CN113528710B - 一种用于抗体药物生产的温度调控方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于抗体药物生产的温度调控方法，包括：模型数据获取，以不同档次恒定温度分别培养抗体药物培养材料以获得培养数据；动力学建模，构建关于培养数据的Monod动力学模型，包括动力学基础方程、营养底物、细胞代谢产物、抗体产物的动力学方程；模型参数处理，计算Monod动力学模型得到动力学参数，获得抗体产物浓度与培养温度、培养时间的关系，预测得到获得最高目标抗体产物浓度所需的温度控制策略；培养温度调控，根据温度控制策略调控抗体药物的生产温度。本发明通过建立抗体药物生产工艺中参数的动力学模型，能够系统性的揭示和模拟温度对宿主细胞培养和抗体药物生产的影响，减少单次细胞培养时间和生产成本，提高抗体药物的产量和质量。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种基于动力学模型的温度调控方法，以系统性的揭示和模拟温度对宿主细胞培养和抗体药物生产的影响。
背景技术
近年来，随着生物医药产业的大力发展，抗体药物生产工艺的快速开发成为行业中亟需解决的难题。抗体药物是一类重要的治疗蛋白。在生产过程中通过控制宿主细胞的培养温度以调节其新陈代谢路径，从而获得高产量和质量的抗体药物。鉴于单次细胞培养需要使用昂贵的原材料，以及至少2-3周的时间，极少有研究报道相关的温度控制策略。现阶段行业内普遍使用“黑匣子”式的经验判断，来调控细胞培养过程中的温度。但众所周知，不同类型的宿主细胞，或者相同类型的不同亚克隆细胞的特性和习性大相径庭。现有的基于过往经验的决策，往往带来误判，给生产带来本不必要的损失。
发明内容
本发明提供一种用于抗体药物生产的温度调控方法，解决了现有技术依赖过往经验调控细胞培养温度的技术问题，通过建立抗体药物生产工艺中参数的动力学模型，以系统性的揭示和模拟温度对宿主细胞培养和抗体药物生产的影响，减少单次细胞培养时间和生产成本，提高抗体药物的产量和质量。
为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种用于抗体药物生产的温度调控方法，包括以下步骤：
模型数据获取，配置相同培养条件的多组抗体药物培养材料，以不同档次的恒定温度分别培养第一预设培养时间，获得对应不同档次的恒定温度的所述抗体药物培养材料的培养数据；其中，所述培养数据至少包括宿主细胞状态指标、营养底物浓度、细胞代谢产物浓度、目标抗体产物浓度；
动力学建模，构建所述培养数据的Monod动力学模型，所述Monod动力学模型至少包括基于所述宿主细胞状态指标、所述营养底物浓度、所述细胞代谢产物浓度构建的动力学基础方程，以及营养底物、细胞代谢产物、目标抗体产物的动力学方程；
模型参数处理，对所述Monod动力学模型进行计算，得到在不同档次的恒定温度、所述第一预设培养时间的情况下关于宿主细胞生长、目标抗体药物生产、营养底物、细胞代谢产物的动力学参数，并基于所述动力学参数获得目标抗体产物浓度与培养温度、培养时间的关系，预测得到第二预设培养时间内的每一培养时刻获得最高目标抗体产物浓度所需培养温度的温度控制策略；其中，所述第二预设培养时间大于所述第一预设培养时间；
培养温度调控，根据所述温度控制策略对抗体药物的生产进行温度调控。
在本发明的其中一种实施例中，对应所述宿主细胞状态指标的细胞状态包括宿主细胞的生长和死亡；对应所述营养底物浓度的营养底物至少包括葡萄糖、谷氨酰胺和谷氨酸；对应所述细胞代谢产物浓度的细胞代谢产物至少包括乳酸、氨。
在本发明的其中一种实施例中，所述基于所述宿主细胞状态指标、所述营养底物浓度、所述细胞代谢产物浓度构建的动力学基础方程，具体为：
rX＝(μG-μd)X
其中，rX为反应速率，μG是细胞特定增长率，μd是细胞比死亡率，X是活细胞密度；μmax是最大比细胞生长速率，kd是最大比细胞死亡率；KIS、KIP、KDS和KDP是不同物质的饱和常数，S是限制性底物的浓度，P是代谢物的浓度。
在本发明的其中一种实施例中，所述营养底物浓度的动力学方程，包括：
葡萄糖的动力学方程：
谷氨酰胺的动力学方程：
谷氨酸的动力学方程：
其中，X是活细胞密度，μG是细胞特定增长率；
rGlc为葡萄糖的反应速率，aGlc是维持细胞活力的葡萄糖消耗，是与宿主细胞生长相关的葡萄糖消耗；
rGln为谷氨酰胺的反应速率，dGln是维持细胞活力的谷氨酰胺消耗，是与宿主细胞生长相关的谷氨酰胺消耗；
rGlu为谷氨酸的反应速率，dGlu是维持细胞活力的谷氨酸消耗，是与宿主细胞生长相关的谷氨酸消耗。
在本发明的其中一种实施例中，所述细胞代谢产物浓度的动力学方程，包括：
乳酸的动力学方程：
氨的动力学方程：
其中，X是活细胞密度，μG是细胞特定增长率；
rLac为乳酸的反应速率，aLac是维持细胞活力的乳酸消耗，bLac是维持细胞生长的乳酸消耗，kLac是乳酸的速率常数，KLac是乳酸的饱和度数，Lac是乳酸浓度；
rAmm为氨的反应速率，aAmm是维持细胞活力的氨消耗，bAmm是维持细胞生长的氨消耗，kAmm是氨的速率常数，KAmm是氨的饱和度数，Amm是氨浓度。
在本发明的其中一种实施例中，所述目标抗体产物浓度的动力学方程，包括：
rTP＝QTPX
其中，rTP为目标抗体产物的反应速率，QTP为目标抗体产物的特定生产速率，X是活细胞密度，KP为最大的比蛋白产生率，KS和Kp是不同物质的饱和常数，S是限制性底物的浓度，P是代谢物的浓度。
在本发明的其中一种实施例中，所述方法还包括：
模型数据验证，配置相同培养条件的另一多组所述抗体药物培养材料，以预设的初始温度下培养，并从所述初始温度开始降档至不同的温度培养至第二预设培养时间，获得所述抗体药物培养材料在不同档次的温度下的培养数据。
在本发明的其中一种实施例中，所述方法还包括：
将所述抗体药物培养材料在不同档次的温度下的培养数据与预测得到的所述温度控制策略中的培养数据进行比对，获得实验误差；
判断所述实验误差是否属于预设的误差范围之内，得到预测的所述温度控制策略的精确度。
相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
1、克服以过往经验进行“黑匣子”式的细胞培养温度调控弊端，采用动力学模型的方法，系统性的揭示和模拟温度对宿主细胞培养和抗体药物生产的影响，能够科学高效地实现抗体药物生产的温度调控；
2、基于动力学模型，能够以有限少量的实验数据预测得到不同温度控制策略下的抗体药物生产结果，将传统所需的2-3周单次实验时间减少一半以上，极大地节约人力物力资源；
3、通过从较短时间的细胞培养数据提取得到动力学模型参数，能够较为准确地预测不同温度调控策略下的较长时间的细胞培养结果，将原本需要的实验探索转变为科学性、系统性的计算预测，更加深入抗体药物生产中工艺参数的系统理解，满足以通过设计的概念来控制产品；
4、通过开发动力学建模方法实现对抗体药物生产过程中精细化温度调控和预测，能够定量分析不同种类宿主细胞培养的动力学性质，以及不同温度控制策略对细胞培养和抗体药物产出的影响，极大地优化了生物制药工艺中的控温条件，非常有利于提高抗体药物的产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中的用于抗体药物生产的温度调控方法的流程步骤图；
图2是本发明实施例中关于宿主细胞密度的计算预测数据与实验数据的拟合程度的曲线图，其中，图2a～2c展示的是图2中33D6与33D8曲线、34D6与34D8曲线、34D6 33D8与34D8 33D10曲线的明细示意图；
图3本发明实施例中关于抗体药物滴度的计算预测数据与实验数据的拟合程度的曲线图，其中，其中，图3a～3c展示的是图3中33D6与33D8曲线、34D6与34D8曲线、34D6 33D8与34D8 33D10曲线的明细示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了突破现有技术的细胞培养温度控制依据人为经验进行“黑匣子”式的不科学尝试，本发明提出了一种在蛋白药物生产工艺中，基于动力学模型的温度控制方法，能够评估在细胞培养过程中温度对抗体药物产量的影响，并将之应用到不同温度控制策略的评估和结果预测中去。通过结合动力学模型，能够预测不同温度控制策略下的抗体药物产量变化，这一能力可在大规模减少工艺开发中的人力物力成本，缩短药物开发时间，在生物制药工艺开发过程中进行广泛的应用。下面通过实施例详细介绍本发明。
请参见图1，图1示出了本发明的其中一种实施例的方法步骤示意图，在本实施例中，用于抗体药物生产的温度调控方法，包括以下步骤：
步骤S1：模型数据获取，配置相同培养条件的多组抗体药物培养材料，以不同档次的恒定温度分别培养第一预设培养时间，获得对应不同档次的恒定温度的所述抗体药物培养材料的培养数据；其中，所述培养数据至少包括宿主细胞状态指标、营养底物浓度、细胞代谢产物浓度、目标抗体产物浓度；
步骤S2：动力学建模，构建关于所述培养数据的Monod动力学模型，所述Monod动力学模型至少包括基于所述宿主细胞状态指标、所述营养底物浓度、所述细胞代谢产物浓度构建的动力学基础方程，以及营养底物、细胞代谢产物、目标抗体产物的动力学方程；
步骤S3：模型参数处理，对所述Monod动力学模型进行计算，得到在不同档次的恒定温度、所述第一预设培养时间的情况下关于宿主细胞生长、目标抗体药物生产、营养底物、细胞代谢产物的动力学参数，并基于所述动力学参数获得目标抗体产物浓度与培养温度、培养时间的关系，预测得到第二预设培养时间内的每一培养时刻获得最高目标抗体产物浓度所需培养温度的温度控制策略；其中，所述第二预设培养时间大于所述第一预设培养时间；
步骤S4：培养温度调控，根据所述温度控制策略对抗体药物的生产进行温度调控。其中，在本实施例中，可以根据宿主细胞的培养特性设定第一预设培养时间，以中国仓鼠卵巢细胞的培养为例，第一预设培养时间设定为8～10天，第二预设培养时间设定为14天，通过对进行短时间的细胞培养所提取出的动力学模型参数可用于较为准确地预测不同温度控制策略下的14天细胞培养结果，能够有效节省单次实验时间，降低人力物力资源。
在本发明的其中一种实施例中，所述方法还包括：
步骤S5：模型数据验证，配置相同培养条件的另一多组所述抗体药物培养材料，以预设的初始温度下培养，并从所述初始温度开始降档至不同的温度培养至第二预设培养时间，获得所述抗体药物培养材料在不同档次的温度下的培养数据。
将所述抗体药物培养材料在不同档次的温度下的培养数据与预测得到的所述温度控制策略中的培养数据进行比对，获得实验误差；
判断所述实验误差是否属于预设的误差范围之内，得到预测的所述温度控制策略的精确度。
为了便于更好的理解本发明的实现原理，下面以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的培养作为实施例进行详细介绍。
一、准备实验所需材料：
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，基础培养基，补料培养基，葡糖糖。
二、进行实验操作
1、获取模型数据：
首先，将CHO细胞置于250ml摇瓶中培养，摇瓶中装有基础培养基，初始体积为80mL，用于生产抗体药物。其中，该摇瓶接种的细胞密度(VCD)为10×106细胞/mL，分别在32、33、34、35和36.5℃的恒温下培养8天。
然后，将所有摇瓶在摇床上以150rpm的搅拌速率和6％的CO2浓度中孵育，当细胞达到预定的细胞密度(VCD)时，开始每天添加专有的补料培养基，同时提供额外的葡萄糖以维持浓度范围。
最后，进行产量检测和质量研究，使用自动细胞计数器(Beckman Coulter)离线对VCD和细胞活力进行定量。葡萄糖，谷氨酰胺，谷氨酸，乳酸盐和胺用生化分析仪(Roche)进行定量。
2、进行动力学建模：
考虑到宿主细胞内新陈代谢涉及数千种化学物质和酶促反应，其中许多机理是尚未被完全揭示的。因此，在实际应用中，我们建立了一种非结构化的动力学方法，以提取重点相关要素，具体如下：
在此研究中，细胞的生长(G)和死亡(d)是直接表征宿主细胞状态的指标；
营养物质(P)，特别是葡萄糖(Glc)，谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸(Glu)被认为是重要的，它们表征了细胞的成长和物质积累；
细胞代谢产物(P)，特别是乳酸(Lac)和氨(Amm)也被认为是重要因素，他们表征了的细胞的代谢；
抗体药物(TP)是目标产物。
基于Monod模型，所述基于所述宿主细胞状态指标、所述营养底物浓度、所述细胞代谢产物浓度构建的动力学基础方程：
rX＝(μG-μd)X (1-a)
其中，rX为反应速率，μG是细胞特定增长率，μd是细胞比死亡率，X是活细胞密度；μmax是最大比细胞生长速率，kd是最大比细胞死亡率；KIS、KIP、KDS和KDP是不同物质的饱和常数，S是限制性底物的浓度，P是代谢物的浓度。
葡萄糖的动力学方程：
其中，X是活细胞密度，μG是细胞特定增长率；rGlc为葡萄糖的反应速率，aGlc是维持细胞活力的葡萄糖消耗，是与宿主细胞生长相关的葡萄糖消耗；
其积分式可表达为：
其中，V为体积，C为相应物质的浓度，t1和t2是起始和结束时间。
谷氨酰胺和谷氨酸一方面作为氮源和能量物质，另一方面也是其它酶催化反应的产物和底物，进入中枢代谢，其动力学过程可表示为：
特别的，在生物制药生产过程中，一般都会提供充足的营养物质来生产谷氨酰胺和谷氨酸，因此可以设定：
其中，bAmino是常数。因此，可将(3-a)和(4-a)简化为：
谷氨酰胺的动力学方程：
谷氨酸的动力学方程：
其中，X是活细胞密度，μG是细胞特定增长率；
rGln为谷氨酰胺的反应速率，dGln是维持细胞活力的谷氨酰胺消耗，是与宿主细胞生长相关的谷氨酰胺消耗；
rGlu为谷氨酸的反应速率，dGlu是维持细胞活力的谷氨酸消耗，是与宿主细胞生长相关的谷氨酸消耗。
类似于葡萄糖，谷氨酰胺和谷氨酸的积分式可表达为：
作为已知的可追踪代谢产物，乳酸和胺从中央代谢中产生，以支持细胞生长并维持细胞活力，同时在细胞培养过程中被消耗。因此，该过程可以表示为：
乳酸的动力学方程：
氨的动力学方程：
其中，X是活细胞密度，μG是细胞特定增长率；
rLac为乳酸的反应速率，aLac是维持细胞活力的乳酸消耗，bLac是维持细胞生长的乳酸消耗，kLac是乳酸的速率常数，KLac是乳酸的饱和度数，Lac是乳酸浓度；
rAmm为氨的反应速率，aAmm是维持细胞活力的氨消耗，bAmm是维持细胞生长的氨消耗，kAmm是氨的速率常数，KAmm是氨的饱和度数，Amm是氨浓度。
为了表征目标抗体药物的生产过程，应考虑各种营养底物和代谢产物。基于Michaelis-Menten结构进行组合，所述目标抗体产物浓度的动力学方程，包括：
rTP＝QTPX (8-a)
其中，rTP为目标抗体产物的反应速率，QTP为目标抗体产物的特定生产速率，X是活细胞密度，KP为最大的比蛋白产生率，KS和Kp是不同物质的饱和常数，S是限制性底物的浓度，P是代谢物的浓度。
三、进行模型分析
基于实验操作中的“模型数据获取”实验获取数据，并根据上述方程式，进行动力学参数的计算。作为可行的实施方式，可使用Excel Visual Basic for Applications编码中的Odexlims程序，或者使用MATLAB求解方程。
通过多次重复实验计算，得到的相同参数显示参数误差在5％以下，表明模型的较为精确。计算获得的动力学参数被应用在“模型数据验证”实验中，以验证模型的可靠性。其中，本发明中所使用的实验数据均进行了归一化处理。
下面进行动力学模型的应用实例：
基于上述动力学模型和“模型数据获取”实验，可以计算得到表1中的动力学参数。
表1细胞生长，抗体药物生产及其它相关物质的动力学参数
使用表1中的动力学参数，用以拟合“模型数据验证”中获取的结果(如图2和图3示出)，可以发现，宿主细胞密度VCD和抗体药物滴度的计算数据(曲线)与实验数据(点)非常吻合。这表明从8天短时间段提取的动力学模型参数可用于较准确预测不同温度调控策略下的14天细胞培养结果。
基于此，表2进一步计算出单次生产过程中多次调节温度条件下的抗体药物滴度。其中，初始温度均设定为36.5℃。
表2通过动力学参数预测的不同温度调控策略下的抗体药物归一化滴度
在本实施例中，选取的部分预测控温条件进行了实验验证，从实验验证结果来看，预测的数据与实验数据的误差≤3％。
计算数据表明在第8或者10天，将培养温度从36.5℃降至33或者34℃，对产量提高最为有益。因此，可以认为此模型方法适用于较精确的计算预测最优的温度控制策略，而不必对每一个条件进行实验探索。
综上，得到结论如下：
随着人们对抗体药物的需求的日益上升，对生物制药工艺进行精细的控温条件优化，以提高产量变得尤为重要。在这项工作中，通过开发一种用于抗体药物生产的温度调控方法来对药物生产过程中进行精细化温度调控和预测。应用动力学模型定量分析了某种CHO细胞培养的动力学性质以及不同温度调控策略对其影响，并基于此提出了一种较优的控温策略。同时该动力学模型还可用于工艺开发过程中的结果预测，极大的减少开发所需的人力物力资源和时间。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于抗体药物生产的温度调控方法，其特征在于，包括以下步骤：
模型数据获取，配置相同培养条件的多组抗体药物培养材料，以不同档次的恒定温度分别培养第一预设培养时间，获得对应不同档次的恒定温度的所述抗体药物培养材料的培养数据；其中，所述培养数据至少包括宿主细胞状态指标、营养底物浓度、细胞代谢产物浓度、目标抗体产物浓度；
动力学建模，构建所述培养数据的Monod动力学模型，所述Monod动力学模型至少包括基于所述宿主细胞状态指标、所述营养底物浓度、所述细胞代谢产物浓度构建的动力学基础方程，以及营养底物浓度、细胞代谢产物、目标抗体产物的动力学方程；
模型参数处理，对所述Monod动力学模型进行计算，得到在不同档次的恒定温度、所述第一预设培养时间的情况下关于宿主细胞生长、目标抗体药物生产、营养底物、细胞代谢产物的动力学参数，并基于所述动力学参数获得目标抗体产物浓度与培养温度、培养时间的关系，预测得到第二预设培养时间内的每一培养时刻获得最高目标抗体产物浓度所需培养温度的温度控制策略；其中，所述第二预设培养时间大于所述第一预设培养时间；
培养温度调控，根据所述温度控制策略对抗体药物的生产进行温度调控；
其中，所述目标抗体产物浓度的动力学方程，包括：
rTP＝QTPX
其中，rTP为目标抗体产物的反应速率，QTP为目标抗体产物的特定生产速率，X是活细胞密度，KP为最大的比蛋白产生率，KS和Kp是不同物质的饱和常数，S是限制性底物的浓度，P是代谢物的浓度；
对应所述宿主细胞状态指标的细胞状态包括宿主细胞的生长和死亡；对应所述营养底物浓度的营养底物至少包括葡萄糖、谷氨酰胺和谷氨酸；对应所述细胞代谢产物浓度的细胞代谢产物至少包括乳酸、氨。
2.如权利要求1所述的用于抗体药物生产的温度调控方法，其特征在于，所述基于所述宿主细胞状态指标、所述营养底物浓度、所述细胞代谢产物浓度构建的动力学基础方程，具体为：
rX＝(μG-μd)X
其中，rX为反应速率，μG是细胞特定增长率，μd是细胞比死亡率，X是活细胞密度；μmax是最大比细胞生长速率，kd是最大比细胞死亡率；KIS、KIP、KDS和KDP是不同物质的饱和常数，S是限制性底物的浓度，P是代谢物的浓度。
3.如权利要求1所述的用于抗体药物生产的温度调控方法，其特征在于，所述营养底物浓度的动力学方程，包括：
葡萄糖的动力学方程：
谷氨酰胺的动力学方程：
谷氨酸的动力学方程：
其中，X是活细胞密度，μG是细胞特定增长率；
rGlc为葡萄糖的反应速率，aGlc是维持细胞活力的葡萄糖消耗，是与宿主细胞生长相关的葡萄糖消耗；
rGln为谷氨酰胺的反应速率，dGln是维持细胞活力的谷氨酰胺消耗，是与宿主细胞生长相关的谷氨酰胺消耗；
rGlu为谷氨酸的反应速率，dGlu是维持细胞活力的谷氨酸消耗，是与宿主细胞生长相关的谷氨酸消耗。
4.如权利要求1所述的用于抗体药物生产的温度调控方法，其特征在于，所述细胞代谢产物浓度的动力学方程，包括：
乳酸的动力学方程：
氨的动力学方程：
其中，X是活细胞密度，μG是细胞特定增长率；
rLac为乳酸的反应速率，aLac是维持细胞活力的乳酸消耗，bLac是维持细胞生长的乳酸消耗，kLac是乳酸的速率常数，KLac是乳酸的饱和度数，Lac是乳酸浓度；
rAmm为氨的反应速率，aAmm是维持细胞活力的氨消耗，bAmm是维持细胞生长的氨消耗，kAmm是氨的速率常数，KAmm是氨的饱和度数，Amm是氨浓度。
5.如权利要求1所述的用于抗体药物生产的温度调控方法，其特征在于，所述方法还包括：
模型数据验证，配置相同培养条件的另一多组所述抗体药物培养材料，以预设的初始温度下培养，并从所述初始温度开始降档至不同的温度培养至第二预设培养时间，获得所述抗体药物培养材料在不同档次的温度下的培养数据。
6.如权利要求5所述的用于抗体药物生产的温度调控方法，其特征在于，所述方法还包括：
将所述抗体药物培养材料在不同档次的温度下的培养数据与预测得到的所述温度控制策略中的培养数据进行比对，获得实验误差；
判断所述实验误差是否属于预设的误差范围之内，得到预测的所述温度控制策略的精确度。
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