CN104822821A - 用于优化灌流细胞培养系统的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

公开了方法和灌流培养系统。所述系统和方法涉及降低起始灌流速率，导致在生物反应器和细胞保留装置中细胞的滞留时间增加，和/或伴随地增加起始生物反应器体积或减少起始细胞保留装置体积，或两者。其它方法实施方案包括增加组织培养流体的个别组分的浓度，并且添加重组蛋白降解的稳定剂。

Description

用于优化灌流细胞培养系统的方法和系统
相关申请
本申请要求享有于2012年10月10日提交的标题为“METHODS AND SYSTEMS FOR OPTIMIZING PERFUSION CELL CULTURE SYSTEM”（代理人案件号 BHC125019（BH-021L））的美国临时专利申请系列号 61/712,190的优先权，其为了全部目的以其整体在此通过引用并入本文。
背景
重组蛋白，诸如rhFVIII（重组人因子VIII蛋白质，其是由 Bayer Healthcare, Berkeley, CA生产的Kogenate® FS或KG-FS的活性成分），通常在灌流连续细胞培养过程中生产。在该系统中的关键受控参数是细胞比灌流速率(specific perfusion rate)（在本文中也称为灌流速率或CSPR），其可以作为每天每细胞灌流的培养基的体积（体积/C/D）或以每天的体积计算。细胞培养基对总生产成本有显著地贡献，并且是为何将努力投入在使用对于细胞健康和/或产物产量和产物品质最优的尽可能低的灌流速率上的一个原因。进一步地，如果可以维持蛋白质产量，较低的灌流速率可以增加工厂生产能力并且在具有对基础设备最低限度改变的生产中提供灵活性。
相对高的灌流速率帮助确保对细胞培养提供充足的营养，但是这也稀释了产物，导致了更大的收获体积。在另一方面，低灌流速率会减少产物稀释但是可能影响其稳定性。例如，在生物反应器中的条件下分子的滞留时间增加可能导致分子暴露于蛋白酶或可能促进其降解的其他因素。如果营养成为其浓度的限制（或如果积累了副产物），则较低的灌流速率还可能影响细胞性能。因此，仅仅降低灌流速率是不够的。
将为蛋白产物的最优细胞生产提供充分的营养和副产物清除的最低灌流速率会因此将导致更高的产量，同时需要较少的组织培养基（在本文中也称为组织培养流体、组织/细胞培养基、或培养基（medium）/培养基（media））­——只要灌流速率的改变不影响产物稳定性。因此，应当对于细胞比生产力(specific productivity)和对于产物稳定性来优化灌流速率。
灌流速率的改变还影响了滞留时间（细胞和产物暴露于系统的单元操作（unit-operation）条件的平均时间）。用于生产重组蛋白诸如重组FVIII的灌流生物反应器系统的两个关键单元操作在生物反应器和细胞保留装置（cell retention device）（在本文中也称为CRD），例如，沉降器（settler）中发生。生物反应器对于理想的细胞培养条件（例如，生理温度和适当氧合）是优化的和受控的，而通常的细胞保留装置被设计和优化为保留细胞并且将细胞再循环回到生物反应器。因为CRD通常不是被设计用于提供生物反应器的理想培养条件，因此高细胞浓度和非理想条件的组合可能处于不期望的状态。为了缓和这些条件，使用策略（诸如冷却）以降低浓缩的细胞团的代谢速率。通常，预期在细胞保留装置中的条件会减少细胞代谢，其进而可能减少细胞生产力。
在灌流系统中，细胞（和产物/副产物）在生物反应器和细胞保留装置之间持续地循环。因此细胞在对细胞生产力有利的条件（即，在生物反应器中）和其中生产力通常较低的条件（例如，在CRD中）之间循环。在灌流系统中的细胞在外部次优环境中（例如，在CRD内）花费显著时间的问题是产业中公认的（参见Bonham-Carter和Shevitz, BioProcess Intl. 9(9) Oct. 2011, pp. 24-30）。此外，细胞滞留在CRD中越长，一旦细胞回到生物反应器中，可以导致回收需要更长的时间。这可以导致系统生产力的进一步降低。
重组蛋白产物，诸如FVIII，可以通过连续的培养基收集进行收获。FVIII产物活性还在生物反应器中使用的温度下随时间而降低。因此，通过降低灌流速率增加滞留时间可以导致活性重组蛋白产物更低的积累。
因此，存在对于具有更低的灌流速率但仍具有高重组蛋白生产力的灌流生物反应器系统和方法的需要。
概述
在一个方面中，提供具有生物反应器和细胞保留装置的灌流生物反应器培养系统。灌流生物反应器培养系统包括起始灌流速率、起始生物反应器体积和起始细胞保留装置体积。系统涉及降低起始灌流速率，导致细胞在生物反应器和细胞保留装置中的滞留时间增加，和同时增加起始生物反应器体积或减少起始细胞保留体积，或两者。系统涉及改变灌流速率、生物反应器工作体积或CRD工作体积，以便实现在CRD的条件中的细胞的最优滞留时间。
在另一个方面中，提供优化灌流生物反应器系统的方法。方法包括提供含有细胞的组织培养流体（在本文中也称为组织培养基或培养基）至包括生物反应器和细胞保留装置的生物反应器系统，其中所述系统具有起始灌流速率、起始生物反应器体积和起始细胞保留装置体积，和降低起始灌流速率，导致细胞在生物反应器和细胞保留装置中的滞留时间增加，并且增加起始生物反应器体积或减少起始细胞保留体积，或两者。所述方法涉及改变灌流速率、生物反应器工作体积或CRD工作体积，以便实现在CRD 的条件中的细胞的最优滞留时间。
在另一个方法方面中，提供优化灌流生物反应器系统的方法。方法包括提供含有细胞的第一组织培养流体至包括生物反应器和细胞保留装置的生物反应器系统，所述系统具有起始灌流速率、起始生物反应器装置体积和起始细胞保留体积；降低起始灌流速率，导致细胞在生物反应器和细胞保留装置中的滞留时间增加，并且用第一组织培养流体替换第二组织培养流体，相比于第一组织培养流体，所述第二组织培养流体通过替换或浓度改变具有对细胞培养物的个别组分的调节。
在另一个方法方面中，提供优化灌流生物反应器系统的方法。方法包括提供含有表达重组蛋白的细胞的第一组织培养流体至包括生物反应器和细胞保留装置的生物反应器系统，其中所述系统具有起始灌流速率、起始生物反应器体积和起始细胞保留装置体积，降低起始灌流速率，导致细胞在生物反应器和细胞保留装置中的滞留时间增加，并且添加重组蛋白的稳定剂以减少降解。
本教导的这些和其他特征在本文中描述。
附图
技术人员会理解下文描述的附图是仅用于说明目的。附图不是意在以任何方式限制本教导的范围。
图1显示了灌流生物反应器系统的图示实施方案。
图2显示了对于CSPR逐步降低，沿着1L灌流培养物（X-轴，按天数）在Y-轴中活细胞密度（菱形）和相对的CSPR（方形）的图。CSPR以相对单位给出。
图3显示了来自CSPR逐步降低的1L灌流细胞培养物的样品的活细胞密度（VCD，菱形）和效能（方形）（以标准化的效能显示）的图。
图4A-B显示了在不同CSPR，相对于计算的效能观察到的平均效能差异（以%计）的柱状图（A）和图（B）。将计算的效能设置在100%。
图5显示了葡萄糖和乳酸的代谢数据的图，表明了在1L灌流细胞培养期间，CSPR时间框（以天计）中的逐步降低与CSPR中的相对变化。
图6显示了在上清液（消耗的培养基/收获的培养流体）中FVIII活性减少的图：实验，在37℃孵育9小时。剩余FVIII活性以对照的百分比显示。
图7显示了使用来自FVIII稳定性测试的数据的计算FVIII活性和来自CSPR减少实验的实验测定的活性的比较的图。在不同CSPR水平的计算滴度以%给出，且100%是新生FVIII的初始效能。
图8A-B显示了使用生物反应器和细胞保留装置的不同比例的活细胞密度和目标的CSPR速率（A）和在生物反应器样品中的FVIII效能（B）的图。
图9A-B显示了谷氨酰胺和谷氨酸的图。在样品中的浓度（A）和FVIII生产细胞的比生长速率（B）。
图10A-B显示了在不同CSPR和生物反应器工作体积的生物反应器系统的生产力（A）和在不同培养CSPR的每1L培养物的计算的生产力（B）的图。
图11A-B显示添加的稳定剂可以（剂量依赖性地）减少由于在生物反应器中滞留时间增加导致的效能损失（~13-15%），但是不能补偿全部的损失（~ 23%）。
图12显示了表明根据实施方案的优化灌流生物反应器系统的方法的流程图。
图13显示了表明根据实施方案的优化灌流生物反应器系统的另一个方法的另一个流程图。
图14显示了表明根据实施方案的优化灌流生物反应器系统的另一个方法的还另一个流程图。
多个实施方案的描述
本发明的实施方案提供了用于增加灌流细胞培养系统的生产能力的方法和系统。
降低灌流速率增加了在CRD以及在生物反应器中的细胞（和重组蛋白/FVIII产物）滞留时间，导致活性重组蛋白产物诸如FVIII减少的生产。在某些实施方案中，灌流速率的降低通过改变生物反应器与CRD的相对体积进行补偿。在一些实施方案中，体积的改变约为与灌流速率的降低相同的比例。例如，灌流速率降低一半伴随着生物反应器与CRD的体积比的同时加倍。根据本发明的实施方案的系统和方法可以导致重组蛋白产物的有力(robust)生产。也可以补偿灌流速率的降低，通过组织培养基的组分的调节，或通过添加稳定剂（诸如对于重组FVIII，即，rFVIII的钙）以减少一种或多种蛋白产物的降解。
灌流细胞培养系统包括两个关键单元操作：生物反应器，其中条件对于重组蛋白生产（诸如rFVIII）通常是最优的，和CRD（例如，沉降器），其中由于缺乏氧气控制和相比于生物反应器中的生理温度通常低的操作温度，条件对于重组蛋白产物/rFVIII生产不是最优的。因此，细胞培养物通过在有助于（和较少有助于）细胞生产力和重组蛋白产物/rFVIII生产的环境之间的管道持续地循环。此外，细胞在CRD中相对于生物反应器中的滞留时间越长，由于细胞从较低向较高细胞代谢状态的转换所致的生产力中的预期损失越大。
图1表明了灌流生物反应器培养系统100的实施方案的框图。灌流生物反应器培养系统100包括具有生物反应器进口105和生物反应器出口106的生物反应器101。生物反应器101包括经配置以保留组织培养流体（TCF）和待培养的细胞的培养室。灌流生物反应器培养系统100包括细胞保留装置（CRD）102，其可以包括细胞聚集体收集器（cell aggregate trap）或其他合适的细胞分离器。细胞保留装置102具有用于再循环组织培养流体和细胞至生物反应器101的出口107。细胞保留装置102还具有另一个出口108，其输送只具有少量细胞的组织培养流体的收获排出物至无细胞收获物104，用于重组蛋白产物的分离和纯化。灌流生物反应器培养系统100还包括培养基容器103，其通过进口105输送新鲜组织培养流体至生物反应器。灌流生物反应器系统100可以用于生物制品诸如促凝剂因子的生产。例如，本文描述的灌流生物反应器培养系统100和方法可以用于制备任何蛋白产物，包括重组蛋白产物并且包括促凝剂因子诸如因子VII、VIII或因子IX，或其他合适的因子或物质。
在系统实施方案中，提供了灌流生物反应器培养系统100。该系统包括：生物反应器101，其经配置以含有组织培养流体和待培养的细胞；CRD 102，其经配置以从生物反应器101接收含有细胞的组织培养流体，从组织培养流体分离一些细胞并且提供组织培养流体和细胞的收获排出物，和提供组织培养流体和细胞的再循环排出物至生物反应器101。系统100具有起始灌流速率（第一灌流速率）、起始生物反应器体积（第一生物反应器体积）、起始细胞保留装置体积（第一起始细胞保留装置体积）和起始生物反应器体积和起始细胞保留装置体积的起始体积比（第一体积比）。在一个或多个实施方案中，降低起始灌流速率（至第二灌流速率），导致细胞在生物反应器101和细胞保留装置102中滞留时间的增加。另外或可替代地，增加起始生物反应器体积（至第二生物反应器体积）或减少起始细胞保留装置体积（至第二细胞保留装置体积），或两者，导致起始体积比增加（至第二体积比）。
在一个或多个实施方案中，起始体积比的增加约为与起始灌流速率的降低相同的比例。在某些实施方案中，起始灌流速率在约三分之一至约三分之二的范围内降低。在其他实施方案中，起始灌流速率降低多达约三分之一。在其他实施方案中，起始灌流速率降低多达约一半，且还在其他实施方案中，起始灌流速率降低多达约三分之二。在一些实施方案中，起始生物反应器体积增加约三分之一至约三分之二；在其他实施方案中，起始生物反应器体积增加多达约三分之一。在其他实施方案中，起始生物反应器体积增加多达约一半，且还在其他实施方案中，起始生物反应器体积增加多达约三分之二。
在一个或多个实施方案中，起始细胞保留装置体积减少约三分之一至约三分之二。在一些实施方案中，起始细胞保留装置体积减少多达约三分之一。在一些实施方案中，起始细胞保留装置体积减少多达约一半，且还在其他实施方案中，起始细胞保留装置体积减少多达约三分之二。
在一个或多个实施方案中，起始体积比增加约三分之一至约三分之二。在一些实施方案中，起始体积比增加多达约三分之一。在一些实施方案中，起始体积比增加多达约一半，且还在其他实施方案中，起始体积比增加多达约三分之二。在某些实施方案中，起始灌流速率约为每天1至15体积。
现在将参考图12描述优化灌流生物反应器培养系统100的方法。优化灌流生物反应器培养系统100的一个方法200包括：在201中，提供含有细胞的组织培养流体至包括生物反应器和细胞保留装置的生物反应器系统，所述系统具有起始灌流速率（第一灌流速率）、起始生物反应器体积（第一生物反应器体积）、起始细胞保留装置体积（第一细胞保留装置体积）、和起始生物反应器体积和起始细胞保留装置体积的起始体积比（第一体积比）。方法进一步包括在202中降低起始灌流速率（至第二灌流速率），在203中导致细胞在生物反应器和细胞保留装置中滞留时间的增加，和/或在204中，增加起始生物反应器体积（至第二生物反应器体积）或减少起始细胞保留体积（至第二细胞保留体积），或两者，导致起始体积比增加（至第二体积比）。
在一些实施方案中，起始体积比的增加约为与起始灌流速率的降低相同的比例。在一些实施方案中，起始灌流速率在约三分之一至约三分之二的范围内降低。在其他实施方案中，起始灌流速率降低多达约三分之一。在其他实施方案中，起始灌流速率降低多达约一半，且还在其他实施方案中，起始灌流速率降低多达约三分之二。
在某些实施方案中，起始生物反应器体积增加约三分之一至约三分之二。在某些实施方案中，起始生物反应器体积增加多达约三分之一。在其他实施方案中，起始生物反应器体积增加多达约一半，且还在其他实施方案中，起始生物反应器体积增加多达约三分之二。
在其他实施方案中，起始细胞保留装置体积减少约三分之一至约三分之二。在一些实施方案中，起始细胞保留装置体积减少多达约三分之一。在其他实施方案中，起始细胞保留装置体积减少多达约一半，且还在其他实施方案中，起始细胞保留装置体积减少多达约三分之二。
在一些实施方案中，起始体积比增加约三分之一至约三分之二。在一些实施方案中，起始体积比增加多达约三分之一。在其他实施方案中，起始体积比增加多达约一半，且还在其他实施方案中，起始体积比增加多达约三分之二。在某些实施方案中，起始灌流速率约为每天1至15体积。
现在将参考图13描述优化灌流生物反应器培养系统100的另一个方法。优化灌流生物反应器培养系统100的一个方法300包括，在301中，提供含有细胞的第一组织培养流体至包括生物反应器和细胞保留装置的生物反应器系统，其中所述系统具有起始灌流速率（第一灌流速率）、起始生物反应器体积和起始细胞保留装置体积。此外，方法300包括在302中降低起始灌流速率（至第二灌流速率）。这导致在303中细胞在生物反应器和细胞保留装置中滞留时间的增加。方法300进一步包括在304中用第一组织培养流体替换第二组织培养流体，相比于第一组织培养流体，所述第二组织培养流体具有第一组织培养流体的个别组分的增加的浓度，且没有添加新组分。例如，增加的浓度可以包括在第一组织培养流体的个别组分的约1至10倍的范围内，或在第一组织培养流体的个别组分的约1.2至约5倍的范围内增加浓度，并且胱氨酸可以用半胱氨酸代替。
在一些实施方案中，第一组织培养流体可以包括氨基酸，其可以包括，例如，任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，第二组织培养流体可以具有增加浓度的一种或多种氨基酸，诸如在第一组织培养流体中存在的浓度的约1.1至约10倍的范围内的增加。在一些实施方案中，第二组织培养流体可以具有在第一组织培养流体中存在的浓度的约1.2至约5倍或甚至约1.2至约2倍范围内的增加浓度的一种或多种氨基酸。在一些实施方案中，增加的氨基酸可以在第一组织培养流体中存在的全部氨基酸的约50%至约75%的范围内。在一些实施方案中，氨基酸胱氨酸可以由额外的半胱氨酸代替，使得第二组织培养流体具有比第一组织培养流体多约1.1至约12倍的半胱氨酸。可以使用其他浓度范围和/或百分比。
在一些实施方案中，第一组织培养流体可以包括盐，其可以包括氯化钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠、氯化镁、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锌、硝酸铁、二氧化硒、氯化钙和/或可以在组织培养流体中发现的其他盐。在一些实施方案中，第二组织培养流体可以具有在第一组织培养流体中存在的浓度的约1.1至约10倍范围内的增加浓度的一种或多种盐。在其他实施方案中，第二组织培养流体可以具有在第一组织培养流体中存在的浓度的约1.2至约5倍或约1.2至约2倍范围内的增加浓度的一种或多种盐。在一些实施方案中，增加的盐可以在第一组织培养流体中存在的全部盐的约50%至约75%的范围内。可以使用其他浓度范围和/或百分比。
在一些实施方案中，第一组织培养流体可以包括维生素，其可以包括生物素、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、次黄嘌呤、肌醇、烟酰胺、维生素C、吡哆醇、核黄素、硫胺素、胸苷、维生素B-12、吡哆醛、腐胺和/或可以在组织培养流体中发现的其他维生素。在一些实施方案中，第二组织培养流体可以具有在第一组织培养流体中存在的浓度的约1.1至约5倍范围内的增加浓度的一种或多种维生素。在一些实施方案中，第二组织培养流体可以具有在第一组织培养流体中存在的浓度的约1.2至约3倍范围内的增加浓度的一种或多种维生素。在一些实施方案中，增加的维生素可以在第一组织培养流体中存在的全部维生素的约50%至约75%的范围内。可以使用其他浓度范围和/或百分比。
在一些实施方案中，第一组织培养流体可以包括一种或多种不同于上文所列的那些的组分（“其他组分”），其可以包括葡萄糖、甘露糖、丙酮酸钠、酚红、谷胱甘肽、亚油酸、硫辛酸、乙醇胺、巯基乙醇、正磷酰乙醇胺（ortho phosphorylethanolamine）和/或可以在组织培养流体中发现的其他组分。在一些实施方案中，第二组织培养流体具有在第一组织培养流体中存在的浓度的约1.1至约10倍范围内的增加浓度的一种或多种“其他组分”。在一些实施方案中，第二组织培养流体具有在第一组织培养流体中存在的浓度的约1.2至约5倍或约1.2至约2倍范围内的增加浓度的一种或多种“其他组分”。在一些实施方案中，增加的一种或多种“其他组分”可以在第一组织培养流体中存在的全部“其他组分”的约50%至约75%的范围内。可以使用其他浓度范围和/或百分比。
现在将参考图14描述优化灌流生物反应器培养系统的另一个方法400。优化灌流生物反应器系统100的方法400包括，在401中，提供含有表达重组蛋白的细胞的第一组织培养流体至包括生物反应器和细胞保留装置的生物反应器系统，所述系统具有起始灌流速率（第一灌流速率）、起始生物反应器体积和起始细胞保留装置体积。方法400进一步包括在402中降低起始灌流速率（至第二灌流速率），导致在403中细胞在生物反应器和细胞保留装置中的滞留时间增加。方法400还包括在404中添加稳定剂以减轻重组蛋白的降解。在某些实施方案中，稳定剂是钙。如在图11A-11B中显示的，添加稳定剂减少了由于在生物反应器中滞留时间增加所致的效能损失（~13-15%）。
用于因子VIII的生产的实例灌流培养系统例如描述于标题为 “Process and Medium For Mammalian Cell Culture Under Low Dissolved Carbon Dioxide Concentration,”的US 6,338,964中和Boedeker , B.G.D., Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 27(4), 第385-394页中和2012年1月18日提交的美国申请号61/587,940中，其全部公开内容在此以其整体通过引用并入本文。生物反应器101和细胞保留装置102是本领域已知的。在某些实施方案中，细胞保留装置102可以进一步包括细胞聚集体收集器，其经配置以接收组织培养流体和细胞的再循环排出物，从组织培养流体和细胞的再循环排出物中分离细胞团块，并且将剩余的组织培养流体和细胞返回至生物反应器101。
细胞培养可以通过接种来自先前生长的培养物的细胞而起始。典型的生物反应器参数可以维持（例如，自动地）在稳定的条件下，诸如温度约37℃、pH约6.8、溶解氧（DO）约为50%的空气饱和(air saturation)，和近似地不变的液体体积。可以使用其他生物反应器参数。DO和pH可以使用可商购获得的探头在线测量。生物反应器过程可以以分批或补料分批模式起始，以允许起始细胞浓度的增加。这随后可以是灌流阶段，其中将细胞培养基经由进口105持续地泵入生物反应器101中，并且将含有细胞的组织培养流体经由出口106泵出。组织培养流体的流速可以控制并且随着细胞浓度成比例地增加。当细胞浓度在生物反应器101中达到目标水平（例如，大于1×106 个细胞/mL）时，可以建立稳定状态或稳定灌流过程，并且可以控制在该浓度。此时，流速可以保持不变。在灌流生物反应器系统100中，细胞密度可以保持在例如，每毫升约4百万个至约4千万个细胞。
可以使用已知的下游实践以纯化使用本文描述的系统和方法生产的重组蛋白。通常的纯化方法可以包括细胞分离、浓缩、沉淀、层析和过滤等。其他纯化方法也是可以的。
细胞可以是任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞。细胞可以是制备任何生物蛋白产物的任何细胞。细胞可以是经工程改造以表达一种或多种重组蛋白产物的重组细胞。细胞可以表达抗体分子。产物可以是任何蛋白产物，包括重组蛋白产物诸如促凝因子，包括例如因子VII、因子VIII、因子IX和因子X。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，诸如，例如，BHK（幼仓鼠肾）细胞、CHO（中国仓鼠卵巢）细胞、HKB（肾和B细胞的杂化物）细胞、HEK（人胚肾）细胞和NS0细胞。哺乳动物细胞可以是表达因子VIII的重组细胞。
组织培养流体，也已知为组织培养基，可以是任何合适类型的组织培养基。例如，组织培养流体可以是基于可商购获得的由JRH (Lenexa, Kansas)或Life Technologies (Grand Island, N.Y.) 制造的DMEM/F12制剂并补充有其他添加剂诸如铁、Pluronic F-68或胰岛素的培养基组合物，并且可以基本上没有其他蛋白质。可以使用络合剂诸如组氨酸（his）和/或亚氨基二乙酸（IDA），和/或可以使用有机缓冲剂诸如MOPS (3-[N-吗啉代]丙磺酸)、TES (N-三[羟甲基]甲基-2-氨基乙磺酸)、BES (N,N-双[2-羟乙基]-2-氨基乙磺酸) 和/或TRIZMA (三[羟甲基]氨基乙烷) ；其全部可以从例如Sigma (Sigma, St. Louis, Mo.)获得。在一些实施方案中，组织培养流体可以单独地或组合地添加有已知浓度的这些络合剂和/或有机缓冲剂。在一些实施方案中，组织培养流体可以含有EDTA，例如，50 μM，或另一种合适的金属（例如，铁）螯合剂。可以使用其他组合物、制剂、添加剂、络合剂和/或缓冲剂。
起始灌流速率可以是，例如，通过由FDA批准的生物产物的生物许可所设置的灌流速率。起始灌流速率例如可以是被认为经优化的起始灌流速率。起始生物反应器体积和起始细胞保留装置体积也可以是，例如，在生物产物的生物许可中设置的那些或另外被认为对特定系统优化的。起始灌流速率、起始生物反应器体积或细胞保留装置体积可以是，例如，由系统生产商推荐的那些。要注意的是起始灌流速率、起始生物反应器体积和/或细胞保留装置体积不需要是操作期间使用的实际值。相反，这样的起始值可能仅仅用于在操作期间使用的灌流速率、生物反应器体积和/或细胞保留装置体积的选择。生物反应器体积和/或细胞保留装置体积可以是操作体积或工作体积。
滞留时间是细胞和产物暴露于系统100的单元操作的条件下的平均时间。两个关键单元操作是生物反应器101和细胞保留装置102。
本教导的方面可以鉴于以下的实施例而进一步理解，所述实施例不应当被理解为以任何方式限制本教导的范围。
实施例
实施例1：降低起始灌流速率和增加培养基组分的效果
在该实施例中，使用了富集培养基和生物反应器容器101，所述生物反应器容器101在1L工作体积下操作并装备有用于细胞保留的375 mL沉降器型的细胞保留装置102。生产rhFVIII（KG-FS的活性成分）的BHK细胞生长直至在约25 x 106 个细胞/mL的细胞密度达到稳定状态。在该实施方案中，起始灌流速率（对照速率）以11体积/天的高速率维持5天。设置两个系统。在实验系统中，使用新VM2培养基，通过基于测量的细胞密度调节收获泵速度，将灌流速率逐步降低至初始灌流速率的0.83、0.67和0.5部分(fraction)。培养在每个灌流速率水平保持5天并且收集样品用于效能测试（表1）。细胞活性（图2）和新陈代谢（图5）没有受到灌流速率改变的显著影响。乳酸在较低灌流速率下增加，但是其也在以11体积/天的灌流速率的对照生物反应器运行中向着运行的后面部分中增加（图5）。生长速率明显不受对灌流速率进行的改变的影响，这既因为清洗速率（purge rate）没有改变也因为活细胞密度（VCD）在灌流速率降低实验中维持恒定地高（图2）。在另一个对照系统中，11 体积/天的灌流速率在整个运行过程中维持（没有显示）。分析收集的样品的FVIII活性。
表1：测试和对照系统的目标灌流速率
R3是改良的DMEM-F12 (1:1)基础培养基并且VM2是富集的DMEM-F12基础培养基（包括特定增强）。如显示的，随着灌流速率降低的每个步骤，FVIII滴度增加（图4A-4B）。在5.5 体积/天的灌流速率水平，平均效能相比在11 体积/天的初始灌流速率下的平均效能高约50%（图3）。在对照发酵罐中，FVIII活性维持在恒定水平（没有显示）。然而，虽然当灌流速率降低一半时效能增加~50%，但其并不与计算的效能相匹配，所述计算的效能应当已经是100%增加（即，当降低灌流速率一半时，效能加倍）——以获得每单元操作相同的排出物(output)。
在5.5 体积/天（正常灌流速率的一半，如在正常灌流速率的培养基体积的一半），在测量值和计算值之间的差异随每个减少步骤比预期的增加少约23%（图4A-4B）。
相比于正常灌流发酵，通过使用一半培养基体积（约一半培养基成本）降低灌流速率并使用新VM2培养基，在收获物中存在FVIII的约50%更多的活性（而不是100%更多以产生相同的排出物）。
观察到的滴度和计算的滴度之间的比较显示，相比于计算值，测量的FVIII活性较低。因此发现细胞培养系统的生产力在较低的灌流速率下较低。
实施例2：FVIII稳定性
为检查滞留时间对FVIII活性的去稳定化的影响，使用了来自稳定状态灌流培养的新鲜生物反应器样品。
通过离心将细胞去除以避免FVIII进一步的生产，并且将上清液在细胞培养模拟条件下在滚管(roller tube)中在保温箱中37℃下孵育。
在规定的时间点，取得样品用于FVIII测定。结果显示FVIII活性在孵育的第一天内从100%大幅度降低至约60%和在进一步孵育期间更缓慢的降低（图6）。
明显地，滞留时间的增加不利地影响了FVIII活性。
使用来自FVIII活性时间依赖性降低的数据，计算了由在灌流速率降低实验期间（实施例1）滞留时间增加导致的FVIII活性的理论降低，并且将其与在图4A-4B中显示的实验活性比较。比较显示观察的滴度和计算的滴度之间的差异可以部分地是在降低的灌流速率的延长的滞留时间期间FVIII不稳定性的结果（图6）。然而，FVIII稳定性损失不能解释在降低的灌流速率的效能的总体降低。
实施例3：灌流速率降低结合增加生物反应器工作体积
实施例2显示由于更长的滞留时间，灌流速率降低受到FVIII效能损失的限制。
为克服延长的滞留时间的负面影响，测试了生物反应器工作体积对细胞保留装置体积（例如，沉降器体积）的比例的增加。
如表2中概述的将灌流速率降低结合工作体积增加来实施灌流培养。在使用9 x 106 个细胞/mL接种后在约3天内将细胞生长至约24 x 106 个细胞/ml的稳定状态细胞密度。在收集了在11 体积/天 (1X)的正常灌流速率约14天（时间周期1）的数据集后，通过降低收获物流速并且保持约24 x 106个细胞/mL的恒定细胞密度，将灌流速率靶定在8.5 体积/天 (0.78X)持续12天（时间周期2）。对于随后12天的细胞培养，通过对液面传感器的调节将生物反应器101的工作体积从1 L增加至1.3 L（时间周期3）。细胞密度保持在24 x 106 个细胞/mL并且灌流速率靶定在8.5 体积/天（表2，图8A）。
在该实施例中使用的基于标准DMEM-F12的生产培养基，其明显地含有对于在测试的灌流速率下正常细胞培养性能的足够的营养。葡萄糖浓度在降低的灌流速率期间保持在0.8g/L以上并且在灌流速率为8.5体积/天（0.78X）的周期期间谷氨酰胺浓度为约1mM。在降低灌流速率或增加生物反应器的工作体积后对细胞生长速率的影响是不明显的（图9）。
表2：生物反应器的目标灌流速率和工作体积
样品的FVIII活性在灌流速率从11体积/天（1X）降低至8.5体积/天（0.78X）后提高约10%（图8B）。系统的计算的生产力在时间周期1期间降低至生产力的约86%（图10A-10B，表1）。这与实施例2一致（见图4A-4B）。
在时间周期3中，当维持0.78X的降低的灌流速率并且因此增加培养体积对CRD体积的比例时，生物反应器101的工作体积/CRD 102的工作体积的工作体积比从1X增加至1.3X，导致在CRD 102中的培养滞留时间的减少和细胞生产力的损失。
的确，FVIII活性在该时间周期期间增加（见图10A-10B）。
计算的系统生产力相比于具有1X工作体积和11体积/天（1X）的灌流速率的系统的生产力显示出127%的增加。这与对1.3X工作体积的130%的计算的生产力接近（图10 A-10B，表3）。
标准化至1X培养体积，时间周期3的计算的生产力与在标准条件下的培养物的生产力大致相同（98%相对于100 %，表3）。
这证明了降低细胞比灌流速率CSPR至少30%同时维持细胞比系统生产力和总系统生产力可行的，这是因为在收获物中的FVIII的浓度成比例地增加。
表3：在不同细胞培养CSPR和生物反应器/细胞保留装置工作体积下的生产力
。
11 体积/天和8.5 体积/天分别对应于1X和0.78X；细胞密度约为：24x106 个细胞/mL。FVIII的总滞留时间由在生产生物反应器中的滞留时间（在生物反应器体积Vpr中的Tpr ）和在非生产沉降器中的滞留时间（在沉降器体积Vnpr中的Tnpr）构成。因此，FVIII的平均滞留时间（TR）如下（V培养基：每24小时的培养基总体积）：
TR = Tpr + Tnpr = Vpr / V培养基 x 24 小时 + Vnpr / V培养基 x 24 小时。
在表4中，显示了不同发酵条件的滞留时间。生产力与Tnpr成反比地相关。Tpr增加的效果似乎对生产力具有较小的影响。
目前的FVIII生产系统的Tnpr是由于较小的沉降器/生物反应器体积；使用11体积/天的相同灌流速率和细胞密度的1 L工作体积系统的Tnpr的仅约一半。
表4：在不同FVIII发酵条件下的FVIII滞留时间的比较
假设细胞密度为24x106 个细胞/mL。
实施例4：用于实施例1-3的材料和方法
灌流细胞培养
对于比例扩大，将表达重组人FVIII（KG-FS的活性成分）的重组BHK细胞使用R3生产培养基接种在摇瓶中。摇瓶在35.5℃和30 rpm下孵育，并且连续地分瓶(split)，直到出现期望的细胞量。
将来自比例扩大的细胞在DASGIP 控制站上以9 x 106 vc/mL接种入以1L的工作体积的1.5L DASGIP容器中。通过控制培养基泵的液面传感器使工作体积保持不变。
通过调节依赖于测量的细胞密度的收获泵，使用CRD（例如，0.375 mL体积的细胞沉降器）在细胞积累期间以7.3体积/天的目标CSPR和在稳定状态下以11体积/天的目标CSPR建立灌流。灌流速率从预校准的收获泵计算，但是也通过测量收获物体积来检查。实际灌流速率通过校准始终等于预期的体积。使用站式恒温器（station thermostat）将温度控制在35.5℃并且通过在设定于16-18℃的冷却水浴中冷却导向CRD的管道将CRD温度控制在20-23℃。通气由硅氧烷管式通气机(silicone tube aerator)提供，且在气体中的氧气百分比通过溶解氧控制器控制。在稳定状态期间典型的氧气百分比为70%至80%。反压保持在0.5至0.6 bar。在稳定状态的细胞密度靶定在25 x 106 vc/ml，并且受控以维持溶解氧的充足。补充通气通过5 L/小时的顶部空间通气(head space aeration)提供。培养物pH通过添加4%的碳酸钠溶液控制在6.85的目标。
为了灌流速率的降低，将收获泵设置在合适的泵速率，而细胞密度维持不变。调节氧气供应以达到控制设置点。
如果需要，通过将液面传感器拉升至合适的位置完成从1X至1.3X的工作体积比的增加。通过增加在气体混合物中的氧气百分比调节氧气供应以维持细胞密度在所需水平。
细胞培养的样品使用外部样品泵（Watson Marlow 101U/R, Watson Marlow, Inc., Wilmington, MA）从反应器容器中取出，并使用细胞计数系统（Cedex XS分析仪, Innovatis, UK）分析细胞密度和活性，和使用两个YSI 2700s（一个测量葡萄糖和乳酸，和另一个测量谷氨酰胺和谷氨酸）进行分析。样品中的因子VIII通过钙的添加（至20mM）稳定化，在-70摄氏度冷冻并且以后通过显色测定法分析rFVIII（重组FVIII）效能。
显色效能测定方法包括两个连续的步骤，其中颜色强度与样品中因子VIII活性成比例。在第一步骤中，在钙离子和磷脂最优量的存在下，通过因子IXa和它的辅因子（因子VIIIa），将因子X活化为因子Xa。存在过量的因子X，使得因子X的活化速率仅取决于因子VIII的量。在第二步骤中，因子Xa水解显色物质以产生生色团，并且在405 nm光度测定读取颜色强度。使用线性回归统计方法计算未知物的效能，并且检查测定的有效性。活性以国际单位/mL（IU/mL）报道。
FVIII稳定性测试
从以11 体积/天的细胞比灌流速率在正常R3培养基中生长的1L工作体积灌流培养物中收集14 mL无细胞（离心的）培养物上清液，并且转移至具有通气帽的50ml滚管。将上清液的样品与20mM钙冷冻用作对照。管在37℃以 5 % CO2和80%湿度在30rpm下孵育。在规定的时间点取样，按需要添加钙以使得全部样品达到20mM的终浓度，并且贮存在-80℃直到测试FVIII活性。全部实验以一式两份实施。
培养基制剂
富集培养基VM2的设计
对于VM2培养基，大多数组分以2X浓度使用。变化（相对于基于DMEM/F12的以1:1比例的标准R3培养基）如下。氨基酸浓度基于它们的消耗率测定，在消耗培养基分析实验中计算。低可溶性胱氨酸使用更高浓度的（更可溶的）半胱氨酸代替。谷氨酰胺以10mM（R3培养基浓度的2X）包含在内。镁以与标准R3培养基中相同的浓度使用，且微量元素以2X浓度使用，除了二氧化硒（其以1X使用）。以2X浓度包含钙。葡萄糖和甘露糖分别保持在1g/L和3g/L，即，与在标准R3培养基中相同；谷氨酰胺浓度设置为10mM。油酸、胆固醇、胰岛素和任何其他添加剂也以与正常R3（DMEM/F12 1:1）培养基中相同的浓度使用。重要地，没有将新的培养基组分（不存在于R3改良DMEM/F12培养基中）引入VM2——只是已将特定组分的浓度改变。
关于实施例1-4的总结性评论
设计富集培养基制剂以在FVIII生产中使用11 体积/天的CSPR速率约一半的CSPR水平下维持足够的营养水平。显示使用正常R3（基于DMEM/F12的）生产培养基营养物，CSPR水平可以从11体积/天降低至8.5 体积/天。这显示营养限制和/或副产物毒性废物积累在测试的降低的CSPR下不是限制性的。
在降低的灌流速率（假设相同细胞比生产力），虽然FVIII效能增加，但是增加比计算的低。
FVIII稳定性实验显示，在细胞培养系统中更长的滞留时间导致FVIII效能损失，推测这是由于降解。在（无细胞）稳定性实验中FVIII活性的减少只是部分地解释了在CSPR降低期间与理论的FVIII效能的差距。
目前的1L 工作体积灌流系统的生物反应器/CRD体积比是2.67。随着生物反应器/CRD工作体积增加至1.3，体积比增加至3.47。
通过改变生物反应器与CRD体积的比例，在灌流培养中的细胞的生产力在CSPR为8.5 体积/天时增加至接近与在CSPR为11 体积/天时的系统的生产力的相同水平。
从经济的角度，这将意味着在用减少的新鲜培养基体积的上游处理中以及在用较低的收获物体积的下游处理中成本节省至少1.3倍。
含有FVIII的培养基的滞留时间TR分配在Tpr和Tnpr中。上文的实施例证明主要是Tnpr影响了系统的生产力。
因此用于生产力的优化的另一个策略可以是通过将CRD（例如沉降器）和与之相连的管道的体积降到最低来将Tnpr降到最低。
谷氨酰胺浓度（使用R3培养基以CSPR 8.5体积/天）高于0.6 mM，其在先前研究中是这样的浓度，低于所述浓度使得生长速率受到限制。在具有细胞密度约24 x 106 个细胞/ml的描述的条件下没有观察到生长限制。
使用含有10mM谷氨酰胺（相比于在标准R3培养基中的5mM）的富集培养基VM2，即使在CSPR速率低至5.5 体积/天时，谷氨酰胺浓度仍可以保持在远高于(well above) 2mM。在这些条件下没有观察到对生长的影响。
虽然本教导结合各种实施方案进行了描述，但不旨在本教导受限于此类实施方案。相反，本教导涵盖各种替代方案、修饰、和等同方案，如本领域技术人员将理解的。此外，本申请中引用的所有参考文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、条约，均出于任何目的以其整体明确地通过引用并入本文。本文所用的部分标题(section headings)仅为组织性目的，而不应理解为以任何方式限制所描述的主题。

Claims (47)

1.灌流生物反应器培养系统，包括：
生物反应器，其经配置以含有组织培养流体和待培养的细胞；
细胞保留装置，其经配置以接收来自所述生物反应器的含有细胞的组织培养流体，从所述组织培养流体分离一些细胞并且提供组织培养流体和细胞的收获排出物，并且提供组织培养流体和细胞的再循环排出物至所述生物反应器；
其中所述系统具有起始灌流速率、起始生物反应器体积、起始细胞保留装置体积，和所述起始生物反应器体积和起始细胞保留装置体积的起始体积比；
其中
将所述起始灌流速率降低，导致在所述生物反应器和细胞保留装置中细胞的滞留时间增加，或者
将所述起始生物反应器体积增加或将所述起始细胞保留体积减少，或两者，导致所述起始体积比的增加。
2.权利要求1的所述灌流生物反应器培养系统，其中将所述起始灌流速率降低，导致在所述生物反应器和细胞保留装置中细胞的滞留时间增加，和将所述起始生物反应器体积增加或将所述起始细胞保留体积减少，或两者，导致所述起始体积比的增加。
3.权利要求2的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述起始体积比的增加约为与所述起始灌流速率的降低相同的比例。
4.权利要求2的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述起始灌流速率降低多达约三分之一。
5.权利要求2的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述起始灌流速率降低多达约一半。
6.权利要求2的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述起始生物反应器体积增加约三分之一。
7.权利要求2的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述起始生物反应器体积增加多达约一半。
8.权利要求2的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述起始细胞保留体积减少多达约三分之一。
9.权利要求2的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述起始细胞保留体积减少多达约一半。
10.权利要求2的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
11.权利要求10的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述哺乳动物细胞选自BHK细胞、CHO细胞、HKB细胞、HEK细胞和NS0细胞。
12.权利要求11的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述哺乳动物细胞是BHK细胞。
13.权利要求10的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述哺乳动物细胞是表达重组因子VIII（rhFVIII）的重组细胞。
14.权利要求13的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述rHFVIII是KG-FS的活性成分。
15.权利要求2的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述起始灌流速率约为每天1至15体积。
16.权利要求2的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述起始体积比的增加多达约三分之一。
17.权利要求2的所述灌流生物反应器培养系统，其中所述起始体积比的增加多达约一半。
18.优化灌流生物反应器系统的方法，其包括：
提供含有细胞的组织培养流体至包括生物反应器和细胞保留装置的生物反应器系统，其中所述系统具有起始灌流速率、起始生物反应器体积、起始细胞保留装置体积，和所述起始生物反应器体积和起始细胞保留体积的起始体积比；和
降低所述起始灌流速率，导致在所述生物反应器和细胞保留装置中细胞的滞留时间增加，或者
增加所述起始生物反应器体积或减少所述起始细胞保留装置体积，或两者，导致所述起始体积比的增加。
19.权利要求18的所述方法，其进一步包括：
降低所述起始灌流速率，导致在所述生物反应器和细胞保留装置中细胞的滞留时间增加，和
增加所述起始生物反应器体积或减少所述起始细胞保留装置体积，或两者，导致所述起始体积比的增加。
20.权利要求18的所述方法，其中所述起始体积比的增加约为与所述起始灌流速率的降低相同的比例。
21.权利要求18的所述方法，其中所述起始灌流速率降低多达约三分之一。
22.权利要求18的所述方法，其中所述起始灌流速率降低多达约一半。
23.权利要求18的所述方法，其中所述起始生物反应器体积增加多达约三分之一。
24.权利要求18的所述方法，其中所述起始生物反应器体积增加多达约一半。
25.权利要求18的所述方法，其中所述起始细胞保留体积减少多达约三分之一。
26.权利要求18的所述方法，其中所述起始细胞保留体积减少多达约一半。
27.权利要求18的所述方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
28.权利要求27的所述方法，其中所述哺乳动物细胞选自BHK细胞、CHO细胞、HKB细胞、HEK细胞和NS0细胞。
29.权利要求27的所述方法，其中所述哺乳动物细胞是BHK细胞。
30.权利要求26的所述方法，其中所述哺乳动物细胞是表达重组人因子VIII（rhFVIII）的重组细胞。
31.权利要求29的所述方法，其中所述rHFVIII是KG-FS的活性成分。
32.权利要求18的所述方法，其中所述起始灌流速率约为每天1至15体积。
33.权利要求18的所述方法，其中在所述起始体积比的增加多达约三分之一。
34.权利要求18的所述方法，其中在所述起始体积比的增加多达约一半。
35.优化灌流生物反应器系统的方法，其包括：
提供含有细胞的第一组织培养流体至包括生物反应器和细胞保留装置的生物反应器系统，其中所述系统具有起始灌流速率、起始生物反应器体积和起始细胞保留体积；和
降低所述起始灌流速率，导致在所述生物反应器和细胞保留装置中细胞的滞留时间增加，并且用所述第一组织培养流体替换第二组织培养流体，相比于第一组织培养流体，所述第二组织培养流体具有所述第一组织培养流体的个别组分的增加的浓度，且没有添加新的组分。
36.权利要求35的所述方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
37.权利要求35的所述方法，其中所述哺乳动物细胞选自BHK细胞、CHO细胞、HKB细胞、HEK细胞和NS0细胞。
38.权利要求36的所述方法，其中所述哺乳动物细胞是BHK细胞。
39.权利要求35的所述方法，其中所述哺乳动物细胞是表达重组人因子VIII (rhFVIII)的重组细胞。
40.权利要求39的所述方法，其中所述rHFVIII是KG-FS的活性成分。
41.优化灌流生物反应器系统的方法，其包括：
提供含有表达重组蛋白的细胞的第一组织培养流体至包括生物反应器和细胞保留装置的生物反应器系统，其中所述系统具有起始灌流速率、起始生物反应器体积和起始细胞保留装置体积；和
降低所述起始灌流速率，导致在所述生物反应器和细胞保留装置中细胞的滞留时间增加，并且添加所述重组蛋白降解的稳定剂。
42.权利要求41的所述方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
43.权利要求42的所述方法，其中所述哺乳动物细胞选自BHK细胞、CHO细胞、HKB细胞、HEK细胞和NS0细胞。
44.权利要求42的所述方法，其中所述哺乳动物细胞是BHK细胞。
45.权利要求42的所述方法，其中所述哺乳动物细胞是表达因子VIII (rhFVIII)的重组细胞。
46.权利要求45的所述方法，其中所述rHFVIII是KG-FS的活性成分。
47.权利要求41的所述方法，其中所述稳定剂是钙。
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