JP2015531241A - かん流細胞培養システムを最適化するための方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年10月10日に出願された、発明の名称を「METHODS AND SYSTEMS FOR OPTIMIZING PERFUSION CELL CULTURE SYSTEM」とする、米国仮出願番号61/712,190号(Attorney Docket No.BHC125019(BH−021L))の優先権を主張し、全ての目的について、その全体が参照により本願明細書に組み込まれる。
[実施例1]:開始かん流速度低下および培地成分増加の効果
この実施例では、濃縮した培地ならびに、1Lの作動容量で操作され、細胞保持用の375mlのセトラ型細胞保持装置102を備えるバイオリアクタ容器101を使用した。KG−FSの活性成分であるrhFVIIIを産生するBHK細胞を、約25×106個/mLの細胞密度で定常状態に達するまで増殖させた。この実施形態では、前記開始かん流速度(コントロール速度)を、11容量/日の速い速度で5日間維持した。2つのシステムを設定した。実験のシステムでは、新たなVM2培地を使用して、かん流速度を、測定した細胞密度に基づいて、収集ポンプスピードを調節することにより、前記最初のかん流速度の0.83、0.67および0.5の割合に段階的に低下させた。前記培養を、各かん流速度レベルにおいて5日間維持し、サンプルを、効力試験用に収集した(表1)。細胞生存率(図2)および代謝(図5)は、かん流速度の変化により有意な影響を受けなかった。乳酸塩は、より低いかん流速度において増加したが、それは、11容量/Dのかん流速度で運転した、前記運転の後半部分におけるコントロールのバイオリアクタにおいても増加した(図5)。増殖速度は、前記かん流速度に対してなされた変更により明らかな影響を受けなかった。パージ速度を変化させなかったか、生細胞密度(VCD)が、かん流速度低下実験に沿って、高く一定に維持されたかのいずれかのためである(図2)。別のコントロールシステムでは、11容量/日のかん流速度を、運転全体を通して維持した(図示せず)。収集されたサンプルを、FVIII活性について分析した。
FVIII活性の不安定化における滞留時間の影響の実験について、定常状態のかん流培養からの新鮮なバイオリアクタサンプルを使用した。
実施例2は、かん流速度低下が、より長い滞留時間によるFVIII効力の損失により限定されたことを示す。
TR=Tpr+Tnpr=Vpr/Vmedia×24時間+Vnpr/Vmedia×24時間
表4において、種々の発酵条件の滞留時間を示す。生産性は、Tnprと反比例して相関する。Tpr増加の効果は、生産性における影響をほとんど有さないと思われる。
かん流細胞培養
スケールアップのために、KG−FSの活性成分である組換えヒトFVIIIを発現する組換えBHK細胞を、R3産生培地を使用して、振とうフラスコ中に播種した。フラスコを35.5℃および30rpmでインキュベートし、連続的に、所望量の細胞が存在するまで分割した。
14mLの無細胞(遠心)培養上清を、11容量/dの細胞特異的かん流速度での通常のR3培地中で増殖させた、1Lの作動容量のかん流培養物から収集し、50mLの通気キャップ付き回転チューブに移した。前記上清サンプルを、コントロールとなる、20mM カルシウムと共に凍結させた。前記チューブを、37℃、5% CO2および80%湿度において、30rpmでインキュベートした。規定の時点で、サンプルを取り出し、必要に応じて、カルシウムを、20mMの最終濃度に、全サンプルがなるように添加し、FVIII活性について試験するまで、−80℃で保存した。全ての実験を、ダプリケートで行った。
濃縮培地VM2の設計
VM2培地について、ほとんどの成分を、2×濃度で使用した。1:1の比でのDMEM/F12に基づく標準的なR3培地に対する変更は、下記の通りである。アミノ酸の濃度を、その消費速度に基づいて決定し、消費培地分析実験において算出した。低い溶解性のシスチンを、より高い濃度の(より高い溶解性の)システインで置き換えた。グルタミンを、10mM(前記R3培地濃度の2×)で含ませた。マグネシウムを、標準的なR3培地におけるのと同じ濃度で使用した。微量元素を、1×で使用した二酸化セレンを除いて、2×濃度で使用した。カルシウムを、2×濃度で含ませた。グルコースおよびマンノースを、1g/Lおよび3g/Lでそれぞれ維持した。すなわち、標準的なR3培地におけるのと同じに維持した。グルタミン濃度を、10mMに設定した。オレイン酸、コレステロール、インスリンおよび任意の他の添加剤も、通常のR3(DMEM/F12 1:1)培地におけるのと同じ濃度で使用した。重要なことは、(前記R3修飾DMEM/F12培地に存在しない)新たな培地成分を、VM2に導入せず、特定の成分の濃度のみを変更した。
濃縮培地の配合を、FVIII産生に使用した11容量/dのCSPRの約半分のCSPRレベルにおいて、十分な栄養レベルを維持するために設計した。CSPRレベルを、(DMEM/F12に基づく)通常のR3産生培地栄養を使用して、11から8.5容量/日に低下させ得ることを示した。このことは、栄養制限および/または副産物の毒性廃棄物の蓄積が、試験した低下したCSPRにおいて限定しないことを示す。
Claims (47)
- かん流バイオリアクタ培養システムであって、
組織培養流体および培養される細胞を含むように構成されたバイオリアクタと、
前記バイオリアクタから、細胞を含む組織培養流体を受容し、一部の細胞を前記組織培養流体から分離し、組織培養流体および細胞の収集産物を提供し、前記バイオリアクタへの組織培養流体および細胞の再循環産物を提供するように構成された細胞保持装置と
を含み、
前記システムが、開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量、開始細胞保持装置容量および前記開始バイオリアクタ容量と前記開始細胞保持装置容量との開始容量比を有し、
前記開始かん流速度が低下して、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらすか、または、
前記開始バイオリアクタ容量が増加する、もしくは、前記開始細胞保持容量が低下する、もしくは、その両方がされて、前記開始容量比の向上をもたらすかのいずれかをする、
かん流バイオリアクタ培養システム。 - 前記開始かん流速度が低下して、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらし、前記開始バイオリアクタ容量が増加する、もしくは、前記開始細胞保持容量が低下する、または、その両方がされて、前記開始容量比の向上をもたらす、請求項1に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記開始容量比の向上が、前記開始かん流速度の低下とほぼ同じ割合である、請求項2に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記開始かん流速度が、約3分の1まで低下する、請求項2に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記開始かん流速度が、約半分まで低下する、請求項2に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記開始バイオリアクタ容量が、約3分の1まで増加する、請求項2に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記開始バイオリアクタ容量が、約半分まで増加する、請求項2に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記開始細胞保持容量が、約3分の1まで減少する、請求項2に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記開始細胞保持容量が、約半分まで減少する、請求項2に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記細胞が、哺乳類の細胞である、請求項2に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記哺乳類の細胞が、BHK細胞、CHO細胞、HKB細胞、HEK細胞およびNS0細胞からなる群から選択される、請求項10に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記哺乳類の細胞が、BHK細胞である、請求項11に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記哺乳類の細胞が、組換えVIII因子(rhFVIII)を発現する組換え細胞である、請求項10に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記rHFVIIIが、KG−FSの活性成分である、請求項13に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記開始かん流速度が、1日あたりに約1から15容量である、請求項2に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記開始容量比の向上が、約3分の1までである、請求項2に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- 前記開始容量比の向上が、約半分までである、請求項2に記載のかん流バイオリアクタ培養システム。
- かん流バイオリアクタシステムを最適化する方法であって、
細胞を含む組織培養流体を、バイオリアクタおよび細胞保持装置を含むバイオリアクタシステムに提供する工程であって、前記システムが、開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量、開始細胞保持装置容量および前記開始バイオリアクタ容量と前記開始細胞保持容量との開始容量比を有する工程と、
前記開始かん流速度を低下させて、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらすか、または、
前記開始バイオリアクタ容量を増加させる、もしくは、前記開始細胞保持装置容量を減少させる、もしくは、その両方をさせて、前記開始容量比の向上をもたらすかのいずれかをする工程と
を含む、方法。 - 前記開始かん流速度を低下させて、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらす工程と、
前記開始バイオリアクタ容量を増加させ、もしくは、前記開始細胞保持装置容量を減少させ、もしくは、その両方をさせて、前記開始容量比の向上をもたらす工程と
をさらに含む、請求項18に記載の方法。 - 前記開始容量比の向上が、前記開始かん流速度の低下と約同じ割合である、請求項18に記載の方法。
- 前記開始かん流速度が、約3分の1まで低下する、請求項18に記載の方法。
- 前記開始かん流速度が、約半分まで低下する、請求項18に記載の方法。
- 前記開始バイオリアクタ容量が、約3分の1まで増加する、請求項18に記載の方法。
- 前記開始バイオリアクタ容量が、約半分まで増加する、請求項18に記載の方法。
- 前記開始細胞保持容量が、約3分の1まで減少する、請求項18に記載の方法。
- 前記開始細胞保持容量が、約半分まで減少する、請求項18に記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳類の細胞である、請求項18に記載の方法。
- 前記哺乳類の細胞が、BHK細胞、CHO細胞、HKB細胞、HEK細胞およびNS0細胞からなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記哺乳類の細胞が、BHK細胞である、請求項27に記載の方法。
- 前記哺乳類の細胞が、組換えヒトVIII因子(rhFVIII)を発現する組換え細胞である、請求項26に記載の方法。
- 前記rHFVIIIが、KG−FSの活性成分である、請求項29に記載の方法。
- 前記開始かん流速度が、1日あたりに約1から15容量である、請求項18に記載の方法。
- 前記開始容量比の向上が、約3分の1までである、請求項18に記載の方法。
- 前記開始容量比の向上が、約半分までである、請求項18に記載の方法。
- かん流バイオリアクタシステムを最適化する方法であって、
細胞を含む第1の組織培養流体を、バイオリアクタおよび細胞保持装置を含むバイオリアクタシステムに提供する工程であって、前記システムが、開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量および開始細胞保持容量を有する工程と、
前記開始かん流速度を低下させて、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらす工程と、前記第1の組織培養流体を、第2の組織培養流体に置き換える工程であって、前記第2の組織培養流体が、前記第1の組織培養流体と比較して、新たな成分を添加することなく、前記第1の組織培養流体における個々の成分の向上した濃度を有する工程と
を含む、方法。 - 前記細胞が、哺乳類の細胞である、請求項35に記載の方法。
- 前記哺乳類の細胞が、BHK細胞、CHO細胞、HKB細胞、HEK細胞およびNS0細胞からなる群から選択される、請求項35に記載の方法。
- 前記哺乳類の細胞が、BHK細胞である、請求項36に記載の方法。
- 前記哺乳類の細胞が、組換えヒトVIII因子(rhFVIII)を発現する組換え細胞である、請求項35に記載の方法。
- 前記rHFVIIIが、KG−FSの活性成分である、請求項39に記載の方法。
- かん流バイオリアクタシステムを最適化する方法であって、
組換えタンパク質を発現する細胞を含む第1の組織培養流体を、バイオリアクタおよび細胞保持装置を含むバイオリアクタシステムに提供する工程であって、前記システムが、開始かん流速度、開始バイオリアクタ容量および開始細胞保持装置容量を有する工程と、
前記開始かん流速度を低下させて、前記バイオリアクタおよび前記細胞保持装置中での前記細胞の滞留時間の増加をもたらす工程と、前記組換えタンパク質の分解の安定剤を添加する工程と
を含む、方法。 - 前記細胞が、哺乳類の細胞である、請求項41に記載の方法。
- 前記哺乳類の細胞が、BHK細胞、CHO細胞、HKB細胞、HEK細胞およびNS0細胞からなる群から選択される、請求項42に記載の方法。
- 前記哺乳類の細胞が、BHK細胞である、請求項42に記載の方法。
- 前記哺乳類の細胞が、VIII因子(rhFVIII)を発現する組換え細胞である、請求項42に記載の方法。
- 前記rHFVIIIが、KG−FSの活性成分である、請求項45に記載の方法。
- 前記安定剤が、カルシウムである、請求項41に記載の方法。
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