CN103923882A - 甲肝病毒单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种甲肝病毒单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No.7858的杂交瘤细胞株分泌产生。该单克隆抗体能够高效、特异性地中和甲肝病毒抗原，对于甲肝病毒感染的诊断、预防及治疗具有重要意义。

Description

甲肝病毒单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及病毒免疫学检测领域，具体地说，涉及甲肝病毒单克隆抗体及其应用。

背景技术

甲型病毒性肝炎简称甲型肝炎，是由甲型肝炎病毒（甲肝病毒，HAV）引起的一种急性传染病。甲型肝炎病毒属于微小核糖核酸病毒科，肝病毒属。病毒颗粒呈球形，直径约为27nm，无囊膜，衣壳由32个壳粒组成，呈20面体立体对称，每个壳粒具有四个多肽分别为病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，基因组为单股正链RNA，其长度相当于7500个核苷酸左右。在RNA的3′末端有多聚腺苷序列，在5′末端以共价形式与病毒基因组蛋白连接。根据病毒核苷酸序列分析，可将人甲肝病毒分为四个基因型，但其抗原性相似，所以甲型肝炎病毒只有一个血清型。

甲型肝炎病毒主要通过粪-口途径传播，传染源多为病人。病毒潜伏期为15～45天，病毒常在患者转氨酸升高前的5～6天就存在于患者的血液和粪便中。发病2～3周后，随着血清中特异性抗体的产生，血液和粪便的传染性也逐渐消失。长期携带病毒者极罕见。HAV随患者粪便排出体外，通过污染水源、食物、海产品（如毛蚶等）、食具等的传播可造成散发性流行或大流行。也可通过输血或注射方式传播，但由于HAV在患者血液中持续时间远较乙型肝炎病毒短，故此种传播方式较为少见。

人类感染甲肝病毒后，首先在消化道中增殖，在短暂的病毒血症中，病毒又可继续在血液白细胞中增殖，然后进入肝脏，在肝细胞内复制繁殖。甲肝病毒仅有一个血清型和一个抗原抗体系统，因此其检测抗体可在世界各国使用。甲肝的发病机制不清楚，但是与肝脏免疫作用特别是细胞免疫作用相关。HAV可从肝细胞经胆汁进入肠道排出体外。因此，可从粪便中检出HAV颗粒加以确诊，在潜伏期或黄疸期的传染性最强。

临床表现：甲肝分为急性黄疸型，急性无黄疸型，亚临床型和急性淤胆型，其中急性淤胆型是急性黄疸型的特殊性，是由于肝细胞分泌胆汁功能受损。由于无论从临床表现还是从肝功能检查，都无法将急性甲型肝炎病毒感染与其他类型的肝炎病毒感染相区分，因此病原学检查对于诊断急性甲型肝炎病毒感染十分重要。

甲型肝炎的病原学检查包括：（1）抗HAV IgM:HAV感染后早期产生IgM型抗体，是新近感染的证据，也是早期诊断甲型肝炎最简便而可靠的血清学标志。在发病后数天即可阳性，一般持续8～12周，少数可延续6个月。临床上多采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测。（2）抗HAV IgG：出现稍晚，于2～3个月达到高峰，是过去感染的标志，可持续多年或终身。其他检测方法有：免疫电镜观察和鉴定HAV颗粒，体外细胞培养分离病毒，检测HAV RNA等，一般仅在实验研究中使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种甲肝病毒单克隆抗体及其应用。

为了实现本发明目的，本发明利用甲肝病毒（TZ84株）全病毒颗粒作为抗原利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，然后通过SouthernBiotech单克隆抗体分型试剂盒对所获得的单抗进行亚型鉴定，通过免疫印迹法分析单抗特异性，采用间接ELISA法进行中和试验，获得了能够分泌中和甲肝病毒并能够特异性结合甲肝病毒的细胞系，及由该细胞系分泌产生的单克隆抗体。

在本发明的一方面，提供一种对甲肝病毒具有高中和效价的杂交瘤细胞株，即甲型肝炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株HAV mAb-4。该杂交瘤细胞株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.7858，保藏日期2013年7月10日。

在本发明的另一个方面，提供由上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。

进一步地，本发明还提供根据所述单克隆抗体的抗原结合区域（例如重链和轻链可变区）发展出的各种衍生抗体，可以用于被动免疫治疗或者预防甲肝病毒感染，如人源化的抗体。

由于本发明的单克隆抗体对于甲肝病毒具有高水平的中和效果，因此本发明还提供所述单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体，或其任意组合在制备用于检测甲肝病毒抗原的试剂、药剂或试剂盒中的应用。

本发明另一个方面提供用于检测甲肝病毒抗原，或抗甲肝病毒IgG或IgM的试剂盒、试剂、药剂，其包括本发明所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体，或其任意组合。所述试剂、药剂或试剂盒可用于检测甲肝病毒抗原。从而进一步用于诊断甲肝病毒感染。

本发明再一个方面提供一种用于治疗或预防甲肝病毒感染的药物，所述药物包含所述单克隆抗体或其活性片段或其保守性变异体。优选地，所述药物进一步包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明的又一个方面提供一种用于治疗和/或预防甲肝病毒感染的方法，其中包括将本发明所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体施用于患者。

本发明还提供了用于检测甲肝病毒抗原的方法，其中使用了本发明所述的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体，或标记的本发明的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体。优选地，采用双抗夹心法进行检测甲肝病毒抗原。

对于本发明所述的标记，其是指生物标记或化学标记。例如酶标记或荧光标记（例如荧光素标记）。优选地，所述酶标记为辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记等。

对于本发明的用于预防或治疗目的的单克隆抗体，其优选是被人源化的。

本发明还提供所述单克隆抗体在制备用于预防或治疗甲肝病毒感染的人源化抗体中的应用。

本发明还提供了甲肝病毒相关抗原、抗体的检测方法，其包括：1、用于样本中针对甲肝病毒的IgG抗体的检测方法：将纯化病毒液吸附于固相载体上，再加入置于缓冲系统中的待检标本，再加入携带可标记检测物的识别所检测标本来源物种的IgG抗体的第二抗体，再通过检测所携带的标记物的存在推测标本中抗甲肝病毒抗体的存在或者多少。优选的所述可检测标记物为辣根过氧化物酶或荧光素标记。2、用于样本中针对甲肝病毒的IgM抗体的检测方法：将纯化病毒液吸附于固相载体上，再加入置于缓冲系统中的待检标本，再加入携带可检测标记物的识别所检测标本来源物种的IgM抗体的第二抗体，再通过检测所携带的标记物的存在推测标本中抗甲肝病毒抗体的存在或者多少。优选的所述可检测标记物为辣根过氧化物酶或荧光标记物。3、用于样本中针对甲肝病毒的IgM抗体的检测方法：将抗待检物种的IgM的抗体（抗抗体，抗IgM的抗体）吸附于固相载体上，再加入置于缓冲系统中的待检标本，再加入携带可检测标记物的识别所检测标本的酶标记抗原，再通过检测所携带的标记物的存在推测标本中抗甲肝病毒IgM抗体的存在或者多少。优选的所述可检测标记物为辣根过氧化物酶或荧光素标记物。

本发明提供一株保藏号为CGMCC No.7858，能够分泌产生甲肝病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由其分泌产生的单克隆抗体能够高效、特异性地中和甲肝病毒抗原，对于甲肝病毒感染的诊断、预防及治疗具有重要意义。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1杂交瘤细胞系的获得

包括如下步骤：

1、免疫原的制备

免疫原为甲肝病毒抗原---TZ84株，由北京科兴生物制品有限公司提供。将病毒接种2BS细胞，培养、收获后经PEG沉淀与三氯甲烷抽提进行纯化，然后进行超滤浓缩及灭活以制备纯化病毒液。

2、动物免疫

采用甲肝病毒纯化液进行BALB/c小鼠初次免疫和加强免疫，所用BALB/c小鼠为雌性，月龄为6-8周，体重为18-22g。免疫程序：首次免疫取甲肝病毒纯化液与弗氏完全佐剂佐剂混合乳化，免疫BALB/c小鼠，150μg/只，皮下多点注射；间隔10天后进行第二次免疫，取甲肝病毒纯化液与弗氏不完全佐剂混合乳化，然后加强免疫上述小鼠，剂量同第一次；7天后采血，采用间接ELISA法测定抗体的抗甲肝病毒活性。对检测抗体效价最高的小鼠不加佐剂，用甲肝病毒纯化液进行腹腔加强免疫。

3、细胞融合

取免疫鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤按比例融合，铺96孔细胞培养板，采用HAT选择培养基培养杂交瘤细胞，第7天采用间接ELISA法检测细胞上清以筛选阳性细胞。间接法采用甲肝病毒纯化液包被，筛选呈阳性的细胞孔。间接ELISA法如下：将甲肝病毒纯化液包被酶标板，加入阳性血清对照、阴性血清对照，同时设置空白对照孔，37℃反应后洗涤酶标板，加入羊抗小鼠IgG-HRP；反应后洗涤酶标板，加入TMB显色液37℃显色10-20分钟，用2M H₂SO₄终止反应，仪器上读取OD₄₅₀的吸光度。根据吸光度值筛选阳性细胞孔。

4、克隆：采用有限稀释法对阳性细胞孔进行克隆。

5、检测：对克隆板内的细胞上清进行检测，采用甲肝抗原纯化液包被酶标板进行检测。

6、二次克隆化，同步骤4的操作。

7、二次克隆化后的检测，同步骤5的检测方法，采用间接ELISA法将第二次克隆的细胞上清进行针对甲肝病毒抗原的阳性检测，选择单细胞阳性孔进行扩大培养，获得大量杂交瘤细胞。

实施例2单克隆抗体的筛选及制备

1、单克隆抗体腹水制备

杂交瘤细胞扩大培养采用腹腔注射小鼠制备腹水。其中腹水制备流程如下：培养杂交瘤细胞，于后腹腔注射石蜡致敏的BALB/c小鼠，7～14天左右收集腹水，1200转/分钟离心，除去沉淀，收集上层单克隆抗体腹水。

2、单克隆抗体的初步筛选和制备

采用甲肝病毒纯化液1:100稀释后分别包被酶标板，100μl/孔，包被过夜；用0.01M PBST-20（含0.5v/v‰吐温-20）的洗液洗板3遍，加入10%小牛血清、0.01M PBST-20（含0.5v/v‰吐温-20）溶液，200μl/孔，37℃封闭，弃去板中溶液。加入系列稀释的上述获得的上层单克隆抗体腹水，100μl/孔，其中小鼠阴性血清为阴性对照；37℃孵育1小时，用上述洗液洗板，加入1:10000稀释于10%小牛血清、0.01MPBST-20（含0.5v/v‰吐温-20）溶液的羊抗小鼠IgG-HRP，100μl/孔，37℃孵育1小时，洗板，加入100μl的TMB显色液，采用2M H₂SO₄终止反应，450nm处读数，共筛选处6株对于甲肝病毒抗原反应的单克隆抗体杂交瘤细胞，分别编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#。

对上述筛选的杂交瘤细胞株建系，液氮保存。将初筛的6株杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔，获得单克隆抗体。

本实施例中采用甲肝病毒包被的间接ELISA法初筛方法，节省工作量与时间。

实施例3单克隆抗体亚型鉴定

按照抗体亚型鉴定试剂盒（购自Southern Biotech公司）说明书操作，对实施例2中筛选出的单抗进行亚型鉴定。实验结果如表1所示。

表16株甲肝单抗抗体亚型鉴定结果

由表1可见，1#单抗为IgM型，此亚型抗体特异性差；2#单抗为IgG3型，在有限的实验条件下此亚型抗体不易于纯化；因此1#、2#单抗不适合作为ELISA酶标抗体的原材料。其余4株单抗中3＃、5＃单抗为IgG2a型，4＃、6＃单抗为IgG2b型，可作为ELISA酶标抗体材料的候选对象。

实施例4免疫印迹法分析单抗特异性

对亚型检定筛选出的4株单抗进行特异性检测。对甲肝病毒抗原纯化液进行还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（12%分离胶、5%浓缩胶）。电泳后将凝胶在80-100V恒压下转膜1-2小时，将胶上分离蛋白转移至PVDF膜上。含3%BSA的0.01mol/L PBS4℃过夜封闭PVDF膜。将膜分别与1:100-1:200稀释的单抗腹水室温孵育2小时后，PBS洗涤三次，加入1:1000稀释的羊抗鼠IgG-HRP室温孵育1-2小时，PBST20洗涤三次，HRP-DAB底物显色试剂盒（购自天根TIANGEN）显色。

甲型肝炎病毒抗原纯化液SDS-PAGE免疫印迹法检测甲型肝炎病毒纯化液结果。结果显示3＃单抗对病毒纯化液中的杂质蛋白有非特异性结合，故不能选择此株单抗作为酶标抗体原材料。其余3株（4#、5#、6#）均可特异性结合于甲肝病毒的VP2蛋白上，这3株单抗可用于后续的酶标抗体材料的筛选。

实施例5单克隆抗体抗原表位识别

根据亚型鉴定和免疫印迹的实验结果，共剔除掉3株单抗（1＃、2＃、3＃），将其它3株候选单抗用辛酸-硫酸铵法进行纯化，取部分纯化液进行HRP标记，将单抗纯化液按1:100稀释后加入已包被甲肝病毒抗原的酶标板进行阻断，然后加入HRP标记的各单抗进行自配对和两两交叉配对，根据自身阻断和交叉阻断结果来分析各单抗的甲肝病毒抗原结合表位。此实验重复测定两次，统计实验结果。

阻断率≥50％即视为阻断成功，＜50%的阻断率不予显示。具体检测结果见表2。

表2甲肝单抗阻断结果统计（阻断率％）

由表2可见，4#、5#、6#3株单抗可交叉相互阻断，表明识别相同的抗原表位。

实施例6单克隆抗体的中和效价检测

将筛选出的3株单抗纯化液经8倍稀释后除菌过滤，然后2倍系列稀释，与等量稀释至1000CCID₅₀/ml的甲肝病毒混合，于37℃中和1-2小时，接种于长成单层2BS细胞的25cm²细胞培养瓶中，1ml/瓶，每一稀释度接种2瓶，37℃吸附2-3小时，补加细胞维持液，33-35℃培养21天后弃去上清液，用PBS溶液清洗细胞表面，加入1-2ml Versen液，反复冻融5次后收获病毒。采用ELISA双抗体夹心法定性检测甲肝抗原，以能完全中和1000CCID₅₀/ml甲肝病毒的最高稀释度为该株单抗的中和效价。实验结果如表3所示。

表3单抗中和效价检测结果

单抗编号	4#	5#	6#
				中和效价	1:4096	1:1024	1:4096

由表3可见，4＃和6#单抗中和效价较高，可达1:4096，5＃单抗中和效价较低，为1:1024。最终选取分泌4#单克隆抗体的杂交瘤细胞株HAV mAb-4进行保藏，其保藏编号为CGMCC No.7858。

测序结果表明，编码4＃单克隆抗体IgG轻链及重链可变区的核苷酸序列分别如Seq ID No.1和2所示。

根据以上描述，本发明具有如下优点：

（一）本发明的4#单克隆抗体为针对甲肝病毒高特异性的抗体，同时对甲肝病毒具有较高的中和效价。

（二）本发明的4#单克隆抗体对应于甲肝病毒中和表位，可用于甲肝病毒IgG抗体竞争法检测，从而更加有效的评价疫苗的免疫效果。

（三）本发明的4#单克隆抗体对甲肝病毒具有较强的中和效果，提示可将其改造为治疗性的单克隆抗体。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.甲型肝炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株HAV mAb-4，其保藏编号为CGMCC No.7858。

2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

3.用于检测甲肝病毒抗原，或抗甲肝病毒IgG或IgM的试剂盒、试剂，其包括权利要求2所述的单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒、试剂，其特征在于，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。

5.根据权利要求4所述的试剂盒、试剂，其特征在于，所述标记为酶标记或荧光标记。

6.根据权利要求5所述的试剂盒、试剂，其特征在于，所述标记为辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记，或荧光素标记。

7.权利要求2所述单克隆抗体在制备用于检测甲肝病毒抗原，或抗甲肝病毒IgG或IgM的试剂盒、试剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。

9.权利要求2所述单克隆抗体在制备用于预防或治疗甲肝病毒感染的人源化抗体中的中的应用。

10.由权利要求2所述单克隆抗体制备的用于预防或治疗甲肝病毒感染的人源化抗体。