CN106244563A - 一种猪流行性腹泻病毒空斑纯化方法 - Google Patents

一种猪流行性腹泻病毒空斑纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物病毒领域，旨在提供一种猪流行性腹泻病毒空斑纯化方法。该方法包括步骤：用病毒维持液将待纯化的病毒样品进行梯度稀释；接种Vero E6细胞并培养，待长至单层且细胞密度达90％以上备用；用病毒维持液清洗Vero E6细胞表层2‑3次，加入梯度稀释的待纯化病毒液和病毒维持液后吸附2h；用无菌PBS清洗细胞表层后，覆盖半固体培养基培养4‑5天，直至病毒空斑出现；挑取病毒空斑，获得病毒液。本发明明显缩短了PEDV纯化的时间，经过2‑3轮该操作，即可获得纯化的毒株。纯化后的毒株病毒滴度高，24h内可出现明显的细胞病变，便于病毒的大量培养与获取。该PEDV空斑纯化方法具有良好的应用前景，为疫苗的研制和相关科研的开展提供了技术支持。

Description

一种猪流行性腹泻病毒空斑纯化方法
技术领域
本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒空斑纯化的方法，属于微生物病毒领域。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,以下简称PEDV)属于α冠状病毒属成员，主要引起猪呕吐、腹泻和脱水等临床症状。不同年龄和不同品种的猪均易感，但对哺乳仔猪的危害最为严重，死亡率最高可达100％。1971年本病首次报道于比利时和英国，随后在欧洲和亚洲迅速传播。我国在2010年出现大面积流行，给我国养猪业造成巨大的经济损失，是我国当前猪病防控的重点疫病之一。该病传播速度快，危害严重，目前该病的防控仍以母猪疫苗预防为主。获得纯化的流行毒株，不仅为疫苗研制提供原料，也为该病毒的相关研究提供材料和方法，对该病的预防和控制具有重要的意义。
目前关于PEDV的报道多集中在病毒的分离培养和病原检测方法上，PEDV空斑纯化技术时有报道，但纯化分离的毒株病毒滴度低，培养时间长，传代次数多，细胞病变(CPE)不明显，限制了该疫苗的研发速度和质量，增加了疫苗成本。因此，需要建立一种更加高效的PEDV空斑纯化方法，缩短培养和纯化时间，提高毒株的病毒滴度，为疫苗的研制和相关病毒研究提供技术支持。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种猪流行性腹泻病毒空斑纯化方法。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种猪流行性腹泻病毒空斑纯化方法，包括下述步骤：
(1)在6孔细胞培养板中接种Vero E6细胞，接种密度为3×105个/孔；然后加入细胞生长培养基，2mL/孔；将细胞培养板放置在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中培养18-24h，待Vero E6细胞长至单层且细胞密度达90％以上，备用；
(2)用病毒维持液将待纯化的病毒样品进行梯度稀释，制备10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的病毒液；
(3)吸弃细胞培养板中的细胞生长培养基，用病毒维持液清洗Vero E6细胞表层2-3次；
(4)向各孔的单层Vero E6细胞中分别加入梯度稀释的待纯化病毒液，200μL/孔；再各加入200μL的病毒维持液，吸附2h；
(5)病毒吸附结束后，吸弃6孔板中的病毒液，用无菌PBS清洗细胞表层2-3次；向细胞表面覆盖半固体培养基，2.5mL/孔，4℃冰箱放置5min待琼脂凝固后，倒置放在细胞培养箱中培养4-5天，直至病毒空斑出现；
(6)挑取病毒空斑，获得病毒液。
本发明中，所述细胞生长培养基由1×DMEM基础培养液和如下终浓度的物质组成：体积百分比浓度为10％的胎牛血清，1×双抗(青霉素100U/mL、链霉素100U/mL)
本发明中，所述病毒维持液由1×DMEM基础培养基和如下终浓度的物质组成：2μg/mL TPCK处理的胰酶，0.3％胰蛋白示磷酸肉汤(TPB)，1×双抗。
本发明中，所述半固体培养基由如下终浓度的物质组成：1×MEM，2μg/mL经TPCK处理的胰酶，0.3％TPB，1×双抗，0.5％低熔点琼脂糖(UltraPure LMP Agarose)
本发明中，待纯化的病毒样品为临床腹泻样本，经检测为PEDV阳性，该样本在VeroE6上培养能产生明显的细胞病变；连续传代5-7代获取细胞培养物，在-80℃条件下反复冻融3次离心后得到的细胞培养上清液。
本发明中，所述待纯化的病毒样品的获取方法为：临床采集仔猪腹泻样本，加入等体积的PBS混匀，PBS为0.01M，pH7.2，1×双抗；将经过0.22μm滤器过滤除菌后获得的液体接种于Vero E6细胞中，当80％以上细胞出现细胞病变时收集细胞；-80℃条件下反复冻融3次，离心取上清为病毒液；该病毒液在Vero E6细胞上进行连续传代5-7代后，每代均能产生明显的细胞病变，最后一次进行传代的细胞培养物即为待纯化的病毒样品。
本发明中，在步骤(6)中，选取出现10个左右空斑的培养孔，进行挑斑。
本发明中，所述步骤(6)具体是：先吸取200μL病毒维持液于病毒冻存管中，之后用微量200μL吸头插入预挑斑部位，吹打几次后吸出，转移至冻存管中混匀，再吸取100μL新的病毒维持液反复吹打空斑部位，将空斑上的病毒尽可能全部吸出至冻存管中，将吸出的液体反复冻融3次后，5000rpm/min，离心10min，取上清-80℃保存备用。
本发明中，将步骤(6)所得病毒液作为待纯化的病毒样品，按步骤(2)至(6)重复操作2次以获得进一步纯化的病毒液。
本发明中，步骤(4)中在进行病毒接种时，设立一个空白对照孔(Mock)，加入200μL的病毒维持液。
本发明是用待纯化的PEDV病毒样品吸附Vero E6单层细胞，覆盖半固体培养基后，经4-5天可以看到明显的空斑形成。经荧光定量RT-PCR检测和测序验证表明，经过3轮空斑纯化后，获得的病毒为PEDV毒株。
与现有技术相比，本发明的技术效果是：
本发明显著缩短了PEDV纯化的时间，经过2-3轮该操作，即可获得纯化的毒株。纯化后的毒株病毒滴度高，24h内可出现明显的细胞病变，便于病毒的大量培养与获取。该PEDV空斑纯化方法具有良好的应用前景，为疫苗的研制和相关科研的开展提供了技术支持。
附图说明
图1是PEDV/LA/2015/01分离株第1次空斑纯化结束后染色照片。
PEDV/LA/2015/01分离株第1次空斑纯化结束后，将6孔细胞板中的半固体培养基取出，4％多聚甲醛固定后，用结晶紫染色的照片，可见在10-6稀释度可见比较均匀的空斑，空斑大小和形态比较一致。
图2是纯化后的两株PEDV/LA/2015毒株2株PEDV临安分离株第3次空斑纯化后荧光定量扩增曲线。
实施例中分别用PEDV、TGEV、RV和PdCoV引物检测纯化的病毒株，只有PEDV检测是阳性，其余均是阴性；但是各阴性曲线非常接近，几乎重合成一条曲线，但实际上是多个曲线。
具体实施方式
本发明在实施时，按如下方法步骤进行。
1、材料和方法
1.1 Vero E6细胞：Vero C1008(E6)细胞株(购自中国科学院上海细胞库，GNO17，非洲绿猴肾细胞)，按常规方法进行传代培养，取48h内长成的单层细胞用于实验。
1.2试剂和培养基：
细胞生长培养基：由基础培养基(1×DMEM，购自Gibco)和如下终浓度的物质组成：胎牛血清10％(体积百分比，购自Gibco)，100U/mL的青霉素和100U/mL的链霉素(1×双抗，购自Gibco)。
病毒维持液：由基础培养基(1×DMEM)和如下终浓度的物质组成：2μg/mL TPCKTreated Trypsin(购自Sigma)，0.3％Tryptose Phosphate Broth(TPB，购自Sigma)，1×双抗。
半固体培养基：由如下终浓度的物质组成：1×MEM，2μg/mL TPCK TreatedTrypsin,0.3％TPB，1×双抗，0.5％UltraPure LMP Agarose(购自Invitrogen)。
1.3待纯化样品：从浙江省临安某猪场采集的仔猪临床腹泻样本2份，分别加入等体积无菌的PBS(pH7.2，0.01M，100U/mL的青霉素和100U/mL的链霉素)混匀后，经过0.22μm滤器过滤除菌后获得的液体，接种于Vero E6细胞中，当80％细胞出现细胞病变时收集细胞，-80℃条件下反复冻融3次，获得的病毒液。该病毒液经3-5次传代，每代次均可产生明显细胞病变，最后一次收获的病毒液保存在-80℃备用。
2、空斑纯化病毒的方法
2.1单层细胞的准备
将25cm2方瓶内长成单层的Vero E6细胞，用常规方法进行细胞传代，按3×105个/孔的细胞密度接种于6孔细胞板中，加入细胞生长培养基2mL/孔，将细胞培养板放置在37℃含5％CO2的细胞培养箱中培养18-24h，待细胞长至单层，细胞密度达90％以上可用于病毒接种。
2.2病毒的稀释
用病毒维持液将1.3中保存的待纯化病毒液进行10倍梯度稀释，分别制备10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的病毒液各500μL，放置备用。
2.3病毒的吸附
吸弃6孔细胞板中的生长培养基，用病毒维持液清洗细胞表层2次。之后向单层Vero E6细胞中加入稀释好各梯度病毒液200μL/孔，每个稀释度做2个重复孔，同时设两个孔为空白对照孔，各加入200μL的病毒维持液，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱吸附2个小时，每隔半个小时轻轻摇晃一下细胞板。
2.4覆盖半固体培养基
在病毒吸附过程中，准备半固体培养基，配置方法如下：分别准备A液和B液，其中A液由2×MEM(购自Gibco)，4μg/mL TPCK Treated Trypsin，0.6％TPB，2×双抗组成，37℃预温待用；B液为1％UltraPure LMP Agarose(购自Invitrogen)，用超纯水配置，高压灭菌后，37℃培养箱储存待用。用前将A液与B液1:1混匀，37℃备用。
病毒吸附结束后，吸弃6孔板中的病毒液，用无菌PBS清洗细胞表层2次，之后将混匀的半固体培养基2.5mL/孔加入到6孔板中，4℃冰箱放置5min待琼脂凝固后，倒置放在细胞培养箱中培养4-5天，每天显微镜下观察空斑形成情况，直至病毒空斑出现。
2.5挑取病毒空斑，获得病毒液
待空斑出现后，选取大约出现10个左右空斑的细胞孔进行挑斑。首先在显微镜下进行观察，在预挑斑的部位用记号笔勾画出空斑轮廓。先吸取200μL病毒维持液于病 毒冻存管中，之后用微量200μL吸头插入预挑斑部位，吹打几次后吸出，转移至冻存管中混匀，再吸取100μL新的病毒维持液反复吹打空斑部位，将空斑上的病毒尽可能全部吸出至冻存管中，将吸出的液体反复冻融3次后，5000rpm/min，离心10min，取上清-80℃保存备用。
2.6重复纯化，获得纯PEDV样品
按照2.1-2.5的操作将2.5获得的病毒液再重复2次，获得进一步纯化的PEDV样品。
2.7经过2.1-2.6的操作，共得到纯化的PEDV毒株2株，分别命名为PEDV/LA/2015/01和PEDV/LA/2015/02。
3、纯化PEDV毒株的检测
3.1半数细胞培养物感染量TCID50
3.1.1按照2.1的方法，将Vero E6细胞平铺在96孔细胞培养板中，制备单层细胞。
3.1.2将2.7纯化的病毒株用病毒维持液进行连续10倍梯度稀释，从10-1到10-10。
3.1.3吸弃96孔细胞板中的上清液，用无菌PBS清洗细胞表面后，将稀释好的病毒接种到细胞板中，每一个稀释度接种一纵排8孔，200μL/孔。同时设正常对照组(不接种病毒)两纵排。
3.1.4每日显微镜下观察细胞病变情况，一般需要观察4-5天。
3.1.5结果计算
根据Karber方法计算TCID50，结果显示PEDV/LA/2015/01的病毒滴度TCID50为5×1010.5/mL，具体见表1。
表1各病毒液稀释度出现的CPE孔数记录表
按照公式LgTCID50＝L-d(s-0.5)，其中L表示最高稀释度的对数，d表示稀释度对数之间的差，s表示阳性孔比率总和，计算得到TCID50为5×1010.5/mL。
3.2荧光定量PCR检测
3.2.1将2.7纯化的病毒上清液进行病毒的细胞增殖培养，得到的病毒液用QIAampViral RNA Mini Kit试剂盒提取RNA，参考Takara SYBR Premix Taq试剂盒，分别用猪 流行性腹泻(PEDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪轮状病毒(RV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的引物对该纯化的病毒样品进行一步法荧光定量RT-PCR检测，引物序列(5’-3’)见表2，荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件如下：2×One Step SYBR RT-PCR Buffer 10μL，EnzymeMix 0.8μL，Primer fwd 0.4μL，Primer rev 0.4μL，ROX 50×0.4μL，RNA 2μL，DEPC H2O补足20μL体系。反转录42℃5min，95℃10s；PCR扩增95℃5s，60℃30s，40个循环；95℃60s；60℃30s；95℃30s。
表2荧光定量RT-PCR检测引物序列(5’-3’)
分别用PEDV、TGEV、RV和PDCoV对纯化的该病毒进行检测，由扩增曲线可以看出，只有PEDV出现典型的“S”型扩增曲线，而TGEV、RV和PDCoV均为阴性，结果表明所纯化得到的病毒株为PEDV。
3.3毒株测序
按照Takara MLV反转录试剂盒说明书将3.2.1提取的RNA进行反转录，合成cDNA。随后对PEDV N序列进行PCR扩增和测序。扩增体系及条件如下：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，Primer fwd 2μL，Primer rev 2μL，Taq HS 0.25μL，cDNA 2μL，ddH2O补足体系50μL。94℃预变性5min，98℃15s，58℃2min，72℃30s，扩增40个循环，72℃延伸10min，4℃终止反应。
引物序列为(5’-3’)(SEQ ID NO：1、2)：
PEDV-N-fwd：GGAATTCGATGGCTTCTGTCAGCTTTCAGGAT
PEDV-N-rev：GGCGTCGACTTAATTTCCTGTATCGAAGAT
PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定，用凝胶纯化试剂盒回收，送苏州金唯智生物技术有限公司测序，经软件拼接获得N基因序列。经NCBI Blast比对，确定为PEDV毒株。实验显示纯化得到两株病毒，两株病毒序列稍有差别，具体如SEQ ID NO：3、4所示。

Claims (10)

1.一种猪流行性腹泻病毒空斑纯化方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)在6孔细胞培养板中接种Vero E6细胞，接种密度为3×105个/孔；然后加入细胞生长培养基，2mL/孔；将细胞培养板放置在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中培养18-24h，待VeroE6细胞长至单层且细胞密度达90％以上，备用；
(2)用病毒维持液将待纯化的病毒样品进行梯度稀释，制备10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的病毒液；
(3)吸弃细胞培养板中的细胞生长培养基，用病毒维持液清洗Vero E6细胞表层2-3次；
(4)向各孔的单层Vero E6细胞中分别加入梯度稀释的待纯化病毒液，200μL/孔；再各加入200μL的病毒维持液，吸附2h；
(5)病毒吸附结束后，吸弃6孔板中的病毒液，用无菌PBS清洗细胞表层2-3次；向细胞表面覆盖半固体培养基，2.5mL/孔，4℃冰箱放置5min待琼脂凝固后，倒置放在细胞培养箱中培养4-5天，直至病毒空斑出现；
(6)挑取病毒空斑，获得病毒液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞生长培养基由1×DMEM基础培养液和如下终浓度的物质组成：体积百分比浓度为10％的胎牛血清；1×双抗。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒维持液由1×DMEM基础培养基和如下终浓度的物质组成：2μg/mL经TPCK处理的胰酶，0.3％胰蛋白示磷酸肉汤，1×双抗。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述半固体培养基由如下终浓度的物质组成：1×MEM，2μg/mL TPCK处理的胰酶，0.3％TPB，1×双抗，0.5％低熔点琼脂糖。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，待纯化的病毒样品为临床腹泻样本，经检测为PEDV阳性，该样本在Vero E6上培养能产生明显的细胞病变；连续传代5-7代获取细胞培养物，在-80℃条件下反复冻融3次离心后得到的细胞培养上清液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待纯化的病毒样品的获取方法为：临床采集仔猪腹泻样本，加入等体积的PBS混匀，PBS为0.01M，pH7.2，1×双抗；将经过0.22μm滤器过滤除菌后获得的液体接种于Vero E6细胞中，当80％以上细胞出现细胞病变时收集细胞；-80℃条件下反复冻融3次，离心取上清为病毒液；该病毒液在Vero E6细胞上进行连续传代5-7代后，每代均能产生明显的细胞病变，最后一次进行传代的细胞培养物即为待纯化的病毒样品。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(6)中，选取出现10个左右空斑的培养孔，进行挑斑。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)具体是：先吸取200μL病毒维持液于病毒冻存管中，之后用微量200μL吸头插入预挑斑部位，吹打几次后吸出，转移至冻存管中混匀，再吸取100μL新的病毒维持液反复吹打空斑部位，将空斑上的病毒尽可能全部吸出至冻存管中，将吸出的液体反复冻融3次后，5000rpm/min，离心10min，取上清-80℃保存备用。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤(6)所得病毒液作为待纯化的病毒样品，按步骤(2)至(6)重复操作2次以获得进一步纯化的病毒液。
10.根据权利要求1至9任意一项中所述的方法，其特征在于，步骤(4)中在进行病毒接种时，设立一个空白对照孔，加入200μL的病毒维持液。
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