
(h)		 TR
(총 체류시간) (h)		 1L 배양 시스템으로 정규화된
평균 생산성 (%)
1 1 2.22 0.83 3.06 100
1 0.78 2.86 1.07 3.93 85.9
1.3 0.78 2.86 0.82 3.68 98
추정 세포밀도 24xl06 세포/mL
실시예 4: 실시예 1-3의 재료 및 방법
관류 세포 배양물
스케일 업을 위해 KG-FS의 활성성분인 재조합 인간 FVIII을 발현하는 재조합 BHK 세포를 R3 생산 배지를 사용하는 진탕 플라스크에 접종하였다. 플라스크를 35.5℃에서 30 rpm으로 인큐베이션하고 원하는 양의 세포가 존재할 때까지 연속 분열시켰다.
스케일 업의 세포를 DASGIP 제어역에서 작업 부피 1L의 1.5L DASGIP 용기 내에 9 x 106 vc/mL로 접종하였다. 작업 부피를 매질 펌프를 제어하는 레벨 센서로 일정하게 유지하였다.
측정된 세포 밀도에 따라 하베스트 펌프를 조절하여 세포 축적 동안 7.3 vol/일, 그리고 정상상태에서 11 vol/일의 표적 CSPR에서 CRD(예를 들어, 0.375 mL 부피의 세포 침강수조)를 사용하여 관류를 구성하였다. 관류속도를 사전 보정된 하페스트 펌프로부터 계산하였으나, 또한 하베스트 부피를 측정하여 확인하였다. 실제 관류속도는 보정에 의해 예측된 부피와 일관되게 동일하였다. 스테이션 온도조절장치를 사용하여 온도를 35.5℃로 조절하였고 CRD 온도는 16-18℃로 설정된 냉장 수조에서 CRD까지 이어지는 튜브를 냉각하여 20-23℃로 조절하였다. 에어레이션 (Aeration)은 실리콘 튜브 에어레이터에 의해 제공되었고 가스 중의 산소 비율은 용존산소조절기에 의해 조절되었다. 정상 상태에서 전형적인 산소 비율은 70% 내지 80%였다. 배압을 0.5 내지 0.6 bar로 유지하였다. 정상 상태에서의 세포 밀도는 25 x 106 vc/mL를 목표로 조절하여 용존산소 충족을 유지하였다. 시간 당 5L의 공간 부분 에어레이션이 보충 에어레이션을 제공하였다. 배양 pH는 4% 탄산나트륨 용액을 첨가하여 6.85의 목표값으로 조절하였다.
관류속도 감소를 위해 하베스트 펌프를 적절한 펌프 속도로 설정하였고, 세포 밀도는 일정하게 유지하였다. 산소 공급을 제어 세트 포인트를 충족하도록 조절 하였다.
필요하다면, 레벨 센서를 적절한 위치로 당겨서 1X에서 1.3X로 작업 부피 비율을 증가하였다. 산소 공급은 가스 혼합물 내에서 산소 비율을 증가시켜서 조절하여 세포 밀도를 필요한 농도로 유지하였다.
세포 배양물의 샘플을 반응기 용기에서 외부 샘플 펌프(Watson Marlow 101U/R, Watson Marlow, Inc., Wilmington, MA, US)로 취하여 세포 밀도와 생존력에 대한 세포 계수 시스템(Cedex XS analyzer, Innovatis, UK), 및 2 YSI 2700s(하나는 글루코스와 락테이트를 측정하고, 다른 하나는 글루타민과 글루타메이트 측정)를 사용하여 분석하였다. 샘플 중의 Factor VIII을 칼슘 첨가(20 mM까지)로 안정화하고 -70℃로 동결한 후, 발색성 어세이로 rFVIII (재조합 FVIII) 포텐시를 분석하였다.
발색성 포텐시 어세이 방법은 2개의 연속 단계를 포함하며, 여기서 색의 강도는 샘플 중에서 Factor VIII 활성에 비례한다. 제1 단계에서, Factor X는 최적 량의 칼슘 이온과 인지질의 존재 하에서 Factor IXa와 그의 코팩터, Factor VIIIa에 의해 Factor Xa로 활성화된다. Factor X의 활성화 속도가 오로지 Factor VIII의 양에만 의존하도록 과량의 Factor X가 존재한다. 제2 단계에서, Factor Xa는 발색 기질을 가수분해하여 발색단을 얻고, 색 강도는 405 nm에서 광도측정으로 판독하였다. 미지물의 포텐시를 계산하고, 어세이의 유효성을 선형 회귀통계방법을 사용하여 확인하였다. 활성을 mL 당 국제단위(IU/mL)로 기록하였다.
FVIII 안정성 시험
14 mL의 (원심분리된)무세포 배양 상징액을 정상 R3 배지에서 11 vol/d의 세포 특이적 관류속도로 배양한 관류배양의 1L 작업 부피로부터 수집하여 통기성 마개가 있는 50 mL 롤링 튜브에 옮겼다. 상징액 샘플을 대조용인 20 mM 칼슘과 함께 동결하였다. 튜브를 37℃, 5% C02 및 80% 습도에서 30 rpm으로 인큐베이션하였다. 정해진 시간에 샘플을 취하여 필요하다면 칼슘을 첨가하여 모든 샘플의 최종 농도를 20 mM이 되게 하고, FVIII 활성을 시험할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 모든 실험은 2회 반복 수행하였다.
배지의 배합
농축 VM2 의 설계
VM2 배지에서 대부분의 성분들은 2X 농도로 사용되었다. 변화는 DMEM/F12를 1:1 비율로 포함하는 표준 R3 배지와 관하여 다음과 같다. 아미노산 농도를 소모 배지 분석 실험에서 계산된 그의 소모율에 기초하여 측정하였다. 용해도가 낮은 시스틴을 고농도의 (더 많이 녹는)시스테인으로 대체하였다. 글루타민을 10 mM(R3 배지 농도의 2X) 포함시켰다. 마그네슘은 표준 R3 배지에서와 같은 농도로 사용되었고, 이산화셀레늄이 1X로 사용된 것을 제외하고 미량 원소들은 2X 농도로 사용되었다. 칼슘은 2X 농도로 포함되었다. 글루코스와 만노스는 각각 1 g/L와 3 g/L, 즉 표준 R3 배지에서와 같이 유지되었고; 글루타민 농도는 10 mM로 설정되었다. 올레산, 콜레스테롤, 인슐린 및 다른 첨가제들 또한 정상 R3 (DMEM/F12 1:1) 배지와 같은 농도로 사용되었다. 중요한 것은 (R3 개질 DMEM/F12 배지에 존재하지 않는)새로운 배지 성분들은 VM2에 도입되지 않았고 - 단지 특정 성분들의 농도만 변화하였다.
실시예 1-4와 관련한 비고
FVIII 생산에서 사용된 11 vol/d의 CSPR 속도 약 절반의 CSPR 수준에서 충분한 영양 수준을 유지하기 위해 농축 배지 배합물을 설계하였다. CSPR 수준은 정상적 R3 (DMEM/F12 포함) 생산 배지 영양을 사용하여 11에서 8.5 vol/일로 감소할 수 있는 것으로 나타났다. 이것은 영양소 제한 및/또는 부산물 독성 폐기물 축적이 시험된 감소 CSPR에 제한되지 않는 것을 나타낸다.
감소된 관류속도에서 FVIII 포텐시는 증가하지만 증가분은 동일한 세포 특이적 생산성을 가정하여 계산된 것보다 더 낮았다.
FVIII 안정성 실험에서는 세포 배양물 시스템에서 체류시간이 길수록 짐작컨대 분해로 인하여 FVIII 포텐시 손실이 유발되는 것으로 나타났다. (무세포)안정성 실험에서 FVIII 활성의 감소는 갭(gap)을 CSPR 감소 동안 이론적 FVIII 포텐시로 단지 부분적으로 설명한다.
현재 1L 작업 부피 관류 시스템의 바이오반응기/CRD 부피비는 2.67이다. 바이오반응기/CRD 작업 부피가 1.3으로 증가하면서, 부피비는 3.47까지 증가하였다.
바이오반응기 대 CRD 부피의 비율을 변경하여 관류배양에서 세포의 생산성을 CSPR 11 vol/d에서의 시스템 생산성과 같은 수준에 근접한 CSPR 8.5 vol/일로 증가시켰다.
경제적 관점에서, 이것은 적어도 1.3 팩터의 낮은 하베스트 부피를 갖는 하부 공정에서뿐만 아니라 감소된 새로운 배지 부피를 갖는 상부 공정에서도 비용 절감을 의미한다.
FVIII을 함유하는 배지의 체류시간 TR은 Tpr과 Tnpr에 분배된다. 상기한 실시예들은 주로 Tnpr이 이 시스템의 생산성에 영향을 주는 것을 입증하고 있다.
따라서, 생산성을 최적화하는 다른 전략은 CRD(예를 들어, 침강수조)와 여기에 결합된 튜빙의 부피를 최소화하는 것에 의한 Tnpr의 최소화일 수 있다.
글루타민 농도(CSPR 8.5.vol/d의 R3 배지 사용)는 0.6 mM 초과였고, 이것은 이전 시험에서 성장률이 제한되는 농도 미만의 농도였다. 약 24 x 106 세포/mL의 세포 밀도로, 기술된 조건 하에서 성장 제한은 관찰되지 않았다.
표준 R3 배지의 5 mM 글루타민과 비교하여 10 mM의 글루타민을 함유하는 농축 배지 VM2를 사용하여 글루타민 농도는 5.5 vol/일 정도의 낮은 CSPR 속도에서도 2 mM를 초과하여 잘 유지될 수 있다. 이러한 조건 하에서 생육에 대한 어떠한 영향도 관찰되지 않았다.
본 발명을 다양한 구체예와 함께 기술하였으나, 본 발명이 이러한 구체예에 제한되지는 않아야 한다. 한편, 당업자들이라면 본 발명을 이해할 수 있으므로, 본 발명은 다양한 대안, 변형, 및 등가물을 포함한다. 또한, 비제한적으로 특허, 특허출원, 기사, 도서, 논문을 비롯하여 본 원에서 인용된 모든 문헌들과 유사 재료들은 본 원에서 참조로 그 전체 내용이 임의의 목적으로 포함되었다. 본 원에서 사용된 섹션 제목은 단지 구성을 위한 것이며 임의 방식으로 기술된 요지를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

Claims (47)

  1. 조직배양액과 배양될 세포를 함유하도록 설치된 바이오반응기;
    바이오반응기로부터 세포를 함유하는 조직배양액을 수용하여 조직배양액으로부터 일부 세포를 분리하고 조직배양액과 세포의 수확 배출물을 제공하고, 바이오반응기에 조직배양액과 세포의 재순환 배출물을 제공하도록 설치된 세포 체류장치를 포함하고;
    출발 관류속도, 출발 바이오반응기 부피, 출발 세포 체류장치 부피 및 출발 바이오반응기 부피와 출발 세포 체류장치 부피의 출발 부피비를 갖고;
    출발 관류속도를 저감하여 바이오반응기와 세포 체류장치에서 세포의 체류시간을 증가하거나,
    출발 바이오반응기 부피를 증가하거나 출발 세포 체류부피를 감소하거나 둘 다 수행하여 출발 부피비를 증가하는, 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 출발 관류속도가 저감하여 바이오반응기와 세포 체류장치에서 세포의 체류시간을 증가하고, 출발 바이오반응기 부피가 증가하거나 출발 세포 체류부피를 감소하거나 둘 다 수행하여 출발 부피비를 증가하는, 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  3. 제2항에 있어서, 출발 부피비의 증가가 대략 출발 관류속도의 감소와 동일한 비율인 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  4. 제2항에 있어서, 출발 관류속도가 최대 약 1/3까지 감소된 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  5. 제2항에 있어서, 출발 관류속도가 최대 약 1/2까지 감소된 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  6. 제2항에 있어서, 출발 바이오반응기 부피가 약 1/3까지 증가된 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  7. 제2항에 있어서, 출발 바이오반응기 부피가 최대 약 1/2까지 증가된 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  8. 제2항에 있어서, 출발 세포 체류부피가 최대 약 1/3까지 감소된 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  9. 제2항에 있어서, 출발 세포 체류부피가 최대 약 1/2까지 감소된 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  10. 제2항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  11. 제10항에 있어서, 포유동물 세포가 BHK 세포, CHO 세포, HKB 세포, HEK 세포, 및 NSO 세포로 구성되는 군에서 선택된 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  12. 제11항에 있어서, 포유동물 세포가 BHK 세포인 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  13. 제10항에 있어서, 포유동물 세포가 재조합 팩터 VIII(rhFVIII)을 발현하는 재조합 세포인 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  14. 제13항에 있어서, rHFVIII이 KG-FS의 활성성분인 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  15. 제2항에 있어서, 출발 관류속도가 일일 약 1 내지 15 부피인 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  16. 제2항에 있어서, 출발 부피비의 증가가 최대 약 1/3인 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  17. 제2항에 있어서, 출발 부피비의 증가가 최대 약 1/2인 관류 바이오반응기 배양 시스템.
  18. 세포를 함유하는 조직배양액을 바이오반응기와 세포 체류장치를 포함하는 바이오반응기 시스템에 제공하고(여기서, 시스템은 출발 관류속도, 출발 바이오반응기 부피, 출발 세포 체류장치 부피 및 출발 바이오반응기 부피와 출발 세포 체류장치 부피의 출발 부피비를 갖는다);
    출발 관류속도를 저감하여 바이오반응기와 세포 체류장치에서 세포의 체류시간을 증가하거나,
    출발 바이오반응기 부피를 증가하거나 출발 세포 체류장치 부피를 감소하거나 둘 다에 의해 출발 부피비를 증가하는 것을 포함하는 관류 바이오반응기 시스템의 최적화 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    출발 관류속도를 저감하여 바이오반응기와 세포 체류장치에서 세포의 체류시간을 증가하고,
    출발 바이오반응기 부피를 증가하거나 출발 세포 체류장치 부피를 감소하거나 둘 다에 의해 출발 부피비를 증가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 출발 부피비의 증가가 대략 출발 관류속도의 감소와 동일한 비율인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 출발 관류속도가 최대 약 1/3까지 감소된 방법.
  22. 제18항에 있어서, 출발 관류속도가 최대 약 1/2까지 감소된 방법.
  23. 제18항에 있어서, 출발 바이오반응기 부피가 약 1/3까지 증가된 방법.
  24. 제18항에 있어서, 출발 바이오반응기 부피가 약 1/2까지 증가된 방법.
  25. 제18항에 있어서, 출발 세포 체류부피가 최대 약 1/3까지 감소된 방법.
  26. 제18항에 있어서, 출발 세포 체류부피가 최대 약 1/2까지 감소된 방법.
  27. 제18항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 포유동물 세포가 BHK 세포, CHO 세포, HKB 세포, HEK 세포, 및 NSO 세포로 구성되는 군에서 선택된 방법.
  29. 제27항에 있어서, 포유동물 세포가 BHK 세포인 방법.
  30. 제26항에 있어서, 포유동물 세포가 재조합 인간 팩터 VIII(rhFVIII)을 발현하는 재조합 세포인 방법.
  31. 제29항에 있어서, rHFVIII이 KG-FS의 활성성분인 방법.
  32. 제18항에 있어서, 출발 관류속도가 일일 약 1 내지 15 부피인 방법.
  33. 제18항에 있어서, 출발 부피비의 증가가 최대 약 1/3인 방법.
  34. 제18항에 있어서, 출발 부피비의 증가가 최대 약 1/2인 방법.
  35. 세포를 함유하는 제1 조직배양액을 바이오반응기와 세포 체류장치를 포함하는 바이오반응기 시스템에 제공하고(여기서 시스템은 출발 관류속도, 출발 바이오반응기 부피, 및 출발 세포 체류부피를 갖는다);
    출발 관류속도를 저감하여 바이오반응기와 세포 체류장치에서 세포의 체류시간을 증가하고, 제1 조직배양액과 비교하여 제1 조직배양액의 개별 성분의 농도가 증가된 제2 조직배양액을 새로운 성분의 추가 없이 제1 조직배양액으로 대체하는 것을 포함하는, 관류 바이오반응기 시스템의 최적화 방법.
  36. 제35항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 포유동물 세포가 BHK 세포, CHO 세포, HKB 세포, HEK 세포, 및 NSO 세포로 구성되는 군에서 선택된 방법.
  38. 제36항에 있어서, 포유동물 세포가 BHK 세포인 방법.
  39. 제35항에 있어서, 포유동물 세포가 재조합 인간 팩터 VIII(rhFVIII)을 발현하는 재조합 세포인 방법.
  40. 제39항에 있어서, rHFVIII이 KG-FS의 활성성분인 방법.
  41. 재조합 단백질을 발현하는 세포를 함유하는 제1 조직배양액을 바이오반응기와 세포 체류장치를 포함하는 바이오반응기 시스템에 제공하고(여기서, 시스템은 출발 관류속도, 출발 바이오반응기 부피, 및 출발 세포 체류장치 부피를 갖는다);
    출발 관류속도를 저감하여 바이오반응기와 세포 체류장치에서 세포의 체류시간을 증가하고, 재조합 단백질 분해 안정화제를 첨가하는 것을 포함하는 관류 바이오반응기 시스템의 최적화 방법.
  42. 제41항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 포유동물 세포가 BHK 세포, CHO 세포, HKB 세포, HEK 세포, 및 NSO 세포로 구성되는 군에서 선택된 방법.
  44. 제42항에 있어서, 포유동물 세포가 BHK 세포인 방법.
  45. 제42항에 있어서, 포유동물 세포가 팩터 VIII(rhFVIII)을 발현하는 재조합 세포인 방법.
  46. 제45항에 있어서, rHFVIII이 KG-FS의 활성성분인 방법.
  47. 제41항에 있어서, 안정화제가 칼슘인 방법.
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