CN102994442B - 一种利用激流式生物反应器悬浮培养动物细胞的工艺过程及控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用激流式生物反应器无血清培养动物细胞生产重组蛋白类药物的工艺过程及控制方法。该工艺采用流加基础培养液来提高细胞密度并扩大细胞培养体积。通过降低培养温度和流加浓缩的表达培养液来维持细胞密度和活率。从而高效、持续的获得重组蛋白。工艺控制方法主要针对不同细胞株生长代谢变化，对pH、溶解氧、温度变化进行在线监测；对细胞密度、活率、培养体系中葡萄糖、谷氨酰胺、氨、乳酸、渗透压进行定时检测。该方法特别适合大规模动物细胞悬浮培养。具有操作控制简单，传质传氧效率高，培养周期稳定、批次间结果差异小、生产成本低、容易实现大体积、高密度等优点。

Description

一种利用激流式生物反应器悬浮培养动物细胞的工艺过程及控制方法

技术领域

本发明属于细胞工程技术，涉及动物细胞大规模培养及生产重组蛋白药物的工艺，具体涉及动物细胞无血清高密度，高表达悬浮培养工艺过程控制方法。

背景技术

动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一，并随着重组治疗性蛋白类药物的广泛应用而迅速发展。目前工业化生产动物细胞表达重组蛋白治疗药物的主要方法是通过生物反应器，在体外大规模高密度培养杂交瘤细胞、工程细胞、昆虫细胞和微生物等，再通过相关的纯化手段制备重组蛋白产品。

用于细胞大规模培养的生物反应器有搅拌式生物反应器，气升式生物反应器，中空纤维生物反应器，固定床式生物反应器，旋转式生物反应器，一次性生物反应器。[SINGH Vijay.Disposable bioreactor for cell cumture usingwave-induced agitation[J].Cytotechnology，1999，30：149-158.][2]SlivacI，

V G， K，

I and Kniewald Z 2006Aujeszky’sdisease virus production in disposable bioreactor[J].Biosci.31：363-368.]搅拌式生物反应器的最大优点是能培养各种类型的动物细胞，培养工艺容易放大，产品质量稳定，适合于工业化生产，在生物制品开发中潜力很大。但这种生物反应器也有不足之处，即机械搅拌会产生高剪切力，对细胞造成某种程度上的损伤。气升式生物反应器能在通气的同时，利用其独特的回路循环装置使液相达到循环。最常见的为管道或板柱内循环气升式生物反应器。外循环气升式反应器，将下降管置于反应器外部，可用于高细胞浓度灌注培养。缺点相对来说较少，主要是高密度培养时混合不够均匀。中空纤维生物反应器的主要组成部分是一充满培养液的闭合管道，管道中插入半通透性的中空纤维。中空纤维为培养细胞提供营养物质并运走代谢废物。但是细胞密度过高会妨碍氧的扩散，使细胞的得氧量不同。同时，此反应器中还存在着营养物质和代谢产物的浓度差，这就导致了细胞生长的不均一性。[李宝香，郭德伦，张莹三维细胞培养技术及相关仪器的进展和应用]填充床生物反应器中填充了某种材料，作为固定细胞的载体，填料颗粒堆叠成床。培养液可以在床层中流动。它没有机械搅拌和气泡，所以剪切力小，适合细胞培养。但该反应器的最大缺点是混合效果差，传质、传氧效率低。[动植物细胞培养生物反应器的研究进展王志江，郑裕国旋转式生物反应器(RCCS)主要由控制装置和培养容器两部分组成。培养容器主要由内外两个圆筒组成，内、外筒可相对独立地旋转。整个容器由电机驱动沿水平轴旋转，细胞颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道。由于该系统无推进器、空气升液器、气泡或搅拌器，细胞颗粒不与容器壁或任何其它易致伤的物体相碰，故几乎没有破坏性的剪切力。普通生物反应器由于通过搅拌保持细胞的悬浮而产生的剪切力破坏了细胞间和细胞与基质问的稳定，使组织和细胞集中于自身的修复，而大大影响其生长和其它的正常生理功能。由于有很好的物质交换功能，细胞在RCCS中能以很高的密度生长，其细胞的培养密度可达到10⁸，故可快速大规模地培养细胞。此外，这种培养能提供本能的分化、高细胞增殖、低的细胞死亡率和增加细胞产物的分泌。[Fang A，Pierson D L.Mishra SK.etal.Growth of Streptomyces hygroscopicusinrotating wall bioreactor under simulated microgravity inhibits rapamycinproduction[J].Appl Microbiol Biotecknol.2000，54：33.]一次性生物反应器是最近发展起来的新式反应器，由预先消毒的、可被FDA认可的、对生物无害的聚乙烯塑料箱组成，箱中部分填充培养液并接种细胞，箱中其余部分是空气。使用前箱体用r射线消毒，用后丢弃。特殊的开孔可进行无菌加样、取样，而不必把生物反应器置于层流罩中，装置简单，易于操作，成本低，低剪切力，无空气鼓泡减低了气泡对细胞的损害，可用于培养动物细胞和植物细胞并十分适合生产病毒。此反应器已经成功悬浮培养重组NSO细胞生产单克隆抗体；悬浮培养人293细胞生产腺病毒；用昆虫sf 9细胞生产棒状病毒；用微载体Cytodex 3培养人293细胞。[林福玉，陈昭烈等.大规模动物细胞培养的问题及对策.生物技术通报.1999，1：32-35.]

本发明中激流式生物反应器是一种全新概念的生物反应器，激流式生物反应器由控制系统、激流式振荡器、细胞培养罐、一次性细胞培养袋、灭菌器、取样器、储液袋七大部分组成。基于无鼓泡式新型传氧机制，它通过激流式振荡器机械摇动产生激流而使培养液反复冲刷细胞培养袋内表面的氧分子层，进而使氧，二氧化碳等气体分子层迅速溶解于培养液中，同时带走排除代谢废物，以满足细胞正常生长和代谢的需求。激流式反应器采用具有世界专利的无鼓泡式传氧技术，可支持悬浮细胞高密度培养。细胞培养用塑料反应袋采用符合生物安全性的专用生物EVA膜，经过24kGy钴60幅照灭菌，通过内毒素残留检测，符合GMP生产条件的要求。培养液在菌塑料反应袋中产生激流式的冲刷，袋子内壁和培养液之间完成氧分的传递，从而达到高效的传氧、传质和混合的目的。该系统无气升装置、鼓泡或搅拌器，使剪切力最小化。一次性培养袋使用后就抛弃，可避免交叉污染、缩短批间处理周期，无需清洗、消毒、验证，极大地提高工作效率。

动物细胞大规模培养一般分为分批式(batch)、流加式(Fed-batch)、灌流式(perfusion)三种操作模式。当前公开发表的生产工艺占有主流优势的是利用反应器进行的悬浮培养，工艺设计是流加或灌流培养[米力，陈志南，动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择，中国生物工程杂志，2003，23(7)：1.]。无血清培养是当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可简化分离纯化步骤，避免支原体、病毒污染造成的危害。[Anna F.Europa，Anshu Garnbhir，Peng-Cheng Fu，Wei-Shou Hu.Multiple States with Distinct CellularMetabolism in Contiuous Culture of mammalian Cells.Biotechnol Bioeng，2000，67(1)：25-34.]流加培养工艺是当前动物细胞大规模培养占有主流优势的培养工艺。在规模化的蛋白质生产中选择使用流加工艺(Fed-batch)的公司有，如美国的Genentech，IDEC，MedImmune，Merck等。流加培养工艺中的关键技术是基础培养液和流加浓缩营养培养液的设计。1996年谢良志博士运用化学计量法，根据动物细胞生长的需求，设计定量添加浓缩的培养液。[Xie L Z，Wang D I.High cell density and high monoclonal antibody production mediumdesign and rational control in a bioreactor.Biorechnol Bioeg，1996，51：725-729.]

发明内容：

本发明的目的是为了应用一种激流式生物反应器，一次性反应袋，无血清悬浮培养动物细胞(细胞包括重组CHO细胞、杂交瘤细胞等)生产重组蛋白的工艺控制方法。我们的优点是该激流式细胞反应器，成本低，操作控制简单，利于大规模扩大生产。通过细胞反应袋表面冲刷传氧，只需通入一定量空气(0.1～10L/min)和少量氧气，即可维持培养体系中溶解氧20～80％；培养过程中只需对pH、溶解氧、温度进行在线监控；对细胞密度、活率、葡萄糖、谷氨酰胺、氨、乳酸含量，渗透压进行定时监测，采用自动控制系统进行流加补料。采用连续流加基础培养液的方法来提高细胞密度并扩大培养体积，再通过降低细胞培养温度和流加浓缩培养液来维持细胞密度和活率。如流程图所示，进行每一轮生产时，从一瓶工作细胞库细胞开始，在无血清培养液中悬浮培养，逐级扩增传代，在摇瓶扩增细胞后，接种至50L激流反应器，再接种至300L反应器进行生产。生产期将持续7-21天，细胞密度(6×10⁶～2×10⁷cells/ml)，加入丁酸钠等已提高重组蛋白的表达量。培养结束时，收获液直接纯化。

1.细胞培养过程描述

工作细胞库细胞管从冷冻保存的液氮罐内取出，在约37℃快速融化，无菌条件下将细胞移入含有无血清培养液的T25方瓶中，并逐级扩增到T125方瓶。这个时候以及整个培养过程中的特定间隔，测量细胞密度和计算群体倍增水平(PDL)的样品都在无菌的条件下取出。T方瓶在37±2℃培养，细胞保持悬浮，密度维持在0.5×10⁶～2×10⁶cells/ml，当培养体积达到40ml将细胞移入摇瓶中，在37±2℃摇床中培养，(2～5天后)再以适当的细胞密度将细胞接入含有新鲜培养液的150ml摇瓶，(2～5天后)再以适当的细胞密度将细胞接入含有新鲜培养液的3L摇瓶，在适当的细胞密度(2～5天后)细胞接入6L摇瓶。在适当的细胞生长时期(2～5天后)，6L摇瓶细胞接入带有气体(O2、CO2和N2)控制系统的50L反应器，50L反应器扩增至40L至50L体积，细胞密度维持在4×10⁶～8×10⁶cells/ml，用袋传袋地方法直接接种300L反应器，温度控制在37±0.2℃，通过控制塔用CO2和碳酸钠(碱)控制pH，用通入空气恒流来保持反应器内正向压力，用氧气通气量间隔时间来控制溶解氧含量高低。所有气体通过0.22μm或更小孔径的膜过滤，葡萄糖要加入培养液中连续流加使糖含量保持在1-2g/L。并不断扩增培养体积，细胞达到较高密度0.8×10⁶～2×10⁷cells/ml，降温30～35℃开始生产期培养，流加浓缩的培养液成分的培养液使细胞保持活率，当细胞群体生长处于衰退期且细胞活率在40～80％时，停止培养。

2.细胞培养扩增的各步工艺参数包括：

1)基础无血清培养液中葡萄糖起始浓度为3～6g/L；浓缩的表达无血清培养液葡萄糖起始浓度为40～60g/L；培养过程中葡萄糖浓度控制为1～2g/L；

2)无血清培养液中谷氨酰胺起始浓度为2～4mM/L；培养过程中谷氨酰胺下限为0.5～1.5mM/L；

3)培养过程乳酸的最高上限为5～20mM/L；

4)冻存管存放在液氮中。T方瓶培养条件：37℃5％CO2培养箱。摇瓶培养条件：37℃摇床，转速100～200rpm。收获方式：无菌放料。收获时间：细胞密度下降且活率在40～80％时。

3.细胞培养原材料

所有生产原材料都必须按照GMP中规定的程序，完成接收、鉴定、抽样、检验、测试和签发。表1列出重组药物细胞培养中所用原材料，必要的情况下相同材料也可以替代。

表1细胞培养原材料

本发明以附图的形式进行说明，但以下说明并不构成对本专利的限制。

附图说明：

附图1：工艺流程图。

附图2：激流式生物反应器。

附图3：一次性细胞反应袋。

附图4：基础培养液在培养前、中、后期氨基酸含量对比。

附图5：CHO细胞表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体各项曲线。

具体实施方式：

以下通过实施例详细说明本发明的内容，但这些实施例并不构成对本发明的限制。下面以CHO细胞的大规模培养(CHO细胞表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体)为例说明生产过程。

1.培养液的配制

1.1.1基础培养液配制：

取常温注射用水，先加入配制总体积的70％左右。准确称量所需培养液HyClone公司CDM4CHO干粉(6.25克/升)加入搅拌30分钟。加入大豆水解物1g/L，酵母水解物3g/L继续搅拌30分钟。加入以下物质：KCl(0.3118g/L)、NaH₂PO₄(0.125g/L)、Na₂HPO₄(0.142g/L)NaHCO₃(1.5g/L)、HEPES(4.76g/L)、F68(1.5g/L)、NaCl(2.5g/L)、葡萄糖(2.5g/L)、谷氨酰胺(0.585g/L)，继续搅拌30分钟以上。加入胰岛素浓储液(10g/L)1ml/L。用3M盐酸或3M氢氧化钠调pH至6.9～7.0，继续搅拌30分钟左右。定容至配制体积。过滤分装，过滤后无菌验证并检查滤膜完整性。置于4℃冰箱内储存。

1.1.2浓缩培养液配制

取常温注射用水，先加入配制总体积的70％左右。准确称量所需培养液CDM4CHO干粉(18.75克/升)加入搅拌30分钟。加入大豆水解物10g/L，酵母水解物30g/L继续搅拌30分钟。加入以下物质：KCl(0.3118g/L)、NaH₂PO₄(0.125g/L)、Na₂HPO₄(0.142g/L)、NaHCO₃(1.5g/L)、HEPES(4.76g/L)、F68(1.5g/L)、葡萄糖(46g/L)、谷氨酰胺(1.755g/L)，继续搅拌30分钟以上。加入胰岛素浓储液(10g/L)1ml/L。用3M盐酸或3M氢氧化钠调pH至6.9～7.0，继续搅拌30分钟左右。定容至配制体积。过滤分装，过滤后无菌验证并检查滤膜完整性。置于4℃冰箱内储存。

基础培养液和浓缩培养液全部采用一次性塑料袋内进行，过滤分装在一次性补料袋内，无菌验证后置于4℃冰箱内储存。

2.种子细胞的准备

2.1工程细胞细胞株名称及来源

生产重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的工程细胞株是经过转染目的基因的CHO-S细胞，CHO-S细胞系源于成年中国仓鼠卵巢的稳定非整倍体细胞，是最为常见的转染、表达和大规模生产重组蛋白的细胞系之一。本项目所采用的CHO-S细胞购自GIBCO公司。由本公司基因工程上游实验室稳定转染，经过克隆筛选和鉴定，建立细胞库。

2.2保存方式

生产用表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体CHO-S细胞采用液氮长期保存。将处于对数生长期的表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体CHO-S细胞离心收集，加入冻存培养液(配比：45％新鲜B001培养液、45％条件培养液和10％DMSO)重悬细胞，终密度控制在0.5～1×10⁷个/ml。然后，分装至冻存管中，每管1-1.5mL。冻存管置于4度10分钟，-20度30分钟，-80度16-18小时或过夜，最后置于液氮罐中，长期保存。

3.种子细胞的扩增

3.1种子复苏

从工作细胞库中取出1支细胞，核对标识，立即将其浸入37℃的水浴中，不断搅动，使之迅速融化。

无菌操作将融化的细胞液转移到15ml离心管中，加入10ml基础培养液离心后弃上清，用5ml基础培养液重悬，转移至T-25方瓶中，并放入37℃，5％CO₂培养箱中培养。

3.2种子细胞扩增

细胞在T-25方瓶中处于对数生长期时，可直接转移到T-75的方瓶中，并补加10ml基础培养液。2天后转移到T-125的方瓶中并补加20ml基础培养液。当细胞密度达到0.5×10⁶～2×10⁶cells/ml接种到40ml摇瓶，在37±2℃摇床中培养，摇床转速120rpm/min，以后逐级放大到150ml摇瓶、3L摇瓶、6L摇瓶扩增，细胞密度达到3～6×10⁶cells/ml，活率大于95％，培养体积大于3L，准备接种。

4.接种50L生物反应器

将以上对数生长期细胞接种到50L反应器中，37℃进行培养。每天取样检测细胞生长状态，培养过程中根据细胞生长状态调整各参数进行补料，PH控制在7.0-7.2当培养体积扩增到40-50L后，细胞密度要求4×10⁶～8×10⁶cells/ml，活率要求大于95％，作为接种300L反应器生产的种子来源。

5.300L反应器培养

5.1300L反应器培养操作程序

校正温度电极、pH电极、溶氧电极，将电极放入不锈钢桶内湿热灭菌。

将灭菌后的电极无菌操作安装反应器内，加入20L基础培养液进行无菌验证。

将50L激流式反应器扩增的种子细胞，接种至300L激流式反应器中，将控制塔和气体管路接通，根据细胞密度、D0、转速适当调整控制塔上各进气流量计的气体流量，培养过程中视细胞生长状态调整各参数进行补料，培养体积达到200L，细胞密度达到1×10⁷以上时补加浓缩培养液并且降温表达，直至细胞活率下降到80％以下时，收液纯化。

5.2培养周期参数控制指标

6.检测方法

6.1氨基酸分析

取原始培养液和不同时间的细胞培养液上清，用美国安捷伦1200液相色谱，Waters公司ACCQ-Tag氨基酸衍生试剂盒柱前衍生外标法定量测定氨基酸含量。通过氨基酸分析可以检测培养末期剩余氨基酸含量，从而监测细胞的氨基酸需求。

6.2活细胞计数

采用德国INNOVNTIS公司CAST model TT细胞计数仪。进行死活细胞计数。

6.3葡萄糖和乳酸含量测定

采用山东省科学院生物研究所BA-40C酶电极分析仪。

6.4渗透压摩尔浓度测定

采用天河医疗仪器有限公司渗透压摩尔浓度测定仪。

6.5表达的目标蛋白测定

酶联免疫吸附试验ELISA法。

6.6谷氨酰胺和氨测定

采用美国CASY-2型生化分析仪。

Claims (1)

1.一种用激流式生物反应器培养CHO细胞表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的方法，其步骤如下： 

1）培养液的配制： 

1)1，基础培养液配制：取常温注射用水，先加入配制总体积的70％,准确称量所需培养液HyClone公司CDM4CHO干粉6.25克/升,加入搅拌30分钟,加入大豆水解物1g/L，酵母水解物3g/L继续搅拌30分钟,加入以下物质：KCl 0.3118g/L、NaH₂PO₄ 0.125g/L、Na₂HPO₄ 0.142g/L、NaHCO₃ 1.5g/L、HEPES 4.76g/L、F68 1.5g/L、NaCl 2.5g/L、葡萄糖2.5g/L、谷氨酰胺0.585g/L，继续搅拌30分钟,加入浓度为10g/L的胰岛素浓储液1ml/L,用3M盐酸或3M氢氧化钠调pH至6.9～7.0，继续搅拌30分钟,定容至配制体积,过滤分装，过滤后无菌验证并检查滤膜完整性,置于4℃冰箱内储存, 

1)2，浓缩培养液配制:取常温注射用水，先加入配制总体积的70％,准确称量所需培养液CDM4CHO干粉18.75克/升,加入搅拌30分钟,加入大豆水解物10g/L，酵母水解物30g/L继续搅拌30分钟,加入以下物质：KCl 0.3118g/L、NaH₂PO₄ 0.125g/L、Na₂HPO₄ 0.142g/L、NaHCO₃ 1.5g/L、HEPES 4.76g/L、F68 1.5g/L、葡萄糖46g/L、谷氨酰胺1.755g/L，继续搅拌30分钟,加入浓度为10g/L的胰岛素浓储液1ml/L,用3M盐酸或3M氢氧化钠调pH至6.9～7.0，继续搅拌30分钟,定容至配制体积,过滤分装，过滤后无菌验证并检查滤膜完整性,置于4℃冰箱内储存, 

基础培养液和浓缩培养液全部采用一次性塑料袋内进行，过滤分装在一次性补料袋内，无菌验证后置于4℃冰箱内储存， 

2)种子细胞的准备 

2)1，工程细胞细胞株名称及来源：生产重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的工程细胞株是经过转染目的基因的CHO-S细胞，CHO-S细胞系源于成年中国仓鼠卵巢的稳定非整倍体细胞，购自GIBCO公司, 

2)2，保存方式：生产用表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体CHO-S细胞采用液氮长期保存,将处于对数生长期的表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体CHO-S 细胞离心收集，加入冻存培养液,其配方为：45％新鲜B001培养液、45％条件培养液和10％DMSO重悬细胞，终密度控制在0.5～1×10⁷个/ml，然后，分装至冻存管中，每管1-1.5mL，冻存管置于4度10分钟，-20度30分钟，-80度16-18小时或过夜，最后置于液氮罐中，长期保存， 

3）种子细胞的扩增 

3）1，种子复苏：从工作细胞库中取出1支细胞，核对标识，立即将其浸入37℃的水浴中，不断搅动，使之迅速融化，无菌操作将融化的细胞液转移到15ml离心管中，加入10ml基础培养液离心后弃上清，用5ml基础培养液重悬，转移至T-25方瓶中，并放入37℃，5％CO₂培养箱中培养， 

3）2，种子细胞扩增：细胞在T-25方瓶中处于对数生长期时，可直接转移到T-75的方瓶中，并补加10ml基础培养液，2天后转移到T-125的方瓶中并补加20ml基础培养液，当细胞密度达到0.5×10⁶～2×10⁶cells/ml接种到40ml摇瓶，在37±2℃摇床中培养，摇床转速120rpm/min，以后逐级放大到150ml摇瓶、3L摇瓶、6L摇瓶扩增，细胞密度达到3～6×10⁶cells/ml，活率大于95％，培养体积大于3L，准备接种； 

4）接种50L生物反应器 

将以上对数生长期细胞接种到50L激流式生物反应器中，37℃进行培养，每天取样检测细胞生长状态，培养过程中根据细胞生长状态调整各参数进行补料，PH控制在7.0-7.2当培养体积扩增到40-50L后，细胞密度要求4×10⁶～8×10⁶cells/ml，活率要求大于95％，作为接种300L反应器生产的种子来源， 

5）300L反应器培养 

5）1，300L反应器培养操作程序：校正温度电极、pH电极、溶氧电极，将电极放入不锈钢桶内湿热灭菌，将灭菌后的电极无菌操作安装反应器内，加入20L基础培养液进行无菌验证，将50L激流式反应器扩增的种子细胞，接种至300L激流式反应器中，将控制塔和气体管路接通，根据细胞密度、DO、转速适当调整控制塔上各进气流量计的气体流量，培养过程中视细胞生长状态调整各参数进行补料，培养体积达到200L，细胞密度达到1×10⁷以上时补加浓缩培养液并且降温表达，直至细胞活率下降到80％以下时，收液纯化， 

5）2，培养周期参数控制指标 

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