CN102242173A - 一种石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法，是通过蔗糖密度梯度离心纯化病毒粒子，0.1%SDS处理纯化病毒，分离病毒囊膜蛋白。本发明主要针对病毒囊膜蛋白，能促进病毒囊膜蛋白质组学的研究进展，有助于进一步研究石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白在病毒感染宿主过程中的功能，在分子与细胞水平上了解病毒与宿主的相互作用机制，为防治虹彩病毒病害和病毒疫苗的研制提供有力的科学依据与应用基础。

Description

一种石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法

技术领域

本发明涉及病毒囊膜蛋白的提取方法，具体地讲涉及一种石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法。

背景技术

病毒结构蛋白是病毒形态发生所必需的蛋白质，也是构成具有侵染力的成熟病毒颗粒所必需的成分。在有囊膜病毒中，病毒的结构蛋白主要有衣壳蛋白（capsid protein）、囊膜蛋白（envelope protein）以及基质蛋白（matrix protein）。在这些蛋白中，囊膜蛋白由于位于病毒粒子的最外侧，并且被认为是病毒入侵吸附识别时的配体分子，因此受到广泛的关注。囊膜是包被着病毒衣壳的一层膜，病毒囊膜的成分主要来自宿主细胞，由蛋白质、脂质及多糖等组成。病毒完成装配，从宿主细胞中释放出来，细胞膜双层磷脂中原有的细胞源性蛋白被病毒蛋白完全或部分取代，成为病毒的囊膜蛋白。囊膜在病毒感染、复制及致病过程中起重要作用。囊膜蛋白的主要功能有：（1）是病毒的主要表面抗原，可以诱导机体产生保护性的中和抗体。（2）具有凝集脊椎动物红血球细胞、细胞融合以及酶等活性。（3）与靶细胞结合。对病毒囊膜蛋白的研究将有利于发现与阐明病毒感染、复制及装配的机理，为研究病毒宿主相互作用机制和病毒防治提供依据。

对于病毒囊膜蛋白的研究，病毒囊膜的分离纯化是研究的基础和起点。大多数囊膜蛋白是和膜及病毒衣壳整合在一起的，所以分离提纯比较困难。用表面活性剂溶解囊膜是纯化囊膜蛋白的常用策略，囊膜在表面活性剂的作用下可变成蛋白质-脂肪-表面活性剂的复合物而被溶解。囊膜被溶解后，可以采用电泳技术分离纯化囊膜蛋白进而进行质谱鉴定。 

表面活性剂是分离提纯囊膜蛋白的关键性试剂，用合适的表面活性剂溶解囊膜是纯化囊膜蛋白的第一步。表面活性剂可以分为几大类，主要有（1）离子型表面活性剂，如十二烷基磺酸钠（SDS）、脱氧胆酸钠（DOC）；（2）温和非离子型表面活性剂，如曲拉通X-100（Triton X-100）、乙基苯基聚乙二醇（NP-40）；(3)温和型两性表面活性剂，如DDMAU、DDMAB。在囊膜的提取中，表面活性剂的选择很关键，临界微团浓度、亲水-亲脂物平衡值、电荷及紫外穿透性等是选择表面活性剂的主要考虑因素。1% Triton-X 100是分离病毒囊膜比较常用的方法，常用于如牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus, BEFV）和对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus, WSSV）等病毒的囊膜的分离。此外，痘苗病毒(vaccinia virus, VV) 的囊膜用1% NP-40溶液（1% NP-40、50 mM Tris (pH 7.4) 、150 mM NaCl和50 mM DTT）能得到了很好的分离。

迄今为止，仅有少数的几篇关于虹彩病毒囊膜蛋白的报道。而对于有囊膜虹彩病毒的囊膜提取方法，缺乏全面的比较和研究。本发明在比较了几种不同的表面活性剂分离石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的效果后，建立了一种分离虹彩病毒囊膜蛋白的合适方法。

发明内容

针对现有技术的缺乏和不足之处，本发明提供一种虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法。

本发明通过以下方案实现：

一种石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法，其特征在于包括以下步骤：①石斑鱼胚胎细胞接种石斑鱼虹彩病毒，待细胞出现完全病变效应时，收集病毒悬液；②收集的病毒悬液冻融2-3次，去除细胞碎片，取上清液进行超速离心，收集病毒粒子，用蔗糖密度梯度离心得到纯化的病毒粒子；③将纯化的病毒粒子用0.1% SDS室温处理30分钟。  

步骤②所述超速离心为28000rpm离心90分钟。

步骤②冻融是指将病毒悬液放入低温冰箱或液氮中冻存后取出室温溶解。

步骤①是将接种病毒的石斑鱼胚胎细胞经过磷酸缓冲盐溶液漂洗后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶消化1-2分钟，加入新配置的pH 7.4～7.6的含8-10%胎牛血清的MEM培养液，25-28℃进行培养扩增；待细胞生长至对数期时接种0.01-0.1 MOI的病毒，于25-28℃培养3-4天后，收集病毒悬液。

步骤②去除细胞碎片的方法为12,000g离心30分钟，取出上清液，其沉淀用磷酸缓冲盐溶液重悬并反复冻融3次后再超声波破碎，4,000g离心20分钟。

步骤②所述蔗糖密度梯度离心为将病毒悬浮液加于30%-60%蔗糖密度梯度上，150,000 g 4℃离心1小时，收集密度梯度40%-50%之间的条带，溶于TN buffer中；100,000 g 4℃离心1小时得到纯化的病毒粒子。

步骤①收集的病毒悬液于-20～-80℃冻存保存。

步骤②收集的病毒粒子用磷酸缓冲盐溶液重悬溶解后再进行蔗糖密度梯度离心。

TN buffer为50 mM Tris /HCl与150 mM NaCl的混合物，其pH 为7.5。

本发明的优选方案是用蔗糖密度梯度离心纯化病毒粒子，0.1% SDS处理病毒，分离病毒囊膜蛋白；包括以下步骤：

1、病毒接种敏感细胞石斑鱼胚胎细胞，待细胞出现完全病变效应（cytopathic effect, CPE）时，收集病毒悬液，-80℃冻存。

2、收集的病毒悬液反复冻融3次，以完全释放病毒，离心去除细胞碎片，上清液进行超速离心，28000rpm离心90分钟，收集病毒粒子，沉淀的病毒粒子用磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，150,000g蔗糖密度梯度离心90分钟得到纯化的病毒粒子。

3、用三种不同的表面活性剂Triton X-100、NP-40和SDS分离病毒囊膜，用抗病毒的主要衣壳蛋白和囊膜蛋白VP16的抗体Western blot检测病毒囊膜蛋白分离的效果,同时电镜观察处理后的囊膜去除情况。

4、根据上述步骤确定的病毒囊膜蛋白分离的方法，即0.1% SDS处理病毒粒子，用已知的病毒囊膜蛋白VP88和VP90及衣壳蛋白VP38的抗体Western blot验证方法的可靠性。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

（1）本发明提供的石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法能完全溶解病毒囊膜而不影响病毒衣壳的完整性。因此，本方法也适用于其他有囊膜虹彩病毒囊膜蛋白的分离。

（2）囊膜蛋白的研究是近几年病毒结构蛋白研究的一个热点。本发明主要针对病毒囊膜蛋白，能促进病毒囊膜蛋白质组学的研究进展，有助于进一步研究病毒囊膜蛋白在病毒感染宿主过程中的功能，在分子与细胞水平上了解病毒与宿主的相互作用机制，为防治虹彩病毒病害和病毒疫苗的研制提供有力的科学依据与应用基础。

附图说明

图 1 不同表面活性剂处理后Western blot检测VP16及用三种已知病毒结构蛋白抗体Western blot验证新建立的方法的可靠性，其中V指纯化的病毒粒子，S、P分别指处理后的病毒离心分离上清和沉淀。

图 2 病毒用不同表面活性剂处理后的电镜观察，箭头指示的是病毒的衣壳，箭箭头指示的是病毒的囊膜。

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明做进一步的描述。

、材料

实验所用病毒为石斑鱼虹彩病毒（SGIV, A3/12/98 PPD）。

选用细胞系为石斑鱼胚胎细胞系，细胞在含8-10％胎牛血清的MEM 培养基中培养。

、方法

2.1 细胞培养与病毒扩增

取长满单层的石斑鱼胚胎细胞，去除原有培养液，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline, PBS)漂洗一遍后加入0.25%的胰蛋白酶消化1-2分钟，加入新配置的含8-10%胎牛血清的MEM培养液（pH 7.4），吹匀后分至3个细胞培养瓶中于28℃进行培养扩增，待细胞生长至对数期时接种0.01 MOI（multiplicity of infection，感染复数）的石斑鱼彩虹病毒，置于28℃培养箱中培养，扩增病毒。连续培养3-4天后，细胞病变完全，收集病毒悬液，-80℃冻存备用。

2.2 病毒纯化

病毒悬液冻融2-3次后分装入50毫升的离心管中，12,000g离心30分钟，取出上清记为SN1，沉淀用磷酸缓冲盐溶液重悬并反复冻融3次后再超声波破碎，4,000g离心20分钟，取上清记为SN2，将SN1与SN2混合4℃保存过夜；28, 000rpm离心90分钟以沉淀病毒，2毫升TN buffer（50 mM Tris /HCl，150 mM NaCl, pH 7.5）重悬沉淀；将病毒悬浮液加于30%-60%蔗糖密度梯度上，150,000 g 4℃离心1小时，收集密度梯度40%-50%之间的条带，溶于TN buffer中；100,000 g 4℃离心1小时洗糖；收集病毒沉淀，用适量TN buffer 溶解，-80℃保存备用。

2.3 三种不同的表面活性剂Triton X-100、NP-40和SDS分离病毒囊膜

在囊膜的提取中，表面活性剂的选择很关键，本发明比较了三种不同的表明活性剂分离病毒囊膜的效果，分离后的上清和沉淀SDS-PAGE分离后转膜进行Western blot检测。所用一抗分别是抗病毒MCP和VP16蛋白的抗体。MCP是虹彩病毒的主要衣壳蛋白，是病毒衣壳的标志；病毒编码蛋白VP16是一个囊膜蛋白。

Triton X-100提取囊膜蛋白根据Walker方法并略作修改。纯化的病毒用1% Triton X-100在不同的NaCl浓度（0M, 0.1M, 0.5M和1M）下室温处理30分钟，20,000 g 4 ℃离心30分钟, 吸取上清，沉淀再用TN Buffer洗涤一次，分离后的上清和沉淀SDS-PAGE分离后转膜Western blot检测。

NP-40提取囊膜蛋白参考Ojeda等建立的方法。纯化的病毒粒子用50mM Tris (pH 7.4)、1%NP-40、150 mM NaCl和不同浓度的二硫苏糖醇 (DL-Dithiothreitol, DTT)（1mM, 5mM, 10mM和50mM）37℃处理60分钟，离心后吸取上清，沉淀TN Buffer洗涤一次，分离后的上清和沉淀SDS-PAGE分离后转膜Western blot检测。

纯化的病毒粒子用溶于TN Buffer的不同浓度的SDS（0.01%, 0.1%和1.0%）室温处理30分钟，离心后吸取上清，沉淀TN Buffer洗涤一次，分离后的上清和沉淀SDS-PAGE分离后转膜Western blot检测。

2.4 不同的表面活性剂处理后的电镜观察

病毒的表面活性剂处理见上。处理后的沉淀用适量的TN Buffer充分重悬后采用悬滴法制片。即取少量相应悬液，直接滴在有Parafilm膜的网上，悬液在网上呈半球形。30分钟后，用一片干净滤纸从网边吸去液体。稍干后用1%磷钨酸（PTA）染色45秒，用滤纸吸去染液后电镜观察。

2.5 三种已知病毒结构蛋白Western blot验证建立的方法的可靠性

病毒编码蛋白VP88和VP90是囊膜蛋白，VP38是衣壳蛋白。0.1% SDS分离病毒囊膜后，分离的上清和沉淀SDS-PAGE跑胶后转膜Western blot检测验证方法的可靠性。

、结果

3.1 三种不同的表面活性剂处理后的Western blot检测结果

本研究利用病毒的主要衣壳蛋白抗体和囊膜蛋白抗体，Western blot比较了三种不同的表面活性剂Triton X-100、NP-40和SDS分离病毒囊膜蛋白的效果。结果表明，1% Triton X-100结合不同浓度的NaCl均只能部分分离囊膜蛋白VP16，多数仍在沉淀中（图 1b）；1%NP-40处理随着DTT浓度的升高，主要衣壳蛋白也被溶解到上清中（图 1c）；而不同浓度的SDS均能溶解病毒囊膜蛋白VP16，0.1% SDS已能完全溶解病毒囊膜而不破坏衣壳的完整性，达到分离病毒囊膜的效果，因此可能是一种比较合适的分离石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的方法（图 1a）。

3.2不同的表面活性剂处理后的电镜观察结果

电镜在确定病毒形态结构等方面具有其它方法不可代替的作用。我们对三种去垢剂处理后的病毒形态和结构进行了电镜观察。结果显示蔗糖密度梯度纯化的病毒粒子结构完整，可以观察到明显的病毒囊膜，形态为标准的六边形（图 2）。1% Triton X-100和1% NP-40处理病毒囊膜不完全，在处理后的病毒粒子中仍可以观察到残留的病毒囊膜（图 2）。0.1% SDS处理后的病毒粒子衣壳结构完整，而且观察不到囊膜（图 2）。电镜观察结果说明0.1% SDS 室温处理30分钟能溶解病毒囊膜而不破坏衣壳的完整性，与上述Western blot检测的结果一致。

3.3 三种已知病毒结构蛋白Western blot结果    

为了进一步验证0.1% SDS分离SGIV囊膜蛋白的可靠性，我们用3个病毒结构蛋白抗体（VP88、VP90和VP38）Western blot检测0.1% SDS分离病毒囊膜后各蛋白的分布。与之前的研究报道一致，囊膜蛋白VP88和VP90全部在上清中，而衣壳蛋白VP38与MCP一样，全部分布在沉淀（图 1d）。

由以上结果可知0.1% 的SDS能完全溶解病毒囊膜而不影响病毒衣壳的完整性，因此能分离出SGIV囊膜蛋白，为防治虹彩病毒病害和病毒疫苗的研制提供有力的科学依据与应用基础。

Claims (9)

1.一种石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法，其特征在于包括以下步骤：①石斑鱼胚胎细胞接种石斑鱼虹彩病毒，待细胞出现完全病变效应时，收集病毒悬液；②收集的病毒悬液冻融2-3次，去除细胞碎片，取上清液进行超速离心，收集病毒粒子，用蔗糖密度梯度离心得到纯化的病毒粒子；③将纯化的病毒粒子用质量分数0.1% SDS室温处理30分钟。

2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤②所述超速离心为28000rpm离心90分钟。

3. 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤②冻融是指将病毒悬液放入低温冰箱或液氮中冻存后室温溶解。

4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤①是将接种病毒的石斑鱼胚胎细胞经过磷酸缓冲盐溶液漂洗后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶消化1-2分钟，加入新配置的pH 7.4～7.6的含8-10%胎牛血清的MEM培养液，25-28℃进行培养扩增；待细胞生长至对数期时接种0.01-0.1 MOI的病毒，于25-28℃培养3-4天后，收集病毒悬液。

5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤②去除细胞碎片的方法为12,000g离心30分钟，取出上清液，其沉淀用磷酸缓冲盐溶液重悬并反复冻融3次后再超声波破碎，4,000g离心20分钟。

6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤②所述蔗糖密度梯度离心为将病毒悬浮液加于30%-60%蔗糖密度梯度上，150,000 g 4℃离心1小时，收集密度梯度40%-50%之间的条带，溶于TN buffer中；100,000 g 4℃离心1小时得到纯化的病毒粒子。

7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤①收集的病毒悬液于-20～-80℃冻存保存。

8.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤②收集的病毒粒子用磷酸缓冲盐溶液重悬溶解后再进行蔗糖密度梯度离心。

9.如权利要求6所述的提取方法，其特征在于所述TN buffer为50 mM Tris /HCl与150 mM NaCl的混合物，其pH 为7.5。

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