CN100376671C - 抗乙型肝炎病毒表面抗原的杂交瘤细胞株及其单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杂交瘤细胞株，CCTCC保藏号为CCTCC-C200505，其能分泌抗HBV表面抗原的单克隆抗体。用此种单克隆抗体包被建立的ELISA方法，不仅可以检测野生型HBsAg，还可以检出除T123M/C124R和T123N以外的15种变异中的13种变异HBsAg，检测变异株的能力明显优于国内同类产品。该单克隆抗体检测野生HBsAg的最低浓度达到0.5ng/mL，符合国家制定的标准。

Description

抗乙型肝炎病毒表面抗原的杂交瘤细胞株及其单克隆抗体

技术领域

本发明涉及生物制剂，具体地涉及一种分泌抗乙型肝炎病毒表面原抗(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体。

技术背景：

HBsAg是诊断乙型肝炎病毒感染的重要标志。目前国内外HBsAg检测试剂盒多是利用抗-HBsAg单克隆抗体或多克隆抗体建立的ELISA检测方法。各种试剂盒使用的抗体不同，检测变异乙肝病毒的能力不同。目前的研究结果显示，国内的HBsAg检测试剂盒检测变异株的能力不佳，主要原因是没有可以很好的识别变异株的单克隆抗体。因此有必要研发出可以检测野生和变异HBsAg的单克隆抗体，建立检测方法，以显著降低HBsAg变异株的漏检率。

HBsAg变异的原因非常复杂。目前认为乙肝疫苗免疫后抗HBV免疫球蛋白的形成，以及高效价免疫球蛋白预防，药物的压力以及病毒的持续感染与HBV突变有关。使用高效价免疫球蛋白也会导致HBV S基因突变，肝移植病人使用高效价免疫球蛋白后仍然有约30％的人感染HBV。

自从上世纪80年代推广乙肝疫苗接种预防HBV感染以来，HBV感染的流行率显著降低，对人类的健康起到了很大作用。但是随着疫苗应用年限的延长，可逃避乙肝疫苗的S基因突变的免疫逃避株越来越多。目前报道，我国乙肝疫苗和HBIG母婴阻断失败者，S基因变异率约为20％-40％；我国单纯乙肝疫苗免疫后携带者变异率为31％。表面抗原变异株仍然具有致病性和传播能力，可能成为潜在的传染源，可能突破人群已有免疫力形成新的感染而成为新的公共卫生问题。因此，研究S基因突变株的预防和诊断，对控制HBV的感染，进行HBV感染流行的监测以及献血员的筛查有重要意义。

HBV S基因突变株的预防和诊断对献血员的筛查也有重要意义。目前我国对献血员的筛查主要是通过血清学的方法。乙肝变异株的出现给血液制品的筛查提出了问题。变异株与野生株HBsAg的抗原性有很大改变；表面抗原“a”决定簇145等位点氨基酸变异后，抗原性会发生较大改变，约60％变异表面抗原与针对野生型HBsAg的单克隆抗体的抗原反应性减弱或消失，用国内外现行表面抗原诊断试剂盒不能检测出，漏检率从12％-90％不等。变异株感染的病人容易漏检，变异株污染的血液制品也不易发现，对HBV的预防控制带来困难。

目前用于检测HBV突变的方法主要有直接测序、有限稀释PCR、克隆筛选和特异基因序列固相聚合酶链反应(SS-SPPCR)。特异基因序列固相聚合酶链反应(SS-SPPCR)是检测HBV基因点突变的和区分野毒株与变异株的混合感染灵敏而特异的新方法。这些方法检测基因突变的特异性很好，但费用昂贵，需要许多大型仪器设备和熟练的技术人员，操作复杂，检测时间长，不易在我国推广使用。

检测HBsAg的常用方法是ELISA，决定方法灵敏性和特异性的关键是有合适的抗-HBsAg的单克隆抗体。目前有许多研究单位制备了可以应用于临床检测的相关单克隆抗体，但主要是用于检测野生株，可以较好识别变异株的单克隆抗体迄今尚未见报道。因此，筛选可以识别变异株的单克隆抗体具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述背景技术存在的不足，提出制备一种抗-HBsAg的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，使其制备的试剂能在检测出乙肝病毒野生株的同时还能检测出多种乙型肝炎病毒变异株。

本发明所述杂交瘤细胞株是通过免疫、融合以及筛选得到的，属于鼠源杂交瘤细胞D12E9F11，其CCTCC保藏号为200505，它能分泌抗HBsAg的单克隆抗体。

该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体能同时与野生型和突变型HBsAg进行特异性的结合反应。

本发明所述杂交瘤细胞的特征：

细胞系名称(Cell line Name)：鼠源杂交瘤细胞D12E9F11

种名(Species)：Mouse

衍生组织(Tissue Derived)：小鼠骨髓瘤细胞SP2/0

形态学(Morphology)：Lymphoblast

传代培养液(Medium and Supplement)：RPMI164090％；FCS10％

生长条件(Growth Condition)：37℃，CO₂ 5％

冻存基质(Freeze Medium)：FCS 90％，DMSO 10％

分泌物(抗体)特征：

抗体类别：lgG1

抗体效价：上清≥1×10³ ELISA

           腹水≥1×10⁷ ELISA

抗体亲和力：用于野生型HBsAg检测灵敏度可以达到0.5ng/ml，超过我国食品与卫生监督局颁布的标准(标准为1.0ng/ml)，检测常见变异Gly145Arg HBsAg的灵敏度可以达到1.0ng/ml。

存活性(Viability)：≥90％

本发明用途：

直接用途：建立可以同时检测乙肝病毒突变株和野生株在内的乙肝病毒表面抗原的临床检测实验技术。包括ELISA，胶体金免疫渗析，多种乙肝病毒抗原的固相与液相分析，以及多种免疫病理检测技术等。这些方法的建立，能在很大程度上突破常规乙肝病毒表面抗原检测试剂在多种变异株检测上的限制。

间接用途：采用本细胞株分泌抗体所开发的实验技术与试剂，可广泛地用于乙肝的基础、临床与流行病学研究，尤其是用于对献血人员中乙肝病毒变异株感染者的筛选。

本发明对推动我国病毒性肝炎的防治与研究，对进一步推进乙肝的临床、流行病学发展以及预防输血性肝炎的传播具有及其重要的价值。

具体实施方式

一、抗-HBsAg的单克隆抗体细胞株的建立

1、免疫原的制备

免疫原为从HBV感染者血清中分离的HBsAg。

2、免疫动物：

取HBsAg 20ug稀释在100ul生理盐水中，加入等量的氢氧化铝佐剂，混匀后，在BALB/c小鼠(6周龄)颈背部皮下多点注射。间隔2和4周后，取同量抗原加不完全佐剂追加免疫两次，免疫结束后采集少许鼠血，检测HBsAb效价。融合前2天，用相同剂量抗原腹腔注射追加免疫。

3、免疫效价检测

使用上海科华生物公司HBsAg预包被96孔聚苯乙烯板检测免疫后小鼠血清效价检测。

鼠血清用含10％牛血清PBS以10²-10⁶倍稀释，加入96孔板，0.1ml/孔，37℃，60分钟。甩去孔中液体，扣干，用洗涤液注满各孔，静置15秒，甩去孔中液体，拍干。重复5次。每孔加1∶4000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 50ul于各孔中，37℃，45分钟。重复上洗涤。加50ul含有0.1％(W/V)邻苯二胺0.1％，50ul双氧水PH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，振荡混匀，置37℃，15分钟。用1M硫酸终止显色后，振荡混匀，在492nm波长读数。以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断免疫鼠血清的校价。

3、细胞融合建株

末次加强免疫后，无菌取小鼠脾脏，收集脾细胞，用无血清培养液洗3次，计数并测定细胞活力。收获对数生长期的骨髓瘤细胞，作活细胞计数，细胞活力应不低于95％。将1×10⁸脾细胞与2×10⁷骨髓瘤细胞在50ml尖底离心管中混匀，离心，弃去上清液，加入0.7ml分子量为4000的PEG作为融合剂，使其融合，用HAT选择培养基培养，使杂交瘤细胞能生长，待细胞长至10⁵/ml时，同上免疫效价测定法筛选检测细胞分泌抗体情况；

4、有限稀释法对阳性克隆的克隆化培养

用弯吸管吹打杂交瘤细胞培养板中孔内的克隆，悬浮于完全培养液中。计数细胞，调整细胞浓度至100个/ml、50个/ml、10个/ml。分别将三种密度的杂交瘤细胞悬液接种于含饲养细胞的96孔培养板中，每孔加0.1ml，使每孔平均含10、5、1个细胞。在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养。1周后可半量换液。培养10-14天取培养上清液进行同上免疫效价测定法筛选检测细胞分泌抗体情况。取第一次克隆化培养后抗体分泌水平最好的20个孔中的细胞进行第二次克隆化培养。方法同上。直到100％的克隆分泌特异性抗体为止。筛选出一株抗体性质最好的细胞，将阳性克隆进一步扩大培养，用10％DMSO的培养液配成10⁶/ml细胞，冻存。共建一株稳定分泌抗体细胞株。命名为：D12E9F11。

二、单克隆抗体的制备

制备含特异性单克隆抗体的腹水：选用BALB/C雌性经产鼠，在接种杂交瘤细胞前1周，先给小鼠腹腔注射0.5ml降植烷。收集生长良好的杂交瘤细胞，离心洗涤1次，重悬浮于无血清培养液中，调整细胞密度，每只小鼠腹腔注射10⁶个杂交瘤细胞。接种细胞7-12天，可见小鼠腹部明显膨大。消毒腹部皮肤，用5ml注射器接8号针头，刺入腹腔，收集腹水。3000rpm离心15min，弃去上层油脂，吸取淡黄色腹水，分装，-70℃保存备用。

三、单克隆抗体的纯化

取1ml制备的小鼠腹水，加入等量的饱和硫酸铵溶液，使达到50％的饱和度，室温搅拌2小时，静置过夜，12000rpm，4℃离心30分钟，弃去上清。将沉淀物用PBS溶解，加入0.8体积的饱和硫酸胺溶液，使达到40％的饱和度，室温搅拌2小时，静置过夜，12000rpm，4℃离心30分钟，弃去上清。将沉淀物用PBS溶解，加入0.7体积的饱和硫酸铵溶液，使达到35％的饱和度，室温搅拌2小时，静置过夜，12000rpm，4℃离心30分钟，弃去上清。沉淀物用PBS溶解，放入透析袋中，将透析袋放入盛有1升PBS的容器中，透析24小时，其间换PBS两次。测定纯化抗体的浓度，并通过PAGE蛋白电泳观察纯化抗体，4℃保存备用。

四、单克隆抗体的免疫学性状分析

1、特异性测定

用D12E9F11单抗包被后，用HBV核心抗原，以及非HBV抗原为待检抗原，用HRP标记的抗-HBsAg多抗为检测抗原测定。结果表明，除与HBV表面抗原反应外，与HBV核心抗原及对照抗原无特异性反应。

2、单抗免疫球蛋白类及亚类测定

30ml细胞培养上清按25.8％加入固体硫酸铵4℃，2小时，3000转离心30分钟，溶液用0.1ml中性PBS溶解。用兔抗鼠1g分型血清(Sigma)作免疫双扩散，24小时后观察沉淀线。结果单抗为IgG1。

3、单抗识别HBsAg位点的分析

同上用HBsAg包被96孔板，50ul HBsAb阳性病人血清，50ulHRP标记的单抗，37℃1小时，洗涤后同上加显色液测492nm吸收值。以单抗腹水对同一HRP标记的单抗抑制为100％，以已知单抗对标记单抗的抑制为阴性对照，计算抑制率。抑制率为(1-测定0D/阴性对照OD)×100。≥50％的抑制率为阳性。结果27份表面抗体阳性血清对三组抗体均显示了不同程度的抑制率(见表1)，由此显示自然感染后的抗体可以抑制单抗与HBsAg的反应，因此提示此单抗所识别的位点也存在于自然抗原上。

表1.竞争抑制法测定抗体结果

抑制率(％)	阳性血清(份)	阴性血清(份)
			0-910-1920-2930-3940-4950-59≥60	1232676	7575300

五、单抗的应用研究

单抗检测变异表面抗原的的能力

应用ELISA对本株单抗识别常见HBV S基因变异抗原的能力进行检测，并与8种国产常用HBSAg检测试剂盒对比。检测结果见表3。本单抗(D12E9F11)可以检测出15种变异中的13种，8种常用HBsAg检测试剂盒对变异株的检测分别为：武汉长立7种、厦门新创8种、万泰7种、科华6种、荣盛8种、月亮湾6种、华美7种、爱恩地7种。单抗D12E9F11对变异HBsAg的检出比率较常规试剂盒显著为高，ELISA显色强度也显著高于试剂盒。

表2.实验中表达野生及变异HBsAg的重组质粒

样品	血清型	突变位点	突变发生于MHR的位置	国家	样品来源
						1056Sp91-4696AP3.1Arg145drArg145dwArgl45ywBA2.4BA3.2BA3.4C126GlydrGly dwGly ywHK188M5	aywadwadwadradwaywaywaywaywadradradwaywadrayw	P120S/S143LD99N/122NT123/G145RD144AG145RG145RG145RY100C/P120TT123N/C124RT123NI126T/S143T标准序列标准序列标准序列L98V/Q101RY100S/T118V/R122K/M133I/Y134N/P142S/S143L/G145K	2、41，2，444441，2223，411-4	西班牙印度尼西亚英国中国意大利德国巴基斯坦巴基斯坦巴基斯坦中国中国西班牙西班牙中国香港沙特阿拉伯	静脉药瘾者免疫接种肝移植后HBIG治疗人工突变免疫失败免疫失败肝移植后HBIG治疗肝移植后HBIG治疗肝移植后HBIG治疗HBsAg携带者阳性对照阳性对照阳性对照骨髓捐献者肾移植病人

SA4SA6SA7

adwadwayw

M133T/Y161FQ129R/G130N/A166VM133T

3，53，53

南非南非南非

急性乙型肝炎慢性肝病慢性肝病

表3：单抗D12E9F11和常用HBsAg检测试剂盒检测野生及变异HBsAg的比较。

样品	长立	厦门新创	万泰	科华	荣盛	月亮湾	华美	爱恩地	D12E9F11
										1056sp	+	+	+	-	+	-	-	-	+
91-4696AP3.1Arg145drArgl45dwArg145ywBA2.4BA3.2BA3.4C126Gly DrGly DwGly YwHK188M5SA4SA6SA7包被抗体检测抗体	++------++++---++单抗多抗	++------+++++++++-+++单抗多抗	++------+++++--++单抗多抗	++---+--+++++++++--+-单抗多抗	++--+---+++++--++单抗多抗	++------+++++--++单抗多抗	++--+---+++++--++单抗多抗	++------+++++--++单抗多抗	++++++--+++++++++++++单抗多抗

注：以S/N值判断结果，S/N大于2.1为阳性，小于2.1为阴性。

表4：单抗D12E9F11效价检测：

样品	稀释度
									10<sup>-1</sup>	10<sup>-2</sup>	10<sup>-3</sup>	10<sup>-4</sup>	10<sup>-5</sup>	10<sup>-6</sup>	10<sup>-7</sup>	阴性对照
	细胞培养上清腹水	2.690	1.916	0.643	0.277≥2.900	0.097≥2.900	0.0422.435	0.0400.299									0.0240.029

六、小结

本专利发明采用常规单克隆抗体的制备技术，使用从HBV感染者血清中分离的HBsAg为免疫原免疫小鼠，经细胞融合、筛选后，成功的筛选到一株可以较好识别HBV变异株的单克隆抗体。识别的表位存在于天然表面抗原上。用此种单克隆抗体包被建立的ELISA方法，不仅可以检测野生型HBsAg，还可以检出除T123M/C124R和T123N以外的15种变异中的13种变异HBsAg，检测变异株的能力明显优于国内同类产品。该单克隆抗体检测野生HBsAg的最低浓度达到0.5ng/mL，符合国家制定的标准。国内目前尚没有报道有可以分泌检测变异株的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。具有此种性质的细胞株是本单位的首创。

使用本发明的细胞株分泌的抗体建立的ELISA检测表面抗原的方法可以取代目前国内HBV免疫逃避变异株检测能力较差的现行HBsAg诊断试剂。在用于HBV变异株感染临床检测与研究的其他实验技术，如免疫荧光检测、免疫胶体金技术和放射免疫检测等，也有很好的应用前景。本技术一旦实施，可广泛地用于乙肝的基础、临床与流行病学研究，尤其是用于对献血人员中乙肝病毒变异株感染者的筛选。对推动我国病毒性肝炎的防治与研究，对进一步推进乙肝的临床、流行病学发展以及预防输血性肝炎的传播具有及其重要的价值。

Claims (2)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征是该细胞株的保藏号为：CCTCC NO：C200505，其能分泌抗HBV表面抗原的单克隆抗体。

2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，其特征是该抗体特异性地抗HBV表面抗原。