CN104845938B - 乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体及其应用，属于免疫学领域。本发明将乙型肝炎病毒表面抗原免疫接种小鼠后，将鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选能够稳定分泌乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株SVAHBV‑1，其保藏编号为CGMCC No.10320，其分泌的单克隆抗体效价高，可达10⁶，可以特异性的区分常见的多种病毒，特异性好，可用于制备乙型肝炎病毒表面抗原含量检测试剂盒和抗体检测试剂盒，也可以用于乙型肝炎病毒表面抗原的鉴别诊断，具有广泛的应用前景和市场价值。

Description

乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域与疫苗学领域，具体地，涉及一种抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体及产生该抗体的杂交瘤细胞株以及抗体的应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是一种嗜肝病毒，是肝病毒家族的DNA逆转录病毒，于1965年被丹娜发现，被称之为丹式颗粒。主要存在于肝细胞并损害肝细胞，该病原体可通过血液，母婴和性传播感染机体，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化，损害肝脏，引发乙型病毒性肝炎疾病，简称乙肝。乙型病毒性肝炎分急性和慢性两种。急性乙型肝炎在成年人中90％可自愈，而慢性乙型肝炎表现不一，分为慢性乙肝携带者、慢性活动性乙型肝炎、乙肝肝硬化等。HBV在全世界范围内均有流行，据WHO统计，全球约有20亿人感染过HBV病毒，其中3亿以上的人群为慢性HBV携带者，迄今为止，每年仍有近100万人死于HBV感染引起的肝衰竭和肝癌。在我国，约有1亿的HBV携带者，目前乙肝病毒携带率为7.18％，其中约三分之一有反复肝损害，表现为活动性的乙型肝炎或者肝硬化。

乙肝流行范围广，治疗困难，对人体造成的危害大。首先，乙肝的传染性极强。乙肝病毒由质地坚硬的外壳包被，保护病毒不受外界恶劣环境侵害，使其生命力极其顽强，它可通过患者排出的各种体液传染给健康的人群。其次，乙肝的治愈非常困难，虽然现在市面上针对乙肝治疗的药品很多，但真正治愈的特效药品很少。此外，乙肝容易发生恶变，据统计，HBV携带者如果不加以治疗，31.6％～60.1％将会转化成慢性肝炎，而20.8％～56.3％的慢性肝炎会恶化变成肝硬化，肝硬化患者如不及时治疗就会有16％～51.1％的患者转化为肝癌，危及生命。乙肝还具有突发性，乙肝病毒在人体内存在，具有一定的潜伏期，不易被发现，当外界条件成熟，就可突然间发作，并且不可抑制。对HBV的防治成为全世界亟待解决的问题。在尚未找到较好的治疗方法之前，对乙肝病毒的预防就显得尤为重要。乙肝疫苗的推广应用，使得乙肝病毒的感染率逐年下降，对乙型肝炎的预防和控制起重要作用。

乙型肝炎表面抗体是对乙肝病毒免疫的保护性抗体。它的阳性表明既往感染过乙肝病毒，但已经排除病毒，或者接种过乙肝疫苗，产生了保护性抗体。血清中乙型肝炎表面抗体滴度越高，保护力越强。乙型肝炎表面抗体是由乙型肝炎表面抗原诱导产生，为保护性抗体。在HBV感染恢复期或注射乙肝疫苗后出现，它的出现标志对HBV感染产生特异性免疫。乙型肝炎表面抗体是指动物或人体抗乙型肝炎表面抗原产生的IgG、IgM等类型抗体的总称，广泛应用于乙型肝炎病毒鉴定、乙型肝炎疫苗以及乙型肝炎表面抗原的定性和定量检测中。

由于目前乙型肝炎表面抗原检测多采用人源乙型肝炎表面抗体检测体系，而人源乙型肝炎表面抗体的获取较为困难，因此需要一种获取相对较为容易，且产量较高的乙型肝炎表面抗体来取代。目前，市售的乙肝疫苗有血源性乙肝疫苗、乙肝多肽疫苗和基因工程重组乙肝疫苗等。由于血源性乙肝疫苗有传播其它疾病(如艾滋病、丙型肝炎等)的风险，我国目前主要提倡使用基因工程重组乙肝疫苗，因此，有必要制备一种特异性的抗重组乙型肝炎表面抗原的单克隆抗体，用于重组乙型肝炎表面抗原、抗体的检测及病毒的鉴别。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体，用于乙型肝炎病毒表面抗原含量的检测。

本发明的另一目的在于提供上述单克隆抗体的应用。

为了达到上述目的，本发明首先提供一种能够稳定、高效分泌乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，其为SVAHBV-1，于2015年1月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株SVAHBV-1，其保藏编号为CGMCC No.10320。

本发明还提供了由上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。

具体而言，本发明采用小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备乙型肝炎病毒表面抗原的中和性单克隆抗体，通过以下技术方案实现：通过将免疫乙肝疫苗原液的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，分离出能够分泌乙型肝炎病毒表面抗体的单克隆杂交瘤细胞，接种小鼠腹腔，制备含有特异性乙型肝炎病毒表面抗体的腹水，经过后期处理并验证，得到特异性好、抗体水平高且能长期保存的乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体。

进一步，本发明提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体，其由保藏编号为CGMCC No.10320的杂交瘤细胞株分泌获得。

所述乙肝疫苗原液的制备方法为：取以DNA重组技术构建的表达乙型肝炎病毒表面抗原的重组汉逊酵母工作种子批菌种，经锥形瓶、种子罐和生产罐进行三级发酵，收获菌体并破碎，获得菌体破碎上清液，经纯化后获得精纯液，经除菌过滤后即为乙肝疫苗原液。

更进一步地，本发明提供了上述单克隆抗体在制备检测乙型肝炎病毒表面抗原试剂盒中的应用。

本发明提供了上述的单克隆抗体在制备检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒中的应用。

本发明提供了一种用于检测乙型肝炎病毒表面抗原或抗体的试剂盒，含有上述单克隆抗体。

对本发明的单克隆抗体，经生物标记或化学标记后获得的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。

进一步地，经酶标记的上述单克隆抗体属于本发明的保护范围。

所述的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

本发明提供了保藏编号为CGMCC No.10320的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在检测生物样品中乙型肝炎病毒表面抗原中的应用。

本发明提供了保藏编号为CGMCC No.10320的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用。

含有本发明所述单克隆抗体的预防或治疗乙型肝炎的药物属于本发明的保护范围。

本发明提供了保藏编号为CGMCC No.10320的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在乙肝疫苗制备过程中质量检测中的应用。

本发明提供的乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体具有如下有益效果：

1、本发明的单克隆抗体具有较高的效价即反应性，间接法效价最高可达10⁶。

2、本发明的单克隆抗体与甲肝病毒、肠道病毒71型病毒、柯萨奇A16病毒等无交叉反应，均有较好的病毒特异性。

3、本发明杂交瘤细胞SVAHBV-1分泌的单克隆抗体的亲和常数为1.39×10⁷M^-1，可广泛应用于乙型肝炎病毒表面抗原的检测、鉴别、筛查与疫苗生产的抗原检测以及流行病调查中；同时检测的乙型肝炎病毒表面抗原，可以更加有效的反映乙肝疫苗中的抗原含量，对疫苗的工艺研究与生产具有重要意义。

附图说明

图1为杂交瘤细胞SVAHBV-1分泌的单克隆抗体的免疫印迹图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明选用的表达乙型肝炎病毒表面抗原的重组汉逊酵母工程菌株来自北京科兴生物制品有限公司，工作种子为原始种子扩增5代，但菌株不限于本来源与本代次的菌株。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。

实施例1免疫原制备与动物免疫

(1)采用分子克隆技术构建p5GK3质粒，通过电转化至汉逊酵母，定向敲除汉逊酵母的尿嘧啶合成酶(乳清苷-5-磷酸脱羧酶)基因Ura3，得到相应的尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌株后，通过营养缺陷型培养基筛选出构建的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌株。采用分子克隆技术构建乙肝表面抗原表达质粒pDKXMPHT，转化至尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌内，筛选获得能够表达重组乙肝表面抗原的汉逊酵母菌株。

(2)取以DNA重组技术构建的表达乙型肝炎病毒表面抗原的重组汉逊酵母工作种子批菌种，经锥形瓶、种子罐和生产罐进行三级发酵，收获菌体。

(3)采用高压匀质的方法破碎菌体，11700g或更高离心力离心30min去除细胞碎片，即为重组汉逊酵母菌体破碎上清液。

(4)在菌体破碎上清液中加入聚乙二醇6000，搅拌均匀后4℃静置沉淀，离心去除沉淀，即为PEG沉淀上清。

(5)在PEG沉淀上清中加入硅胶，4℃搅拌收集沉淀，以生理盐水洗涤沉淀3次；向沉淀中加入解吸附液，离心收集上清，用膜包进行超滤，即为超滤液。

(6)超滤液使用离子交换层析和分子筛层析，监测波长为280nm，收集洗脱液，获得精纯液，经除菌过滤后即为乙肝疫苗原液。

(7)将乙肝疫苗原液与弗氏佐剂(0天免疫为弗氏完全佐剂，14天、28天、35天免疫为弗氏不完全佐剂)等体积混合乳化后于0天、14天、28天、35天背部皮下多点免疫BALB/c小鼠，0.2mg/只。

(8)末次免疫一周后采血，间接ELISA检测抗体效价，血清稀释10⁴倍时OD值为1.116，于末次免疫一周后采用乙肝疫苗原液腹腔冲击选定的小鼠，3天后取小鼠脾脏，进行细胞融合。

实施例2细胞融合及建株

(1)细胞融合前复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天去除RPMI1640细胞培养液(Gibco)，重新添加培养液，准备SP2/0细胞。

(2)处死免疫小鼠，按常规方法制备小鼠脾细胞悬液。

(3)根据脾细胞与SP2/0细胞计数结果分别加入适量不完全IMDM培养液(Gibco)，SP2/0细胞晃动混匀，脾细胞用移液管吹打均匀。然后将脾细胞与SP2/0细胞按1:2合于50ml离心管中，混匀。

(4)加不完全IMDM培养液至50ml，离心5钟，倒净上清。轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，离心管置37℃水浴，准备融合。

(5)将37℃预热的50％的PEG40001ml，用滴管缓慢滴入混合细胞管，边滴边转动离心管，使细胞保存在混匀状态。

(6)静置90s后立即缓慢加入15ml无血清的IMDM培养基(Gibco)(37℃)，然后离心5钟，弃去上清。

(7)加入IMDM完全培养液(Gibco)，混匀，将混悬液分别加至96孔细胞培养板中，100μl/孔，于37℃，5％CO₂培养箱内培养。

(8)第2天细胞板加HAT培养液(IMDM含1*HAT(Sigma))100μl/孔。(9)每3天换一次HAT培养液，观察是否出现杂交瘤，两周后换HT培养基(IMDM含1*的HT(Sigma))，观察融合细胞生长状况。

(10)细胞融合后第七天开始观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清进行抗体ELISA检测。将阳性孔细胞转入24孔板扩大培养，及时做亚克隆。

(11)经3次亚克隆得到稳定分泌抗体的细胞系，命名为SVAHBV-1，冻存细胞。将杂交瘤细胞株进行保藏，保藏号CGMCC No.10320，分类命名为：乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏时间：2015年1月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

实施例3单抗细胞株腹水制备及抗体效价检测

按常规方法将冻存的实施例2获得的杂交瘤细胞进行复苏，培养，待细胞覆盖25ml的细胞培养瓶瓶底50％以上时即可按照常规方法腹腔接种BALB/c小鼠，定期收集腹水HBV-1。

将乙肝疫苗原液采用0.01M PBS1:60稀释，100μl/孔包被酶标板，4℃过夜，检测本发明杂交瘤细胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗体腹水HBV-1的抗体效价，抗体检测OD值/阴性血清检测OD值(小于0.05按0.05计算)大于或等于2.1时，抗体结果为阳性，此时抗体所对应的稀释倍数即为抗体效价。腹水HBV-1抗体效价最高达为10⁶，效价较高。结果见表1。

表1 抗体效价检测结果

实施例4抗体亚类测定

将乙肝疫苗原液采用0.01M PBS 1:60倍稀释后100μl/孔包被酶标板4℃过夜，然后采用Sigma公司ISO2-1KT鼠单抗分型试剂按照单抗亚类试剂说明书进行试验，最后加入HRP标记的兔抗鼠二抗进行单克隆抗体亚类鉴定。结果显示本发明单抗为IgG2b型。

实施例5免疫印迹(Western blotting)实验

将乙肝疫苗原液采用BIO-RAD的电泳电转设备使用15％的SDS-PAGE电泳胶进行电泳后再电转到硝酸纤维素膜后，以本发明杂交瘤细胞腹水为一抗(1：1000)，AP-羊抗小鼠IgG为二抗进行Western blotting鉴定，结果见附图1，结果显示，杂交瘤细胞SVAHBV-1分泌的单克隆抗体与重组乙型肝炎病毒表面抗原单体及多聚体均能够反应，表明该单抗与变性后的抗原能产生反应，说明本发明杂交瘤细胞SVAHBV-1分泌的单抗HBV-1能够识别线性表位，是线性单抗。

实施例6杂交瘤细胞系分泌单抗的稳定性检测

分别在3个月和9个月后，从液氮中取出冻存的SVAHBV-1杂交瘤细胞株进行复苏、扩大培养后，制备腹水，进行间接ELISA检测抗体效价，以前期制备的腹水，HBV-1单抗腹水(0天)为对照同时进行检测。结果表明，本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体腹水效价达到10⁶以上，与前期腹水效价无差异，表明细胞保藏后制备的腹水的效价未下降。因此单克隆细胞株分泌抗体的活性没有降低，稳定性良好。结果见表2。

表2 抗体效价稳定性检测结果

实施例7亲和常数测定

将本发明的杂交瘤细胞株分泌的单抗HBV-1纯化后检测其蛋白质含量。采用1:5,1:10,1:20,1:40稀释的不同浓度的乙型肝炎病毒表面抗原横向包被酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜。第二天洗板后封闭2小时，拍干待用。将纯化后的单抗HBV-12倍梯度稀释，纵向加入包被后的酶标板，采用间接ELISA法检测抗原抗体反应的OD值。以各抗原浓度下的曲线平坦段的OD值计为100％，计算50％OD值，考察50％OD值所对应点的单抗浓度[Ab]t，再根据亲和常数计算公式K＝(n-1)/2(nAb’-Ab)可以得到本发明单抗的亲和常数为1.39×10⁷M^-1。

表3 亲和常数检测结果

实施例8用于检测抗原含量

将乙型肝炎病毒表面抗原兔多抗采用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)1:4000稀释，100μl/孔包被酶标板，4℃过夜。封闭液37℃封闭2小时，分别加入乙肝疫苗(酵母)冻干参比品和3批乙型肝炎疫苗，37℃反应1小时，洗板后加入纯化后的1:8000稀释的乙型肝炎病毒表面抗原单抗HBV-1，37℃反应1小时，洗板后加入1:4000稀释的羊抗鼠HRP，37℃反应1小时后洗板进行显色、终止、读数，检测乙型肝炎疫苗的表面抗原含量。结果见表4。

表4 抗原含量检测方法应用

采用本发明建立的抗原含量检测方法检测3批乙型肝炎疫苗中的表面抗原含量，检测值相对于理论值的回收率分别为122％-136％之间，满足质量标准的要求，在酶联免疫法允许的误差范围内，检测方法准确可靠。本发明具有较好的应用效果。

实施例9抗原含量检测试剂盒特异性研究

将乙型肝炎病毒表面抗原兔多抗采用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)1:4000稀释，100μl/孔包被酶标板，4℃过夜。封闭液37℃封闭2小时，分别加入乙肝疫苗原液、甲肝灭活疫苗原液、柯萨奇A16(CA16)灭活疫苗原液、CA16收获液、肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗原液、EV71收获液，37℃反应1小时，洗板后加入SPA纯化后的1:8000稀释的乙型肝炎病毒表面抗原单抗HBV-1，37℃反应1小时，洗板后加入1:4000稀释的羊抗鼠HRP，37℃反应1小时后洗板进行显色、终止、读数，检测样品的乙肝表面抗原含量，结果见表5。

表5 单克隆抗体特异性OD值

本发明与甲肝灭活疫苗原液、CA16灭活疫苗原液、CA16收获液、EV71灭活疫苗原液、EV71收获液均不反应，表明本发明可以有效区分上述病毒，同时采用本发明建立的体系和培养基以及重组汉逊酵母菌培养物不存在交叉反应，可以有效检出乙型肝炎病毒表面抗原，具有高度的特异性。

本发明在用于抗原含量检测时，可以作为双抗体夹心ELISA检测的试剂盒包被抗体，也可用对它进行生物标记或化学标记，作为双抗体夹心ELISA检测试剂盒的夹心酶标抗体；同时，也可以将它和另一物种的多抗配对使用，通过加入夹心抗体的第二酶标抗体的方法制备抗原含量检测试剂盒。

本发明的单抗用于制备抗体检测试剂盒时，可以作为包被抗体或者酶标竞争抗体，也可以作为竞争抗体并加入抗鼠酶标二抗的方法进行检测。

由于该单抗良好的活性和特异性，它也具有预防和治疗乙型肝炎病毒导致的乙型肝炎疾病的潜在功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.10320。

2.一种乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCCNo.10320的杂交瘤细胞株分泌获得。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，为经生物标记或化学标记的单克隆抗体。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测乙型肝炎病毒表面抗原试剂盒中的应用。

5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒中的应用。

6.权利要求2所述的单克隆抗体在检测生物样品中乙型肝炎病毒表面抗原中的应用。

7.权利要求2所述的单克隆抗体在制备预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用。

8.一种预防或治疗乙型肝炎的药物，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体。

9.一种用于检测乙型肝炎病毒表面抗原的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体。

10.一种乙型肝炎病毒表面抗体的检测试剂，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体。