CN101948815B

CN101948815B - Ev-71型病毒蚀斑纯化方法

Info

Publication number: CN101948815B
Application number: CN 201010229519
Authority: CN
Inventors: 常国辉; 吴晓燕; 林磊; 罗彦军; 户义; 李靖; 杨银辉; 康晓平; 祝庆余
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2010-07-12
Filing date: 2010-07-12
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2030-07-12
Also published as: CN101948815A

Abstract

本发明公开了一种EV-71型病毒蚀斑纯化的方法。该方法包括下述步骤：1)制备单层vero细胞，加入含病毒的样品液，吸附1小时；2)将吸附后的细胞表面覆盖一层MEM固体培养基培养至病毒蚀斑出现；3)挑取病毒蚀斑获得病毒液。本发明的方法用病毒样品吸附Vero细胞单层，覆盖MEM细胞固体培养基，3-5天可以看到明显的蚀斑形成，实验证明，经过3轮蚀斑纯化和扩增后，RT-PCR检测和测序表明已经得到纯化的病毒株。

Description

EV-71型病毒蚀斑纯化方法

技术领域

本发明涉及一种EV-71型病毒蚀斑纯化的方法。

背景技术

目前也有蚀斑纯化技术方法的报道，首先将不同稀释度数的病毒液接种于培养器皿中，吸附1-4小时后，吸弃吸附后的病毒液并用维持液洗去残余的病毒液，加第一营养覆盖层待凝固后翻面培养数天后加入第二层覆盖层，凝固后同样翻面避光培养1-2天即可观察蚀斑的形成。但是这种纯化方法可能会造成病毒由蚀斑扩散至琼脂表明，从而污染同一培养物内的其它蚀斑，这是由于当病毒繁殖后再加入中性红溶液或者第二层琼脂时，就将病毒分散于琼脂表面，而且中性红燃料的存在会抑制病毒蚀斑的形成并破坏宿主细胞。这种纯化方法较为复杂，蚀斑形成所需时间较长，所需的实验周期也较长。而且已报道的蚀斑纯化技术在纯化病毒方面得到广泛的应用，但用原有方法中的低熔点琼脂糖来纯化EV-71病毒的结果不是很理想。

手足口病(Hand-Foot-mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病，近年来多爆发于亚太地区的热带区域，以婴幼儿发病为主。引起手足口病的肠道病毒包括肠道病毒EV71型(肠道病毒71，Enterovirus 71，简称EV-71)和A组的柯萨奇病毒(CoxA)、埃克病毒(Echo)等。其中EV-71是引起手足口病的主要病原，常导致严重的神经系统综合症。EV-71是单股正链RNA病毒，分为A、B、C3个基因型，B1-B4及C1-C4共8个亚型。

该病以前虽有报道但多以散发病例出现，而09年在我国的安徽、河南和河北多个地区呈爆发流行，对婴幼儿健康造成了严重的危害。因此，纯化该病毒，并研究该病毒，了解该病毒的特性对该疾病的预防和治疗具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定易操作的病毒蚀斑纯化的方法。

本发明所提供的一种EV-71型病毒蚀斑纯化方法，包括下述步骤：

1)制备单层vero细胞，加入含病毒的样品液，吸附1-2小时；

2)将吸附后的细胞表面覆盖一层培养哺乳动物细胞用固体培养基培养至病毒蚀斑出现；

3)挑取病毒蚀斑获得病毒液。

所述方法中，所述培养哺乳动物细胞用固体培养基为哺乳动物细胞培养用培养液添加结冷胶获得的固体培养基，所述结冷胶为：SIGMA公司生产的Gelrite Gellan Gum。

所述培养哺乳动物细胞用培养液为含有MEM培养基成分的培养液。

所述培养哺乳动物细胞用培养液所述培养哺乳动物细胞用培养液由基础培养液和如下终浓度的物质组成：胎牛血清体积百分比1％，2M HEPES 10mL/L，L-谷氨酰胺2mmol/L，100×NEAA 10mL/L，青霉素50U/ml，链霉素50U/ml，质量百分含量为7.5％的NaHCO₃溶液25mL/L；所述基础培养基为MEM培养液。所述终浓度是在培养哺乳动物细胞用培养液中的终浓度。

注：一般市售的青霉素为80万U/瓶，将其溶解于4ml灭菌去离子水中，每升培养液中加入0.5ml，其最终浓度为100U/ml；市售的链霉素为100万U/瓶，将其溶解于5ml灭菌去离子水中，每升培养液中加入0.5ml，其最终浓度为100U/ml。下面的相同。

所述培养哺乳动物细胞用固体培养基中SIGMA公司生产的Gelrite Gellan Gum的添加量为1.25g/L。

所述方法步骤1)中，所述的吸附条件：37℃ 5％CO₂，95％空气，99％湿度，一个大气压，所述百分含量均为体积百分含量。

所述方法步骤2)中，所述的培养条件：37℃ 5％CO₂，95％空气，99％湿度，一个大气压，所述百分含量均为体积百分含量。

所述方法步骤3)中，所述挑取蚀斑的方法是用微量移液器插取无菌的微量吸管，吸取含有2％(体积百分比)胎牛血清的细胞维持液放入无菌的冻存管中，之后用该微量吸管插入蚀斑部位，垂直吹打后吸出放入上述冻存管中再吸取冻存管中含有病毒的液体插入上述蚀斑部位反复吹打，吸出即为病毒液。

所述方法步骤3)中，还包括将获得的病毒液冻融3次作为待纯化样品再重复步骤1)-步骤3)2次，获得进一步纯化的病毒液。

所述EV-71型病毒为肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)肠道病毒EV71型河南分离株2CGMCC №.3675或肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)肠道病毒EV71型重庆分离株1CGMCC №.3674。

所述待纯化的样品液为采集的临床手足口病患者血清、粪便、咽拭子或肛拭子用含体积百分比为0.2％的牛血清白蛋白、100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素，pH7.2、0.01M/L的PBS溶液洗涤获得的液体，过滤灭菌后接种于Vero细胞，当细胞病变达到95％时，收获细胞-70℃冻融3次，获得的病毒液。所述含体积百分比为0.2％的牛血清白蛋白、100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素，pH7.2、0.01M/L的PBS溶液是将pH7.2、0.01M/L的PBS溶液中添加体积百分比为0.2％的牛血清白蛋白、100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素获得的，添加的浓度时在PBS溶液中的总浓度。

本发明的方法用病毒样品吸附Vero细胞单层，覆盖MEM细胞固体培养基，3-4天可以看到明显的蚀斑形成，实验证明，经过3轮蚀斑纯化和扩增后，RT-PCR检测和测序表明已经得到纯化的病毒株。本发明的方法具有稳定、易操作的优点，为纯化EV-71病毒提供了一种简单可行的方法。本发明的蚀斑纯化方法在病毒纯化方面具有良好的应用前景，不仅可以快速准确的纯化EV71病毒，而且经初步实验表明，该方法还可以广泛的应用于多种病毒的纯化。

附图说明

图1是EV-71型病毒河南分离株2第3次蚀斑纯化时挑取单斑的照片；

图2是EV-71型病毒重庆分离株1第3次蚀斑纯化时挑取单斑的照片；

图3为Vero细胞阴性对照照片，可以观察到细胞生长状态良好；

图4为病毒样品PCR检测结果。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、EV-71蚀斑形成方法的建立

1、材料和方法

1)细胞：Vero细胞株(购自Invitrogen公司)，按照常规方法传代培养，取48h内长成的单层细胞用于实验。

2)待纯化样品：

从河南省采集手足口病患者临床粪便样本3份、从安徽省采集手足口病患者临床咽拭子样本1份和从重庆市采集手足口病患者临床肛拭子样本3份，粪便样本分别溶于无菌的pH7.2、0.01M/L的PBS溶液(内含2.5ug/ml的两性霉素B或者40ug/ml的制霉菌素)中，充分混匀后离心，上清通过0.22um的滤膜后直接接种于Vero单层细胞；咽拭子和肛拭子样本采集后将棉拭子折断后放入装有2ml含0.2％(体积百分比)的牛血清白蛋白、100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素，pH7.2、0.01M/L的PBS溶液的无菌小瓶中，之后通过机械震荡使材料从拭子上洗下，液体通过0.22um的滤膜后直接接种于Vero单层细胞，当细胞病变达到95％左右的收获细胞，-70℃冻融3次之后保存备用。

3)试剂和培养基：

含有10％(体积百分比)胎牛血清的营养液的配制方法：500ml DMEM液、50ml胎牛血清、100U的青霉素、100U的链霉素，5ml 100XNEAA(非必需氨基酸)、100ul1M/L HEPES，之后用实验室配制的经过0.22um滤膜过滤除菌的7.5％NaHCO₃(质量百分比)调节溶液的pH值至7.0-7.2，上述DMEM液、胎牛血清、青霉素、链霉素，100XNEAA(非必需氨基酸)、HEPES均为GIBCO公司产品。

含有2％(体积百分比)胎牛血清的细胞维持液的配制方法：500ml DMEM液、10ml胎牛血清、100U青霉素、100U链霉素，5ml 100X NEAA(非必需氨基酸)和100ul 1M/L HEPES混匀，之后用实验室配置的经过过滤除菌的7.5％NaHCO₃(质量百分比)调节溶液的pH值为7.0-7.2；上述DMEM、胎牛血清、青霉素、链霉素，100XNEAA(非必需氨基酸)、HEPES均为GIBCO公司产品。注：一般市售的青霉素为80万U/瓶，将其溶解于4ml灭菌去离子水中，每升培养液中加入0.5ml，其最终浓度为100U/ml；市售的链霉素为100万U/瓶，将其溶解于5ml灭菌去离子水中，每升培养液中加入0.5ml，其最终浓度为100U/ml。

2×MEM培养基的配制方法：10×MEM(Invitrogen公司)200mL，去离子水800mL，2M HEPES 20mL，200mmol/l L-Glutamine(L-谷氨酰胺)20mL，100×NEAA(非必需氨基酸)20mL，100U/ml的青霉素，100U/ml的链霉素，7.5％(质量百分浓度)NaHCO₃ 50mL充分混匀后用0.22um滤膜过滤除菌，分装后4℃保存。100XNEAA(非必需氨基酸)、HEPES、青霉素、链霉素抗生素购自GIBCO公司。

2、蚀斑纯化病毒的方法

1)细胞单层的制备

将75cm²方瓶内长成单层的Vero细胞(Invitrogen公司)先用pH7.2、0.01M/L的无菌PBS溶液洗3次后吸出，加入0.25％(质量百分比)的胰蛋白酶消化后吸出消化液，用80ml含有10％(体积百分比)胎牛血清的营养液悬浮细胞制成悬液，按照3ml/孔接种于6孔板(6孔板属于细胞培养中常见的实验耗材，其面积为10cm²)中，37℃5％CO₂培养箱培养，待细胞长成单层时做蚀斑纯化的实验。

2)病毒的稀释和感染

用含有2％(体积百分比)胎牛血清的细胞维持液将步骤1中的步骤2)所准备的病毒培养上清液做10倍连续稀释，放置备用。之后吸去6孔板中的原有细胞培养液，每孔分别加入1ml上述病毒稀释液，每一个稀释度做2个孔，放置CO₂培养箱中在37℃、5％(体积含量)CO₂，95％(体积含量)空气，99％湿度；一个大气压的条件下吸附1小时，中间轻轻摇晃一次。

3)覆盖培养基培养形成蚀斑

待步骤2)中病毒吸附步骤剩余20分钟的时候，准备好2个50ml无菌的离心管，分别盛有20ml含有2％(体积百分比)胎牛血清的2×MEM培养基和20ml 2.5g/L的Gelrite结冷胶溶液放入56℃水浴锅中预热，病毒吸附1小时后，吸去6孔板中的病毒液，用无菌的PBS溶液(pH7.2，0.01M/L)洗细胞2次，之后快速混匀2×MEM培养基和Gelrite结冷胶溶液后，将混匀的培养基在凝固前按照3ml/孔的量加入孔中，(加入后厚度约为0.5-0.7cm)待加入的培养基冷却凝固后封口继续放置细胞培养箱中在37℃ 5％(体积含量)CO₂，95％(体积含量)空气，99％湿度，一个大气压的条件下培养。同时做不加Gelrite胶的平行处理：加入相同浓度的病毒液吸附1小时后，用无菌的PBS溶液细胞2次后，每孔加入3ml含有2％(体积百分比)胎牛血清的细胞维持液，封口后继续培养，24小时后观察细胞的生长状况，不加凝胶组做染色观察。

上述凝固后的培养基即为添加体积百分比1％的胎牛血清，2M HEPES 10mL/L，L-谷氨酰胺2mmol/L，100×NEAA 10mL/L，青霉素50U/ml，链霉素50U/ml，质量百分含量为7.5％的NaHCO₃溶液25mL/L的MEM培养液添加SIGMA公司生产的Gelrite Gellan Gum的添加量为1.25g/L凝固后的固体培养基。

上述Gelrite结冷胶：一种结冷胶产品，Gelrite Gellan Gum本身为粉末状物质，易溶于水，形成浑浊状液体，无粘性，高压灭菌后呈透明状液体保存于4℃冰箱中，使用的时候取出适量56℃温预，由于离子的存在，当与2×MEM培养液等体积混合降至室温时即形成固体凝胶状。2.5g/L的Gelrite结冷胶配方：称取2.5克粉末GelriteGellan Gum加入0.9L去离心水中，磁力搅拌器上加热形成混匀液后定容至1L，200mL每瓶分装后121℃高压灭菌30分钟，待温度下降至室温后放入4℃冰箱保存。GelriteGellan Gum购自SIGMA公司，Batch#：027K00251。

上述经病毒吸附，覆盖Gelrite胶凝糖的单层细胞2-5天可以看到明显的蚀斑形成，但是蚀斑的大小以及形成明显斑的时间依不同病毒株而有差异，有的斑呈葡萄串型，有的则呈蜂窝型。

4)挑斑和染色次日后持续观察细胞的生长状况，待48-72小时出现蚀斑的时候，选择病毒蚀斑形态较好(选择病毒蚀斑形态较好的标准首先要求在一个培养孔中蚀斑的数目不得超过10个，同时距离所近的蚀斑在10毫米以上。最后所挑选的蚀斑部位用显微镜观察可以看出与周围的细胞有明显的差异。对单斑(见图1和图2所示)进行挑取的方法：用无菌1ml微量移液器吸管吸取500ul含2％(体积百分比)胎牛血清的细胞维持液加入到无菌的细胞冻存管中，之后用该微量吸管，插入预挑选蚀斑部位(显微镜观察时用记号笔标记出蚀斑的部位，便于以后在工作台中挑取蚀斑)，垂直吹打几次后吸出放入冻存管中(微量吸管中含有凝胶以及病毒形成的单斑)，用该微量吸管吸取100ul冻存管中的液体再反复吹打蚀斑部位，目的是将病毒单斑完全从孔上吹起，将吸出的液体反复冻融3次后(冻融3次的具体方法：放入-70℃冰箱过夜，次日在37℃水浴锅中融化，再重复2次，-70℃处理无需过夜但是每次的冻融要保证充分冻结或者融化)，在超声仪中超声2min，2000rpm离心10分钟后取上清作为病毒液重复上述步骤1)-3)的制备蚀斑过程，再重复2次，即可获得纯化的病毒株。

共获得EV71型病毒纯化株7株，其中从河南省采集的样品中分离到三株病毒：EV-71型病毒河南分离株1(简称EV-71H1)、EV-71型病毒河南分离株2(简称EV-71H2、EV-71型病毒河南分离株3(简称EV-71H3)；从安徽省采集的样品中分离到一株名：EV-71型病毒安徽分离株1(简称EV-71 A1)；从重庆采集的样品中分离到三株病毒：EV-71型病毒重庆分离株1(简称EV-71 C1)、EV-71型病毒重庆分离株1(简称EV-71 C2)、EV-71型病毒重庆分离株1(简称EV-71 C3)。

上述其中两个毒株形成的蚀斑见图1、图2、图3。图1和图2分别是EV-71型病毒河南分离株2和EV-71型病毒重庆分离株1第3轮蚀斑纯化时挑取单斑的照片，由图片可以看出，病毒已形成蚀斑。蚀斑部位的细胞出现变圆聚集的现象，而其周围的细胞则无任何变化。图3为Vero细胞阴性对照照片，可以观察到细胞生长状态良好。

上述七株病毒经过扩增后保存病毒种子，并进行病毒蚀斑形成检测，病毒基因组检测和感染性滴度测定。

3、蚀斑纯化获得病毒的检测

1)蚀斑滴定计数试验按照上述步骤2中的步骤2)-步骤3)的方法，将步骤2中的步骤4)获得的纯化的病毒株在6孔细胞板单层Vero细胞上进行病毒接种，待细胞单层上出现明显的蚀斑时，在不加Gelrite胶的细胞板上通过染色计数蚀斑数(PFU/ml)。首先吸出原细胞孔中的维持液，每孔加入3ml的5％(体积百分比)甲醛溶液固定10-30min，吸出固定液，用自来水沿细胞孔中间缝隙冲洗固定液，最后加入KVF染色液(KVF染色液配方：每100ml含0.85g NaCl、1g结晶紫、20ml无水乙醇、5ml 37％甲醛溶液，加水补足至100ml，过滤后避光保存)10min用自来水沿细胞孔中间缝隙冲洗染色液，自然晾干后计数。

病毒蚀斑形成单位的滴定计算方法，以1ml中所形成的蚀斑数目来表示。用公式A＝a×b/v计算，A：每毫升病毒中蚀斑形成单位的数目；a：平均每孔中出现的蚀斑数；b：病毒稀释倍数；v：每孔接种的病毒体积。

蚀斑滴度和病毒滴结果比较了经过三轮的蚀斑纯化和扩增后的病毒感染力和以前分离的病毒感染力，首先测定病毒的TCID₅₀，之后利用相同的浓度经过蚀斑测定，结果显示经过蚀斑纯化后的要比之前的高。具体见表1和表2。

表1：EV-71型病毒纯化前后病毒滴定的比较

表2：EV-71型病毒纯化前后病毒滴定的比较

病毒株	纯化前(LgPFU/ml)	纯化后(LgPFU/ml)	差值
				EV-71 H1	3030	3150	0120

EV-71H2	3015	3195	0180
				EV-71H3	3170	3325	0155
EV-71C1	2940	3100	0160
				EV-71C2	2695	2860	0175
EV-71C3	2650	2750	0100
				EV-71A1	2670	2775	0105

2)肠道病毒特异性片段检测取经过扩增的病毒样品，按照RNA提取试剂盒说明进行RNA的提取，按照反转录酶的说明书进行反转录。合成肠道病毒特异性引物(包括EV71、CA16)、柯萨奇病毒特异性引物、EV-71特异性引物进行RT-PCR检测病毒样品，3对引物(F表示上游引物，R表示下游引物，引物序列均为5’-3’方向)具体如下：

EV71特异性引物：

F1：TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC；

R1：ACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTCC。

肠道病毒特异性引物：

F2：ATTGGTGCTCCCACTACAGC；R2：TCAGTGTTGGCAGCTGTAGG。

柯萨奇病毒特异性引物：

F3：GCAGCCCAAAAGAACTTCAC；R3：ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC。

RT条件如下：模板RNA 11ul，随机引物1ul，70℃*10min，4℃反应5min后加入5×M-MLV Buffer 4ul，10mM dNTP 1ul，40U/μl RRI 1ul，M-MLV RT 1ul，42℃*1h，70℃*5min，4℃终止进行cDNA合成。随后利用cDNA检测病毒特异性目的片段。具体扩增体系以及条件如下：模板cDNA 2ul，上游和下游引物各0.5ul，10×PCRBufferlul，10mM dNTP1ul，rTaq(Biolab公司)0.5ul灭菌去离子水补足10ul体系。在94℃预变性2min，94℃*15s，58℃*10s，72℃*20s扩增2个循环，94℃*15s，55℃*10s，72℃*20s，33扩增2个循环，72℃延伸5min，4℃终止反应。

PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，是否含病毒保守片段，结果如图4。图4中1为阴性对照(PCR模板为灭菌的去离子水)；2为EV-71特异性引物扩增EV-71型河南分离株2病毒株；3为柯萨奇病毒特异性引物扩增EV-71型河南分离株2病毒株；4为肠道病毒特异性引物扩增EV-71型河南分离株2病毒株；5为DL2000Marker；6为EV-71特异性引物扩增EV-71型重庆分离株1病毒株；7为柯萨奇病毒特异性引物扩增EV-71型重庆分离株1病毒株；8为肠道病毒特异性引物扩增EV-71型重庆分离株1病毒株。

由上面的图片可以看出，采用肠道病毒特异性引物、柯萨奇病毒特异性引物和EV71病毒特异性引物鉴定利用蚀斑方法纯化的河南分离株和重庆分离株，EV-71特异性引物和肠道病毒特异性引物均能扩增出于预期大小符合的条带，分别为226bp和100bp，结果表明所纯化得到的病毒株为肠道病毒EV71型。

3)病毒基因组测序测序结果表明，经过蚀斑纯化得到的病毒含有与报道的EV71型病毒的核苷酸序列。其中EV-71型(Enterovirus 71)河南分离株2的序列如序列1所示，EV-71型重庆分离株1的序列如序列2所示。

实验表明，上述经过改良的蚀斑纯化方法具有快速、准确、易操作的特性。不仅可以快速准确的纯化EV71型病毒，而且经初步实验表明，该方法还可以广泛的应用于多种病毒的纯化。

4、蚀斑纯化的毒株的进一步研究

将上述EV-71河南分离株2和EV-71重庆分离株1，于2010年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为：CGMCC №.3675和CGMCC №.3674，保藏证明中的名称为肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)肠道病毒EV71型河南分离株2CGMCC №.3675和肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)肠道病毒EV71型重庆分离株1CGMCC №.3674。下述简称肠道病毒EV71型(Enterovirus71)河南分离株2和肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1。并对这两个菌株的生理生化性质和致病性进行了进一步的实验研究和鉴定。

1)形态学特征

将步骤2中纯化获得的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2和肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1感染Vero细胞(Invitrogen公司)，具体增殖方法为待Vero细胞长满单层25cm²方瓶培养瓶瓶底时，先用移液管吸出细胞培养液，取2ml已经冻融3次的病毒增殖悬液，1000rpm离心5-10min取上清加入到培养瓶中，封口后放入37℃、5％CO₂孵育2h，中间每个30min轻轻摇晃一次，2h后吸出吸附液，补加8ml新鲜的含有2％(体积百分比)胎牛血清的细胞维持液，继续放入培养箱中培养，经常观察细胞，当细胞出现95％的病变时收获细胞。感染Vero细胞(Invitrogen公司)后，37℃培养48小时后离心收集细胞沉淀做超薄片进行电镜观察，结果表明在肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2和肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1感染细胞胞浆内均可见20-30nm的圆形的病毒颗粒。

2)理化性质：

核型实验：将步骤2中分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2或肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1病毒液感染Vero细胞，当Vero细胞出现95％左右的病变时，先吸出原有的细胞培养液，用一次性细胞刮刮起瓶底的细胞，之后用原有的培养液悬浮细胞，反复冻融3次后，2000rpm离心5-10min，收集上清后分装即为病毒液)分为加药组和无药组两组，加药组的细胞维持液加入5溴-2脱尿苷，使其终浓度为50ug/ml，无药组不做任何处理，之后用含有2％(体积百分比)胎牛血清的细胞维持液进行10倍系列稀释(分别10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍稀释)，最后将各稀释液接种于铺满单层Vero细胞(Invitrogen公司)的96孔板中，每个稀释度接种4孔，0.2ml/孔，37℃培养24-72小时连续观察并记录细胞生长情况。结果加药组和无药组均出现细胞病变，并且滴度均为10^-5，证明步骤①分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2和肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1均为RNA病毒。

耐乙醚实验：将步骤2分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2或肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1病毒液分为实验组和对照组两份，实验组用终浓度为20％(体积浓度)的乙醚溶液处理，对照组不做任何处理，封口后都放入4℃放置过夜后，次日放入生物安全柜中使乙醚完全挥发，用含有2％(体积浓度)胎牛血清的细胞维持液进行10倍系列(分别10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、1^-10倍稀释)稀释，分别接种于铺满单层Vero细胞的96孔板中，每个稀释度分别接种个4孔，0.2ml/孔，24-72小时连续观察记录细胞生长情况。结果两组均出现明显的细胞病变，滴度均为10^-4，证明步骤1分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2和肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1均为无囊膜病毒。

④血清学特征：

用步骤2分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2或肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1感染Vero细胞制备抗原片，抗原片制备的方法如下所述：

实验前准备：把抗原片摆放在抗原架上，每个架上排放2排，1排4个，完毕后用罩子盖上防止灰尘的进入。之后按照下面步骤进行：

i)待25cm2方瓶的Vero细胞生长至80％左右的时候，用实验病毒株2ml感染细胞1小时后，吸出吸附液，补加新鲜的细胞维持液，放入培养箱中培养；

ii)当细胞出现细胞病变的时候(约25％-50％)，按照细胞传代的方法消化细胞，用适量体积的培养液(含有10％胎牛血清的DMEM细胞生长液，具体配方：向500mlDMEM液体中加入50ml胎牛血清、100X Antibiotic-Antimycotic、100X NEAA、100ulHEPES，之后用实验室配制的经过0.22um滤膜过滤除菌的7.5％(质量百分比)NaHCO₃调节溶液的pH值至7.0-7.2，上述液体均为GIBCO公司产品)；3ml)悬浮细胞，每个抗原孔加入40ul细胞悬液，盖上盖子后放入培养箱中继续培养8小时；

iii)取一烧杯内盛PBS溶液(0.01mol/L-pH＝7.2)，将吸附后的抗原片缓缓放入溶液中，浸泡1min左右，取出放在工作台内晾干，约需30min；

iv)将抗原片放入盛有丙酮(国药集团化学试剂有限公司分析纯浓度99.5％)的烧杯中，-20℃30min或者过夜；

v)取出晾干后保存于低温(-40℃以下)冰箱中备用。

间接免疫荧光法：用山东临床鉴定为手足口病恢复期患者的血清稀释液以及荧光标记的IgG抗体分别进行间接免疫荧光检测，于显微镜下观察并照相。

血清制备方法：经过山东省成武县医院临床鉴定为手足口病患者，采集其恢复期患者血液放置于37℃培养箱孵育30min，经800rpm离心15min后吸取上清得到。

用0.005M pH值为7.2的PBS配制2％(质量百分比)BSA(牛血清白蛋白)作为血清稀释液，血清在使用前56℃水浴灭活30min，之后将血清按照实验要求进行稀释后进行间接免疫荧光实验，具体实验步骤如下：

1)从冰箱中取出抗原片，肉眼观察上面的细胞是否脱落，如果有脱落孔，放弃不用；

2)在抗原片上用蜡笔在吸附有抗原的画圈周围划一圈，防止所加样品溢流；

3)根据实验的需要稀释所检测的血清后加样，每孔20-25ul，一般需要做复孔，故需要50ul，根据需要做倍比稀释；

例：首浓度按照1∶10，故需要加入10ul血清+90ul抗体稀释液，在漩涡混合器上充分混匀后取出50ul 1∶10稀释液+50ul血清稀释液(1∶20)，依此稀释下去，一般稀释至1∶160；

4)把已经加样的抗原片放入铺有塑料板的饭盒中，放入37℃、5％CO₂培养箱中孵育30min；

5)取出抗原片，放入洗板槽内，向里面加入洗涤液(0.005M PBS+0.02％_{(体积百分} _比)Tween 20)，在水平振荡器上洗涤5min，重复3次；

6)待抗原片完全风干后，加入1∶50稀释的荧光抗体25ul/孔，放入饭盒后在37℃、5％CO₂培养箱中孵育30min；

荧光抗体的稀释：取出针对所加入血清来源的适量荧光抗体，用0.02％(质量百分比)伊文斯兰溶液按照1∶50稀释抗体，该实验所使用的抗体为FITC conjugate GoatAnti-Human IgG购自Sigma公司。

7)重复步骤5)；

8)风干后，滴加无菌水在荧光显微镜下观察荧光情况并记录结果。

结果表明了所检测人血清中的抗体可以与抗原片上吸附固定的病毒抗原发生特异性的反应，而且血清的效价均可以达到1∶40。

5、病毒全基因组序列测定和同源性分析：

按照步骤2)的方法将步骤2分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2和肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1感染Vero细胞后收集细胞以及培养上清，用试剂盒提取总的RNA，按照反转录酶的说明书进行反转录。合成8对引物(F表示上游引物，R表示下游引物，引物序列均为5’-3’方向)具体如下：

F1：TTAAAACAGCTGTGGGTTG；R1：ACTTCCAGTACCATCCCTTG。

F2：ATGGTCGGCTATGGTGAGTG；R2：AGTGAGTGTTGCTGATCCATGGT。

F3：TGTTCACTGGGTCCTTTATGGC；R3：ACCAGCATAATTTGGGTTGGCT。

F4：ACCATTCATGTCACCTGCGA；R4：CTAGATACGACACATTCCCAAA。

F5：ATCAGCAAATTCATGGATTGGCT；R5：ATGACATACACTAGCGATACAAC。

F6：TGCTTGTCATGCAATCCATCGC；R6：TAGCAGGCTTCCTCCATACTCAT。

F7：ACTAAGCTAGAGCCCAGTGT；R7：TCACGACCAGATTTCTGGTG。

F8：GAAAAATTTGTGAGCACAAT；R8：GCTATTCTGGTTATAACAAAT。

之后按照上述合成的引物进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶纯化试剂盒回收，之后送往上海英俊公司测序，经DNAstar Seqman软件拼接为全序列。采用Blast、DNAstar、MegAligen程序、Clustal W软件以及MEGA4.0软件，对肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2病毒株进行同源性比对和核苷酸序列进化进行分析。

结果表明肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2扩增的8个片段经过拼接后组成基因组全长约为7419个碱基(不包含poly(A)尾，序列如序列表中序列1所示)。基因组编码区起于自序列表中序列1的5’端第742位核苷酸2，止于自序列表中序列1的5’端第7324位，共6582个碱基。5’和3’端各有一段非编码区，长度分别为741nt和96nt。碱基统计结果表明，A含量最高，G含量最低，G+C含量为48％。将测得的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2的VP1的全序列(序列如序列表中序列1的5′第2437-3327位核苷酸)与不同流行区和不同时间分离的多株肠道病毒EV71型病毒相对应序列进行同源性比对，结果表明其与首都儿科研究所2007年分离的BJ4211株(GenBank：EU024958.1)同源性高达97.4％，与EV-71标准株BrCr(GenBank：U22521.1)在核苷酸和氨基酸的同源性分别为82.7％和95％，而与CoxA16则分别(GenBank：AF177911.1)为64.2％和72％。用Meg Aligen程序进行分析表明肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2在进化上属于C₄基因亚型

肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1扩增的8个片段经过拼接后组成基因组全长，约7422个碱基(不包含poly(A)尾，序列如序列表中序列2所示)。基因组编码区起于自序列表中序列2的5’端第744位核苷酸，止于自序列表中序列2的5’端第7326位，共6582个碱基。5’和3’端各有一段非编码区，长度分别为743nt和97nt。碱基统计结果表明，A含量最高，G含量最低，G+C含量为48％。将测得的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1的VP1的全序列(序列如序列表中序列2的5′第2439-3329位核苷酸)与不同流行区和不同时间分离的多株EV-71型病毒相对应序列进行同源性比对，结果表明其与本实验室分离肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2同源性高达95.3％，与首都儿科研究所2007年分离的BJ4211株同源性高达95.4％(编码VP₁蛋白的序列如序列表中序列2(GenBank：EU024958.1)，与EV-71标准株BrCr(GenBank：U22521.1)在核苷酸和氨基酸的同源性分别为83.4％和95.3％，而与CoxA16(GenBank：AF177911.1)则分别为59.5％和64.2％。用Meg Aligen程序进行分析表明肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1在进化上属于C₄基因亚型。

⑥致病性鉴定：

将步骤2分离的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1和肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2在Vero细胞上大量增殖后，并在其上测定病毒的TCID₅₀，结果表明该病毒的滴度为1×10⁷。从北京军事医学科学院实验动物中心领取2日龄Balb/c乳鼠进行该分离株致病性研究。实验采取腹腔接种和脑内注射两种不同的接种方式，病毒的接种量为1000TCID₅₀，同时设立对照组接种PBS溶液，共5组(每组接种乳鼠1窝，平均8只，雌雄均有，各个剂量组腹腔注射100ul、脑内注射20ul)。连续观察小鼠。

结果表明，肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1实验组小鼠在接种后第3-7天内出现体重稍微减轻、精神状态不佳外，与对照组小鼠无任何差异，连续观察21天，实验组小鼠无死亡。结果表明，分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1为弱致病性毒株。肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2实验组乳鼠在接种病毒后3-6天出现体重减轻、后肢偏瘫、抽搐等症状，在接种后第3-5天乳鼠出现陆续死亡，未死亡的小鼠随后症状消失；而腹腔接种实验组症状同上，但是时间较脑内接种的晚2-3天，小鼠陆续在接种第5-8天出现死亡，未死亡的乳鼠随后症状消失；而对照组小鼠未出现任何症状和死亡。

上述的实验表明，本发明的方法建立稳定易操作的EV-71病毒蚀斑滴定方法，为纯化病毒提供简单可行的方法，为EV71病毒的研究奠定了基础。

Claims

1.一种用于非诊断目的的EV-71型病毒蚀斑纯化方法，包括下述步骤：

1)制备单层vero细胞，加入待纯化的样品液，吸附1-2小时；

3)挑取病毒蚀斑获得病毒液；

所述培养哺乳动物细胞用固体培养基为：将预热至56℃的浓度为2.5g/L的GelriteGellan Gum水溶液与含有体积百分含量为2％的胎牛血清的2×MEM培养基等体积混合后降至室温时形成的固体凝胶；

所述2×MEM培养基的组成为：10×MEM 200mL，去离子水800mL，2M HEPES 20mL，200mmol/l L-Glutamine 20mL，100×NEAA 20mL，100U/ml的青霉素，100U/ml的链霉素，质量百分浓度为7.5％的NaHCO₃50mL。

2.根据权利1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述的吸附条件：37℃5％CO₂，95％空气，99％湿度，一个大气压，所述5％和95％均为体积百分含量；所述步骤2)中，所述的培养条件：37℃5％CO₂，95％空气，99％湿度，一个大气压，所述5％和95％均为体积百分含量。

3.根据权利1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述挑取蚀斑的方法是用微量移液器插取无菌的微量吸管，吸取含体积百分比为2％的胎牛血清的细胞维持液放入无菌的冻存管中，之后用该微量吸管插入蚀斑部位，垂直吹打后吸出放入上述冻存管中，再吸取冻存管中含有病毒的液体插入上述蚀斑部位反复吹打，吸出即获得病毒液。

4.根据权利1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，还包括将获得的病毒液冻融3次作为待纯化样品，重复步骤1)-步骤3)2次，获得纯化的病毒。

5.根据权利1-4中任意一项所述的方法，其特征在于：所述待纯化的样品液为采集的临床手足口病患者血清、粪便、咽拭子或肛拭子用pH7.2、0.01mol/L的PBS溶液中添加体积百分比为0.2％的牛血清白蛋白、100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素获得的溶液洗涤获得的液体，过滤灭菌后接种于Vero细胞，当细胞病变达到95％时，收获细胞-70℃冻融3次，获得的病毒液。