CN1311257A - 双特异性单克隆抗体、其制备方法和用其制成的溶血栓剂 - Google Patents

Abstract

提供分泌一种双特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述双特异性单克隆抗体为IgGl型抗体,分子量150KD,对纤维蛋白的亲和常数为6.3×10^－10,对尿激酶的亲和常数为2.93×10^－10,而对纤维蛋白原无亲和性。本发明在构建杂交瘤细胞后将杂交瘤细胞株进行无血清培养基培养,再进行补料培养,然后用亲和层析法分离纯化,得到高纯度、高亲和力的双特异性单克隆抗体。含本发明双特异性单克隆抗体的溶血栓剂药效提高,而出血的副作用大为减少。

Description

双特异性单克隆抗体、其制备方法和用其制成的溶血栓剂

本发明属于生物制药领域，具体涉及用单克隆抗体工程方法生产抗血栓药物。

心血管类疾病，是危害人类健康的第一大类疾病。而心肌梗塞，是心血管疾病的一个重要方面。一旦发生心肌梗塞，患者必须立即用溶栓药物治疗，血栓溶解所需的时间对患者的康复是至关重要的。

大多数的心肌梗塞，是由于冠状动脉血栓形成引起的，可以用溶解血栓剂治疗。溶栓剂一般是纤维蛋白溶酶原激活剂，可以激活纤维蛋白溶酶原转化成纤维蛋白溶酶，后者使血栓中的纤维蛋白溶解，从而使血栓溶解。

链激酶、尿激酶和组织型纤溶酶原激酶(tPA)是三种广泛用于治疗血栓症的溶栓剂，已用于治疗急性心血管疾病如：心肌梗塞，脑卒中，肺栓塞，深度静脉血栓症，外周动脉阻塞等。链激酶、尿激酶和tPA等，由于对纤维蛋白专一性不高，因此对纤维蛋白溶酶原的激活无选择性，将使几种凝血因子包括纤维蛋白原、因子Ⅴ和因子Ⅷ等不同程度地降解，从而造成出血等副作用，严重危害患者的康复。

为了增加溶栓剂对血栓的专一性，减少溶栓剂的副作用，有人将尿激酶通过化学反应连接到抗纤维蛋白特异性抗体上，结果可明显地增强尿激酶对血栓的溶解能力达100倍以上。因此，可利用单克隆抗体的高度专一性，制备一个双特异性单克隆抗体，其一端专一性结合纤维蛋白，而另一端抗尿激酶等溶栓剂，从而开发一个具有较强溶栓能力及较小副作用的导向性新型溶栓物质。

应用化学连接技术以及杂交瘤技术等均可制备双特异性单克隆抗体。

Runge MS等人，通过二硫键，将抗纤维蛋白单克隆抗体的Fab’与抗单链tPA的单克隆抗体连接，得到双特异性单克隆抗体，这种双特异性单克隆抗体可使tPA的溶栓能力提高8.6倍。

Kurokawa T等人，将分泌抗尿激酶的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞，与分泌抗人纤维蛋白的小鼠杂交瘤细胞融合，得到了分泌双特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，从小鼠腹水中收获双特异性单克隆抗体，该双特异性单克隆抗体对人纤维蛋白的亲合常数为2×10^-7，对尿激酶亲合常数为2×10^-8，当与尿激酶原和尿激酶结合时，对人血栓的溶栓能力可以分别提高20倍和5倍。

Harber等人，用杂交瘤技术制备双特异性单克隆抗体，其一端抗血栓纤维蛋白，另一端是抗溶栓制剂tPA。该双特异性单克隆抗体与纤维蛋白原没有交叉反应。将其注入体内后，会迅速富集定位到体内的血栓部位，并捕获内源性tPA，从而可降低tPA的剂量，增强溶解纤维蛋白能力和减轻tPA引起出血的副作用。

以化学的方法双制备功能单克隆抗体，反应难于控制，收率较低，实际意义不大。双特异性单克隆抗体的制备方法主要是在富含血清培养基中培养杂交瘤细胞而得到双特异性单克隆抗体。但是，由于高浓度血清的存在，细胞密度难于提高，因而抗体的表达量不高；此外，培养基中大量血清的存在，势必影响后续的抗体分离纯化，从而提高单克隆抗体的制造成本。

降低培养基中的血清浓度，是获得双特异性单克隆抗体的一个理想方法。但是，分泌双特异性单克隆抗体的杂交瘤必须同时保留四条表达四种抗体链的染色体，因此在降低血清的培养过程中有两个严重问题，一个是容易死亡，另一个是丢失产抗体链的染色体。所以，目前双特异性抗体的获得主要是以小鼠腹水方式，但这种方式由于存在人鼠共患疾病传播的可能性，根本上制约了双特异性单克隆抗体的实际应用。

各种杂交瘤细胞培养基都有一些基本一致的营养成分，如氨基酸、无机盐、维生素、葡萄糖及一些蛋白质添加物，包括生长因子、贴壁因子、激素、结合蛋白等。一些常规的培养基如MEM,DMEM,RPMI等基本上都含有这些成分。目前，细胞培养基主要还是以新生牛或胎牛血清作为主要成分。

血清培养存在许多缺点，首先各种血清必须广泛筛选，费时，代价高，而且无法保证一致，且潜在的血清细胞毒作用经常被忽视；另外，血清成分复杂，易给细胞培养带来污染，导致产物后处理困难。因此，无血清培养基的研究是细胞培养技术领域的一项重大课题。目前，已有用于杂交瘤细胞培养的商品化的无血清培养基。无血清培养基减少了操作费用和过程不稳定性，并去除了污染的可能性，但无血清培养基中添加的蛋白成分价格昂贵，而有的成分如BSZ等一般浓度较高，且杂质较多，致使表达产物分离纯化仍较困难。

杂交瘤细胞的培养，主要方式有批培养、补料培养和灌注培养等。

对杂交瘤细胞实行补料培养，使细胞不断接受新鲜营养物质，同时可降低某些抑制生长的代谢废物浓度，增加细胞密度，提高单克隆抗体产量，因此是细胞培养的一个很好的方法。然而，在补料培养过程中，细胞培养周期通常受到不断补加料液而升高的渗透压的限制。若补加10倍浓缩的培养基，则可使培养液渗透压明显升高，这对大多数杂交瘤细胞而言是致命的。Ryn JS等人用低渗透压的培养基作为初始培养基，延缓了由于添加10倍补料浓缩液而导致的大量细胞死亡的启动时间，使获得的抗体浓度达提高5倍多。

单克隆抗体的分离纯化一般包括以下几步：盐析分级，去除白蛋白、脂蛋白及一些培养基成分；离子交换层析；A蛋白或G蛋白亲和层析；凝胶过滤或疏水层析。

目前，国内外研制的抗纤维蛋白和抗溶栓制剂的双特异性单克隆抗体大多是通过化学过程合成的，而用杂交瘤细胞制备抗纤维蛋白和抗溶栓制剂的双特异性单克隆抗体，也都是通过小鼠腹水获取的。一般腹水中单克隆抗体的产量较高，但小鼠无法避免病原体污染，而且每只小鼠产生的单克隆抗体含量及效价均有变化，因此后续提纯比较困难。

本发明的第一个目的是提供一种分泌双特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的第二个目的是提供一种双特异性单克隆抗体。

本发明的第三个目的是提供用细胞反应器稳定生产大量双特异性单克隆抗体的方法。

本发明的第四个目的是提供一种有较强溶血栓能力而副作用较小的导向性溶血栓冻干制剂。

本发明所提供的杂交瘤细胞株FZ01保藏于CCTCC，保藏号No.C200002，该细胞株分泌一种双特异性单克隆抗体，所述双特异性单克隆抗体一端抗尿激酶，另一端专一性抗纤维蛋白，而对纤维蛋白原无交叉反应。

本发明所提供的双特异性单克隆抗体为IgG1型抗体，分子量150KD，对纤维蛋白的亲和常数为6.3×10^-10，对尿激酶的亲和常数为2.93×10^-10，而对纤维蛋白原无亲和性，系保藏于CCTCC、保藏号为No.C200002的杂交瘤细胞株FZ01所产生。

本发明所提供的双特异性单克隆抗体的制备方法包括：构建杂交瘤细胞后将杂交瘤细胞株进行无血清培养基培养，再进行补料培养，然后分离纯化双特异性单克隆抗体。

本发明所提供的溶血栓冻干制剂包含有效量的双特异性单克隆抗体和尿激酶，其比例为2.5∶1-6∶1，及药用赋形剂。

以下对本发明进行详细描述。

本发明构建了一株三源杂交瘤细胞细胞株，所述细胞株分泌一种双特异性单克隆抗体，该双特异性单克隆抗体一端抗尿激酶，另一端专一性抗纤维蛋白，而对纤维蛋白原无交叉反应。

本发明针对杂交瘤细胞的生长特点，开发了适合细胞生长的无血清培养基，实现了杂交瘤细胞从高血清培养基到无血清培养基培养的转变，杂交瘤细胞分泌抗体的能力保持不变。

本发明采用5L细胞培养罐，实现了对产抗纤维蛋白和抗尿激酶的双特异性单克隆抗体的三源杂交瘤细胞的补料培养。为了避免补料液高渗透压对细胞培养的影响，采取不同于一般补加10倍DMEM浓缩液的补料培养。在杂交瘤细胞批培养代谢研究的基础上，配置了适合该细胞株的补料液，另外，为了避免细胞培养过程中副产物，尤其是乳酸和氨的累积对细胞培养的影响，补料培养过程采用控制葡萄糖和谷氨酰胺浓度作为双限制性因素，控制细胞合理的代谢途经，最终实现细胞培养的高密度，高产的目的。

本发明在补料培养后收集培养基，用亲和层析的方法，获得高纯度、高亲和力的双特异性单克隆抗体。

图1是本发明的流程图。

本发明的具体实施方案如下：

1．分泌双特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

纤维蛋白原用凝血酶酶解，产生纤维蛋白，免疫BALB/c小鼠。分离免疫脾细胞，同骨髓瘤细胞株融合，得到杂交瘤，筛选产生抗纤维蛋白而与纤维蛋白原无交叉反应抗体的杂交瘤。把该杂交瘤细胞株同以小分子尿激酶为抗原的BALB/c鼠免疫脾细胞融合，筛选分泌抗尿激酶及抗纤维蛋白的杂交瘤细胞株。所得杂交瘤细胞株，其分泌的抗体对纤维蛋白、血栓及尿激酶有高度亲和性，是一种双特异性单克隆抗体。

2．杂交瘤细胞株从血清培养基转化为无血清培养基培养

含15％小牛血清的RPIM1640培养基中培养的杂交瘤细胞，采用连续稳定的线路，将血清从15％-10％-5％-4％-3％-2％-1％逐渐降低，每一步降低血清浓度，均用有限稀释的方法，选择分泌抗体量变化不大的单克隆。细胞稳定在添加1％小牛血清的RPIM1640培养基中后，换用添加1％无IgG的胎牛血清的RPMI1640培养基，继续培养，开始无血清的适应，同时用有限稀释的方法，选择分泌抗体量变化不大的单克隆。同上述方法，继续以1％-0.5％-0.2％-0.1％-0.05％-0％，降低血清浓度。最后，细胞完全适应在无血清的培养基中生长，同时用有限稀释的方法，选择分泌抗体量变化不大的单克隆，制备种子库，分装冻存。

3．细胞反应器补料培养杂交瘤细胞

为了达到细胞高密度及高产的目的，避免细胞培养过程中营养成分耗竭和代谢副产物尤其是乳酸和氨的累积，采用控制培养液中葡萄糖和谷氨酰胺浓度，即流加葡萄糖和谷氨酰胺的补料培养方法。

细胞反应器补料培养包括以下步骤：

1)进行无血清批培养，无血清培养基包含基础培养基DMEM/F₁₂(1∶1)；基本添加剂ITES，即低内毒素的胰岛素(I)5-20mg/l、转铁蛋白(T)5-20mg/l、乙醇胺(E)1-10μmol/l、亚硒酸钠(S)50-100nmol/l；和辅助添加剂地塞米松0.5-2ng/ml、腐胺10-15μmol/l、维生素E15-30μmol/l、维生素C15-30μmol/l和氢化可的松0.5-1μg/ml。

起始培养基的葡萄糖浓度为2.0g/L，谷氨酰胺4.0mM/L。

2)进行补料培养，细胞接种密度为1～2.0×10⁵个细胞/ml，培养初期采用表面通气，葡萄糖浓度降至1.0g/L以下时开始流加补料培养基，控制培养液中葡萄糖浓度为0.25-1g/L，谷氨酰胺浓度为0.5-2.0mM/L。当细胞密度升高至1.0×10⁶个细胞/ml以上时，改为深层通气。培养过程中定时测细胞的氧耗率，以分析细胞的代谢情况。培养到120小时，细胞密度达最大5.0×10⁷个/ml，细胞活性为90％以上。整个培养周期为312小时，分泌的双特异性单克隆抗体浓度可达500mg/L以上。

在细胞反应器补料培养过程中确定反应器内培养液葡萄糖和谷氨酰胺浓度的方法：

1)在转瓶中进行无血清批培养，起始培养基的葡萄糖浓度为2.0g/L，谷氨酰胺4.0mM/L。

2)在转瓶中进行补料培养，分别控制补料液葡萄浓度；根据细胞的生长及双特异性单克隆抗体的浓度最高，确定培养液中葡萄糖浓度为0.25-1g/L，最佳浓度控制为0.5g/L。

3)在转瓶中进行补料培养，培养液葡萄糖浓度控制在0.5g/L。分别控制培养液中谷氨酰胺浓度，根据细胞的生长及双特异性单克隆抗体的浓度最高，确定谷氨酰胺浓度为0.5-2.0mM/L，最佳浓度控制为1.0mM/L。

4、分离纯化

收获的培养液，调pH2.5-3.0，以硫酸铵分级沉淀。离心收集沉淀，称重，加100～200倍缓冲液悬浮，调pH7.0-8.0，过纤维蛋白亲和柱，洗涤，洗脱。比活大于10万IU/mgPr.的尿激酶，过经pH7.2-7.6缓冲液平衡的苯甲脒亲和柱，经缓冲液洗涤后，将上述洗脱液过柱，洗涤后，洗脱。加硫酸铵沉淀，离心收集沉淀，加水悬浮，调pH4.0-4.5，过分子筛S-200，收集抗体洗脱峰。SDS-PAGE及RP-HPLC检测，所得双特异性单克隆抗体纯度达95％以上，分子量为150KD。

5．双特异性单克隆抗体的性质

1)以琼脂扩散试验及ELISA方法测定，本发明所述双特异性单克隆抗体为IgG1型抗体。对纤维蛋白的亲和常数为6.3×10^-10，对尿激酶的亲和常数为2.93×10^-10，而对纤维蛋白原则无亲和性。

2)本发明所述之单克隆抗体与尿激酶按克分子数3∶1的比例组成复合物，进行动物试验。结果表明，对一定的溶栓效果，复合物中尿激酶的剂量可减少到单独使用尿激酶的五分之一，而溶栓速度更快，血浆中纤维蛋白原的含量使用前后变化不大，提示复合物出血的危险大大减少了。

3)本发明的双特异性单克隆抗体对尿激酶原有较高的亲和性，其亲和常数与尿激酶相当。

本发明所提供的溶血栓冻干制剂包含有效量的双特异性单克隆抗体和尿激酶，其比例为2.5∶1-6∶1，及药用赋形剂。所述双特异性单克隆抗体和尿激酶的比例以3∶1为佳；药用赋形剂可采用本领域常用的赋形剂，如0.5-2％甘露醇、0.0004％吐温80、10mM PB和0.1M NaCl。

通过本发明的方法，实现了杂交瘤细胞在无血清培养基中、于细胞反应器内以补料方式培养，达到双特异性单克隆抗体的高表达；用亲和层析的方法进行分离纯化，从培养基中获得了高纯度、高亲和力的双特异性单克隆抗体。本发明的方法可用于稳定地生产大量的双特异性单克隆抗体。动物试验表明，该双特异性单克隆抗体使尿激酶的溶血栓能力提高5～10倍，而出血的副作用大大减小。

本发明的补料培养方法对其它杂交瘤细胞及一般动物细胞的补料培养也有一定的借鉴作用。

以下用实施例和实验例对本发明进行举例说明，它们旨在阐述本发明的最佳实施方案。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均落在本申请权利要求的范围内。

实施例1细胞降血清浓度适应无血清培养基

选择细胞生长状态良好，活性大于95％的细胞，添加15％小牛血清的RPMI1640培养基，于100ml的方瓶中培养。每天换液，去除悬浮于液体中的细胞，连续培养一个月，始终保持95％以上活性，单克隆抗体浓度为20mg/l。

换添加10％小牛血清的RPMI1640培养基培养，继续每天换液，去除悬浮于液体中的细胞，连续培养一个月，始终保持95％以上活性，以有限稀释的方法，选择分泌单克隆抗体浓度为20mg/l以上的单克隆细胞继续培养。

换添加5％小牛血清的RPMI1640培养基培养，继续每天换液，去除悬浮于液体中的细胞，连续培养一周，始终保持95％以上活性，以有限稀释的方法，选择分泌单克隆抗体浓度为20mg/l以上的单克隆细胞继续培养。按上述方法，依序5％-4％-3％-2％-1％将血清浓度降至1％。

将细胞用10ml离心管，1000rpm转速，离心10min，将离心的细胞转入添加1％无IgG胎牛血清的无血清培养基中连续培养二周，细胞活性保持在90％以上，以有限稀释的方法，选择分泌单克隆抗体浓度为20mg/l以上的单克隆细胞继续培养。

换添加0.5％无IgG胎牛血清的无血清培养基培养，继续每天换液，去除悬浮于液体中的细胞，连续培养一周，恢复细胞活性达95％以上，以有限稀释的方法，选择分泌单克隆抗体浓度为20mg/l以上的单克隆细胞继续培养。按上述方法，依序0.5％-0.2％-0.1％-0.05％将血清浓度降至0.05％。

将细胞用10ml离心管，1000rpm转速，离心10min，将离心的细胞转入添加无血清培养基中，细胞活性保持在90％以上，以有限稀释的方法，选择分泌单克隆抗体浓度为20mg/l以上的单克隆细胞继续培养，使细胞活性恢复至95％以上，分泌单克隆抗体浓度为20mg/l以上。以无血清培养基分装，冻存。

实施例2无血清培养基的选择

以化学成分明确的DMEM/F₁₂作为基础培养基。按1∶1的体积比配成溶液。

选择ITES作为基本添加剂

I：低内毒素的胰岛素，10μg/ml

T：转铁蛋白，10μg/ml

E：乙醇胺，10μmol/l

S：亚硒酸钠，100nmol/l

细胞在100ml的方瓶中培养，观察细胞，细胞可在添加ITES的基础培养液中生长，但活性和细胞密度不高

细胞在50ml的小方瓶中做系列培养试验，分别添加地塞米松、氢化可的松、亚油酸、胆固醇、腐胺、对羟基苯甲酸、维生素E、维生素C、巯基乙醇等组分在方瓶中进行批培养，以活细胞密度，存活率和抗体浓度为寻优目标，将优化条件的细胞再进行两两组合，最后选定四个组分作为另外添加剂。

分别以各添加剂的浓度梯度作系列实验，得到合适的浓度。

无血清培养基的确定标准为：在500ml方瓶中装液20ml，分别接入在含有5％血清RPM1640培养基和无血清培养基中适应的细胞，接种密度为1.0×10⁵cells/ml，每种条件各接种3个方瓶，每隔24小时取样计数，最后一起测单克隆抗体浓度。细胞培养到第3天，在有血清和无血清条件下，细胞密度都达到最高，分别为1.0×10⁶cells/ml和1.5×10⁶cells/ml，单克隆抗体浓度分别为20mg/L和20-25mg/L。

实施例3流加补料液的选择

细胞活性为95％的细胞，以1×10⁵cell/ml的密度，接种到150ml转瓶中，培养基体积60ml，转速60r/min。培养箱培养箱CO₂浓度为5％，培养温度为36.8℃。每隔12小时取样，计数。

用YS12700型选择性生化分析仪测定葡萄糖浓度，乳酸脱氢酶法测定乳酸，日立835-50型氨基酸自动分析仪测定氨基酸浓度，尿素试剂盒测定氨浓度(不选用脲酶，而改用2.5mmol/l(NH₄)₂SO₄作为标准液)。

培养到60小时细胞达到最大密度2×10⁶cell/ml，细胞活性为90％。培养到120小时，细胞活性下降到10％，单克隆抗体浓度达最大40mg/l，批培养结束。

分析培养过程中，细胞生长和各营养成分的消耗及生成速率，得到流加补料液的配方。将补料液配成10倍浓缩液。

实施例4控制葡萄糖浓度的流加培养

细胞活性为95％的细胞，以1×10⁵cell/ml的密度，接种到四只150ml转瓶中，培养基体积60ml，转速60r/min。培养箱培养箱CO₂浓度为5％，培养温度为36.8℃。

四只150ml转瓶中，起始的谷氨酰胺浓度为4.0mM/L，起始的葡萄糖浓度分别为：

No.1 2.0g/L；No.2 1.5g/L；No.3 1.0g/L；No.4 0.5g/L

每隔6小时取样计数，测葡萄糖浓度，对No1-No4分别补加浓度为100g/L的葡萄糖浓缩液，使各转瓶中的葡萄糖浓度分别控制在初始水平附近，同时补加10倍浓缩补料液，使其它成分不成为限制因素。

结果表明补料培养较批培养而言，葡萄糖转化为乳酸的摩尔得率系数明显下降，抗体产量明显上升，当葡萄糖浓度为0.5g/L的条件最优。

实施例5谷氨酰胺控制的流加培养

细胞活性为95％的细胞，以1×10⁵cell/ml的密度，接种到四只150ml转瓶中，培养基体积60ml，转速60r/min。培养箱培养箱CO₂浓度为5％，培养温度为36.8℃。

四只150ml转瓶中，起始的葡萄糖浓度为1g/L，谷氨酰胺浓度分别为：

No.1 4.0mM/L；No.2 2.0mM/L；No.3 1.5mM/L；No.4 1.0mM/L。

每隔6小时取样计数，测葡萄糖浓度和谷氨酰胺浓度，对No1-No4分别补加浓度为100g/L的葡萄糖浓缩液和100mM/L的谷氨酰胺浓缩液，使各瓶培养基中的葡萄糖浓度控制在0.5g/L水平附近，而各转瓶中的谷氨酰胺浓度分别控制在初始水平附近，同时补加其它营养成分，使之不成为限制因素。

结果表明，补料培养较批培养谷氨酰胺转化为氨的摩尔得率系数明显下降，抗体产量明显上升，当葡萄糖浓度为1.0mM/L的条件最优。

实施例6细胞反应器补料培养

将5L CelliGen Plus生物反应器及配件安装好后，用pH分别为4.003、6.86和9.18(25℃)的标准pH溶液标定pH电极，然后在罐体中加入PBS至工作体积，连同pH、DO电极一起高压灭菌(121℃,60min)。冷却后，校正DO电极，将罐内PBS压出，接通气体，整个系统准备完毕，可接种细胞进行细胞培养。

PBS从罐中压出后，分别将细胞种子和新鲜培养基压入罐中，最终体积为2.5L。细胞接种密度为2.0×10⁵cell/ml

每隔12小时取样、计数、测葡萄糖和谷氨酰氨浓度。在培养初期，通气以表面通气的形式进入反应器

当葡萄糖浓度降至1.0g/L以下时，开始补加流加培养基。在培养初期，通气以表面通气的形式进入反应器；当细胞密度大于1.0×10⁶cell/ml时改为深层通气。在反应器培养中，每隔一段时间，测一次细胞的氧消耗速率，以分析细胞的代谢情况。

培养到120小时，细胞密度大于1.0×10⁷cell/ml，细胞活性为90％。

整个培养周期为312小时，最终单克隆抗体浓度达850mg/L，收获培养液5升。收获的培养液立即以冰醋酸调pH2.5，搅拌30分钟，加25％硫酸铵，搅拌三个小时以上。

实施例7双特异性单克隆抗体的分离纯化

实施例6所得的硫酸铵沉淀，10000rpm离心，25分钟，收集沉淀。

取沉淀5克，以500ml 50mM NaH₂PO₄,0.4M NaCl,pH7.4悬浮，搅拌1小时，10000rpm离心，25分钟，收集上清。上清过经50mM NaH₂PO₄,0.4M NaCl,pH7.4平衡的纤维蛋白-Sepharose 6B柱(20×30cm)，洗涤，以0.1MHAc,0.4M NaCL,pH3.0洗脱，收集洗脱峰。

0.5克比活大于10万IU/mgPr.的尿激酶，以100ml 50mM NaH₂PO₄,0.4M NaCl,pH7.4溶解，过经50mM 50mM NaH₂PO₄,0.4M NaCl,pH7.4平衡的苯甲脒-Sepharose 6B(26×16cm)，经50mM NaH₂PO₄,0.4M NaCl,pH7.4洗涤。将上述洗脱液调之pH7.4，过柱，50mM NaH₂PO₄,0.4M NaCl,pH7.4洗涤后，以0.1M HAc,0.4M NaCL,pH3.0洗脱。洗脱液加硫酸铵至30％沉淀，搅拌3小时以上，离心收集沉淀，加水悬浮，调pH4.0-4.5，过分子筛S-200(26×100cm)，收集抗体洗脱峰。总收率为22％。SDS-PAGE及RP-HPLC检测，所得双特异性单克隆抗体纯度达95％以上，分子量为150KD。

实验例1含双特异性单克隆抗体的溶血栓剂的药效学研究

按照江苏医药1987,3:131-133和Drugs,1996,(52)4:589的方法，用家兔静脉血栓模型进行本发明的含双特异性单克隆抗体(双抗)溶血栓剂的药效学研究。受试物为尿激酶和尿激酶-双抗(1∶3,w/w)复合物，分别用注射用生理盐水溶解，每2ml分别含以下剂量。测定结果见表1。

                             表1本发明的溶血栓剂的药效学研究

样品	剂量	给药方法	溶栓率(％)	血液中纤维蛋白质含量(g/L)
					对照	生理盐水2ml/只	滴注1.5h	16.5±6.7	2.37±0.79
尿激酶	0.2mg/kg	滴注1.5h	21.9±8.8	1.95±0.76
					0.5mg/kg	滴注1.5h	57.4±16.6	2.06±0.31
	1mg/kg	滴注1.5h	95.3±1.6	1.78±0.23
					尿激酶+双抗(1∶3)	尿激酶含量0.1mg/kg	滴注1.5h	62.8±11.9	2.10±0.52
按尿激酶含量0.2mg/kg	滴注1.5h	97±0.6	2.36±0.35

上述结果表明，本发明的溶血栓剂(尿激酶+双特异性单克隆抗体)的溶血栓作用为尿激酶的5倍以上，而引起出血的可能性比尿激酶小得多，即产生相同的溶栓效果时，本发明的溶血栓剂不会引起出血。

实验例2含双特异性单克隆抗体的溶血栓剂的药代动力学研究

采用Beagle狗进行药代动力学研究，受试物为尿激酶和(尿激酶+双特异性单克隆抗体)复合物，其中尿激酶以¹²⁵Ⅰ标记，用注射用生理盐水配制成溶液，按尿激酶0.2mg/kg的剂量于1分钟内进行静脉注射，以预定的时间间隔测定血浆中¹²⁵Ⅰ的放射活性，测出半衰期。

实验结果：尿激酶t_1/2=0.35小时；复合物t_1/2=0.59小时。

上述结果提示，本发明的溶血栓剂(尿激酶+双特异性单克隆抗体)半衰期比尿激酶长，因此以一定剂量的尿激酶计，溶栓效果提高。

Claims (12)

1．三源杂交瘤细胞株，所述细胞株保藏于CCTCC，保藏号No.C200002，该细胞株分泌一种双特异性单克隆抗体，所述双特异性单克隆抗体一端抗尿激酶，另一端专一性抗纤维蛋白，而对纤维蛋白原无交叉反应。

2．双特异性单克隆抗体，所述双特异性单克隆抗体为IgG1型抗体，分子量150KD，对纤维蛋白的亲和常数为6.3×10^-10，对尿激酶的亲和常数为2.93×10^-10，而对纤维蛋白原无亲和性，系保藏于CCTCC、保藏号为No.C200002的杂交瘤细胞株所产生。

3．权利要求2所述双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于：构建杂交瘤细胞后将杂交瘤细胞株进行无血清培养基培养，再进行补料培养，然后分离纯化双特异性单克隆抗体。

4．如权利要求3所述的方法，其中无血清培养基培养是在无血清适应后再用无血清培养基进行培养，所述无血清培养基包括：

(1)基本培养基DMEM/F₁₂(1∶1)；

(2)基本添加剂ITES：

I：低内毒素的胰岛素，5-20μg/ml

T：转铁蛋白，5-20μg/ml

E：乙醇胺，1-10μmol/l

S：亚硒酸钠，50-100nmol/l；

(3)辅助添加剂：地塞米松0.5-2ng/ml、腐胺10-15μmol/l、维生素E15-30μmol/l、维生素C15-30μmol/l和氢化可的松0.5-1μg/ml。

5．如权利要求4所述的方法，其中所述无血清适应包括如下步骤：将杂交瘤细胞在含15％小牛血清的RPIM1640培养基中培养，用有限稀释法逐步降低血清浓度，直至血清浓度为1％，每步均选择分泌抗体量变化不大的单克隆；细胞稳定在添加1％小牛血清的RPIM1640培养基中后，换用添加无IgG的1％胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养，用有限稀释法逐步降低血清浓度，直至血清浓度为0％、细胞完全适应在无血清培养基中生长。

6．如权利要求5所述的方法，其中血清浓度的降低先从15％-10％-5％-4％-3％-2％-1％，换用添加1％无IgG胎牛血清的RPMI1640培养基后以1％-0.5％-0.2％-0.1％-0.05％-0％降低血清浓度。

7．如权利要求3所述的方法，其中补料培养包括以下步骤：

1)进行无血清批培养，起始培养基的葡萄糖浓度为2.0g/L，谷氨酰胺4.0mM/L；

2)进行补料培养，细胞接种密度为1～2.0×10⁵个细胞/ml，培养初期采用表面通气，葡萄糖浓度降至1.0g/L以下时开始流加补料培养基，控制培养液中葡萄浓度为0.25-1g/L，谷氨酰胺浓度为0.5-2.0mM/L，当细胞密度升高至1.0×10⁶个细胞/ml上以上时，改为深层通气，培养过程中定时测细胞的氧耗率。

8．如权利要求7所述的方法，其中补料培养基葡萄浓度为0.5g/L，谷氨酰胺浓度为1.0mM/L。

9．如权利要求3所述的方法，其中分离纯化包括酸化、硫酸铵分级沉淀；纤维蛋白柱亲和层析、尿激酶柱亲和层析和分子筛S-200过滤。

10．溶血栓冻干剂，包含有效量的权利要求2所述双特异性单克隆抗体和尿激酶，其比例为2.5∶1-6∶1，及药用赋形剂。

11．如权利要求10所述的溶血栓冻干剂，其中双特异性单克隆抗体和尿激酶的比例为3∶1。

12．如权利要求10所述的溶血栓冻干剂，其中药用赋形剂为0.5-2％甘露醇、0.0004％吐温80、10mM PB和0.1M NaCl。

Images