CN112680396B - 单抗或重组蛋白大规模生产中细胞扩增的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种单抗或重组蛋白大规模生产中细胞扩增的方法。具体而言，本发明提供了一种细胞扩增的方法，其包括：将细胞依次进行复苏、CO2摇床批式培养，之后在20L‑100L生物反应器中先进行批式培养再进行灌注培养。本发明的细胞扩增方法结合了细胞批式培养(batch culture)和灌注培养(perfusion culture)技术，只需一个较小体积的生物反应器扩增，即可满足最终大规模细胞培养的种子细胞量，大大缩短扩增时间，节约成本，减少设备占用空间，维持或者提高所产生重组蛋白或单抗的质量。
Description
技术领域
本发明是关于一种细胞扩增的方法，具体地说，是关于一种应用于单抗或重组蛋白大规模生产中的细胞扩增的方法。
背景技术
从应用哺乳动物细胞表达重组蛋白(如细胞因子和单克隆抗体)的技术诞生以来，细胞培养技术、无血清培养基以及用于细胞培养的生物反应器技术在不断地发展，并获得了长足的进步。治疗性单抗的临床剂量大(10mg-1000mg/瓶)，需大体积的生物反应器来培养细胞，以满足市场的需求。
目前商业化生产单克隆抗体的规模达到200-20000L。用于末端大规模生产抗体的细胞培养方式主要有两种：流加式培养(Fed-batch culture)和灌注培养(Perfusionculture)。流加式培养的过程是：先以基础培养基进行细胞培养，当细胞达到一定数量后(如1×107cells/mL)定期(如隔天)在培养系统中补加一定比例的新鲜补料培养基(高浓度培养基)，以满足高密度细胞对营养的需求；此方法的优点是操作简单，产品质量均一性好，单位体积的表达量高，成本低；但是，该方法需要大体积的生物反应器，培养周期较短，大量累计的细胞代谢废物(如NH4 +，高渗透压等)对细胞的生长和维持不利，生产周期一般在12-16天之间。灌注培养的优点是：细胞密度高，细胞培养生长和维持的时间长(30-60天)，收获的培养上清体积大，可用小体积的生物反应器来生产即可满足市场的需求；但是，单位体积的表达量低，成本高。
不管上述何种培养方式，细胞种子的密度均需要达到一定的数量(如3×105-10×105cells/mL)细胞方能正常生长。至目前为止，位于生产上游的细胞扩增均是采用批式培养(Batch culture)的方式。细胞种子批式扩增的方法是：细胞复苏→CO2摇床批式培养(10-12天)→10L生物反应器批式培养(5-6天)→50L生物反应器批式培养(5-6天)→200L生物反应器批式培养(5-6天)→1000L生物反应器批式培养(5-6天)，获得足够的细胞种子后将细胞接种到最终生产的反应器中培养(2000-20000L)。该细胞扩增方式的缺点是：设备占地空间大，设备投资巨大，培养周期长，表达产物(细胞扩增期间表达的抗体或目的蛋白)在较高温度下(一般培养温度为37℃)维持的时间长，对产品的质量均一性有明显的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种改进的细胞扩增方法，应用于单抗或重组蛋白等蛋白的大规模生产。
为实现上述目的，本发明提供了一种新的细胞扩增方法，其结合了细胞批式培养(batch culture)和灌注培养(perfusion culture)技术。本发明中称该方法为PB hybrid细胞扩增技术(PB hybrid cell amplification technology)，简称PB hybrid技术，P代表perfusion，B代表batch。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法，其包括：
将细胞依次进行复苏、CO2摇床批式培养，之后在20L-100L生物反应器中先进行批式培养再进行灌注培养。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，CO2摇床批式培养10-12天后接种20L-100L生物反应器。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，CO2摇床批式培养至细胞密度达到4×109-10×109cells/mL后进行20L-100L生物反应器批式培养。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，生物反应器中先进行批式培养至细胞密度达到5×106-10×106cells/mL后进行灌注培养。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，灌注培养使细胞密度达到20×106-100×106cells/mL后，接种到最终规模的生物反应器中进行大规模培养。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，用于灌注培养的生物反应器可以是一次性的WAVE生物反应器(自带细胞截留装置)，也可以是一次性或不锈钢搅拌式生物反应器(细胞截留装置可选择Applikon公司的Biosep，或美国Repligen公司的ATF系统，或其他公司的任何一款细胞截留系统)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，生产反应器为1000L、2000L、4000L、5000L、6000L、8000L、10000L生物反应器中的一个或多个的组合。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，所述细胞包括但不限于CHO、骨髓瘤细胞(如NSO、SP2/0细胞)、杂交瘤细胞、PerC.6或HEK293细胞。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，20L-100L生物反应器批式培养1-3天后，可根据需要补充培养基，再进行批式培养至所需细胞密度。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，20L-100L生物反应器批式过程中，设置培养条件：pH6.8-7.3，优选为7.0-7.2，最佳为7.1-7.15；温度35-38℃，优选为36-37℃，最佳为36.5-37℃。反应器摇摆角度3-8°，优选位4-6°，最佳为4-5°，摇摆振幅10-15rpm，优选为12-14rpm。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，20L-100L生物反应器灌注培养过程中，设置培养条件：pH7.0-7.2，温度36-37℃，摇摆角度8-10°，摇摆振幅15-20rpm，起始灌注的体积为0.2-0.5CV(培养体积)，随着细胞密度增加，可每天增加灌注的体积，如1CV,1.2CV，1.5CV，1.8CV，2CV，3CV等，直到细胞达到所需密度。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，20L-100L生物反应器培养过程中，反应器摇摆角度和摇摆振幅对调节pH和控制溶氧非常关键，角度和振幅过小，不能维持高密度细胞对溶氧的需求，不能有效排除CO2,维持培养液pH；反之，角度和振幅过大，会产生大量泡沫，对细胞造成损伤。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，20L-100L生物反应器批式培养过程中，设置培养条件：pH6.8-7.3，优选为7.0-7.2，最佳为7.1-7.15，温度35-38℃，优选为36-37℃，最佳为36.5-37℃，转速50-60rpm，溶氧30-80％。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，20L-100L生物反应器灌注培养过程中，设置培养条件：pH7.0-7.2，温度36-37℃，转速60-80rpm，溶氧30-80％。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的细胞扩增的方法中，20L-100L生物反应器灌注培养过程中，起始灌注的体积为0.2-1CV(培养体积)，随着细胞密度增加，每天增加灌注的体积，如1.2CV，1.5CV，1.8CV，2CV，3CV等。
本发明的细胞扩增的方法，可应用于生产抗体或重组蛋白，例如治疗性单抗(如贝伐株单抗等)或其它重组蛋白(如红细胞生成素(EPO)等)。从而，本发明还提供了所述的细胞扩增方法在生产抗体或重组蛋白中的应用。
本发明的有益技术效果：
本发明的细胞扩增方法，只需一个较小体积的生物反应器扩增，即可满足最终大规模细胞培养的种子细胞量，大大缩短扩增时间，同时，在灌注培养的过程中，表达的目的蛋白不断被排出，当细胞种子接种到最后的反应器中时，从种子中带来的目的蛋白非常少，可延长后期细胞培养的周期而不影响产品的质量，该细胞扩增方法的优点是：节省大量设备投资，占地面积小，可节省20％以上的批生产成本。
附图说明
图1A显示本发明实施例1的PB hybrid细胞扩增方式的细胞生长曲线。
图1B显示传统细胞扩增方式的细胞生长曲线。
图2A显示传统细胞扩增方式与本发明实施例1的PB hybrid细胞扩增方式中NH4 +含量变化曲线。
图2B显示传统细胞扩增方式与本发明实施例1的PB hybrid细胞扩增方式中乳酸代谢曲线。
图3显示传统细胞扩增方式与本发明实施例1的PB hybrid细胞扩增方式获得的种子细胞在2000L反应器中的生长曲线。
图4显示传统细胞扩增方式与本发明实施例1的PB hybrid细胞扩增方式获得的种子细胞在2000L反应器中的抗体表达量。
图5显示传统细胞扩增方式与本发明实施例1的PB hybrid细胞扩增方式获得的种子细胞在2000L反应器中生产的抗体电荷异质性比较。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。实施例中，未注明具体条件的实验方法按照所属领域熟知的常规方法和常规条件进行，或按照仪器说明书建议的操作条件进行。
实施例1
以CHO细胞，细胞复苏后在摇瓶中扩增到4×109-10×109cells，接种25LWave反应器(含10L培养基)，批式培养1-2天，细胞密度达到1×106-2×106cells/mL,补充培养基至25L，批式培养3-4天，在批式培养过程中，设置培养条件：pH6.8-7.3，优选为7.0-7.2，最佳为7.1-7.15温度35-38℃，优选为36-37℃，最佳为36.5-37℃。反应器摇摆角度3-8°，优选位4-6°，最佳为4-5°，摇摆振幅10-15rpm，优选为12-14rpm,。当细胞密度达到6×106-10×106cells/mL时开始灌注培养，设置培养条件：pH6.8-7.3，优选为7.0-7.2，最佳为7.1-7.15，温度35-38℃，优选为36-37℃，最佳为36.5-37℃，摇摆角度8-10，优选为5-9，更佳为6-7°，摇摆振幅15-20rpm，起始灌注的体积为0.2-0.5CV(培养体积)，随着细胞密度增加，每天增加灌注的体积，如1CV,1.2CV，1.5CV，1.8CV，2CV，3CV等，直到细胞达到50×106-80×106cells/mL，获得足够的种子细胞后接种2000L反应器。
最终培养体积为2000L，生物反应器为一次性生物反应器。
图1A显示了本实施例的PB hybrid细胞扩增方式的细胞生长曲线。图1B显示了传统细胞扩增方式的细胞生长曲线。图2A显示了传统细胞扩增方式与本实施例的PB hybrid细胞扩增方式中NH4 +含量变化曲线。图2B显示了传统细胞扩增方式与本实施例的PB hybrid细胞扩增方式中乳酸代谢曲线。注：Batch培养中中国仓鼠卵巢细胞(CHO)在细胞生长平台期(Day5后)自己消耗乳酸，使乳酸含量降低；在PB hybrid扩增中，因细胞一直快速生长，仍然在产生乳酸，但由于灌注培养，乳酸浓度随着培养基的排除而降低，因此，两者乳酸下降的机理完全不同。图3显示了传统细胞扩增方式与本实施例的PB hybrid细胞扩增方式获得的种子细胞在2000L反应器中的生长曲线。图4显示了传统细胞扩增方式与本实施例的PBhybrid细胞扩增方式获得的种子细胞在2000L反应器中的抗体表达量。
可以看出，本实施例，与传统传统细胞扩增方式相比，所产生重组蛋白或单抗的质量和表达量有显著提高。
实施例2
以NSO细胞为例，细胞复苏在摇瓶中扩增到4×109-10×109cells，接种50L不锈钢反应器(首先含10L培养基)，批式培养2-3天，细胞密度达到2×106-3×106cells/mL,补充培养基至40-50L，培养3-4天，培养条件为：pH6.8-7.3，优选为7.0-7.2，最佳为7.1-7.15，温度35-38℃，优选为36-37℃，最佳为36.5-37℃，转速50-60rpm，溶氧30-80％。当细胞密度达到6×106-10×106cells/mL时开始灌注培养，细胞截留装置为Biosep，培养条件为：pH6.8-7.3，优选为7.0-7.2，最佳为7.1-7.15，温度35-38℃，优选为36-37℃，最佳为36.5-37℃，转速60-80rpm，溶氧30-80％。起始灌注的体积为0.2-0.5CV(培养体积)，随着细胞密度增加，每天增加灌注的体积，如1.0CV，1.2CV，1.5CV，1.8CV，2CV，3CV等，当细胞种子达到50×106-100×106cells/mL，接种5000L生物反应器。在灌注培养过程中，需要对Biosep的功率随着灌注速度进行调整，并逐步增加，提高细胞截留的效率，减少细胞流失。
最终培养体积为5000L，反应器为不锈钢生物反应器。
本实施例，与传统传统细胞扩增方式相比，所产生重组蛋白或单抗的质量和表达量有显著提高。
在上述实例实施过程中，实施例1节省细胞扩增时间9-10天；在实施例2实施过程中，细胞扩增时间缩短12-15天。因此，本发明的技术，大大缩短了细胞培养的周期，节省生产周期，提高了设备的利用率。
特别地，该技术对温度敏感的抗体的质量有显著的提高，如降低了抗体的酸峰含量，提高抗体电荷均一性(提高主峰含量)，从而提高抗体的生物学活性(图5)。
Claims (1)
1.一种细胞扩增的方法在生产抗体或重组蛋白中的应用，其包括：
将细胞依次进行复苏、CO2摇床批式培养，之后在生物反应器中先进行批式培养再进行灌注培养；
所述细胞为CHO细胞；
CHO细胞复苏后在摇瓶中扩增到4×109 - 10×109cells，接种25LWave反应器，批式培养1-2天，细胞密度达到1×106 - 2×106cells/mL, 补充培养基至25L，批式培养3-4天，在批式培养过程中，设置培养条件：pH6.8-7.3，温度35-38℃，反应器摇摆角度3-8°，摇摆振幅10-15rpm，当细胞密度达到6×106 - 10×106cells/mL时开始灌注培养，设置培养条件：pH6.8-7.3，温度35-38℃，摇摆角度8-10°，摇摆振幅15-20rpm，起始灌注的体积为0.2-0.5CV，所述CV为培养体积，随着细胞密度增加，每天增加灌注的体积，直到细胞达到50×106 - 80×106cells/mL，获得足够的种子细胞后接种2000L反应器，最终培养体积为2000L，生物反应器为一次性生物反应器。
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2019
- 2019-10-18 CN CN201910996185.9A patent/CN112680396B/zh active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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