CN103525766B - 一种猪肾细胞系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了猪肾细胞系及其应用，猪肾细胞系，其保藏号为：CCTCC C201324。本发明构建的稳定表达CD163的PK-15细胞系可以用于PRRSV病毒的分离和培养，也可以用于PRRSV细胞受体的研究。PRRSV易感的猪源细胞系的建立，为PRRSV的培养提供了一个备选细胞系，扩大了PRRSV研究的宿主细胞范围，对于PRRSV疫苗的生产有着重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物学技术领域，涉及一种猪肾细胞系及其应用，具体地说，是一种构建稳定表达PRRSV细胞受体的猪肾细胞系的建立及其衍生的猪源细胞分离培养PRRSV。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称“猪蓝耳病”，是由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一种猪的急性传染病。PRRSV具有很强的宿主细胞嗜性，目前用于分离和培养PRRSV的细胞系主要是猪肺泡巨噬细胞(PAM)和非洲绿猴肾细胞(Marc-145)。研究表明，PRRSV的细胞嗜性是由于宿主细胞表面的病毒受体决定的。目前研究发现CD163分子可以作为PRRSV的一个细胞受体，能介导PRRSV的非易感细胞系变成PRRSV的易感细胞系。由于PAM细胞制备过程麻烦，代价高，且不能保证不同批次之间的稳定性；Marc-145细胞来源与猴，而非猪来源细胞，会导致PRRSV体外研究受限于不能反应自然宿主的细胞的感染情况，且该细胞目前的专利不在我国。因此，通过构建PRRSV易感的猪来源的细胞系，可以模拟PRRSV感染自然宿主细胞的过程，扩大研究范围。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术中的空白，提供一种猪肾细胞系及其应用。
其具体技术方案为：
一种猪肾细胞系，其保藏号为：CCTCC C201324，保藏日期为2013年3月6日。
本发明所述的猪肾细胞系在分离和培养PRRSV中的应用。
本发明通过在PAM细胞中扩增全长CD163分子cDNA(GenBank登陆号：JX292263)。将其连入PiggyBac表达载体，构建了表达CD163蛋白的真核表达载体。将该真核表达载体与表达PiggyBac转座酶的载体共转染至PK-15细胞系，通过嘌呤霉素和绿色荧光蛋白的筛选，得到一株稳定表达CD163分子的PK-15细胞系。
通过PRRSV SD16毒株感染实验，发现该株细胞对PRRSV高度易感。PRRSV感染的毒价可以达到105TCID50/mL以上，和Marc-145上培养的该毒株毒价相当。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明构建的稳定表达CD163的PK-15细胞系可以用于PRRSV病毒的分离和培养，也可
以用于PRRSV细胞受体的研究。PRRSV易感的猪源细胞系的建立，为PRRSV的培养提供了一个备选细胞系，扩大了PRRSV研究的宿主细胞范围，对于PRRSV疫苗的生产有着重要的意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1猪CD163cDNA全长的克隆
通过制备猪PAM细胞，提取细胞总RNA，通过RT-PCR的方法利用CD163特异性引物扩增出猪CD163片段，CD163cDNA全长3400bp，其中开放阅读框长度为3333bp。目前CD163cDNA序列已经提交至GenBank，登陆号是：JX292263。
实施例2表达CD163PiggyBac表达载体的构建
根据PiggyBac表达载体多克隆酶切位点的序列，选用XbaI和EcoRI将载体线性化，利用In-fusion同源重组的方法将CD163cDNA连接至表达载体，经过酶切和测序正确后，该载体命名为PB-CMV-CD163-EF1α-GFP-Puro。
实施例3稳定表达CD163的PK-15细胞系的建立
将PB-CMV-CD163-EF1α-GFP-Puro载体和表达Piggybac转座酶的载体(PA)按照质量比为5∶1的比例转染至汇合度为90％的PK-15细胞系。转染48h后，使用浓度为5-10μg/mL的嘌呤霉素选择性培养基加压筛选转染的细胞。在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光的表达情况。选择性培养基每48h更换一次，随着阳性细胞比例的增加，嘌呤霉素的浓度适当地增加。经过10天左右嘌呤霉素的筛选，可以看到表达绿色荧光的细胞克隆，挑选表达绿色荧光量比较高的细胞克隆做进一步的亚克隆。再经过一周作用的培养，即得到了稳定表达CD163的细胞系。
实施例4稳定表达CD163的PK-15细胞系的鉴定与体外传代培养
将挑选的单克隆细胞系首先使用RT-PCR的方法鉴定细胞是否表达CD163：提取细胞总RNA，利用特异性引物检测CD163的表达情况，通过琼脂糖凝胶电泳可以发现在CD163特异性条带，而正常的PK-15细胞系中没有CD163的表达。间接免疫荧光实验验证CD163在蛋白水平的表达：通过使用抗CD163的单克隆抗体作为一抗，TRITC标记抗鼠的抗体作为二抗，通过荧光显微镜观察，筛选的细胞均有红色荧光信号的产生，对照的PK-15细胞没有红色荧光信号，说明CD163在蛋白水平表达。Wessern-blot进一步验证CD163的表达：将筛选的细胞用RIPA裂解液裂解后，通过SDS-PAGE和转膜后，使用抗CD163的单抗当做一抗，HRP标记的抗鼠二抗作为二抗，通过特异性底物显示，在130kDa处出现特异性的目的条带，说明CD163蛋白表达。在体外传代，已经传了约60代，其CD163的表达量不变。说明该细胞系已经建立。
实施例5PRRSV感染实验
将筛选的表达CD163的PK-15细胞铺在24孔板，24h做病毒感染实验，病毒接种量为0.1MOI。感染24h后收集细胞上清，检测PRRSV TCID50。细胞使用多聚甲醛固定，使用PRRSVN蛋白特异性抗体检测细胞的感染情况。同时采用RT-PCR的方法扩增病毒N蛋白基因。细胞上清接种至Marc-145细胞后，可以看到Marc-145细胞特有的细胞病变。细胞做IFA实验后，可以看到感染的细胞。RT-PCR分别可以从细胞上清和细胞中扩增得到特异的目的条带。说明筛选的细胞可以被PRRSV感染。随着PRRSV在PK-15-CD163细胞上稳定传代，其毒价逐渐的升高，第三代的病毒可以达到105TCID50/mL.与对照的Marc-145细胞培养的病毒毒价相当。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.一种猪肾细胞系，其特征在于，在体外能稳定传代，可以用于分离和培养PRRSV；其保藏号为：CCTCC C201324。
2.权利要求1所述的猪肾细胞系在分离和培养PRRSV中的应用。
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