CN101717754B - 一种71型肠道病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株71型肠道病毒(简称EV71)及其应用。具体而言，本发明涉及一种通过蚀斑法分离的单克隆病毒株，其子代病毒表现为遗传稳定，可用于人用疫苗生产(尤其是婴幼儿疫苗生产)。本发明的病毒株或由其生产的疫苗可用于预防由EV71病毒引起的疾病(例如手足口病，尤其是儿童的手足口病)，且具有滴度稳定、免疫原性强、免疫剂量小的特点。

Description

一种71型肠道病毒及其应用

本发明涉及一株肠道病毒71型(以下简称EV71)及其应用。具体而言，本发明涉及一种通过蚀斑法分离的单克隆病毒株，其子代病毒表现为遗传稳定，可用于人用疫苗生产(尤其是婴幼儿疫苗生产)。本发明的病毒株或由其生产的疫苗可用于预防由EV71病毒引起的疾病(例如手足口病，尤其是儿童的手足口病)，且具有滴度稳定、免疫原性强、免疫剂量小的特点。

背景技术

EV71属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒A。该病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约24～30nm，核酸为单股正链RNA。EV71病毒的基因组RNA中仅有一个开放阅读框(ORF)，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白。如同其他肠道病毒属成员一样，EV71基因组编码分子量分别为34KD、30KD、26KD和7KD的多肽VP1、VP2、VP3、VP4。这些多肽组成原聚体，然后再拼装成具有五聚体样结构的亚单位。60个亚单位通过各自的结构域相互连接，最终形成病毒的外壳。VP1、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接，因而抗原决定簇基本上位于VP1-VP3上。EV71病毒由于没有类脂膜，所以它对乙醚、脱氧胆酸盐、去污剂以及弱酸有抵抗性。此外，该病毒还能抵抗70％乙醇和5％甲酚皂溶液等常见的消毒剂，但是高温(56℃，30min)处理和紫外线照射可以很快将病毒灭活，它对各种氧化剂如高锰酸钾、双氧水、漂白粉等也很敏感。

EV71病毒的衣壳蛋白中，VP1是该病毒主要的中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性。由于VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，VP1基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，并可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考。因此VP1基因成了EV71基因分型和遗传进化分析的最重要的对象。目前基于VP1核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B、C等三个基因型，其中A型仅包括原型株BrCr-CA-70；B型和C型又可进一步分为B1、B2、B3、B4以及C1、C2、C3和C4亚型。

人是EV71病毒唯一的自然宿主，主要的传染源为病人、健康携带者和隐性感染者。EV71的传染性强，传播途径复杂，流行强度大，传播快，在短时间内即可造成大流行。

EV71引起的疾病的流行一年四季均可出现，常见于夏秋季，且有周期流行特点(间隔2～4年)。下面简单介绍一下EV71引起的疾病的流行历史。

国际流行历史

1974年，Schmidt等首次从美国加利福尼亚一例脑炎患儿的粪便标本中分离到EV71，此后的几十年，EV71已经在世界范围内导致十几次规模不等的流行，尤其是最近十年在亚太地区的流行呈现上升趋势。

1975年，保加利亚发生EV71大流行，共有705名患儿受到感染，其中545例为无菌性脑膜炎，149例发生了急性松弛性瘫痪，68例出现延髓受损，死亡44例。低龄儿童是本次流行的主要对象，93％的病例和83.8％的死亡病例发生在5岁以下人群。但本次疫情未发现HFMD(手足口病)病例。

1978年，匈牙利发生EV71疫情，出现826例无菌性脑膜炎和724例脑炎病例，其中332例经病毒培养或血清学检验证实为EV71感染。所述病例中有严重神经系统损伤患者，包括13例脊髓灰质炎样麻痹、145例脑炎、161例脑膜炎，死亡45例。本次疫情发现4例HFMD病例。

1972～1973年和1978年，日本出现两次EV71大流行，但病情表现相对温和，除少数为脑炎、松弛性麻痹、无菌性脑膜炎外，主要为HFMD病例。其后，日本出现多起EV71的流行。1982年发生爆发流行，共计14万余例病例。1997年，日本出现EV71的局部流行。2000年日本再次出现EV71的流行。从1982年至2000年，只报道了零星的死亡和重症病例。

1997年，马来西亚出现EV71疫情，共报告病例5999例，主要临床表现为HFMD，39例出现急性脊髓灰质炎样麻痹或无菌性脑膜炎，死亡至少31例，死者平均年龄仅1.5岁，病程仅2天。

澳大利亚在历史上也多次出现EV71流行，1972-1973年、1986年和1999年澳大利亚均发生EV71流行。1999年，在澳大利亚西部的佩思，仅从3月到8月的大约6个月的时间里，超过6000例的HFMD病例，其中严重中枢神经系统症状病例为29例，包括脑干脑炎、急性松弛性瘫痪、肺水肿等。病原学检验显示该起疫情由EV71和CA16引起，两者引起病例的构成相近，但有神经系统损伤的都是EV71引起的，未发现致死性的神经性肺水肿病例。

2000年9-11月，新加坡报告HFMD病例3790例，大多数为4岁以下的儿童；分离的病原体主要为EV71；有3例HFMD病例和2例非HFMD病例死亡；尸检结果显示为脑炎、间质性肺炎和心肌炎。

2003年，越南爆发EV71疫情，导致26名小于3岁的幼儿死亡。2005年，越南胡志明市爆发HFMD疫情，导致764例儿童入院治疗和3例死亡。从411例患儿中分离到了病源体，其中173例患儿EV71阳性，有51例伴有急性神经系统症状。

我国流行历史

我国于1987年在湖北首次发现EV71感染，在这次HFMD流行期间，没有发现急性或迟缓性麻痹和无菌性脑膜炎病例。我国香港地区1987年也发生过EV71流行。1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71，1998年深圳市卫生防疫站也从手足口病患者标本中分离出EV71。

1998年我国台湾地区EV71大爆发，分别在6月和10月出现两个流行高峰，共发生129106例手足口病和疱疹性咽峡炎，其中405例为严重的中枢神经系统感染，78例死亡，死亡原因主要为由中枢神经系统感染而导致的肺水肿和出血，而且91％的死亡患儿小于5岁。2000年和2001年，台湾又出现两次EV71流行，规模较1998年小，分别有25人和26人死亡。

自1999年以来，我国广东、福建、上海、重庆等地区报告局部流行EV71，并发现EV71是我国南方地区HFMD的主要病原之一。

1999年5～9月，深圳南山区报道病例66例。从1999年至2004年，深圳市每年出现22～29例的小规模局部爆发，少数病人出现神经系统症状，无死亡病例。2004年3-7月，深圳市发生HFMD聚集性病例10起，共报告病例106例，年龄在3-6岁间，从59份患儿的咽拭子、粪便标本中检测出33份EV71型阳性标本，阳性率为56％。

2000年5～8月山东省招远市爆发EV71疫情，就诊患儿1698例，年龄最小5个月，最大14岁，3例合并爆发心肌炎死亡。

2000年苏州某幼儿园因新加坡生病儿童返回引起爆发。

2001年4月，北京昌平区某幼儿园发生一起手足口病爆发，患病率达6.65％。

2006年全国共报告手足口病13637例，死亡6例。除西藏自治区外，全国31个省、自治区、直辖市均有病例报告。

2007年全国共报告手足口病病例83344例，死亡17例。山东省报告病例39606例，北京、上海等也有手足口病病例报告。

2008年3月上旬，安徽省阜阳市几家医院陆续收治了多例以发热伴口腔、手足、臀部皮疹为主要临床表现的患儿，少数伴有脑、心、肺严重损害，因抢救无效死亡，引起社会各界的广泛关注。4月23日，经流行病学调查、临床诊断和实验室检测，确定为肠道病毒EV71感染。5月2日，我国将手足口病纳入丙类传染病管理。截至5月6日，各地报告病例数超过1000例的有；安徽6545例，死亡22例；广东3100例，死亡3例；北京1482例，无死亡；浙江1198例，死亡1例。

2008年3月1日至5月31日，阜阳共报告患者7470例，发病率89.35/10万；死亡23例，病死率0.31％。患者年龄为28天～30岁，高发年龄组为≤5岁组，发病7184例，占92.70％；男女性别比为1.86∶1；发病数以阜阳市三区(颖州、颖东、颖泉)最高，占阜阳市报告病例总数的53.57％，颍上县最低；最早发病时间为3月10日，4月初病例数逐渐上升，发病高峰为4月28日，当日达到518例，5月6日后迅速下降，至5月17日后，每日发病数降至100例以下。对161例患者的咽试子等标本进行EV71核酸检测，阳性97例(阳性率为60.25％)，在31例患者中分离到13株EV71病毒。

针对全球范围内的EV71的流行，而且因感染引起越来越重的中枢神经系统症状及较高的死亡率，已引起我国和全球许多国家和地区的关注。所以，急需研发一种疫苗来预防EV71的流行。

发明概述

针对目前手足口病的流行态势，为了更好的预防手足口病的暴发，本发明人经过长期不懈的努力，最终筛选出了具有良好功效的可用于预防、治疗或抵抗手足口病的病毒株。在此基础上，本发明的发明人开发了用于预防或治疗手足口病的疫苗或药剂。经实验证明，本发明的疫苗或药剂具有有效的免疫活性和/或攻毒保护能力，可以用于预防EV71病毒引起的儿童手足口病，且免疫剂量小，更适合于婴幼儿疫苗生产。

所以，本发明一方面提供了用于制备针对手足口病的疫苗或药物的病毒株，其为EV71的C4基因型。对于上述病毒株，申请人于2009年12月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)对其进行了保藏，保藏号为CGMCC No.3544。优选地，本发明所涉及的保藏毒株是分离的和/或纯化的。

进一步的，本发明提供了一种用于预防或治疗手足口病的疫苗或药剂，其包含上述所保藏的病毒株。

再一方面，本发明还提供了一种制备针对手足口病疫苗或药剂的方法，其包括使用上述保藏的病毒株。

再另一方面，本发明还提供了上述保藏的病毒株在制备预防或治疗手足口病的疫苗或药剂(例如本发明所述的疫苗或药剂)中的用途。

再另一方面，本发明提供了一种制备针对手足口病的抗体(例如，多克隆抗体或单克隆抗体，或其功能性片段)或杂交瘤细胞或抗血清的方法，其中以本发明所述的毒株、疫苗或药剂为免疫原。本发明还提供了根据该方法所制备的抗体(例如，多克隆抗体或单克隆抗体，或其功能性片段)或杂交瘤细胞或抗血清。

再另一方面，本发明提供了制备预防或治疗手足口病的疫苗或药剂的方法，其包括使用上述保藏的病毒株。

当然，本领域的技术人员明白，本发明的疫苗或药剂可进一步包含其他病毒株，如肠道病毒72型和/或佐剂。

优选地，本发明各实施方式或技术方案中所包含的病毒株为经过灭活的和/或经过纯化的(灭活也可以在纯化以后进行)。进一步优选地，所述灭活是通过β-丙内脂和/或者甲醛来实现的。对于本发明所述的纯化，其可通过澄清过滤、超滤浓缩、离心、和/或层析等进行。

具体而言，本发明中的单价或者还含有其它病毒株的联合疫苗或药剂可以不添加佐剂或可以添加佐剂。“佐剂”是用于增强本发明的病毒的免疫原性的物质，且给予佐剂可以加强免疫应答。另一方面，佐剂对本技术人员而言是公知的。具体地，用于增强病毒的有效性的合适的佐剂包括，但不限于：1)铝盐，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝，等等；2)水包油乳液制剂，如MF59(PCT公布号WO90/14837)，SAF，Ribi^TM佐剂系统(RAS)；3)皂苷佐剂，如ISCOMs，细菌脂多糖，合成的脂类A类似物，如氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)，或者其衍生物或类似物；4)细胞因子，如白介素，干扰素，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，肿瘤坏死因子，等等；和5)作为免疫刺激剂以增强组合物的有效性的其他物质等。

本发明的疫苗或药剂可以用于保护或者治疗对EV71感染敏感的受试者(优选是哺乳动物，更优选是人)，这可通过全身或者粘膜途径施用疫苗或药剂来完成。这些施用可以包括通过肌内、腹膜内、皮内或者皮下途径注射，或者通过粘膜施用于口/消化道、呼吸或者泌尿生殖道。施用剂量依个体体重而定，例如可为0.02-0.03微克/Kg体重或可为0.12微克/Kg，施用次数可为单次或间隔1-6个月加强一次。

当然，本领域技术人员应当明白，根据本发明所保藏的毒株为免疫原(例如本发明所述的疫苗)所制备的抗体(例如，多克隆抗体或单克隆抗体，或其功能性片段)或杂交瘤细胞也是属于本发明的保护范围的，因为这对本领域技术人员而言是显而易见或在无需花费创造性劳动的情况下就可以实施的。

对于本发明的疫苗或药剂，可通过以下方法制备，所述方法包括如下步骤：将保藏的毒株接种至培养的细胞(例如RD细胞、Vero细胞或人胚肺二倍体细胞)后，继续培养接种后的细胞从而经过灭活和纯化(或先纯化后灭活)后获得疫苗原液。可以向该疫苗原液加入佐剂或不加入佐剂，从而获得针对手足口病的单价疫苗或药剂。

具体的，对于本发明的疫苗或药剂可通过以下方法制备，所述方法包括：对于从工作细胞库中取出细胞(例如RD细胞、vero细胞和人胚肺二倍体细胞)进行复苏；对复苏后的细胞进行扩大培养(例如，可以采用转瓶、细胞工厂、发酵罐等方式)；在细胞扩大培养至一定的细胞量后(本领域技术人员可以根据实际需要来进行确定合适的细胞量，例如培养至完全汇合)，按照一定的比例(例如0.00001-10MOI的病毒浓度)接种病毒，然后继续培养(例如在30-40℃下培养2-10日)；在无菌的条件下、收获培养后的单价病毒液；对收获的单价病毒液进行灭活(例如通过加入适量β-丙内脂或者甲醛)和纯化。其中，灭活也可以在纯化以后进行。对于本发明所述的纯化，其可通过澄清过滤、超滤浓缩、离心、和/或层析等进行。

附图说明

图1：病毒中和抗体测定的操作步骤中的版式设计。

图2：EV71滴度随代次变化趋势。

图3：EV71抗原含量随代次变化趋势。

图4：不同剂量免疫大鼠的动态免疫原性分析结果。

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。

实施例

实施例1：Vero细胞(ATCC CCL81)的培养

细胞复苏方法：将细胞种子从液氮中取出，2000rpm离心5min，用复苏液(含20％小牛血清MEM培养基)重悬细胞。将重悬的细胞以约1.0×10⁵细胞/CM²的量接种于空的细胞培养瓶中，并在37℃下培养过夜(约16hr)。然后，更换生长液(含有5％小牛血清的MEM培养基)，继续培养细胞至单层然后传代。

细胞传代方法如下：将单层细胞用消化液(0.25％胰蛋白酶(含0.03％EDTA))消化，按照1∶5的分种率接种(细胞数约为1.5-2.0×10⁵)，37℃培养2天后用于病毒传代，37℃培养4天后用于细胞传代培养。细胞生长过程中将pH控制在7.2-7.4。

实施例2：病毒培养

在2008年的手足口病疫区(安徽阜阳)，采集经临床确诊的典型手足口患者的咽拭子标本，立即置-20℃冻存，运至实验室，用于分离EV71病毒。

将咽拭子在标本保存液中充分搅动(至少40下)，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞，然后在4℃条件下，10000rpm离心20min，用0.22um滤器过滤除菌后将其接种到上述实施例1中培养2天的Vero细胞接种病毒，细胞密度达到约80％。当细胞病变(CPE)达到+++时(1+，＜25％；2+，25％-50％；3+，50％-75％；4+，75％-100％)，收获培养物，-20℃冷冻，然后室温融化处理，从而破坏细胞使病毒颗粒从细胞中释放出来。之后，收获病毒颗粒，并以冻融物为毒种进行传代。第1、2、3、4代按照1∶30体积比接种；其他代次按照1∶100体积比接种。在病毒培养过程中，维持液为不含抗生素但含有2％小牛血清的MEM培养基，其适用于所有代次病毒的传代。

实施例3：蚀斑纯化

将实施例2中所获得的病毒种子稀释至10CCID₅₀。然后将该稀释后的病毒种子接种至长满Vero细胞的6孔板上，以进行蚀斑纯化。

具体而言，使用PBS冲洗细胞板2次，每孔接种病毒1.0ml，35℃吸附120min，每隔30min轻摇6孔板一次，再用PBS洗板2次；将A液和B液等体积混合配制营养琼脂，温度控制在45℃左右，然后在6孔板中加入营养琼脂，每孔添加3.0ml。接着，将6孔板置于35℃、5％CO₂孵箱中培养96hr。

然后，将A液和C液等体积混合，温度控制在45℃左右，在每孔中加入3.0ml染色，再将6孔板置于35℃、5％CO₂孵箱中培养96hr。将6孔板倒置可观察到培养板底面上出现白色斑点，将单个的呈圆形的斑点用记号笔圈出，做好标记，打开细胞板用吸管将标记的斑点上方的营养琼脂吸出，接种于另一块6孔板(板中事先加入含2％牛血清的MEM培养基)。当CPE至++++时，收获培养物悬液，冻融一次，然后如实施例2所示，在Vero细胞上进行3次传代扩增，以建立病毒库。将病毒传至病毒滴度稳定、抗原含量稳定、免疫原性稳定后，建立病毒种子库，并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏号为CGMCC No.3544。所建立的病毒种子库保存于-70℃冰箱中备用。

A液配方：

B液配方：

C液配方：

实施例4：病毒滴度的测定

以不含血清的MEM维持液作为病毒稀释液，将实施例3中获得的病毒种子进行10倍连续稀释，将稀释的毒种接种于长满单层细胞的96孔板中(细胞数为约10⁶细胞/孔)，加入含有2％血清的MEM培养基，37℃培养7天，显微镜下观察细胞CPE，以使96孔板中50％以上呈现典型CPE现象时的最低病毒稀释度作为其病毒滴度(CCID₅₀)。本发明通过如下公式对病毒滴度进行计算：LogCCID₅₀＝L-d(s-0.5)，其中，L＝病毒滴定时的最低稀释度；d＝稀释度的间距；以及s＝被感染细胞比例之和。

结果：种子库(第7代)病毒滴度：

病变孔数(≥+++)：10^-1(8孔)，10^-2(8孔)，10^-3(8孔)，10^-4(8孔)，10^-5(5孔)，10^-6(3孔)，10^-7(0孔)，10^-8(0孔)，10^-9(0孔)，10^-10(0孔)；

logCCID₅₀＝-1-1(8/8+8/8+8/8+8/8+5/8+3/8-0.5)＝-5.5

病毒滴度为：10^5.5CCID₅₀/0.1ml

将连续传代的各个代次的病毒种子按照上述方法测定其病毒滴度，绘制病毒滴度变化曲线，结果见图2。

实施例5：抗原含量测定

采用EV71抗原的双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)，检测实施例3中获得的病毒种子的EV71抗原含量。

a)兔抗EV71多抗包被物的制备、鉴定与纯化

免疫原：EV71山东株是2007年在山东分离的病毒，其属于C4基因型，该株EV71病毒与本发明的病毒同属一个亚型，但流行时间和区域不同，且经测定其VP1基因序列与本发明的序列不同。选择另一个毒株作为免疫原符合一般的试验原则。

免疫原制备：将病毒接种Vero细胞，培养后收获病毒，灭活后进行超滤浓缩、病毒沉淀、密度梯度离心、脱糖、除菌过滤制备EV71疫苗原液，BCA法检测其蛋白浓度，结果：179ug/ml。

兔抗EV71多抗血清制备：将上述EV71疫苗原液与等体积的弗氏完全佐剂混合并充分乳化，免疫新西兰大白兔2只，6ml/只，颈部与背部皮下多点与大腿内侧肌肉免疫；两周后用弗氏不完全佐剂与等体积EV71疫苗原液充分乳化，背部皮下多点免疫兔子，4ml/只；以后每周同第二此免疫一次，再加强免疫3次。最后一次免疫后一周采血，4℃离心，收集全部血清，分别约为60ml，35ml。封装后于-20℃下冻存。

b)单克隆抗体

本文此处所用的单克隆来源于专利发明名称为“EV71病毒广谱性单克隆抗体及其应用”、申请号为200910131558.2中所述的单克隆抗体。

c)采用经典过碘酸钠法对纯化单抗进行HRP标记，标记后加等体积甘油分装2ml/只，5支，-20℃放置。

d)方法建立：抗原含量在80-5U/ml时，OD值≥阴性对照×2.1(阴性对照＜0.050时，按0.05计算，为0.105)。因此该方法的检测灵敏度为5U/ml。抗原含量在80-5U/ml时，连续5点线性≥0.99。因此，该方法的检测灵敏度为5U/ml，检测线性范围为80-5U/ml。

e)EV71抗原检测：检测传代的病毒样品，绘制曲线。

结果：将实施例3中的病毒种子在Vero细胞上传至15代，各代次毒种抗原含量变化趋势见图3。由图中结果看见，本发明的病毒株在蚀斑克隆后连续传15代，抗原含量稳定，说明病毒在Vero细胞上传代是稳定的。

实施例6：中和抗体检测

a)中和实验方法：病毒感染敏感细胞后，引起细胞形态学变化，出现致细胞病变效应(CPE)，特异性中和抗体与病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制CPE的出现。

液体配制

A液：血清处理液：(100ml中含下列液体)

MEM                      95ml

3％L-谷氨酰胺            1ml

7.5％碳酸氢钠            2ml

牛血清                   2ml

B液：细胞营养液：(按生长液配方配制，100ml中含下列液体)

MEM                      86ml

3％L-谷氨酰胺            1ml

7.5％碳酸氢钠            2ml

HEPES                    1ml

牛血清                   10ml

C液：病毒(血清)稀释液：(按维持液配方配制，100ml中含下列液体)

MEM                      94ml

3％L-谷氨酰胺            1ml

7.5％碳酸氢钠            2ml

HEPES                    1ml

牛血清                   2ml

b)攻击病毒CCID₅₀滴定和滴度梯度制备

(1)在实施例3中获得的病毒种子增殖后，将增殖的病毒悬液冻融3次，然后在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清液分装于2支冻存管中，每管1.5ml；

(2)加MEM液10倍系列稀释为10^-1至10^-8病毒液，各加入细胞板内，每孔50μl，每稀释度4孔细胞；

(3)每孔加vero细胞悬液50μl，同时设细胞对照(50μl稀释液+50μl细胞悬液)，36℃培养7d，观察细胞病变；

(4)按Behrens-

公式计算出分离病毒株的CCID₅₀：

log CCID₅₀＝L-d(S-0.5)

(其中：L＝实验中使用的最低稀释度的log值；d＝稀释梯度的log值；S＝终判时阳性部分的总和(即出现CPE的细胞孔所占的比例之和))；

(5)按照上述方法滴定病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100CCID₅₀的病毒载量；

(6)按照计算好的稀释比例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量(即100CCID₅₀/0.05ml)；

(7)取3支小试管，每只加病毒稀释液(液体配制中的C液)0.9ml；

(8)用带滤芯的吸尖(ART吸尖)吸0.1ml已经稀释好的攻击病毒液到第一支小试管中(即10CCID₅₀/0.05ml)，换另一支ART吸尖，轻轻并彻底地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至1CCID₅₀/0.05ml和0.1CCID₅₀/0.05ml。

c)稀释待检血清

(1)待检血清-20℃冻存备检。

(2)取无菌小试管若干支(每份血清使用一支)置试管架上，每管加血清处理液(上面液体配制中的A液)0.3ml，加待测血清0.1ml，盖紧塞子，震摇混匀，放4℃冰箱过夜，即为1∶4稀释血清。次日56℃、30min灭活。

(3)打开独立无菌包装48孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液(上面液体配制中的C液)0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器取处理过的血清0.1ml加入第一孔(即为1∶16)，吹吸8-10次，吸0.1ml加入第二孔(即为1∶64)，依次至1∶1024，血清稀释的过程中不必换吸尖。即每份血清标本进行4倍倍比稀释，即1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1024。

(4)每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。

d)病毒中和抗体测定的操作步骤：

(1)取一块96孔板横向使用，每块板可以做8份(4对)待测血清，版面设计如图1所示。A1-A2孔(B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2)中每孔加入1∶1024稀释度的待测血清0.05ml，不必换吸尖，在A3-A4孔(B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4)中每孔加入1∶256稀释度的待测血清0.05ml，A5-A6孔(B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5F6、G5-G6、H5-H6)中每孔加入1∶64稀释度的待测血清0.05ml，A7-A8孔(B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8)中每孔加入1∶16稀释度的待测血清0.05ml，A9-A10孔(B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10)中每孔加入1∶4稀释度的待测血清0.05ml，A11-A12孔(B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12)为每份待测血清对照孔，每孔中补加稀释液0.05ml；

(2)上述孔中分别加入病毒0.05ml(病毒滴度事先已经稀释为100CCID₅₀/0.05ml)；

(3)盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入36℃CO₂孵箱中孵育2h；

(4)另取一块96孔板纵向使用，做100CCID₅₀/0.05ml病毒滴度的核实(每次实验都必须做)。每孔先加病毒稀释液(试剂配制中的C液)0.05ml，然后从0.1CCID₅₀/0.05ml加起，每孔0.05ml，每个稀释度8孔，不必更换吸尖，一直加至100CCID₅₀/0.05ml；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液，然后放入4℃冰箱中暂存；

(5)在孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为2×10⁵个/ml，每块96孔板至少需要准备10ml；

(6)孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔(待检标本板)和病毒回滴孔和细胞对照孔(病毒回滴板)分别加入0.1ml细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入36℃CO₂孵箱中孵育培养；

(7)使用倒置显微镜每天观察CPE，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当100CCID₅₀/0.05ml的病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果(约5-7d)；

(8)注意：如果病毒对照结果(病毒回滴)不在32-320CCID₅₀/0.05ml的范围内，实验无效，就要重复实验。

d)结果判定：

当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。

将含铝佐剂的疫苗免疫大鼠，剂量分别为6.25U/ml、25U/ml、100U/ml和400U/ml，免疫后累计观察6周，每周测定其中和抗体，结果见图4。由图4可见，随着剂量提高中和抗体效价相应提高，存在明确的量效关系。

实施例7：疫苗制备

将实施例3中获得的病毒种子接种Vero细胞工厂，采用无血清的MEM培养基，33℃培养5-7天进行收获病毒。用终浓度1∶2000甲醛溶液进行灭活，在36.5℃灭活4天。经纯化超滤浓缩，离心纯化后配制疫苗原液，抗原含量200U/0.5ml，蛋白含量为1-5ug/ml。

实施例8：疫苗免疫原性分析

将按照上述实施例7的方法制备的疫苗抗原免疫Wistar大鼠，做不同免疫剂量的动态免疫原性分析，疫苗抗原含量为800U/ml，与等体积的铝佐剂混合配制剂量为400、100、25、6.255U/ml的疫苗原液。免疫程序：1针肌注，0.5ml/只，1-6周分别采血，分离血清，检测中和抗体。

在实验过程中，大鼠共分5组，每组5只，对照为铝佐剂。

中和抗体测定方案如下：

血清按照1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320稀释；阳性对照：兔多抗血清；阴性对照：兔阴性血清。

结果表明：疫苗的量效关系显著，随着剂量提高，中和效价随之提高，Al-400U和Al-100U组的中和抗体效价大于1∶40，达到了保护性抗体水平。

在说明书、权利要求和/或附图中描述的本发明的特性可以单独地或组合地成为用于以其各种形式实现本发明的目的。

Claims (25)

1.一种病毒株，其保藏号为CGMCC No.3544。

2.用于预防或治疗手足口病的疫苗或药剂，其包含权利要求1的病毒株。

3.权利要求2中所述的疫苗或药剂，其中所述的病毒株是经过灭活和纯化的。

4.权利要求3所述的疫苗或药剂，其中所述灭活是通过β-丙内脂和/或者甲醛来灭活的。

5.根据权利要求3所述的疫苗或药剂，其中所述纯化是通过澄清过滤、超滤浓缩、离心、和/或层析来进行的。

6.权利要求2或3的疫苗或药剂，其中所述的疫苗或药剂还含有佐剂。

7.权利要求6的疫苗或药剂，其中所述的佐剂为氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。

8.权利要求1的病毒株在制备预防或治疗手足口病的疫苗或药剂中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述的疫苗或药剂是权利要求2-7中任一项所述的疫苗或药剂。

10.一种制备抗体的方法，其中以权利要求1中所述的病毒株为免疫原。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述的抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

12.根据权利要求10或11的方法，其中所述的免疫原为权利要求2-7中任一项所述的疫苗或药剂。

13.一种制备杂交瘤细胞的方法，其中以权利要求1中所述的病毒株为免疫原。

14.根据权利要求13的方法，其中所述的免疫原为权利要求2-7中任一项所述的疫苗或药剂。

15.一种制备抗血清的方法，其中以权利要求1中所述的病毒株为免疫原。

16.根据权利要求15的方法，其中所述的免疫原为权利要求2-7中任一项所述的疫苗或药剂。

17.通过权利要求1中所述的病毒株为免疫原所制备的抗体。

18.根据权利要求17所述的抗体，其中所述的抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

19.根据权利要求17所述的抗体，其中所述免疫原为权利要求2-7中任一项所述的疫苗或药剂。

20.通过权利要求1中所述的病毒株为免疫原所制备的杂交瘤细胞。

21.根据权利要求20所述的杂交瘤细胞，其中所述免疫原为权利要求2-7中任一项所述的疫苗或药剂。

22.通过权利要求1中所述的病毒株为免疫原所制备的抗血清。

23.根据权利要求22所述的抗血清，其中所述免疫原为权利要求2-7中任一项所述的疫苗或药剂。

24.制备预防或治疗手足口病的疫苗或药剂的方法，其包括使用权利要求1中所述的病毒株或权利要求2-7中任一项所述的疫苗或药剂。

25.权利要求24中所述的方法，其中所述的权利要求1的病毒株是经过灭活和纯化的。

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