CN105385731A - 一种高效表达重组八因子的灌注培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种高效表达重组八因子的灌注培养方法。本发明提供一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，包括如下步骤：1）将重组FVIII细胞株的种子接种于反应器中进行批培养；2）当培养体系中葡萄糖含量为0.5-1.5g/L时，使用旋转过滤灌注方法进入灌注培养模式；3）当反应器内的细胞处于一个稳态阶段，使用声频灌流方法和旋转过滤灌注方法同时进行灌注培养，维持细胞密度在2-3*10⁷个/ml。本发明所提供的高效表达重组八因子的灌注培养方法采用声频灌流方法和旋转过滤灌注方法相结合灌流培养，细胞在整个稳定表达期内，成活率始终保持在90%以上，细胞密度可以达到2.5*10⁷个/ml左右，八因子平均表达量在18？IU/ml。

Description

一种高效表达重组八因子的灌注培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种高效表达重组八因子的灌注培养方法。

背景技术

凝血八因子是目前治疗血友病A(HemophiliaA,HA)的唯一治疗方法，HA患者因基因缺陷导致FVIII表达降低或功能缺陷，表现为凝血功能障碍和自发性出血。目前市售有人血FVIII以及基因重组FVIII。但是人血FVIII产品仍然存在传播不明血源性病原体的可能，因此，在重组DNA技术的日益发展进步下，重组FVIII产品越来越受到重视。

重组FVIII是利用基因重组技术，将编码FVIII蛋白的基因片段插入质粒载体中，而后将其质粒转入能够表达FVIII蛋白的哺乳动物细胞内。由于FVIII蛋白结构复杂，因此必须选择哺乳动物宿主细胞作为FVIII的表达载体。与细菌或酵母细胞不同，哺乳动物细胞具有翻译后修饰功能，例如溶蛋白性裂解、糖基化作用、羟基化作用及硫酸盐化作用，这些功能是形成具有活性的FVIII蛋白二、三级结构所必须的。但是由于FVIII是个特殊的蛋白，糖基化比较复杂，蛋白不稳定，在培养过程中受温度等培养条件影响很大，为了在发酵过程中保证rFVIII的浓度以及质量，需要采用灌注培养的方式。

灌注培养是指把细胞和培养基一起加入生物反应器后，在细胞增长和产物形成的过程中，不断地将部分培养基取出，同时又连续不断地灌入新的培养基的细胞培养方式。连续的灌注培养可以提供给细胞充分的营养成分，同时带走代谢副产物，给细胞的生长提供优良的环境，维持较高的细胞密度，使得细胞表达时间延长，可以大幅度提高生产产率。

实现细胞灌注培养的核心技术是如果有效地对细胞进行截留，即在保证细胞密度和活力的基础上更换培养基。目前，常用的利用细胞截留装置达到细胞灌注培养的方法主要有：倾斜式重力沉降设备、离心细胞分离装置、旋转过滤灌注设备(Spinfilter)、声频灌流装置、中空纤维柱细胞截留装置等。虽然能够适用的方法种类较多，但是这些方法均有非常明显的缺陷。

发明内容

如上所述，现有技术中的各种方法均有非常明显的缺陷。所以鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，用于解决现有技术中的问题。本发明所提供的高效表达重组八因子的灌注培养方法能够同时充分发挥截留方法和重组FVIII的灌注培养生产工艺的优势，达到提高并维持细胞生长密度、延长生产周期、增加FVIII的产量、并保证FVIII的质量的效果。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，包括如下步骤：

1)将重组FVIII细胞株的种子接种于反应器中进行批培养；

2)当培养体系中葡萄糖含量为0.5-1.5g/L时，使用旋转过滤灌注方法进入灌注培养模式；

3)当反应器内的细胞处于一个稳态阶段，使用声频灌流方法和旋转过滤灌注方法同时进行灌注培养，维持细胞密度在2-3*10⁷个/ml。

本领域技术人员可根据重组FVIII细胞株的种类和具体实验需求，选取合适的条件对重组FVIII细胞株的种子进行扩增，并进一步将扩增所得的产物用于步骤1的接种过程中。

所述旋转过滤灌注方法具体指：将一个旋转过滤器(旋转过滤灌注设备、Spinfilter)按放在反应器的旋转轴上，进行灌注培养。

所述旋转过滤灌注方法培养过程中培养基从筛面通过，细胞位于筛面外，在旋转过滤笼内有吸取管，能够将笼内的培养液泵出，从而达到调整培养液参数的目的。

所述使用声频灌流方法和旋转过滤灌注方法同时进行灌注培养具体指：将一个旋转过滤器(旋转过滤灌注设备、Spinfilter)按放在反应器的旋转轴上，同时在反应器上安装声频灌流装置，进行灌注培养。

所述使用声频灌流方法和旋转过滤灌注方法同时进行灌注培养的过程中，培养基从筛面通过，细胞位于筛面外，在旋转过滤笼内有吸取管，能够将笼内的培养液泵出，同时基于声频引起细胞聚集的新型细胞截留装置，是利用声频使细胞聚集后沉淀，促使胞液分离，不仅截留效率高，而且不易堵塞，易于清洗和灭菌，而且在培养过程中，可以将部分细胞碎片与上清液一起分离出反应器。

本发明所提供的灌注培养方法可使用各种市售的旋转过滤灌注设备和/或声频灌流装置，本领域技术人员可根据反应体系的具体参数选择合适的旋转过滤灌注设备和/或声频灌流装置用于灌注培养。

优选的，所述步骤1中，批培养的培养体系体积为4.9-5.1L。

优选的，所述步骤1中，接种后培养体系中的细胞密度为0.6-1.0*10⁶个/ml。

本领域技术人员可根据重组FVIII细胞株的种类选择合适的培养条件进行批培养，在本发明一实施例中，批培养的具体条件为温度37℃、pH6.9、溶氧(DO)30-50％、初始转速90转/min。

优选的，所述步骤2中，当培养体系中葡萄糖含量为0.8-1.2g/L时，使用旋转过滤灌注方法进入灌注培养模式。

优选的，所述步骤2中，灌注培养的培养体系体积为4.9-5.1L。

优选的，所述步骤2中，灌注培养模式期间，保持葡萄糖含量在0.8-1.2g/L。

优选的，所述步骤2中，保持培养体系中的细胞密度在1-2*10⁷个/ml。

本领域技术人员可根据培养体系和反应情况选取合适的方法从培养体系中抽取部分细胞，以是培养体系的细胞密度维持在目标区间。

优选的，所述步骤2中，灌注培养模式的培养时间为10-15天。

优选的，所述步骤3中，灌注培养的培养体系体积为4.9-5.1L。

优选的，所述步骤3中，维持细胞密度在2.0-3.0*10⁷个/ml。

本领域技术人员可根据培养体系和反应情况选取合适的方法从培养体系中抽取部分细胞，以是培养体系的细胞密度维持在目标区间。

优选的，所述步骤3中，灌注培养的培养时间为≥60天。

本领域技术人员可根据重组FVIII细胞株的种类选择合适的培养条件进行灌注培养，在本发明一实施例中，灌注培养的具体条件为温度37℃、pH6.9、溶氧(DO)30-50％。

本发明第二方面提供所述高效表达重组八因子的灌注培养方法在凝血八因子制备领域的用途。

本领域技术人员可根据反应体系的具体情况选取合适的提纯方法对步骤3的反应液进行处理，制备获得凝血八因子产品。

如上所述，本发明所提供的高效表达重组八因子的灌注培养方法采用声频灌流方法和旋转过滤灌注方法相结合灌流培养，先将扩增所得的重组FVIII细胞株的种子接种并进行批培养，待反应器内营养物质消耗到一定水平(以检测葡萄糖含量为衡量标准)，先打开旋转过滤灌注设备进入灌注培养模式，而后到达一定细胞密度后再打开声频灌流装置进行双系统灌注培养，并在培养过程中不定期抽去部分细胞，使反应器内的细胞保持一个合适的细胞密度。本发明所提供的灌注培养方法取两种细胞截留方式的长处，互补不足之处，发挥最大的灌流效率。在细胞增殖生长期，先使用旋转过滤灌注设备进行灌注培养，可以避免声频灌流装置在低密度条件下将细胞过多的带出反应器中，导致细胞数量有一个骤减的过程。而后达到一定细胞密度后，打开声频灌流装置，可以同时利用两个截留系统进行灌注培养，一方面有了旋转过滤灌注设备，使得可以让声频灌流装置在有效范围内达到最优的灌注体积，并且增加了反应器内溶氧的传递；另一方面，培养过程中产生的细胞碎片，在声频灌流装置的作用下离开反应器，使得反应器内的细胞活率处在一个较高的水平。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。

实施例1

(1)细胞的接种

细胞库中复苏一支表达重组FVIII的细胞株(保藏号：CCTCCC2015214)，用无血清培养基在摇瓶中进行培养和扩增，待细胞数量足够后接种于5L培养体系的反应器中。接种后细胞密度为0.8*10⁶个/ml；

(2)起始生长阶段

细胞接入反应器后，设定各项培养参数，温度37℃、pH6.9、溶氧(DO)30-50％、初始转速90转/min。每天无菌取样，检测葡萄糖和FVIII的含量。

(3)进入灌注培养模式

当葡萄糖含量低于1g/L的时候打开Spinfilter(CelliGenPlus，NewBrunswickScientific)进入灌注培养模式，灌注量为保持葡萄糖含量在1g/L左右，在此期间，会使用蠕动泵不定期的持续从反应器中抽去部分细胞，维持细胞在1-2*10⁷个/ml。实验结果表明，通过Spinfilter系统灌注培养下，整个过程维持了20天，在第18天已经开始出现滤网堵塞的现象，使得灌注体积不足以提供反应器内的细胞所需营养，细胞在整个稳定表达期内，成活率始终保持在90％以上，细胞平均密度达1.2*10⁷个/ml左右，八因子平均表达量在10IU/ml。

实施例2

(1)细胞的接种

细胞库中复苏一支表达重组FVIII的细胞株(同实施例1)，用无血清培养基在摇瓶中进行培养和扩增，待细胞数量足够后接种于5L培养体系的反应器中。接种后细胞密度为0.8*10⁶个/ml；

(2)起始生长阶段

细胞接入反应器后，设定各项培养参数，温度37℃、pH6.9、溶氧(DO)30-50％、初始转速90转/min。每天无菌取样，检测葡萄糖和FVIII的含量。

(3)进入灌注培养模式

当葡萄糖含量低于1g/L的时候打开声频灌流装置(10LBiosep，Applikon)进行灌注培养，灌注量为保持葡萄糖含量在1g/L左右，在此期间，会使用蠕动泵不定期的持续从反应器中抽去部分细胞，维持细胞在1-2*10⁷个/ml。实验结果表明，通过Biosep系统灌注培养下，整个过程维持了40天(达到所需量停止培养)，细胞在整个稳定表达期内，成活率始终保持在90％以上，细胞平均密度达1.4*10⁷个/ml左右，八因子平均表达量在13IU/ml。

实施例3

(1)细胞的接种

细胞库中复苏一支表达重组FVIII的细胞株(同实施例1)，用无血清培养基在摇瓶中进行培养和扩增，待细胞数量足够后接种于5L培养体系的反应器中。接种后细胞密度为0.8*10⁶个/ml；

(2)起始生长阶段

细胞接入反应器后，设定各项培养参数，温度37℃、pH6.9、溶氧(DO)30-50％、初始转速90转/min。每天无菌取样，检测葡萄糖和FVIII的含量。

(3)改变培养模式

当葡萄糖含量低于1g/L的时候先打开Spinfilter，进行灌注培养，灌注量为保持葡萄糖含量在1g/L左右，并且维持细胞在1-2*10⁷个/ml。

(4)持续灌注培养阶段

当培养至10-15天，反应器内的细胞处于一个稳态阶段，此时打开Biosep，与Spinfilter同时进行灌注培养。在此期间，会使用蠕动泵不定期的持续从反应器中抽去部分细胞，维持细胞在2-3*10⁷个/ml，此密度条件下，可以使溶氧以及营养的供给处于一个稳态，保持细胞的活率在一个较高水平，在延长灌注培养的周期同时保证了FVIII产量的稳定产出。实验结果表明，通过Spinfilter与Biosep的结合灌注培养下，整个过程维持了60天(达到所需量停止培养)，细胞在整个稳定表达期内，成活率始终保持在90％以上，细胞密度可以达到2.5*10⁷个/ml左右，八因子平均表达量在18IU/ml。

实施例4

1)细胞的接种

细胞库中复苏一支表达重组FVIII的细胞株(同实施例1)，用无血清培养基在摇瓶中进行培养和扩增，待细胞数量足够后接种于5L培养体系的反应器中。接种后细胞密度为0.8*10⁶个/ml；

(2)起始生长阶段

细胞接入反应器后，设定各项培养参数，温度37℃、pH6.9、溶氧(DO)30-50％、初始转速90转/min。每天无菌取样，检测葡萄糖和FVIII的含量。

(3)改变培养模式

当葡萄糖含量低于1g/L的时候先打开Spinfilter，进行灌注培养，灌注量为保持葡萄糖含量在1g/L左右，并且维持细胞在1-2*10⁷个/ml。

(4)持续灌注培养阶段

当培养至10-15天，反应器内的细胞处于一个稳态阶段，此时关闭Spinfilter，打开Biosep单独进行灌注培养。在此期间，会使用蠕动泵不定期的持续从反应器中抽去部分细胞，维持细胞在1-2*10⁷个/ml。实验结果表明，先使用Spinfilter达到一定细胞数量，而后换成Biosep单独灌注培养，整个过程维持了60天(达到所需量停止培养)，细胞在整个稳定表达期内，成活率始终保持在90％以上，细胞密度达到1.5*10⁷个/ml左右，八因子平均表达量在12IU/ml。

实施例5

1)细胞的接种

细胞库中复苏一支表达重组FVIII的细胞株(同实施例1)，用无血清培养基在摇瓶中进行培养和扩增，待细胞数量足够后接种于5L培养体系的反应器中。接种后细胞密度为0.8*10⁶个/ml；

(2)起始生长阶段

细胞接入反应器后，设定各项培养参数，温度37℃、pH6.9、溶氧(DO)30-50％、初始转速90转/min。每天无菌取样，检测葡萄糖和FVIII的含量。

(3)改变培养模式

当葡萄糖含量低于1g/L的时候加入流加培养基，进行流加培养，流加的培养基量为保持葡萄糖含量在1g/L左右，并且使得细胞生长并维持在1-2*10⁷个/ml。

(4)持续灌注培养阶段

当培养至10-15天，反应器内的细胞数目达到1-2*10⁷个/ml，打开Biosep进行灌注培养。在此期间，会使用蠕动泵不定期的持续从反应器中抽去部分细胞，维持细胞在1-2*10⁷个/ml。实验结果表明，通过流加培养待反应器内细胞达到一定数量，而后开启Biosep进行灌注培养，整个过程维持了60天(达到所需量停止培养)，细胞在整个稳定表达期内，成活率始终保持在90％以上，细胞密度达到1.5*10⁷个/ml左右，八因子平均表达量在13IU/ml。

相关实施例的比较结果如表1所示：

表1

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

保藏编号：CCTCCC2015214

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内

保藏日期：2015.12.8

分类命名：中国仓鼠卵巢细胞CHO-rFVIII-11

Claims (10)

1.一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，包括如下步骤：

1)将重组FVIII细胞株的种子接种于反应器中进行批培养；

2)当培养体系中葡萄糖含量为0.5-1.5g/L时，使用旋转过滤灌注方法进入灌注培养模式；

3)当反应器内的细胞处于一个稳态阶段，使用声频灌流方法和旋转过滤灌注方法同时进行灌注培养，维持细胞密度在2-3*10⁷个/ml。

2.如权利要求1所述的一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，其特征在于，所述步骤1中，批培养的培养体系体积为4.9-5.1L。

3.如权利要求1所述的一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，其特征在于，所述步骤1中，接种后培养体系中的细胞密度为0.6-1.0*10⁶个/ml。

4.如权利要求1所述的一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，其特征在于，所述步骤2中，灌注培养的培养体系体积为4.9-5.1L。

5.如权利要求1所述的一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，其特征在于，所述步骤2中，灌注培养模式期间，保持葡萄糖含量在0.8-1.2g/L。

6.如权利要求1所述的一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，其特征在于，所述步骤2中，保持培养体系中的细胞密度在1-2*10⁷个/ml。

7.如权利要求1所述的一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，其特征在于，所述步骤2中，灌注培养模式的培养时间为10-15天。

8.如权利要求1所述的一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，其特征在于，所述步骤3中，灌注培养的培养体系体积为4.9-5.1L。

9.如权利要求1所述的一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，其特征在于，所述步骤3中，维持细胞密度在2.0-3.0*10⁷个/ml。

10.如权利要求1所述的一种高效表达重组八因子的灌注培养方法，其特征在于，所述步骤3中，灌注培养的培养时间为≥60天。