CN109265539A - 利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法及其生产的单克隆抗体 - Google Patents

利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法及其生产的单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，该方法包括：将复苏后的杂交瘤细胞置于第一细胞培养基中进行传代培养和扩大培养，该第一细胞培养基中血清的体积分数大于10％；将杂交瘤细胞转移至第二细胞培养基中进行扩大培养，该第二细胞培养基中血清的体积分数小于等于10％；将杂交瘤细胞转移至无血清细胞培养基中培养，进行单克隆抗体的生产。本申请通过采用第一细胞培养基进行“富养”、采用第二细胞培养基进行“均一群养”，确保不同批次的杂交瘤细胞在抗体生产起始时的浓度和体积保持一致，使得整个生产流程可以广适于不同的杂交瘤细胞株，抗体生长周期稳定；在无血清细胞培养基中生产单克隆抗体，抗体产品质量高。

Description

利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法及其生产的单克隆 抗体
技术领域
本发明属于杂交瘤细胞培养和单克隆抗体生产技术领域，具体涉及一种利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法及其生产的单克隆抗体。
背景技术
杂交瘤细胞(hybridoma)是用骨髓瘤细胞和单克隆的B细胞融合成的细胞，其融合细胞既具有骨髓瘤细胞无限复制的能力，也具有成熟的单克隆B浆细胞不断分泌单克隆抗体的功能。抗体工业生产上利用这种融合细胞进行单克隆抗体的规模化生产，这种融合细胞被称为杂交瘤细胞。
传统的采用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的生产方案一般是将杂交瘤细胞置于含10％胎牛血清的RPMI培养基中培养，这种方法生产的单克隆抗体的纯度只有80-90％。为了提高抗体纯度，现有技术中对用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的生产方案进行了改进，改进方案主要有两种：
(1)低含量血清培养基培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体的生产方案：首先将杂交瘤细胞从液氮保存罐中取出并进行细胞复苏，复苏后将杂交瘤细胞置于含10％胎牛血清的RPMI培养基中传代(传代5天)，传代后将杂交瘤细胞培养在胎牛血清的浓度为2％的低血清RPMI培养液中进行扩大杂交瘤细胞扩大培养和抗体生产，抗体生产时间约为20天。
这种生产方案的不足之处在于，(a)杂交瘤细胞在2％的胎牛血清RPMI培养液中完成单克隆抗体的生产，但胎牛血清中仍旧存在较多蛋白，直接导致杂交瘤细胞分泌的抗体纯度不高，造成后续产品纯度(约90％)和质量较差；(b)整个生产周期需要25天，周期较长；(c)由于培养基营养成分较低，较多种类杂交瘤细胞在2％的低血清RPMI培养液中无法完成扩大培养。
(2)胎牛血清含量梯度下降的杂交瘤细胞培养方案：首先将杂交瘤细胞从液氮保存罐中取出并进行细胞复苏，复苏后将杂交瘤细胞置于含10％胎牛血清的RPMI培养基中传代(传代5天)，传代后将杂交瘤细胞先后在含10％,8％,6％,4％,2％胎牛血清的RPMI培养基中传代培养后(一共培养15天)，最后将杂交瘤细胞转移到无血清的杂交瘤细胞培养基(如，赛默飞Gibco CD hybridoma medium)进行扩大培养和抗体生产，抗体生产时间为15天。
该生产方案的不足之处在于：(a)杂交瘤细胞在转移到无血清培养基之前有为期15天的胎牛血清RPMI培养液血清浓度渐降培养过程，导致生产周期延长了15天，整个抗体生产周期至少需要35天；(b)在血清渐降培养过程中，杂交瘤细胞难以保持最佳的生长状态，抗体生产质量堪忧，且人为操作会导致细胞培养状态批次间不稳定，最终将导致抗体产品批次间质量不稳定；(c)不同杂交瘤细胞对血清渐降过程的适应程度不同，导致不同种类的杂交瘤细胞的生产周期差异性大，针对不同的杂交瘤细胞的生产流程无法达到一致化；(d)杂交瘤细胞在2％的胎牛血清RPMI培养液中完成单克隆抗体的生产，但胎牛血清中仍旧存在较多蛋白，直接导致杂交瘤细胞分泌的抗体纯度不高，造成后续产品纯度(约90％)和质量仍较差。
针对上述问题，目前的主流解决思路是开发新的无血清培养基，以在保证杂交瘤细胞具有良好生长状态的同时尽可能提高单克隆抗体的纯度。但无血清培养基的开发目前还未获得突破性进展，生产的单克隆抗体的质量和产量依旧不高。
发明内容
本申请的发明目的是提供一种生产周期短、生产的单克隆抗体纯度高的利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法。
为实现上述发明目的，本申请的技术方案如下：
一种利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
(1)将复苏后的杂交瘤细胞置于第一细胞培养基中进行传代培养和扩大培养，该第一细胞培养基中血清的体积分数大于10％；
(2)将杂交瘤细胞转移至第二细胞培养基中进行扩大培养，该第二细胞培养基中血清的体积分数小于等于10％；
(3)将杂交瘤细胞转移至无血清细胞培养基中培养，进行单克隆抗体的生产。
本申请独辟蹊径地提出了利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的新思路：先将杂交瘤细胞置于含高体积分数(大于10％)的血清的第一细胞培养基中进行传代培养，使杂交瘤细胞迅速传代，并达到最佳的生长状态；然后再将杂交瘤细胞转移至含低体积分数(小于等于10％)的血清的第二细胞培养基进行扩大培养，使杂交瘤细胞扩增至目标生产体积；最后再将杂交瘤细胞转移至无血清细胞培养基中，进行单克隆抗体的生产。
本申请通过采用第一细胞培养基进行“富养”、采用第二细胞培养基进行“均一群养”，能够确保不同批次的杂交瘤细胞在单克隆抗体生产起始时的浓度和体积保持一致，使得整个生产流程可以广适于不同的杂交瘤细胞株，且不同生产批次的杂交瘤细胞一致性较佳。
本申请的方法在无血清细胞培养基中生产单克隆抗体，从而细胞培养液中不存在任何杂质蛋白影响抗体浓度和纯度，不仅单克隆抗体产品质量高，而且不同批次之间的单克隆抗体产品一致性高。
本申请的抗体生长周期稳定，整个抗体生长周期仅需21天，比传统生产方法大大缩短。
作为优选，步骤(1)中，采用第一细胞培养基对杂交瘤细胞进行复苏。第一细胞培养基中含有较高体积分数的血清，营养丰富，因此采用第一细胞培养基能够快速复苏杂交瘤细胞，使其更易、更快地恢复细胞活性。
作为优选，步骤(1)中，所述的第一细胞培养基中血清的体积分数为15-30％。若第一细胞培养基中血清的体积分数过低(以10％为基数进行比较)，则杂交瘤细胞的传代培养时间相对较长，且达到最佳生长状态的杂交瘤细胞比例会有所降低；若第一细胞培养基中血清的体积分数过高，则杂交瘤细胞对血清的利用率降低，造成血清浪费。
作为进一步优选，步骤(1)中，所述的第一细胞培养基中血清的体积分数为20％。本申请的第一细胞培养基采用现有技术中惯常使用的杂交瘤细胞培养基即可(如RPMI培养基)，血清通常是胎牛血清，也可以是小牛血清。
作为优选，步骤(2)中，待第一细胞培养基中杂交瘤细胞的密度达到1×106个/mL时，将杂交瘤细胞转移至第二细胞培养基中培养。
作为优选，步骤(2)中，所述的第二细胞培养基中血清的体积分数为8-10％。
作为进一步优选，步骤(2)中，所述的第二细胞培养基中血清的体积分数为10％。第二细胞培养基的血清体积分数以常规细胞培养基中的血清体积分数相当为宜，若超过10％，则恐后续将杂交瘤细胞转移至无血清细胞培养基中后会发生不适；若过多地低于10％，则不易在较短时间内使杂交瘤细胞扩增至目标生产体积，不仅会延长生产周期，而且部分杂交瘤细胞很有可能提前进入衰亡期，影响抗体浓度。
本申请的第二细胞培养基采用现有技术中惯常使用的杂交瘤细胞培养基即可(如RPMI培养基)，血清通常是胎牛血清，也可以是小牛血清。
作为优选，步骤(3)中，待第二细胞培养基中杂交瘤细胞的密度达到1×106个/mL时，将杂交瘤细胞转移至无血清细胞培养基中培养。
本申请中，所述的无血清细胞培养基采用现有技术中惯常使用的无血清细胞培养基即可，如赛默飞公司的CD hybridoma培养基。
作为优选，步骤(3)中，无血清细胞培养基的体积与第二细胞培养基的体积相同。如此才能确保在单克隆抗体生产之初，杂交瘤细胞达到了目标生产体积和密度，确保生产批次间的一致性。
本申请还提供了利用所述的利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法生产的单克隆抗体，采用本申请的方法生产的单克隆抗体，其纯度可达到95％以上。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本申请独辟蹊径地提出了利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的新思路：先将杂交瘤细胞置于含高体积分数(大于10％)的血清的第一细胞培养基中进行传代培养，使杂交瘤细胞迅速传代，并达到最佳的生长状态；然后再将杂交瘤细胞转移至含低体积分数(小于等于10％)的血清的第二细胞培养基进行扩大培养，使杂交瘤细胞扩增至目标生产体积；最后再将杂交瘤细胞转移至无血清细胞培养基中，进行单克隆抗体的生产。
(2)本申请通过采用第一细胞培养基进行“富养”、采用第二细胞培养基进行“均一群养”，能够确保不同批次的杂交瘤细胞在单克隆抗体生产起始时的浓度和体积保持一致，使得整个生产流程可以广适于不同的杂交瘤细胞株，且不同生产批次的杂交瘤细胞一致性较佳。
(3)本申请的方法在无血清细胞培养基中生产单克隆抗体，从而细胞培养液中不存在任何杂质蛋白影响抗体浓度和纯度，不仅单克隆抗体产品质量高，而且不同批次之间的单克隆抗体产品一致性高。
(4)本申请的抗体生长周期稳定，整个抗体生长周期仅需21天，比传统生产方法大大缩短。
具体实施方式
下面列举具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1
本实施例以杂交瘤细胞GK1.5细胞株为例，介绍一种利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体CD4抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将杂交瘤细胞置于含20％(体积分数)胎牛血清的RPMI完全培养基中复苏后，进行传代培养和扩大培养；
具体地，先将杂交瘤细胞置于含20％(体积分数)胎牛血清的RPMI完全培养基中，将培养皿置于5％CO2、37℃培养箱内培养，待杂交瘤细胞复苏后完成一次传代，培养过程(3天)中每天进行细胞计数；
然后，将细胞密度生长至1×106个/mL左右或颜色变为橙黄色时的培养液转移至15ml离心管内，4℃下1500rpm离心5min，去掉离心管内上清液；用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在含20％胎牛血清的RPMI完全培养基内，并将细胞重悬液转移至T-25细胞培养瓶中，用含20％胎牛血清的RPMI完全培养基定容至120mL；将T-25细胞培养瓶放置于5％CO2、37℃培养箱内培养，培养过程(3天)中可间隔时间对细胞进行计数；
(2)将杂交瘤细胞转移至置于含10％(体积分数)胎牛血清的RPMI完全培养基中，进行扩大培养；
具体地，待细胞密度生长至1×106个/mL左右或培养液颜色变为橙黄色时，将T-25细胞培养瓶中的120mL培养液转移至50ml离心管内，4℃1500rpm离心5min，然后去掉离心管内上清液；用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在含10％胎牛血清的RPMI完全培养基中；并将细胞重悬液转移至T-75细胞培养瓶中，用含10％胎牛血清的RPMI完全培养基定容至540mL；将T-75细胞培养瓶置于5％CO2、37℃培养箱内培养，培养过程(5天)中可间隔时间对细胞进行计数；
(3)将杂交瘤细胞转移至无血清细胞培养基中培养，进行单克隆抗体的生产；
具体地，待细胞密度生长至1×106个/mL左右或培养液颜色变为橙黄色时，将T-75细胞培养瓶中的培养液分次转移至50ml离心管内，4℃1500rpm离心5min，去掉细胞上层清液，用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在装有540ml无血清CD-hybridoma培养基的T-75细胞培养瓶内，将T-75细胞培养瓶放置于5％CO2、37℃培养箱内培养，进行单克隆抗体的生产；抗体生产周期为10天，在第11天收集培养液用于下一步抗体纯化(采用通用公司的AKTA设备和Mabselect Protein A的柱子进行亲和层析，以纯化抗体，下同)。
实施例2
本实施例以杂交瘤细胞RM45为例，介绍一种利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体CD4的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将杂交瘤细胞置于含15％(体积分数)胎牛血清的RPMI完全培养基中复苏后，进行传代培养和扩大培养；
具体地，先将杂交瘤细胞置于含15％(体积分数)胎牛血清的RPMI完全培养基中，将培养皿置于5％CO2、37℃培养箱内培养，待杂交瘤细胞复苏后完成一次传代，培养过程(3天)中每天进行细胞计数；
然后，将细胞密度生长至1×106个/mL左右或颜色变为橙黄色时的培养液转移至15ml离心管内，4℃下1500rpm离心5min，去掉离心管内上清液；用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在含15％胎牛血清的RPMI完全培养基内，并将细胞重悬液转移至T-25细胞培养瓶中，用含15％胎牛血清的RPMI完全培养基定容至120mL；将T-25细胞培养瓶放置于5％CO2、37℃培养箱内培养，培养过程(3天)中可间隔时间对细胞进行计数；
(2)将杂交瘤细胞转移至置于含8％(体积分数)胎牛血清的RPMI完全培养基中，进行扩大培养；
具体地，待细胞密度生长至1×106个/mL左右或培养液颜色变为橙黄色时，将T-25细胞培养瓶中的120mL培养液转移至50ml离心管内，4℃1500rpm离心5min，然后去掉离心管内上清液；用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在含8％胎牛血清的RPMI完全培养基中；并将细胞重悬液转移至T-75细胞培养瓶中，用含8％胎牛血清的RPMI完全培养基定容至540mL；将T-75细胞培养瓶置于5％CO2、37℃培养箱内培养，培养过程(6天)中可间隔时间对细胞进行计数；
(3)将杂交瘤细胞转移至无血清细胞培养基中培养，进行单克隆抗体的生产；
具体地，待细胞密度生长至1×106个/mL左右或培养液颜色变为橙黄色时，将T-75细胞培养瓶中的培养液分次转移至50ml离心管内，4℃1500rpm离心5min，去掉细胞上层清液，用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在装有540ml无血清CD-hybridoma培养基的T-75细胞培养瓶内，将T-75细胞培养瓶放置于5％CO2、37℃培养箱内培养，进行单克隆抗体的生产；抗体生产周期为10天，在第11天收集培养液用于下一步抗体纯化。
实施例3
本实施例以杂交瘤细胞129G1为例，介绍一种利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体抗乙肝病毒IgG的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将杂交瘤细胞置于含30％(体积分数)胎牛血清的RPMI完全培养基中复苏后，进行传代培养和扩大培养；
具体地，先将杂交瘤细胞置于含30％(体积分数)胎牛血清的RPMI完全培养基中，将培养皿置于5％CO2、37℃培养箱内培养，待杂交瘤细胞复苏后完成一次传代，培养过程(2天)中每天进行细胞计数；
然后，将细胞密度生长至1×106个/mL左右或颜色变为橙黄色时的培养液转移至15ml离心管内，4℃下1500rpm离心5min，去掉离心管内上清液；用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在含30％胎牛血清的RPMI完全培养基内，并将细胞重悬液转移至T-25细胞培养瓶中，用含30％胎牛血清的RPMI完全培养基定容至120mL；将T-25细胞培养瓶放置于5％CO2、37℃培养箱内培养，培养过程(4天)中可间隔时间对细胞进行计数；
(2)将杂交瘤细胞转移至置于含10％(体积分数)胎牛血清的RPMI完全培养基中，进行扩大培养；
具体地，待细胞密度生长至1×106个/mL左右或培养液颜色变为橙黄色时，将T-25细胞培养瓶中的120mL培养液转移至50ml离心管内，4℃1500rpm离心5min，然后去掉离心管内上清液；用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在含10％胎牛血清的RPMI完全培养基中；并将细胞重悬液转移至T-75细胞培养瓶中，用含10％胎牛血清的RPMI完全培养基定容至540mL；将T-75细胞培养瓶置于5％CO2、37℃培养箱内培养，培养过程(5天)中可间隔时间对细胞进行计数；
(3)将杂交瘤细胞转移至无血清细胞培养基中培养，进行单克隆抗体的生产；
具体地，待细胞密度生长至1×106个/mL左右或培养液颜色变为橙黄色时，将T-75细胞培养瓶中的培养液分次转移至50ml离心管内，4℃1500rpm离心5min，去掉细胞上层清液，用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在装有540ml无血清CD-hybridoma培养基的T-75细胞培养瓶内，将T-75细胞培养瓶放置于5％CO2、37℃培养箱内培养，进行单克隆抗体的生产；抗体生产周期为10天，在第11天收集培养液用于下一步抗体纯化。
实施例4
本实施例以杂交瘤细胞3.155为例，介绍一种利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体抗CD8a的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将杂交瘤细胞置于含15％(体积分数)胎牛血清的RPMI完全培养基中复苏后，进行传代培养和扩大培养；
具体地，先将杂交瘤细胞置于含15％(体积分数)胎牛血清的RPMI完全培养基中，将培养皿置于5％CO2、37℃培养箱内培养，待杂交瘤细胞复苏后完成一次传代，培养过程(3天)中每天进行细胞计数；
然后，将细胞密度生长至1×106个/mL左右或颜色变为橙黄色时的培养液转移至15ml离心管内，4℃下1500rpm离心5min，去掉离心管内上清液；用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在含15％胎牛血清的RPMI完全培养基内，并将细胞重悬液转移至T-25细胞培养瓶中，用含15％胎牛血清的RPMI完全培养基定容至120mL；将T-25细胞培养瓶放置于5％CO2、37℃培养箱内培养，培养过程(4天)中可间隔时间对细胞进行计数；
(2)将杂交瘤细胞转移至置于含10％(体积分数)胎牛血清的RPMI完全培养基中，进行扩大培养；
具体地，待细胞密度生长至1×106个/mL左右或培养液颜色变为橙黄色时，将T-25细胞培养瓶中的120mL培养液转移至50ml离心管内，4℃1500rpm离心5min，然后去掉离心管内上清液；用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在含10％胎牛血清的RPMI完全培养基中；并将细胞重悬液转移至T-75细胞培养瓶中，用含10％胎牛血清的RPMI完全培养基定容至540mL；将T-75细胞培养瓶置于5％CO2、37℃培养箱内培养，培养过程(5天)中可间隔时间对细胞进行计数；
(3)将杂交瘤细胞转移至无血清细胞培养基中培养，进行单克隆抗体的生产；
具体地，待细胞密度生长至1×106个/mL左右或培养液颜色变为橙黄色时，将T-75细胞培养瓶中的培养液分次转移至50ml离心管内，4℃1500rpm离心5min，去掉细胞上层清液，用PBS溶液对细胞进行清洗后将细胞重悬在装有540ml无血清CD-hybridoma培养基的T-75细胞培养瓶内，将T-75细胞培养瓶放置于5％CO2、37℃培养箱内培养，进行单克隆抗体的生产；抗体生产周期为10天，在第11天收集培养液用于下一步抗体纯化。
上述实施例分别重复进行三次，三次试验后统计抗体生产周期和抗体纯度的平均值，计算结果如表1所示。
表1
实施例 抗体生产周期(天) 抗体纯度(％)
实施例1 21 95
实施例2 22 95
实施例3 21 95
实施例4 22 95

Claims (10)

1.一种利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将复苏后的杂交瘤细胞置于第一细胞培养基中，进行传代培养和扩大培养，该第一细胞培养基中血清的体积分数大于10％；
(2)将杂交瘤细胞转移至第二细胞培养基中，进行扩大培养，该第二细胞培养基中血清的体积分数小于等于10％；
(3)将杂交瘤细胞转移至无血清细胞培养基中培养，进行单克隆抗体的生产。
2.如权利要求1所述的利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用第一细胞培养基对杂交瘤细胞进行复苏。
3.如权利要求1所述的利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的第一细胞培养基中血清的体积分数为15-30％。
4.如权利要求1所述的利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的第一细胞培养基中血清的体积分数为20％。
5.如权利要求1所述的利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，其特征在于，步骤(2)中，待第一细胞培养基中杂交瘤细胞的密度达到1×106个/mL时，将杂交瘤细胞转移至第二细胞培养基中培养。
6.如权利要求1所述的利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的第二细胞培养基中血清的体积分数为8-10％。
7.如权利要求1所述的利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的第二细胞培养基中血清的体积分数为10％。
8.如权利要求1所述的利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，其特征在于，步骤(3)中，待第二细胞培养基中杂交瘤细胞的密度达到1×106个/mL时，将杂交瘤细胞转移至无血清细胞培养基中培养。
9.如权利要求1所述的利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，其特征在于，步骤(3)中，无血清细胞培养基的体积与第二细胞培养基的体积相同。
10.利用如权利要求1-9中任意一项所述的利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法生产的单克隆抗体，其特征在于，抗体纯度达到95％以上。
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