CN102391995A - 一种杂交瘤细胞无血清高密度悬浮灌流培养工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞高密度灌流培养生产重组抗体蛋白的生产工艺，该工艺主要针对杂交瘤细胞代谢特征，筛选特定的培养成份进行灌流培养，在培养过程中充分补充代谢底物同时有效降低代谢副产物浓度，从而达到高效高产的目标。在过程控制方面，通过建立特异性灌流速率CSPR灌流培养计算模型，对培养参数进行实时计算，通过浓缩培养基分段流加，控制灌流速率，在补充葡萄糖及谷氨酰胺重要底物的同时，将副产物对培养的影响降低到最低。适用于杂交瘤细胞大规模培养制备生产用抗体蛋白，能够在较短时间内提供大量蛋白抗体，且规模小、投资低，能够在短时间内达到高效产出且批次差异低、可重复性高，能够达到抗体药物生产。

Description

一种杂交瘤细胞无血清高密度悬浮灌流培养工艺

技术领域

本发明属于细胞工程领域的细胞工程技术，主要涉及杂交瘤细胞大规模培养及重组蛋白抗体生产，具体涉及一种杂交瘤细胞无血清高密度悬浮灌流培养工艺。

背景技术

动物细胞培养工艺是动物细胞表达生物技术产品的生产工艺。这种工艺的研究，是利用动物细胞的生物代谢过程，对其进行控制，解决工艺过程的共性与特性问题。该工艺研究的主要学科基础是细胞生物学和生物化学工程。相关的学科有遗传学、免疫学、分子生物学、生物化学、微生物学、化学工程学、应用物理和电子计算机等。它是一门由多学科基础综合组成而新兴的生物技术。因此，从事该项技术研究开发的人员，要尽可能掌握较全面的知识，并强调各相关学科之间的密切联系。动物细胞培养工艺在医药工业中的应用，主要是对在基础研究中获得的有价值的产品细胞株加以开发，对细胞株进行优化筛选，解决细胞本身的稳定性、产物与表达产量等问题。建立相关的质量标准，在运用工程技术手段，对产品细胞进行放大，工艺研究，以获得高效、高产量的生物医药产品。

目前，在动物细胞工业化生产蛋白治疗药物中，较为成熟的工艺有流加培养工艺、灌流培养工艺、批式培养工艺和反复批式培养工艺。其中流加培养和灌流培养，是当前动物细胞培养中占有主导优势的工艺方式。

1996年1月至2002年12月，在美国获得批准的生物技术药物的诊断和治疗制剂产品共31种，其中用哺乳动物细胞培养生产的重组蛋白治疗药物的就有21种。在21种产品中，应用最多的动物细胞为CHO、SP2/0和NSO细胞。这些重组治疗药物主要是重组蛋白和抗体。在美国获得批准产品的工艺应用中，最有代表性的需求是生产产量与质量；其培养工艺的生产形式，至少有70％的是采用搅拌式悬浮培养生物反应器系统；50％以上采用无血清培养条件。

除了传统的批式和流加生物反应器培养用于在重组细胞中生产治疗性蛋白，恒化和高密度灌流生物反应器被应用于越来越多哺乳动物细胞培养过程中，因为包含几个重要优点：

第一，不断添加新鲜的培养基并且通过稀释除去代谢副产物，如氨和乳酸(5，6)。

第二，通过哺乳动物细胞外泌重组蛋白(相比于非外泌外源蛋白的细菌)无需等待批式培养结束后细胞破碎获取分泌蛋白产品，在过程中通过灌流可以连续不断获得产物。

第三，相对于不断重复的批式培养过程，灌流培养可以保留对数生长期内的细胞，以提高细胞活性和产能。

第四，通过保留更多的活细胞，通过截流装置，细胞可以达到一个非常高的密度，同时带白质的产率与细胞密度成正比，那么维持高的细胞密度就可以在灌流后期获得相对高的蛋白质产率。接下来，在细胞生长速率普遍低下的高密度灌流培养过程中，许多杂交瘤细胞系展现出高的比生产速率(单细胞)，从而使得蛋白质生产率显著提高。最后，蛋白质在灌流生物反应器内短暂的停留时间的有利于尽量减少他们与死亡细胞释放并积累蛋白酶，唾液酸酶及其他降解酶反应的时间，维持蛋白活性及产量。

下表介绍灌流细胞培养产品发展的过程：

第一次工业规模灌流过程在20世纪80年代末，centocor生产用于治疗败血症的抗体药物entoxin。在1991年，该药品被核准在欧洲上市。但是在美国Centoxin未能通过临床试验随后停产。Centocor后来研发reopro并获得生产许可，并在1994年使用灌流技术大规模生产。同年Genzyme获得Cerezyme生产许可并采用灌流工艺进行生产。

还有其它灌流培养产品，如Gonal-F(Serano)，Remicade(Centocor)，Refacto(Wyeth)，Kogenate-FS(Bayer)，和Zigris(Eli-Lily)不断的上市。

如表1所示，灌流培养生产的产品有庞大的市场。销售灌流培养为基础的药物意义重大，他们是数百万美元的药物。remicade是一种年产上百公斤的单克隆抗体，年销售额达到15亿美元。

表1：灌流系统生产的用于市场的药品

Product	Company	Year	Sales(SM/year)
				Centoxin	Centocor	1991	n/a
Cerezyme	Genzyme	1994	740
				ReoPro	Centocor	1994	400
Gonal-F	Serono	1997	600
				Remicade	Centocor	1998	1500
ReFacto	Wyeth	2000	224
				Kogenate-FS	Bayer	2000	424
Zigris	Eli Lilly	2001	160

值得注意的是，单克隆抗体的生产在杂交瘤细胞中长期连续生物反应器培养时存在不稳定现象。不过，这种在缓慢生长的杂交瘤细胞中逐渐产生的不稳定的抗体与重组细菌表达快速产生的不稳定异源蛋白有相当显著的差异。在哺乳动物细胞中生产的蛋白质会逐步损失，灌流生物反应器培养仍有足够的稳定时间，这个时间也许超过数周或数月，同时在类似规模的生物反应器相对于批式培养可以生产更多的蛋白质。因此，如果在灌流工艺条件下蛋白质稳定性能够得以保证，那么灌流生物反应器培养将成为一种优越的哺乳动物细胞大规模生产治疗性蛋白的运作模式。

近些年，由于市场规模的扩大，灌流培养工艺由于其规模的限制，而逐步被流加培养工艺所取代。但是在抗体制备及药品研发阶段，灌流培养工艺仍因其独到之处而存在着广泛的应用价值。应用常规培养设备加装内部或外部高效稳定的截留装置，可以使得灌流培养在中试规模的发酵罐中获得工业化生产规模的培养体积。而且通过工艺参数优化，尤其是高密度培养条件下的灌流参数优化，在维持高密度培养的情况下，同等条件下灌流培养工艺的产率远高于流加培养，从而得到更多更好的产品。因而高效的灌流模型的开发成为了目前本领域的研究重点。

Ozturk等人介绍了一种关于细胞灌流速率的理念，细胞特异性灌流速率(CSPR)。通过应用底物产物平衡公式，设计、优化、控制灌流生物反应器。

D·(S₀-S)＝q_s·X

D·(P-P₀)＝q_p·X

其中D是稀释率，X是活细胞密度，S，P是底物和产品浓度；S_o和Po分别为他们的起始浓度；q_s和q_p表示底物利用速率和产物合成速率。将CSPR定义为CSPR＝D/X，变换质量平衡方程为：

S＝S₀-q_s/CSPR

P＝P₀+q_p/CSPR

因此，如果CSPR作为一个常数，并且细胞活力不随时间和细胞密度改变，那么CSPR可以用于高密度生物反应器培养基组分衡定的操作控制，从而优化连续生产。

使用CSPR模式控制的灌流生物反应器成功放大应用于中试规模。高度自动化的生物反应器控制系统使用光学密度电极监测细胞密度，实时测量氧消耗速率并结合测量对活细胞密度和细胞活力进行预估。然而该模式下运行的成本相对较高，对监测设备有相当高的要求。

杂交瘤细胞在生长过程中对pH及渗透压等环境参数十分敏感。鉴于其在融合阶段所采用的细胞的特性，大规模高密度的细胞培养面临着一系列的挑战。我们知道在细胞培养过程中，葡萄糖作为主要碳源及能源物质，被连续摄入并且代谢，而代谢副产物乳酸对于培养环境的pH有巨大影响。在糖酵解代谢过程中，葡萄糖分解产生丙酮酸，在不完全氧化的情况下，生成乳酸。乳酸的大量堆积超过NaHCO₃缓冲液的缓冲能力后，导致pH显著下降。在培养过程中具体表现为细胞对数生长期葡萄糖浓度的急剧下降和pH的下降成正比例关系。在细胞大规模培养过程pH是非常重要的过程参数，其主要调控手段包括关联补充CO2及NaOH进行酸碱调控。而流加培养中也采用降低培养环境中葡萄糖浓度的策略，以促进糖酵解过程向完全氧化的方向进行，以降低乳酸的堆积。但是随着NaOH的不断加入将导致培养环境渗透压的上升，同时后期糖消耗量不断增大，降低糖浓度的代谢调控也将难以实现。而以CSPR为基础，结合底物消耗进行灌流培养，在实现低糖浓度培养的基础上，通过不断更新培养基，达到移除有害副产物及稳定培养环境的目标。

但是以往的灌流培养，灌流培养基成分通常恒定不变，培养过程通过改变灌流速率来实现高密度恒化培养。而高密度培养条件下底物消耗成倍增加，培养状态难以稳定。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用于杂交瘤细胞高密度培养重组抗体蛋白的无血清高密度悬浮灌流培养工艺，该工艺能够在较低成本条件下实现细胞大规模高密度培养及抗体蛋白大量表达，同时可满足抗体药物生产工艺对于稳定性、可重现性及连续性的要求。

为实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

一种杂交瘤细胞无血清高密度悬浮灌流培养工艺，用于杂交瘤细胞高密度培养制备重组抗体蛋白，通过特异性灌流速率CSPR计算控制灌流速率，同时通过关键产物比消耗速率的计算，在不同时期通过添加葡萄糖及谷氨酰胺浓缩培养基，改变灌流过程中的底物浓度，达到优化细胞生存条件，抑制副产物产出，提高产率。

具体包括以下步骤：

1)用德国贝朗5L搅拌通气式生物反应器进行杂交瘤细胞培养，起始接种密度2×10⁵cells/ml；培养体积不大于4L；维持培养温度在37℃；pH在7.2-6.8之间；搅拌速率在60-150之间；溶氧浓度在40％-80％之间；

2)过程参数检测可通过在线及离线方式进行，在线检测参数包括温度、搅拌速率、pH值、溶氧浓度、通气量，离线检测参数包括细胞密度X、葡萄糖浓度S_glc、谷氨酰胺浓度S_gln及乳酸浓度P；

3)将杂交瘤细胞复苏后在方瓶、摇瓶中一次传代扩大培养，待细胞密度达到0.8-1.2×10⁶cells/ml时，转入5L贝朗通气搅拌生物反应器中，加入基础灌流培养基EX-CELL620-HSF(SAFC，24621C)；待细胞密度达到1×10⁶cells/ml后，起始灌流培养；灌流回收通过10um内置旋转截流装置进行截流回收；检测细胞密度X、葡萄糖浓度S_glc、谷氨酰胺浓度S_gln及抗体浓度P各参数，维持葡萄糖浓度S_glc不低于0.5g/L、谷氨酰胺浓度S_gln不低于0.5mM；

计算并预估底物消耗，获得灌流培养基灌流速率，同时通过对灌流培养基内额外补加浓缩流加培养基进行分段控制，二次调整培养基灌流速率；

在细胞密度达到3×10⁶cells/ml后，计算细胞结团率，根据结团率调整搅拌速率，每次增大搅拌速率不超过20rpm/天，最高搅拌速率不超过150rpm，维持结团率不超过30％；pH通过培养基灌流调整维持不低于6.8；溶氧始终通过氧气-空气调节维持不低于40％；培养至细胞活性低于60％回收全部培养上清液，通过亲和层析进行抗体回收。

所述培养用杂交瘤细胞其批式培养条件下，主要参数比生长速率不高于1.5d^-1，葡萄糖比消耗速率不高于0.15g/cells·d·L，谷氨酰胺比消耗速率不高于0.1mM/cells·d·L，乳酸比生成速率不超过0.1mM/cells·d·L。

所述的2种浓缩流加培养基分别为：基础灌流培养基添加50g/L葡萄糖，基础灌流培养基添加50mM谷氨酰胺。

所述的基础灌流培养基为EX-CELL 620-HSF培养基(SAFC，24621C)。

本发明的杂交瘤细胞无血清高密度悬浮灌流培养工艺，通过优化CSPR培养模型，建立了一种杂交瘤细胞无血清高密度悬浮灌流培养生产重组抗体蛋白的生产工艺，通过多种参数控制提高批次产出，批次周期20-25天内，细胞密度可达到1-1.5×10⁷cells/ml，最高抗体浓度可达到200-280mg/L，批次产量超过6g。过程控制检测参数相对简便，便于操作，且三批次数据显示批次间差异小，可重复性及连续性强，可应用于抗体药物商业化生产。

附图说明

图1是灌流培养细胞增值活性与抗体量；

图2是灌流培养无血清悬浮培养工艺中葡萄糖浓度及谷氨酰胺浓度；

图3是灌流培养无血清悬浮培养灌流体积与葡萄糖消耗量及谷氨酰胺消耗量；

图4是灌流培养批次细胞抗体纯度(产品还原电泳)；图中的标记分别表示：1-6、3批次产品样品(10ug)，7、Marker(116kD)。

图5是批式培养中细胞密度与比生长速率；

图6是批式培养中比生长速率与葡萄糖比消耗速率；

图7是批式培养中比生长速率与谷氨酰胺比消耗速率；

图8是批式培养中比生长速率与乳酸比生成速率；

图9是本发明的工艺流程图。

以下结合附图和发明人给出的具体实施方式对本发明进一步详细说明。

具体实施方式

针对现有条件及以往细胞大规模培养经验，申请人对CSPR灌流培养模型进行了优化并且应用于杂交瘤细胞株(CYL-1结肠癌抗体表达细胞株)。其设计思路是在灌流控制基础上，通过调节灌流培养基中主要底物(葡萄糖及谷氨酰胺)浓度，一方面避免了流加工艺中批次补加底物造成的底物浓度过高，副产物快速累积，另一方面通过灌流速率及底物流加量的相关控制，避免了大量灌流基础培养基造成的细胞及产物的损失。

在具体计算过程中，主要考量的控制参数为灌流速率及灌流培养基底物浓度，而底物浓度则是由浓缩培养基添加量来控制的。根据反应动力学理论，可以将细胞培养过程分为3个阶段，即对数生长阶段、平台稳定阶段和混合阶段。不同的细胞株具有不同的生长特性，但是其群体生长过程均符合以上分类，差别在于时间的长短和类别数量大小。根据CSPR模型，需要在培养过程中分别确定底物比消耗速率及副产物的比生成速率。根据下面的公式，可以得到一个经验常数，并且放大到5L规模。

r_s＝q_s·X＝αμX+βX

r_p＝q_p·X＝α′μX+β′X

在拟稳态条件下，a、β为常数，r_s、r_p分别表示底物消耗速率及产物生成速率，X表示活细胞密度，μ表示细胞比生长速率。在前期小规模培养中，我们可以模拟该条件下的细胞状况进行实验分析，作图回归得出不同细胞密度下的a、β常数。然后就可以在培养过程中对底物比消耗速率及副产物比生成速率进行模拟放大计算。而后利用CSPR模型方程，计算在当前底物消耗量及产物生成量的情况下，调控底物及副产物浓度在适当的范围。

以下是申请人采用杂交瘤细胞CYL-1，该细胞是人结肠癌组织免疫BALB/c小鼠后经脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合后，筛选获得的杂交瘤细胞株。该细胞能够稳定表达抗人结肠癌相关抗原的单克隆抗体。

本实施例主要通过贝朗B5L生物搅拌通气式生物反应器，结合内部10μm筒形截留装置，灌流培养后回收培养上清液；后使用扩张柱床技术一步回收纯化大规模培养液中的单克隆抗体，经过硫酸铵沉淀及透析后进行分装冻干，获得纯度高于90％的抗体制品。

其工艺过程参见图9，主要分以下几步：

1、种子细胞株复苏，首先用75cm²培养方瓶进行复苏，复苏后细胞密度约3-5×105cells/ml，复苏活性需大于90％，传代培养2天后按照1∶2比例在方瓶中扩大培养；

2、待方瓶培养体积至200ml，接种1L悬浮搅拌培养瓶，起始培养体积400ml，密度约3-5×10⁵cells/ml，搅拌转速不超过100rpm，1∶2比例扩大培养；

3、待摇瓶体积至800ml，细胞密度达到0.8-1.2×10⁶cells/ml时，接种生物反应器，起始培养体积3L，在后期控制浓缩的营养物及灌流培养基，使细胞持续增长，达到高细胞密度和高产物量；

4、回收纯化培养液中的单克隆抗体并分装冻干。

一、生物反应器

(1)1L CellSpin细胞培养摇瓶机(IBS公司瑞士)，磁力变速变频搅拌，适用于各类工程细胞悬浮培养。

(2)5L生物反应器(B.Braun Biotech德国)，无气泡供气系统，10μm Spinfilter；细胞连续旋转过滤器，温度、pH、搅拌、溶氧PID全自动控制，四气混合控制供气系统，溶氧双参数关联、回收液流速。

二、培养用液的配制

1)基础灌流培养基：EX-CELL 620-HSF培养基(24621C，SAFC)。

2)浓缩培养基：EX-CELL 620-HSF培养基添加50g/L葡萄糖和EX-CELL 620-HSF培养基添加50mM谷氨酰胺。

三、细胞的复苏与传代：

(1)从生产细胞库取出CYL-1杂交瘤细胞，置37℃水浴中迅速溶化，移入37℃预热的基础灌流培养基中，800rpm离心5分钟，弃上清，重悬细胞于75cm²培养方瓶，细胞密度在2-3×10⁵cells/ml，5％二氧化碳下37℃培养箱培养，观察细胞生长状态；

(2)2天内观察细胞倍增时间及活性，按照1∶2比例扩大培养，每个方瓶培养体积不超过20ml；

(3)待方瓶培养体积至200ml，接种1L IBS培养摇瓶中；

(4)摇瓶起始培养体积400ml，密度约3×10⁵cells/ml，设置转角45°，搅拌转速65rpm，后期可适当增大转速至70rpm，5％二氧化碳下37℃培养箱培养条件下1∶2比例扩大培养；

三、生物反应器大规模培养：

(一)培养过程

(1)按规程完成生物反应器的安装、校准和灭菌消毒，连接搅拌电机、pH电极导线、溶氧电极导线、温度探头、收液瓶、取样管等，检查无误后，开机；

(2)按照标准操作规程补充灌流培养基约2L进入生物反应器内，开机运行48小时，观察温度、搅拌速度、pH、溶氧等各项参数稳定状况；

(3)接种细胞，待摇瓶体积至800ml，细胞密度达到1.1×10⁶cells/ml时，接种生物反应器，起始培养体积约3L，起始细胞密度在2.7×10⁵cells/ml；

(4)起始培养条件：温度37℃，pH7.2，溶氧控制60％，搅拌速度80rpm，空气、氧气、氮气和二氧化碳四气控制系统；

(5)每24小时取样测定细胞密度、葡萄糖浓度、谷酰胺浓度，定期测定抗体浓度变化；

(6)参数控制：

A)灌流参数控制：待细胞密度达到1×10⁶cells/ml后，起始灌流培养，灌流回收通过10um内置旋转截流装置进行截流回收；

根据公式分别计算灌流速率及浓缩培养基添加体积，具体计算及调控方式如下：检测细胞密度X、葡萄糖浓度S_glc、谷氨酰胺浓度S_gln及乳酸浓度P；

S＝S₀-q_s/CSPR

P＝P₀+q_p/CSPR

r_p＝q_s·X＝αμX+βX

r_p＝q_p·X＝α′μX+β′X

其中CSPR定义为CSPR＝D/X、D是稀释率，X是活细胞密度，r为细胞单位时间单位体积底物消耗量或产物产出量；μ为细胞比生长速率；S，P分别是葡萄糖、谷氨酰胺及乳酸浓度；S₀和P₀分别为当前浓度；q_s和q_p表示底物利用速率和产物合成速率；a、β是测定得到的培养常数，可以在小规模实验中回归计算得到；工艺过程中计算得出维持葡萄糖浓度S_glc不低于0.5g/L、谷氨酰胺浓度S_gln不低于0.5mM；

如附图5所示，在批式细胞培养过程中，收集9天内细胞密度的变化数据，根据细胞对数生长期比生长速率计算公式计算其比生长速率变化趋势，根据葡萄糖、谷氨酰胺及乳酸的浓度变化，根据分别计算葡萄糖比消耗速率、谷氨酰胺比消耗速率及乳酸比生成速率，然后取细胞对数生长期后的数据，如附图6-8以比生长速率为x轴，比消耗或比生成速率为y轴进行散点作图，后添加趋势线，回归得到a、β值。

在灌流培养放大阶段，可根据当前细胞相对比生长速率进行葡萄糖、谷氨酰胺及乳酸消耗生成量的估算。将乳酸估算值代入CSPR相关公式，可计算得到灌流速率预期值，然后根据谷氨酰胺及葡萄糖估算值可计算浓缩培养基添加体积。以添加浓缩培养基的灌流培养基进行灌流培养可在低限度补加底物的情况下，维持低乳酸浓度的培养环境。

由于灌流作用，细胞培养环境及其它底物如氨基酸等消耗得到改善，细胞葡萄糖及谷氨酰胺消耗速率也将受到影响，但仍在工艺控制范围内，仍可维持在设置参数的控制范围。但随细胞密度增大，消耗量逐渐增加，估算值也会倍增放大，当细胞密度高于2×10⁷cells/ml后，灌流体积及浓缩液添加量将大大超过当前细胞现实消耗比例，造成细胞稀释及过量添加，这样将造成培养成本大大增加。同时，灌流速率的增大也将造成截流装置阻塞，无法维持灌流培养。由此，在后期培养过程中，应在维持浓缩液适量补加的情况下，降低灌流速率直至培养批次完成。而这样也可最大程度上回收高浓度的抗体蛋白，达到增加收率的效果。

B)搅拌参数控制：在细胞密度达到3×10⁶cells/ml后，计算细胞结团率，即(消化前细胞密度-消化后细胞密度)/消化后细胞密度，根据结团率调整搅拌速率，结团率不超过30％，每次增大搅拌速率不超过20rpm/天，最高搅拌速率不超过150rpm，；

C)pH及溶氧调控：pH基本可通过培养基灌流调整维持不低于6.8；溶氧可通过氧气-空气调节维持不低于40％；

7)培养至细胞活性低于60％回收全部培养上清液，通过亲和层析进行抗体回收。

结果：

1、由图1可以看出，在培养共进行23天，在培养第15天细胞密度达到最大值1.4×10⁷cells/ml，抗体浓度达到230mg/L。

2、由图2可以看出，在培养第6天后通过灌流调节，主要底物葡萄糖及谷氨酰胺基本维持在设定区间的范围内，在维持较低浓度的情况下未超过设定低限。

3、由图3可以看出，培养过程中，底物消耗量在一定时间内程线性增长态势，细胞达到平台期后，添加浓缩培养基量降低，由于稀释作用，表现出消耗量逐步下降，符合方程模型描述。

4、由图4可以看出，在三批次培养过程中所表达的产品均一性、稳定性良好，由此可见本工艺批次间重复性、连续性良好，适用于蛋白抗体等大批量生产。

Claims (4)

1.一种杂交瘤细胞无血清高密度悬浮灌流培养工艺，其特征在于，通过特异性灌流速率CSPR计算控制灌流速率，同时计算关键产物比消耗速率，在不同时期添加2种浓缩培养基，改变灌流过程中的底物浓度，达到优化细胞生存条件，抑制副产物产出，提高产率；具体包括以下步骤：

1)用5L搅拌通气式生物反应器进行杂交瘤细胞培养，起始接种密度2×10⁵cells/ml；培养体积不大于4L；维持培养温度在37℃；pH维持7.2～6.8之间；搅拌速率在60-150之间；溶氧浓度在40％-80％之间；

2)过程参数检测通过在线和离线方式进行，在线检测参数包括温度、搅拌速率、pH值、溶氧浓度、通气量；离线检测参数包括细胞密度X、葡萄糖浓度S_glc、谷氨酰胺浓度S_gln及乳酸浓度p；

3)杂交瘤细胞复苏后，在方瓶、摇瓶一次传代扩大培养，待细胞密度达到0.8-1.2×10⁶cells/ml时，转入5L通气搅拌生物反应器中；待细胞密度达到1×10⁶cells/ml后，起始灌流培养；灌流回收通过10um内置旋转截流装置进行截流回收；检测细胞密度X、葡萄糖浓度S_glc、谷氨酰胺浓度S_gln及抗体浓度P各参数，维持葡萄糖浓度S_glc不低于0.5g/L、谷氨酰胺浓度S_gln不低于0.5mM；

计算并预估底物消耗，获得灌流培养基的灌流速率，同时通过对灌流培养基内额外补加浓缩流加培养基进行分段控制，二次调整培养基灌流速率；

在细胞密度达到3×10⁶cells/ml后，计算细胞结团率，根据结团率调整搅拌速率，每次增大搅拌速率不超过20rpm/天，最高搅拌速率不超过150rpm，维持结团率不超过30％；pH通过培养基灌流调整维持不低于6.8；溶氧始终通过氧气-空气调节维持不低于40％；培养至细胞活性低于60％回收全部培养上清液，通过亲和层析进行抗体回收。

2.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述培养用杂交瘤细胞其批式培养条件下，主要参数比生长速率不高于1.5d^-1，葡萄糖比消耗速率不高于0.15g/cells·d·L，谷氨酰胺比消耗速率不高于0.1mM/cells·d·L，乳酸比生成速率不超过0.1mM/cells·d·L。

3.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述的2种浓缩培养基分别为：基础灌流培养基添加50g/L葡萄糖，基础灌流培养基添加50mM谷氨酰胺。

4.如权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述的基础灌流培养基为EX-CELL 620-HSF培养基，培养过程中无血清添加。

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