CN109295010B - 一种利用鸡肝细胞进行坦布苏病毒高效扩增的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用鸡肝细胞进行坦布苏病毒高效扩增的方法，包括以下步骤：（1）细胞培养：将鸡肝细胞用含体积浓度为10%胎牛血清的DMEM‑F12培养基进行培养，待细胞长满单层后，用PBS洗涤一遍后，以质量浓度为0.25%的胰酶进行消化、传代至细胞培养板中；（2）鸡肝细胞高效扩增坦布苏病毒：将鸡肝细胞接种至细胞培养板内培养，在汇合度为60%到70%时，将坦布苏病毒AHRD2018株接种鸡肝细胞，MOI为0.01，以2ml含体积浓度为2%胎牛血清的培养基培养4天，定时收集200μl上清冻存于‑80℃冰箱备用，同时每孔补200μl含体积浓度为2%胎牛血清的培养基。本发明利用鸡肝细胞可以更早产生高滴度病毒的特性，利用病毒复制速率显著高于DF‑1细胞和BHK‑21细胞的鸡肝细胞来扩增坦布苏病毒。

Description

一种利用鸡肝细胞进行坦布苏病毒高效扩增的方法
技术领域
本发明涉及一种高效扩增坦布苏病毒的方法，具体涉及一种利用鸡肝细胞进行坦布苏病毒高效扩增的方法。
背景技术
坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）是一种可以引起家禽产蛋急剧下降的单股正链RNA病毒。该病毒属于黄病毒科黄病毒属蚊媒病毒类恩塔亚病毒群。家禽感染TMUV后主要特征为产蛋量下降甚至停止，伴有神经症状，严重者会出现死亡现象，严重制约国内家禽业的健康持续发展。虽然TMUV疫苗的使用有效降低了TMUV的的流行及其发病率，但近年来TMUV病毒易感宿主范围正从鸭扩展到鹅、蛋鸡等。免疫家禽中高致病性TMUV毒株的分离，进一步提示高效TMUV疫苗的研制迫在眉睫。病毒的高效扩增对疫苗的研制至关重要。BHK-21细胞和DF-1细胞是分离、扩增TMUV病毒的常用细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效扩增坦布苏病毒的方法，本发明利用鸡肝细胞可以更早产生高滴度病毒的特性，利用病毒复制速率显著高于DF-1细胞和BHK-21细胞的鸡肝细胞来扩增坦布苏病毒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种利用鸡肝细胞进行坦布苏病毒高效扩增的方法，包括以下步骤：
（1）细胞培养
鸡肝细胞采用含胎牛血清的DMEM-F12培养基进行培养，胎牛血清的体积浓度为10%，待细胞长满单层后，用PBS洗涤一遍后，以质量浓度为0.25%的胰酶进行消化、传代至所需的细胞培养板中。
（2）鸡肝细胞高效扩增坦布苏病毒
将鸡肝细胞、DF-1细胞和BHK-21细胞接种至6孔板内培养，在汇合度为60-70%时，将坦布苏病毒接种细胞，MOI为0.01，三种细胞各做两个重复，以体积浓度为2%胎牛血清的培养基培养4天，每天收集200μl上清冻于-80℃冰箱备用，同时每孔补200μl体积浓度为2%胎牛血清的培养基；测定收集上清的TCID50；利用GraphPad Prism 5软件绘制坦布苏病毒生长曲线。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
第一，本发明以鸡肝细胞作为TMUV病毒分离扩增用细胞。与传统的BHK-21和DF-1细胞相较，TMUV在鸡肝细胞上不仅病毒增殖迅速，而且病毒滴度显著提高。因此，利用能够高效扩增TMUV病毒的鸡肝细胞作为病毒分离扩增用细胞，能够收获更高滴度的病毒，为高效疫苗的研制提供技术平台，实现时间和成本缩减。
第二，本发明快速扩增坦布苏病毒的方法，在同等时间内，不仅病毒增殖速度快，而且病毒效价高，效果显著。
第三，本发明可快速获得高滴度的坦布苏病毒；节约时间、成本，可在疫苗研制中具有良好的应用价值。
附图说明
图1 是鸭坦布苏病毒在鸡肝细胞、DF-1细胞和BHK-21细胞中的生长曲线图；
图1中：DF-1为鸭坦布苏病毒在DF-1细胞中的生长曲线， CL为鸭坦布苏病毒在鸡肝细胞在中的生长曲线， BHK-21为鸭坦布苏病毒在BHK-21细胞中的生长曲线。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，以下实施方式结合附图给出了快速扩增坦布苏病毒的示例。
实施例
一种高效扩增坦布苏病毒的方法，包括以下步骤：
（1）细胞培养
将鸡肝细胞用含体积浓度为10%胎牛血清的DMEM-F12培养基进行培养，DF-1细胞和BHK-21细胞采用含体积浓度为5%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，待细胞长满单层后，用PBS洗涤一遍后，以0.25%的胰酶进行消化、传代至6孔或96孔细胞培养板中。
（2）鸡肝细胞高效扩增坦布苏病毒
将鸡肝细胞、DF-1细胞和BHK-21细胞接种至6孔板内培养，在汇合度为60%到70%时，将坦布苏病毒AHRD2018株接种三种细胞，MOI为0.01，三种细胞各做两个重复，以2ml含体积浓度为2%胎牛血清的培养基培养4天，定时收集200μl上清冻存于-80℃冰箱备用，同时每孔补200μl含体积浓度为2%胎牛血清的培养基。连续收集病毒上清4天后，在DF-1细胞上进行TCID50的测定。首先将DF-1细胞接种于96孔板上，在汇合度为60%到70%时，将收集的上清做10倍倍比稀释，每个稀释度4个重复，接种细胞，维持4天后，将细胞用100μl丙酮乙醇比例为3：2的固定液固定5分钟，干燥；将100μl 1：1000稀释的抗坦布苏病毒的多抗为一抗与固定好的细胞于37℃孵育45分钟，弃去所有液体，以200μl PBS洗3遍；加入100μl 1：150稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗于37℃孵育45分钟，弃去所有液体，以200μl PBS洗3遍，加入50μl PBS，于倒置荧光显微镜下进行观察。通过Reed-Muench法计算TCID50，并利用GraphPad Prism 5软件绘制病毒生长曲线。
结果见图1：同样培养4天，在DF-1细胞上，48h时病毒滴度达到峰值并逐渐下降，最高病毒滴度为5X106TCID50/ml；在BHK-21细胞上，病毒上升缓慢，扩增所需时间较长，最高病毒滴度为1.58X107TCID50/ml；而在鸡肝细胞上72h就可达到最高病毒滴度2.32X108TCID50/ml。

Claims (3)

1.一种利用鸡肝细胞进行坦布苏病毒高效扩增的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）细胞培养
将鸡肝细胞用含胎牛血清的DMEM-F12培养基进行培养，胎牛血清体积浓度为10%，待细胞长满单层后，用PBS洗涤一遍后，以质量浓度为0.25%的胰酶进行消化、传代至细胞培养板中；
（2）鸡肝细胞高效扩增坦布苏病毒
将鸡肝细胞接种至细胞培养板内培养，在汇合度为60%到70%时，将坦布苏病毒AHRD2018株接种鸡肝细胞，MOI为0.01，以2ml体积浓度为2%胎牛血清的培养基培养4天，定时收集200μl上清冻存于-80℃冰箱备用，同时每孔补200μl体积浓度为2%胎牛血清的培养基。
2.根据权利要求1所述的利用鸡肝细胞进行坦布苏病毒高效扩增的方法，其特征在于，步骤（2）中还包括：测定收集上清的TCID50；利用GraphPad Prism 5软件绘制坦布苏病毒生长曲线。
3.根据权利要求1所述的利用鸡肝细胞进行坦布苏病毒高效扩增的方法，其特征在于，所述坦布苏病毒接种鸡肝细胞做两个重复。
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