CN109628407A - 高密度长期培养表达抗vegf人源化单克隆抗体重组cho细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法,涉及高密度长期培养CHO细胞生产抗VEGF人源化单克隆抗体的方法。步骤:(一)准备工作;(二)接种细胞;(三)细胞截留换液操作:第一阶段:细胞增殖阶段,该阶段的目的是促进细胞的快速增殖,在达到所需的细胞浓度时进入第二阶段。第二阶段:抗VEGF人源化单克隆抗体表达阶段在该阶段。本发明有效实现在长期高密度培养CHO细胞过程中可以在线进行中空纤维柱的清洗,有效降低堵塞的发生,达到长期培养的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型利用摇动式一次性袋式激流反应器及细胞截留装置进行高密度长期培养CHO细胞生产抗VEGF人源化单克隆抗体的方法。
背景技术
近年来,随着对以哺乳动物细胞为载体所生产的如蛋白质类、生长因子、疫苗和单抗等重组生物制品的需求量不断加大,人们逐渐将目光集中于大规模动物细胞培养上,并且,随着对哺乳动物细胞了解的不断深入以及新技术的应用,细胞培养的水平在逐步的提高,从最初的几升到如今的几千升甚至上万升,蛋白表达量也由最初的几毫克每升到如今的几克甚至是几十克每升。但由于细胞体外培养的特性,重组生物制品结构的复杂性及对产品要求的一致性使得动物细胞培养技术很难被完全掌握,全球各大生物技术公司也在不断的探索如何提高重组生物制品的产量及质量,并取得了很大的进展。
在上世纪六十年代,灌注培养技术的出现为动物细胞大规模培养开辟了广阔的前景。在随后的研究中,灌注培养技术得到了迅速发展,已成为动物细胞大规模培养的重要方法。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分,并带走代谢副产物,而细胞保留在反应器系统中,由于细胞生长环境优良,可以达到很高的细胞密度,并延长表达时间、增大收获体积,同其它方法相比,灌注培养的产率可以提高很多。当前灌注培养工艺主要还是依赖微载体作为基质来培养细胞,这就不可避免的需要使用血清来作为培养基的添加物来促进细胞的贴附,另外,载体的材质及数量等方面很大程度上制约了培养的细胞数量,其应用还具有一定的局限性。
随着无血清悬浮培养工艺的日趋成熟,现有细胞密度及表达量已不能满足需求,人们重新将目光转移到灌注培养上,如何不用微载体而将细胞截留在反应器中并结合无血清悬浮培养工艺进行产物的表达成为热门。膜过滤细胞具有简单易行的特点,并且成本较低,但由于膜的表面积较小,容易堵塞成为膜过滤细胞的制约之处,因而,人们发现利用切向流技术进行过滤的手段可有效的提高膜过滤系统的效率并减少阻塞的发生,但阻塞问题仍无法彻底解决。对于利用切向流过滤悬浮细胞的工艺的重点在于如何进一步提高过滤效率而减少阻塞的发生上,本发明可实现表达抗VEGF人源化单克隆抗体的细胞长期高密度培养生产抗体。
发明内容
本发明提供一种高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法。
本发明为有效的实现表达抗VEGF人源化单克隆抗体的细胞长期高密度培养,利用摇动式一次性袋式激流反应器作为细胞高密度培养装置,以中空纤维柱作为细胞截留装置,通过培养系统的相关管路设计,在中空纤维柱上增加反向冲洗管路,从而实现在长期高密度培养CHO细胞过程中可以在线进行中空纤维柱的清洗,有效降低堵塞的发生,达到长期培养的目的。
为解决上述问题,本发明采用如下技术方案:高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法,按照如下工艺步骤:
(一)准备工作:将反应器内注入无菌验证培养液,并将细胞节流装置内同时注满该培养液并进行模拟细胞截留的操作,验证管路连接的完整性;将反应器模拟细胞培养条件运行1-2天进行无菌验证工作,验证通过后将验证用培养液弃掉即可;
(二)接种细胞:将经过悬浮驯化的可适应无血清悬浮培养基的表达抗VEGF人源化单克隆抗体的CHO细胞在从液氮罐中复苏后进行培养,在摇瓶中传2-3代后细胞处于对数生长期时进行逐级扩增培养,当细胞数量达到接种要求时进行接种,接种后细胞密度一般为0.5×106-2×106个/mL,接种体积可以是反应器的最小培养体积,然后继续进行扩增培养至工作体积;
接种后的细胞活率应该在90%以上,待细胞密度达到5×106-10×106个/mL时进行细胞截留换液操作;
在进行细胞截留换液操作以前的细胞培养阶段可以视为种子细胞扩增期,控制培养参数为PH:6.8-7.2,之间;DO在30%-80%空气饱和度;温度为34℃-37℃;
(三)细胞截留换液操作:该过程可分为两个阶段进行:
第一阶段:细胞增殖阶段,该阶段的目的是促进细胞的快速增殖,在达到所需的细胞浓度时进入第二阶段;
在第一阶段细胞培养期间,进行细胞培养液置换速率应根据细胞的生长速度、营养物质的消耗情况进行,一般起始置换体积为20%-50%培养体积/天,然后缓慢增加,待细胞达到所需密度或增殖停止时换液速率稳定,一般培养液置换体积为80%培养体积每天;
该阶段一般为接种后持续3-8天;
第二阶段:抗VEGF人源化单克隆抗体表达阶段在该阶段,控制反应器培养参数:温度为36.5℃、PH为7.1-7.3、DO为60%-80%空气饱和度;
同时,控制细胞密度的稳定;控制细胞密度的稳定通过以下方式操作:
1)降低培养温度至32-35℃,同时抑制细胞增殖;
2)或者,通过在灌注培养基内添加正丁酸钠抑制细胞增殖的化合物条件,正丁酸钠添加量为0.5-1mmol/L;
3)或者,以通过从反应器内抽取一定量细胞培养液的方式少量弃去细胞以维持细胞密度的稳定;
4)或者,通过以上两种或三种方式结合使用;
在该阶段的细胞截留换液操作中,换液速率也应控制稳定,在培养液中适当添加促进表达的物质,该物质为0.2%糖基化位点添加剂、4-8mmol/L谷氨酰胺等物质。
在该工艺中第(三)步骤细胞培养液置换过程在1个小时以内完成浓缩细胞及补充培养液的过程,在进行细胞培养液置换操作中应每隔5-20分钟进行一次反向冲洗操作,即停止悬浮细胞的截留浓缩操作,进行澄清培养液的由膜外向膜内的反向冲洗操作,操作过程一般为3-10分钟,然后继续进行悬浮细胞的截留浓缩过程,该过程结束后向反应器内补充新鲜培养基,同时对中空纤维柱再进行一次由膜外向膜内的反向冲洗过程,最后打开澄清培养基的循环管路,使中空纤维柱内部的培养液体始终处于流动状态以防止细胞碎片对膜的进一步堵塞。
本研究的摇动式一次性袋式激流反应器其特征是:基于反应器的气体利用度高、低剪力、无搅拌桨利用流体动力学原理使CHO细胞悬浮培养的特性,另外在该反应器外部连接一个可与细胞截留装置相连的管路。
本研究的中空纤维柱为可进行灭菌(可耐受湿热灭菌、γ射线灭菌、酒精浸泡或NaOH浸泡等)使用的符合GMP要求的材质制造的,该中空纤维柱通过一些外部管路(包括不锈钢管路及医用硅胶管路)与摇动式一次性袋式激流反应器相连。该系统可以单独进行灭菌后通过无菌连接装置与摇动式一次性袋式激流反应器相连。
附图说明
图1是带有反向冲洗结构的中空纤维柱悬浮细胞截留装置示意图;
图中符号说明:铁架台1,中空纤维柱2,压力表3,连通阀4,蠕动泵5,细胞液流动方向6,丰收液流动方向7,培养基流动方向8。
图2是表达抗VEGF人源化单克隆抗体细胞密度及活率曲线图。
图3是细胞培养液置换培养的重组抗VEGF人源化单克隆抗体SDS-PAG电泳图。
图4是细胞培养液置换培养的重组抗VEGF人源化单克隆抗体HPLC图谱。
具体实施方式
下面用最佳的实施例对本发明做详细的说明。
实施例一
高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法,其特征在于:按照如下工艺步骤:
(一)准备工作:将准备好的摇动式一次性袋式激流反应器与细胞截留装置进行灭菌处理,使用无菌连接接头将两个装置连接,打开反应器与细胞截留装置连通管路的开关,使管路处于打开状态。将反应器内注入一定体积的无菌验证培养液,注入量为反应器可正常运转的最小工作体积,并将细胞节流装置内同时注满该培养液并进行模拟细胞截留的操作,验证管路连接的完整性;将反应器模拟细胞培养条件运行1-2天进行无菌验证工作,验证通过后将验证用培养液弃掉即可;
(二)接种细胞:将经过悬浮驯化的可适应无血清悬浮培养基的表达抗VEGF人源化单克隆抗体的CHO细胞在从液氮罐中复苏后进行培养,一般在摇瓶中传2-3代后细胞处于对数生长期时进行逐级扩增培养,扩增过程可使用微型模拟反应器也可以使用摇动式一次性袋式激流反应器,并根据培养体积进行扩增,当细胞数量达到接种要求时进行接种,接种后细胞密度一般为0.5×106-2×106个/mL,接种体积可以是反应器的最小培养体积,然后继续进行扩增培养至工作体积,也可以是直接接种至工作体积;
接种后的细胞活率应该在90%以上,待细胞密度达到5×106-10×106个/mL时进行细胞截留换液操作;
在进行细胞截留换液操作以前的细胞培养阶段可以视为种子细胞扩增期,控制培养参数为PH:6.8-7.2,之间;DO在30%-80%空气饱和度;温度为34℃-37℃。为促进细胞快速增长可在培养基中适当添加短肽类、氨基酸类及生长因子等物质,添加量个根据实际情况进行选择。
(三)细胞截留换液操作:该过程可分为两个阶段进行:
第一阶段:细胞增殖阶段,该阶段的目的是促进细胞的快速增殖,在达到所需的细胞浓度时进入第二阶段。
该阶段细胞的显著特点是:1、细胞增殖迅速,该阶段的细胞生长处于对数生长期;2、对营养需求较高,由于细胞增殖较快,且细胞密度上升较快,因此,所需要的营养物质相对较多;3、代谢废物累积较多;4、抗VEGF人源化单克隆抗体表达水平较低。鉴于以上几点,在该阶段细胞培养期间,进行细胞培养液置换速率应根据细胞的生长速度、营养物质的消耗情况进行,一般起始置换体积为20%-50%培养体积/天,然后缓慢增加,待细胞达到所需密度或增殖停止时换液速率稳定,一般培养液置换体积为80%培养体积每天;
换液速率的选择应根据细胞的生长速率及代谢情况进行选择,以培养基中个营养物质充足但不过剩为标准,另外,也要依据代谢废物如乳酸、氨等累积情况进行选择。若选择连续流灌注培养方式,由于培养液的交换式以持续的方式进行的,细胞的生长环境相对更为稳定,因此细胞生长速率较批次灌注方式更为良好。
由于该阶段细胞的生长速率较快,而抗VEGF人源化单克隆抗体表达水平较低,因此,在该阶段的丰收液可不作为收获液而弃掉。该阶段一般为接种后持续3-8天。
第二阶段:抗VEGF人源化单克隆抗体表达阶段,在第一阶段中,当细胞满足表达所需条件(如细胞密度、表达水平、产物质量等)时,即可进入表达期换液操作。在该阶段,为保证产物质量的稳定性,应控制反应器培养参数(如PH、温度、溶解氧)的稳定,同时,应控制细胞密度的稳定。
控制细胞密度的稳定可通过降低培养温度,降低温度的目的主要是使细胞由G0期停滞在G1期,以利于细胞的表达,同时抑制细胞增殖;另外也可以通过添加丁酸钠等抑制细胞增殖的化合物等条件,也可以通过少量弃去细胞的方式维持细胞密度的稳定,也可以是以上几种方式结合使用。
在该阶段的细胞截留换液操作中,因细胞密度稳定,为保证细胞培养环境的稳定,其换液速率也应控制稳定,在培养液中可适当添加促进表达的物质如短肽类、因子类、无机盐等。
在该工艺中第(三)步骤细胞培养液置换过程的特点是操作时间短,一般在1个小时以内完成浓缩细胞及补充培养液的过程,其细胞培养液收集速率也较大,因此其膜面积一般较连续流方式大。该种方式在进行细胞培养液置换操作中应每隔5-20分钟进行一次反向冲洗操作,即停止悬浮细胞的截留浓缩操作,进行澄清培养液的由膜外向膜内的反向冲洗操作,操作过程一般为3-10分钟,然后继续进行悬浮细胞的截留浓缩过程,该过程结束后向反应器内补充新鲜培养基,同时对中空纤维柱(参阅图1)再进行一次由膜外向膜内的反向冲洗过程,最后打开澄清培养基的循环管路,使中空纤维柱内部的培养液体始终处于流动状态以防止细胞碎片对膜的进一步堵塞。
本发明的优势在于,摇动式一次性袋式激流反应器的高气体利用度及无搅拌桨设计可以提供高密度细胞培养环境,通过增加中空纤维柱反向冲操作的技术手段,有效延长了表达抗VEGF人源化单克隆抗体的细胞培养周围期及细胞密度,明显的降低了柱体堵塞的风险,提高抗VEGF人源化单克隆抗体的质量及产量。
由于细胞培养液置换培养结合了悬浮细胞流加培养与载体灌注培养双方面的优势,在很大程度上改善了细胞的生长及表达环境,不仅使产物的表达量有很大的提高,在产物质量上提高尤为显著,同时,由于收获的澄清液不含细胞,在后期纯化过程中省去了离心、深层过滤、超滤等步骤,对于成本的降低及加速纯化过程起到非常重要的作用,通过该技术使抗VEGF人源化单克隆抗体的质量更高,产业化的优势更为明显。
实施例二
表达抗VEGF人源化单克隆抗体细胞培养工艺研究。
本研究是一种重组抗VEGF人源化单克隆抗体的生产方法,通过该方法所生产的重组抗VEGF人源化单克隆抗体无论在抗体质量上还是产量上均有很大程度的提高。
1、材料和方法:
表达重组抗VEGF人源化单克隆抗体的CHO-S细胞株(该细胞株经过表性分析、稳定性研究等鉴定的可用于生产的细胞株),6.5L摇动式一次性袋式激流反应器、GE中空纤维柱(型号:CFP-4-E-8A)、商业化化学成分限定培养基(GIBICOFortiCHO)等。
种子细胞的复苏与扩增:从液氮罐中取出一只表达重组抗VEGF人源化单克隆抗体的CHO-S细胞株,在空气中停留片刻,然后迅速置于37℃的水浴中使其快速溶解。在超净工作台中将冻存管中的细胞转移到离心管中,以1000rpm/min离心5min,在超净工作台中弃去上清液,然后加入无血清培养基,使其重悬,将细胞转移入40mL模拟反应器中培养,培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度、120rpm/min的振荡培养箱。当细胞增殖旺盛,5×106个/mL时传入1L模拟反应器继续进行扩增培养,当细胞密度达到5×106个/mL,细胞液体积达到500mL时接种反应器。
接种反应器继续进行培养:在无菌条件下将模拟反应器内的细胞转移至接种瓶中,并接种至已准备好的通过无菌验证的反应器中。种子细胞密度为5×106个/mL,接种体积为5L,此时细胞密度约为0.5×106个/mL。
调整反应器的转速为60rpm/min,控制参数为通气量0.2L/min、温度37℃、PH7.1-7.2、溶解氧40%空气饱和度。
种子细胞增殖期间将反应器与悬浮细胞换液装置的管路处于关闭状态,待细胞密度达到5×106个/mL以上时开启悬浮细胞换液装置,该过程需要2-6天。
细胞培养液置换:当细胞密度达到5×106个/mL以上时即可开使进行培养液置换培养,本研究采用批次培养液置换培养方式,换液过程如下:
1)、开启反应器与中空纤维细胞截留装置的管路;
2)、打开中空纤维细胞截留装置的换液管路与澄清液收集路,同时关闭柱体清洗管路与反冲洗管路;
3)、打开蠕动泵,调整转速为2.5-3L/min,待运行稳定后开始收集澄清培养液,收集速度控制在80-200ml/min;
4)、系统每运行10-15min进行一次培养液的由膜外向膜内的反冲操作,反冲操作时停止以上蠕动泵并关闭换液管路与澄清液收集路,开启反冲管路进行反冲洗操作,操作结束后重新打开换液管路与澄清液收集路并关闭反冲洗管路;
5)、待澄清液的收集达到所需体积时停止澄清液的收集,并运行一次反冲洗操作,操作结束后关闭反冲洗管路,运行清洗管路进行柱体的不间断清洗;
6)、向反应器内补充新鲜的培养基至原培养体积。
本次研究的培养液置换量在培养初期为50%;当细胞密度达到1×107个/mL以上时培养液置换量为60%;当细胞密度达到2×107个/mL以上时培养液置换量调整为80%,依据细胞营养消耗情况向反应器内补充5-10%的FeedC培养基,并补充50%浓度的葡萄糖,使反应器内葡萄糖浓度在下次培养液置换前达到2g/L以上。
该研究中细胞密度通过弃掉部分细胞的方式维持细胞密度在2×107个/mL左右,抗体表达期细胞培养条件为通气量0.5L/min、温度37℃、PH6.95-7.0、溶解氧60%空气饱和度。
2、试验结果:
本次研究中通过该工艺进行的培养液置换培养期为45天,收获含有重组抗VEGF人源化单克隆抗体的细胞培养液体积为142L,为培养体积的28.4倍。
通过该工艺所生产的重组抗VEGF人源化单克隆抗体与传统流加培养方式相比抗体质量有所提高,表达量相近,总产量提高近25倍。
具体试验结果见附图:
通过该工艺研究所生产的重组抗VEGF人源化单克隆抗体经与原研药品安维汀进行质量对比研究发现,该抗体电泳纯度可达到100%,肽指纹图谱、体外生物学活性、结合活性等关键指标均与原研药安维汀基本一致,说明该工艺可应用于重组抗VEGF人源化单克隆抗体的生产。
附图1、带有反向冲洗结构的中空纤维柱悬浮细胞截留装置示意图。
附图2、表达抗VEGF人源化单克隆抗体细胞密度及活率曲线图。
附图3、细胞培养液置换培养的重组抗VEGF人源化单克隆抗体SDS-PAG电泳图。
附图4、细胞培养液置换培养的重组抗VEGF人源化单克隆抗体HPLC图谱。
Claims (2)
1.高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法,其特征在于:按照如下工艺步骤:
(一)准备工作:将反应器内注入无菌验证培养液,并将细胞节流装置内同时注满该培养液并进行模拟细胞截留的操作,验证管路连接的完整性;将反应器模拟细胞培养条件运行1-2天进行无菌验证工作,验证通过后将验证用培养液弃掉即可;
(二)接种细胞:将经过悬浮驯化的可适应无血清悬浮培养基的表达抗VEGF人源化单克隆抗体的CHO细胞在从液氮罐中复苏后进行培养,在摇瓶中传2-3代后细胞处于对数生长期时进行逐级扩增培养,当细胞数量达到接种要求时进行接种,接种后细胞密度一般为0.5×106-2×106个/mL,接种体积可以是反应器的最小培养体积,然后继续进行扩增培养至工作体积;
接种后的细胞活率应该在90%以上,待细胞密度达到5×106-10×106个/mL时进行细胞截留换液操作;
在进行细胞截留换液操作以前的细胞培养阶段可以视为种子细胞扩增期,控制培养参数为PH:6.8-7.2,之间;DO在30%-80%空气饱和度;温度为34℃-37℃;
(三)细胞截留换液操作:该过程可分为两个阶段进行:
第一阶段:细胞增殖阶段,该阶段的目的是促进细胞的快速增殖,在达到所需的细胞浓度时进入第二阶段;
在第一阶段细胞培养期间,进行细胞培养液置换速率应根据细胞的生长速度、营养物质的消耗情况进行,一般起始置换体积为20%-50%培养体积/天,然后缓慢增加,待细胞达到所需密度或增殖停止时换液速率稳定,一般培养液置换体积为80%培养体积每天;
该阶段一般为接种后持续3-8天;
第二阶段:抗VEGF人源化单克隆抗体表达阶段在该阶段,控制反应器培养参数:温度为36.5℃、PH为7.1-7.3、DO为60%-80%空气饱和度;
同时,控制细胞密度的稳定;控制细胞密度的稳定通过以下方式操作:
1)降低培养温度至32-35℃,同时抑制细胞增殖;
2)或者,通过在灌注培养基内添加正丁酸钠抑制细胞增殖的化合物条件,正丁酸钠添加量为0.5-1mmol/L;
3)或者,以通过从反应器内抽取一定量细胞培养液的方式少量弃去细胞以维持细胞密度的稳定;
4)或者,通过以上两种或三种方式结合使用;
在该阶段的细胞截留换液操作中,换液速率也应控制稳定,在培养液中适当添加促进表达的物质,该物质为0.2%糖基化位点添加剂、4-8mmol/L谷氨酰胺等物质。
2.如权利要求1所述高密度长期培养表达抗VEGF人源化单克隆抗体重组CHO细胞的方法,其特征在于:在该工艺中第(三)步骤细胞培养液置换过程在1个小时以内完成浓缩细胞及补充培养液的过程,在进行细胞培养液置换操作中应每隔5-20分钟进行一次反向冲洗操作,即停止悬浮细胞的截留浓缩操作,进行澄清培养液的由膜外向膜内的反向冲洗操作,操作过程一般为3-10分钟,然后继续进行悬浮细胞的截留浓缩过程,该过程结束后向反应器内补充新鲜培养基,同时对中空纤维柱再进行一次由膜外向膜内的反向冲洗过程,最后打开澄清培养基的循环管路,使中空纤维柱内部的培养液体始终处于流动状态以防止细胞碎片对膜的进一步堵塞。
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