CN101544962B

CN101544962B - Ev71病毒广谱性单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN101544962B
Application number: CN2009101315582A
Authority: CN
Inventors: 蔡芳; 高强; 李雅静; 张小梅; 尹卫东
Original assignee: SINOVAC BIOTECH CO Ltd
Current assignee: Sinovac Biotech Co., Ltd.
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2009-04-03
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2029-04-03
Also published as: CN101544962A

Abstract

本发明公开了EV71病毒广谱性单克隆抗体及其应用。具体而言，本发明公开了一株具有广谱、高效、特异中和EV71病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备筛选方法、细胞株以及所述单克隆抗体的用途。该中和单克隆抗体具有与EV71病毒A、B、C三种基因型病毒广泛中和的效果。

Description

EV71病毒广谱性单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域的病毒免疫学检测及技术领域，具体涉及一种可中和EV71病毒A、B、C三种基因型病毒的广谱性单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的细胞株、制备方法及该单克隆抗体的用途。

背景技术

近年来，手足口病已经成为越来越威胁国内儿童健康的广泛流行性疾病之一。手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。该病于1957年在新西兰首次报道。1958年分离出柯萨奇病毒，1959年提出手足口病名称。手足口病的早期病原体主要为Cox A16型，而1969年美国在中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出肠道病毒71(亦称为“EV71病毒”)，并被首次确认。此后EV71感染与Cox A16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统为主要临床特征的EV71流行，1975年保加利亚报告病例750例，其中149人致瘫，44人死亡。1994年在英国暴发了Cox A16引起的手足口病，患者大多为1-4岁婴幼儿。根据英国1963年以来的流行病学数据显示，手足口病流行的间隔期为2-3年。20世纪90年代后期，EV71引起的手足口病开始在东南亚地区流行，EV71感染常引起患者发生严重的中枢神经系统症状，死亡率较高。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病，其中，4-8月间共有2628人发病，4-6月间共有29例病人死亡。除此之外，1998-2001年手足口病在新加坡的流行以及2007年该病在中国的流行等均引起了大规模的疾病暴发。

近年，EV71在亚太地区的流行呈逐年上升趋势，国内1981年上海首次报道本病；此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、青海和广东等十几个省市均有报道。1983年天津暴发了Cox A16引起的手足口病，5-10月间发生了7,000余病例。经过2年低水平散发后，1986年再次暴发。1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71，1998年深圳市卫生防疫站从患者标本中分离出EV71。1998年台湾暴发了大规模的EV71疫情，估计发病人数达150万，其中重症405例，死亡78例，大多为5岁以下的幼儿。2000年80,677人发病，291例重症感染者，41人死亡；2001年389例重症感染者，55人死亡。2007年山东临沂、青岛和济南等地发生主要由EV71引起的手足口病流行，其中报告病例近4万，报告死亡病例14例。

EV71可引起严重的并发症。随着EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势，不断引起的中枢神经系统症状导致儿童死亡。我国尤其是南方地区一直存在EV71病毒的活动，人群尤其5岁以下人群EV71抗体阳性率普遍较低，与其他国家和地区(台湾)的研究结果类似，提示EV71病毒对人群尤其是幼儿的危害依然存在，一旦条件具备，将有可能发生暴发和流行。

由于无疫苗、药物等特异性的防控手段，该病存在隐性感染和轻症病例多，传染源难以发现和控制，儿童普遍易感，传播途径多，难以有效阻断等原因，预防控制EV71带来的手足口病难度较大。由于EV71引起的手足口病影响范围的广泛性、危害的严重性，该病在我国已纳入丙类传染病管理。因此，EV71病毒疫苗的抗原含量检测，保护性表位研究，治疗性单克隆抗体的制备，具有广泛的应用范围和社会需求。

EV71属于微小核糖核酸病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员。EV71病毒的基因组为7408核苷酸的单股正链RNA。该基因组仅含有一个开放阅读框(编码含有约2194个氨基酸的多聚蛋白)，其后为85个碱基的3’非编码区。所编码的多聚蛋白可进一步水解成P1，P2和P3三个前体蛋白，P1前体蛋白被进一步活化为1A(多肽VP1)、1B(多肽VP2)、1C(多肽VP3)和1D(多肽VP4)四个病毒结构蛋白；四种结构蛋白拼接成五聚体结构；五聚体形成亚单位结构，60个亚单位构成病毒粒子。P2和P 3前体蛋白主要编码7个非结构蛋白，编码蛋白水解酶及RNA聚合酶，P3区在进化过程中高度保守。VP1作为主要的衣壳蛋白，具有最多的型特异性中和位点，其基因序列与病毒血清型具有较高的相关性。

VP1蛋白是主要的病毒中和决定因子，负责病毒与靶细胞的结合，它直接决定病毒的抗原性。VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，以及由于其变异快速的特点，vp1基因成了基因分型的重要的对象。VP1起始于2438bp-3328bp(BrCr)，由891个核苷酸组成。1999年，Brown等根据1970～1998年分离于美国和其它5个国家的113株EV71的VP1全基因序列，将EV71分为A型、B型和C型3个基因型，其中A型仅有原型株，B型和C型又分为B1-B5以及C1-C5亚型。对于核苷酸序列，型内差异＜12％，型间差异为16.5％～19.7％。

鉴于EV71的危害性以及其多基因型或血清型的特点，有必要开发针对EV71病毒的具有广谱性中和活性的单克隆抗体。

发明内容

本发明人采用EV71全病毒颗粒作为抗原利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，然后通过EV71病毒A、B、C三基因型的间接ELISA法筛选并进行中和试验，获得了能分泌中和EV71三种基因型病毒并能特异性结合EV71病毒的细胞系及由所属细胞系产生的单克隆抗体。

因此，本发明一方面提供了一种对EV71病毒各种基因型均有高中和效价的杂交瘤细胞株。

对于本发明的上述杂交瘤细胞株，申请人于2009年3月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)对其进行了保藏，保藏号为CGMCC No.2937(所对应的本发明的编号为HD6)。

本发明的另一方面提供了由上述的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体，或其活性片段或其保守性突变体。进一步地，本发明的抗体可根据其抗原结合区域(例如重链和轻链可变区)发展出的各种衍生抗体，可以用于被动免疫治疗或者预防EV71病毒感染，如人源化抗体。

由于本发明的单克隆抗体对于EV71病毒A、B、C三种基因型均有高水平的中和效果，所以本发明提供了本发明的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体，或其任意组合在制备用于检测EV71病毒A、B、C三基因型的抗原的试剂、药剂或试剂盒中的应用。

本发明的再一方面提供了试剂、药剂或试剂盒，其包括本发明所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体，或其任意组合。所述试剂、药剂或试剂盒可用于检测EV71病毒抗原，从而可进一步用于诊断EV71病毒感染。

在本发明的又一方面，本发明的试剂、药剂或试剂盒优选包括标记的本发明的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体。

本发明的再一方面涉及一种用于治疗或预防EV71病毒感染的药物，所述药物包含本发明的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体。优选地，所述药物进一步包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明的又一方面涉及一种用于治疗和/或预防EV71病毒感染的方法，其中包括将本发明所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体施用于患者。

本发明还提供了用于检测EV71病毒抗原的方法，其中使用了本发明所述的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体，或标记的本发明的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体。优选的，采用双抗体夹心法进行检测EV71病毒抗原。

对于本发明所述的标记，其是指生物标记或化学标记。例如酶标记的或荧光标记的(例如荧光素标记)。优选地，所述酶标记为辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记。

对于本发明的用于预防或治疗目的的单克隆抗体，其优选是被人源化的。

本发明还提供了如下用途，即，本发明的单克隆抗体在制备用于预防或治疗EV71感染的人源化抗体中的用途。

优选地，本发明所述B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及优选地，C型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。

本发明还提供了EV71相关抗原、抗体的检测方法，其包括：

1、用于样本中针对EV71的IgG抗体的检测方法：将纯化病毒液吸附于固相载体上，再加入置于缓冲系统中的待检标本，再加入携带可检测标记物的识别所检测标本来源物种的IgG抗体的第二抗体，再通过检测所携带的标记物的存在推测标本中抗EV71抗体的存在或者多少。优选的所述可检测标记物为辣根过氧化物酶或荧光素标记。

2、用于样本中针对EV71的IgM抗体的检测方法：将纯化病毒液吸附于固相载体上，再加入置于缓冲系统中的待检标本，再加入携带可检测标记物的识别所检测标本来源物种的IgM抗体的第二抗体，再通过检测所携带的标记物的存在推测标本中抗EV71抗体的存在或者多少。优选的所述可检测标记物为辣根过氧化物酶或荧光标记物。

3、用于样本中针对EV71的IgM抗体的检测方法：将抗待检物种的IgM的抗体(抗抗体，抗IgM的抗体)吸附于固相载体上，再加入置于缓冲系统中的待检标本，再加入携带可检测标记物的识别所检测标本的酶标记抗原，再通过检测所携带的标记物的存在推测标本中抗EV71 IgM抗体的存在或者多少。优选的所述可检测标记物为辣根过氧化物酶或荧光素标记物。

附图说明

图1为本发明的单克隆抗体的针对A基因型的免疫电镜实验，其中：图1A表示直接电镜结果；图1B表示免疫电镜结果(均按1∶100,000放大)。

图2为本发明的单克隆抗体的针对B基因型的免疫电镜实验，其中：图2A表示直接电镜结果；图2B表示免疫电镜结果(均按1∶100,000放大)。

图3为本发明的单克隆抗体的针对C基因型的免疫电镜实验，其中：图3A表示直接电镜结果；图3B表示免疫电镜结果(均按1∶100,000放大)。

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。

实施例1：杂交瘤细胞系的获得、单克隆抗体的筛选及制备

1、单克隆抗体的制备

1.1、免疫原的制备

免疫原为EV71病毒，分别为1969年美国株(A基因型)与2007年山东株(C4基因型)。将病毒接种vero细胞，培养、收毒、灭活后采用50KD的超滤膜超滤浓缩，然后进行纯化、除菌过滤以制备纯化病毒液。

1.2、动物免疫：采用EV71病毒A型纯化病毒液进行BALB/c小鼠初次免疫，采用C基因型纯化病毒液加强免疫。免疫程序：首次免疫取EV71病毒A基因型原液与弗氏完全佐剂混合乳化，免疫BALB/c小鼠，150μg/只，皮下多点注射；间隔10天后进行第二次免疫：取EV71病毒C基因型纯化病毒液与弗氏不完全佐剂混合乳化，然后加强免疫上述小鼠，剂量同第一次；7天后采血，采用间接ELISA法测定抗体的抗EV71活性。对检测抗体效价最高的小鼠不加佐剂，用EV71病毒C基因型纯化病毒液进行腹腔加强免疫。

1.3、细胞融合：取免疫鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤按比例融合，铺96孔细胞培养板，采用HAT选择培养基培养杂交瘤细胞，第七天采用间接ELISA法检测细胞上清以筛选阳性细胞。间接法采用A、B、C三种基因型病毒纯化液分别单独包被，筛选同时呈阳性的细胞孔。间接ELISA法如下：将A、B、C三基因型EV71病毒纯化液包被酶标板，加入阳性血清对照、阴性血清对照，同时设置空白对照孔，37℃反应后洗涤酶标板，加入羊抗小鼠IgG-HRP；反应后洗涤酶标板，加入TMB显色液37℃显色10分钟，用2M H₂SO₄终止反应，仪器上读取OD450的吸光度。

结果，阳性血清对照的OD值为2.496，阴性血清对照的OD值为0.116，空白孔OD值为0.001。经过筛选，所获得的目的细胞株所对应的OD值如表1所示。

表1单克隆抗体细胞株筛选细胞上清OD值

原始孔编号	3F12	3D4	3H6	4A8	4A5
						A基因型纯化病毒液包被	0.982	0.631	0.54	0.574	0.478
B基因型纯化病毒液包被	0.779	0.610	0.476	0.565	0.522
						C基因型纯化病毒液包被	0.921	0.725	0.404	0.446	0.419

由此筛选出5个与EV71病毒A、B、C三基因型均有反应且OD值大于0.4的阳性孔。

1.4、克隆：采用有限稀释法对上述5细胞孔进行克隆。

1.5、检测：七天之后采用EV71病毒A、B、C三基因型病毒纯化液包被酶标板，检测克隆板内的细胞上清，发现仅3F12克隆板对EV71病毒A、B、C三基因型均仍为阳性，其余四株细胞转为阴性。

1.6、从3F12克隆板中挑选两个阳性孔B4，F11进行二次克隆化。

1.7、二次克隆化后的检测：同上述检测方法一样，采用间接ELISA法将第二次克隆的细胞上清进行针对EV71病毒A、B、C三基因型的阳性检测，选择单细胞阳性孔进行扩大培养。其中阳性细胞孔编号为：HN1、HN2、HN3、HC1、HD6，共5株。将上述单克隆抗体细胞株扩大培养，腹腔注射小鼠制备腹水。其中，腹水制备流程如下：培养杂交瘤细胞，收集后腹腔注射石蜡致敏的BALB/c小鼠，7-14天左右收集腹水，1200转/分钟离心，除去沉淀，收集上层单克隆抗体腹水。

2、单克隆抗体初步筛选：采用EV71病毒A、B、C基因型纯化病毒液1∶100稀释后分别包被酶标板，100ul/孔，包被过夜；用0.01MPBST-20(Tween200.5/1,000(V/V)终浓度)的洗液洗板3遍，加入10％小牛血清、0.01M PBST-20(Tween20 0.5/1,000(V/V)终浓度)溶液，200ul/孔，37℃封闭，弃去板中溶液。加入系列稀释的上述获得的上层单克隆抗体腹水，100ul/孔，其中，小鼠阴性血清为阴性对照；37℃孵育1小时，用上述洗液洗板，加入1∶10000稀释于10％小牛血清、0.01M PBST-20(Tween20 0.5/1,000(V/V)终浓度)的羊抗小鼠IgG-HRP，100ul/孔，37℃孵育1小时，洗板，加入100ul的TMB显色液，采用2M H₂SO₄终止反应，450nm处读数，筛选对于EV71病毒A、B、C三基因型均反应的单克隆抗体杂交瘤细胞。结果如下：

表2五株单克隆抗体对EV71病毒A基因型抗原间接法效价结果

表3五株单克隆抗体对EV71病毒B基因型抗原间接法效价结果

表4五株单克隆抗体对EV71病毒C基因型抗原间接法效价结果

EV71病毒A、B、C三基因型依次为1969年美国株A基因型、澳大利亚B3株、2008年安徽株C4基因型。结果显示：仅HN2、HN3、HC1、HD6四株单克隆抗体与上述三种抗原反应性均≥10⁵。筛选出上述4株单克隆抗体，该4株单克隆抗体对于EV71病毒A、B、C基因型均有较强的间接法活性。对上述筛选的4株单克隆抗体细胞株建株，液氮保存。

本实验采用EV71病毒A、B、C三基因型包被的间接ELISA初筛方法，节省了大量的工作量，减少了试剂消耗，节省了时间，免却了更多的生命体用于后期腹水制备试验。

实施例2：单克隆抗体中和效价检测与广谱中和抗体筛选

培养vero细胞；将实施例1中所获得的上层腹水由1∶8起始进行2倍系列稀释，每份样品平行稀释2孔。将稀释腹水分别与100CCID50/0.05ml病毒液(H01、H05、H06、H07或H08病毒)混匀，置36℃下CO₂培养箱中孵育后，每孔加入细胞悬液(细胞浓度控制在1.5-2.0×10⁵个/ml)100ul，置36℃下CO₂培养箱中培养，进行细胞病变观察。同时设立阴性血清对照、阳性血清对照、空白样品对照及正常细胞对照。根据病变观察结果确定待测单克隆抗体样品的中和抗体滴度。筛选对EV71病毒A、B、C三基因型均高效中和的单克隆抗体腹水及其对应细胞株。EV71单克隆抗体中和效价检测结果如下：

表5单克隆抗体腹水对A、B、C基因型EV71病毒中和实验结果

结果：

1、EV71病毒A、B、C三基因型的病毒回滴结果依次为：75、178、133、75、75，满足中和试验病毒回滴32-320的要求，试验成立。

2、HN2、HN3对于A、B、C三基因型，无中和活性；而HC1、HD6腹水对EV71病毒A、B、C三基因型，中国山东、安徽两个地区，2007年、2008年两年度病毒均有中和效果，说明其具有广谱性中和活性。

3、HC1、HD6单克隆抗体对EV71病毒A、B、C三基因型的中和效价＞768，大于公认的1∶8作为判断血清是否具有中和保护效果的标准，HC1、HD6单克隆抗体对于EV71病毒具有高效中和效果。

由于单克隆抗体所识别的完整病毒颗粒的表位能够与其结合，失去对细胞的感染能力，说明病毒所对应的表位位于EV71病毒的表面。

实施例3：HC1、HD6单克隆抗体与Cox A16病毒的交叉保护试验

进行如下实验步骤：培养vero细胞；将单克隆抗体腹水由1∶8起始进行2倍系列稀释，每份样品平行稀释2孔。将稀释血清分别与100CCID50/0.05ml Cox A16病毒液等体积混匀，置36℃ CO₂培养箱中孵育后，每孔加入细胞悬液(细胞浓度控制在1.5-2×10⁵个/ml)100ul，然后置于36℃下CO₂培养箱中培养，进行细胞病变观察。根据病变观察结果确定待测单克隆抗体对应该病毒的中和抗体滴度。

表7单克隆抗体腹水对CA16交叉保护实验结果

从上表可以看出，HC1、HD6腹水对CA16病毒无中和活性。

实施例4：HD6单克隆抗体免疫电镜试验

将实施例1获得的HD6的上层腹水与A、B、C基因型EV71纯化病毒液共同孵育后制备铜网，观察添加单克隆抗体前后EV71病毒分布状态的变化，用可视的方法证实抗体的病毒结合能力。实验流程：将EV71纯化病毒液与HD6单克隆抗体10∶1混合，室温放置2分钟，制备铜网，采用醋酸铀染色，放大100,000倍进行直接电镜观察。同时将未中和的EV71纯化病毒液直接制备铜网并经醋酸铀染色，同上进行电镜观察，结果如下图所示。EV71纯化病毒液A、B、C基因型的直接电镜结果显示：EV71病毒直径为27nm左右，以较分散的状态存在，无聚集趋势如图1A、2A、3A所示；HD6单克隆抗体与A、B、C基因型EV71纯化病毒液反应后进行电镜观察显示，EV71病毒均被单克隆抗体所包围，或者EV71病毒之间通过抗体桥连接到一起，如图1B、2B、3B所示。由此说明，抗EV71病毒HD6单克隆抗体具有与各型别EV71病毒结合的能力。

根据以上描述，本领域技术人员可以得出本发明具有如下优点或可应用的方面。

1、本发明的HD6单克隆抗体对EV71病毒A、B、C三基因型均具有较高的中和效价。

2、本发明的HD6单克隆抗体对EV71病毒A、B、C三基因型均具有较高的中和效价，说明EV71病毒A、B、C三基因型具有相同的表位。

3、本发明的HD6单克隆抗体对EV71病毒A、B、C三基因型均有较中和效价，提示该单克隆抗体可用于广谱EV71病毒检测与疫苗生产的抗原检测，同时检测的是病毒的抗原决定簇，能更加有效的反映疫苗的有效组分。

4、该HD6单克隆抗体对应的是EV71病毒中和表位，可用于EV71IgG抗体竞争法检测，用于疫苗免疫效果的评价，更加有效的评价疫苗的免疫效果。

5、本发明的HD6单克隆抗体对EV71病毒A、B、C三基因型均有较强的中和效果，提示该单克隆抗体可改造成EV71病毒A、B、C三基因型广谱治疗性单克隆抗体。

6、本发明的HD6单克隆抗体对于与EV71病毒高度同源的CoxA16无交叉保护性，HD6单抗是针对EV71的特异性单抗。

Claims

1.一种EV71病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCCNo.2937。

2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体。

3.一种用于检测EV71抗原或EV71的IgG或IgM的试剂盒、试剂或药剂，其包含权利要求2所述的单克隆抗体。

4.根据权利要求3的试剂盒、试剂或药剂，其中所述的EV71病毒选自A、B、C三种基因型的EV71病毒。

5.根据权利要求4的试剂盒、试剂或药剂，其中所述B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。

6.根据权利要求3、4或5所述的试剂盒、试剂或药剂，其所述的单克隆抗体是生物标记或化学标记的。

7.根据权利要求6所述的试剂盒、试剂或药剂，其中所述的标记是酶标记的或荧光标记的。

8.根据权利要求6所述的试剂盒、试剂或药剂，其中所述的标记是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记或是荧光素标记的。

9.权利要求2的单克隆抗体在制备用于检测EV71抗原或EV71的IgG或IgM的试剂盒、药剂或试剂或在制备用于预防或治疗EV71感染的人源化抗体中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述的EV71病毒选自A、B、C三种基因型的EV71病毒。

11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。

12.根据权利要求9、10或11所述的用途，其所述的单克隆抗体是生物标记或化学标记的。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述的标记是酶标记的或荧光标记的。

14.根据权利要求12所述的用途，其中所述的标记是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记的或荧光素标记的。