CN105012935A - Ifitm3蛋白装载的外泌体在制备抗登革病毒干扰素拮抗株感染药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了IFITM3蛋白（跨膜蛋白3）装载的外泌体在制备抗登革病毒干扰素拮抗株感染药物中的应用，其作用机制为高表达IFITM3的外泌体能够高效地抑制登革病毒干扰素拮抗株吸附宿主细胞后的穿入过程。本发明建立了以IFITM3蛋白装载的外泌体抗登革病毒干扰素拮抗株的新策略，包装有抗病毒蛋白的外泌体是否可以代替干扰素直接应用于抗干扰素拮抗株病毒药物研发，这开拓了人源化抗病毒蛋白在抗病毒防治领域的临床应用新领域，从而为新型抗干扰素拮抗病毒的药物开发提供新的思路及方向。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域，更具体地，涉及IFITM3蛋白装载的外泌体在制备抗登革病毒干扰素拮抗株（DENV-2 NGC）感染药物中的应用。
背景技术
登革病毒（dengue virus, DENV）属于黄病毒科黄病毒属中的一个病毒种，根据抗原表位的不同分为1，2，3，4四种血清型（DENV1~4）。登革病毒主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）等昆虫媒介传播，引起登革热（dengue fever, DF），以及病死率较高的登革出血热（dengue hemorrhagic fever, DHF）和登革休克综合征（dengue shock syndrome, DSS）。目前，登革热被列为全球最重要的蚊虫传播性疾病，已成为一个严重的全球性公共卫生问题。尽管如此，目前国内外尚无有效的预防性疫苗，也无针对病毒的特效性治疗药物。
干扰素（interferon, IFN），是由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的。IFN是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制，同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。是目前最主要的抗病毒感染的生物制品。2008年，研究人员发现一株2型登革病毒株DENV2 New Guinea C (NGC) (GenBank accession number M29095)可以抑制宿主细胞的干扰素免疫应答，并最终确定这种抑制效应是毒株特异性而非血清型特异性。该株登革病毒拮抗干扰素的机制目前正研究中：（1）其中很重要的一个方面是，登革病毒具有拮抗IFN-I产生的能力。据报道，登革病毒NS2B/3蛋白酶通过靶向人细胞的MITA/STING蛋白，干扰RIG-I和MDA5的信号传递，抑制宿主细胞IFN-I的产生。（2）另外研究发现，登革病毒NS5与STAT2相结合，NS5蛋白通过蛋白酶体介导STAT2的降解而抑制IFN-I下游信号途径。目前国内外尚未有针对干扰素拮抗病毒株感染的特异性有效治疗药物。
1984年，Friedman等人在经IFN处理的神经细胞瘤细胞进行cDNA筛查时首次发现干扰素诱导跨膜蛋白家族（interferon-inducible transmembrane proteins, IFITM），位于11号染色体上。人类该基因具有ifitm1、ifitm2、ifitm3、ifitm5四种类型，表达的蛋白为14-17 kD的跨膜蛋白。2009年Brass等]研究者基于大规模RNA干扰技术的基因组功能筛查，发现IFITM家族蛋白作为一种干扰素诱导的抗病毒蛋白，能较强的抑制流感病毒和黄病毒的对宿主细胞穿入过程，进而发挥高效的抗流感病毒活性。接着，相继揭示了IFITM蛋白具有广谱的抗病毒活性。但是，IFITM蛋白在宿主细胞中参与抑制病毒穿入的具体分子机制，以及该蛋白参与宿主的抗病毒天然免疫的作用方式尚未明确还有待深入研究。
外泌体（exosome）又称胞外体，是由细胞内的多泡体（multivesicularbody, MVB）与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种膜性囊泡，大小为40～100 nm大小。目前研究发现在病毒感染时，宿主细胞会将干扰素诱导的抗病毒蛋白包装成外泌体形式，进行抗病毒蛋白的细胞间传递，使宿主形成更强的抗病毒免疫状态。2013年，袁正宏教授的研究团队发现包装了抗病毒分子的外泌体可直接在肝细胞间传递，进而增强了IFN-α诱导的抗病毒免疫应答。外泌体传递宿主细胞抗病毒蛋白，为新型抗病毒药物的开发开拓了新的方向。本研究通过探索包装抗病毒蛋白的外泌体，是否可以特异性地作用于干扰素拮抗的登革病毒株（DENV-2 NGC），如此可对未来的病毒性病原体所致的疾病的防治提供新的线索与思路。
发明内容
本发明人通过研究发现，通过本发明提供的IFITM3蛋白装载的外泌体能够特异性抗登革病毒干扰素拮抗株（DENV-2 NGC），其作用机制为高表达IFITM3蛋白的外泌体能够特异性地抑制登革病毒干扰素拮抗株（DENV-2 NGC）穿过宿主细胞膜进入宿主细胞的过程。这就为新型抗干扰素拮抗株病毒药物的开发和机体天然免疫机制的研究开拓了新的方向。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
1. 构建高表达IFITM3重组质粒，制备方法为：
1）根据IFITM3的基因序列，设计正向引物，如SEQ ID NO：1所示，设计反向引物，如SEQ ID NO：2所示；
2）根据PCR扩增产物，反应条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸7 min，然后将所有扩增产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；
3）利用QIAprep spin miniprep kit抽提质粒，将pMSCV质粒DNA与IFITM3基因片段PCR产物进行双酶切反应和连接，测序比对后，利用氯化铯梯度离心法提取pMSCV- IFITM3重组质粒DNA。
2. IFITM3蛋白装载的外泌体的制备方法：
1）构建IFITM3稳定高表达的293T细胞株。
2）收集高表达IFITM3的293T细胞培养基上清。
3）将上清采用蔗糖密度梯度超速离心法即得所述外泌体。
3. IFITM3蛋白装载的外泌体的产量的鉴定方法：
应用Western Blotting检测蔗糖密度梯度超速离心法得到的外泌体中IFITM3的蛋白水平。
4. IFITM3蛋白装载的外泌体将IFITM3蛋白传递给受体细胞的鉴定方法：
1）采用IFITM3蛋白装载的外泌体处理HeLa细胞不同时间点后。
2）应用Western Blotting检测HeLa细胞中IFITM3的蛋白水平。
5. IFITM3蛋白装载的外泌体的活性鉴定方法：
1）采用IFITM3蛋白装载的外泌体处理HeLa细胞。
2） 24h后感染DENV-2 NGC，感染48h后提取细胞及上清的RNA。
3）应用实时荧光定量RT-PCR检测细胞内及上清中病毒的RNA的拷贝数。
6. 外泌体将抗病毒蛋白IFITM3传递给受体细胞后，受体细胞是否能获得抗病毒能力，鉴定方法：
1）采用IFITM3蛋白装载的外泌体处理HeLa细胞。
2）24h后感染DENV-2 NGC，感染48h固定细胞。
3）应用免疫荧光的方法检测经过包装有IFITM3的外泌体处理的HeLa细胞的病毒感染情况。
7. IFITM3蛋白装载的外泌体是否会刺激受体细胞产生干扰素，鉴定方法：
1）采用IFITM3蛋白装载的外泌体处理HeLa细胞。
2）24h后应用ELISA检测受体细胞HeLa的培养上清中的IFN-α和IFN-β的蛋白水平。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所提供的IFITM3蛋白装载的外泌体可以传递宿主细胞抗病毒蛋白，并特异性的抑制登革病毒干扰素拮抗株（DENV-2 NGC）。这就为新型抗干扰素拮抗株病毒药物的开发和机体天然免疫机制的研究开拓了新的方向。
附图说明
图1是高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的exosome中IFITM3蛋白表达的Western Blotting鉴定结果图。
图2是用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的exosome处理HeLa细胞后，HeLa细胞中IFITM3蛋白表达变化的电泳图。
图3是用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的exosome处理对照组的HeLa细胞以及沉默了内源性IFITM3的HeLa细胞不同的时间点后，HeLa细胞中IFITM3蛋白表达变化的时间效应的电泳图。
图4是实时荧光定量RT-PCR方法检测用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的exosome处理HeLa细胞后，HeLa细胞内感染的DENV-2 NGC RNA结果图。
图5是Real time RT-PCR方法检测用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的exosome处理HeLa细胞后，HeLa细胞培养基上清中的DENV-2 NGC RNA结果图
图6是免疫荧光方法检测用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的exosome处理HeLa细胞后，HeLa细胞病毒感染情况的结果图
图7是用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的exosome处理HeLa细胞，培养上清中IFN-α蛋白含量的ELISA结果图。
图8是用高表达IFITM3的293T细胞裂解液及培养上清中提取的exosome处理HeLa细胞，培养上清中IFN-β蛋白含量的ELISA结果图。
具体实施方式
下面结合一些具体实施方式对本发明做进一步解释和说明。具体实施例为进一步详细说明本发明，非限定本发明的保护范围。
实施例1：pMSCV-IFITM重组质粒的构建、鉴定及提取
从GenBank数据库下载IFITM3基因序列，利用Primer Premier 5.0软件自行设计一对引物扩增全长IFITM3基因，引物由上海英俊生物公司合成。引物序列为：
Forward: 5’GGAAGATCTGCCATGAATCACACTGTCCAAACCTTC
Reverse:5’CCGGAATTCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATCCATAGGCCTGGAAGATCAG
利用Trizol法提取细胞总RNA后，以核酸蛋白定量仪分别测定 RNA浓度，根据所测得的浓度，将全部RNA用无RNA酶的水稀释成终浓度为1 μg/μl。我们利用提取到的细胞RNA得到IFITM3基因的cDNA产物，再根据PCR扩增产物，反应条件如下：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 延伸7 min。将所有扩增产物用1.5 %琼脂糖凝胶（含终浓度为0.5 μg/ml的EB）电泳并切胶回收纯化。
利用QIAprep spin miniprep kit抽提质粒，将pMSCV质粒DNA与IFITM3基因片段PCR产物进行双酶切反应和连接，在200 μl DH5α感受态细菌中加入10 μl连接产物中，37 ℃ 培养箱中，倒置平板培养12～16 h至长出菌落。最后挑取单菌落接种于3 ml含氨苄青霉素（50 μg/ml）的LB培养液中，37℃ 300 rpm摇菌过夜。
经双酶切鉴定正确的阳性克隆菌送上海英俊公司测序，利用DNASTAR软件系统的SeqMan模块程序对测序结果进行序列比对分析。确定无误后，利用氯化铯梯度离心法大量提取pMSCV-IFITM3重组质粒DNA。
实施例2：稳定高表达外源性IFITM细胞系的建立
1. 磷酸钙法转染制备逆转录病毒：取对数期生长的293FT，将20μg的重组质粒、20μg包装质粒pIK、380 μl 1×TE、60 μl 2M CaCl2 混匀后，再逐滴缓慢加入480 μl 2×HEPES，将混合液均匀加入的293FT的培养基内，同时加入10 μl氯喹（100 μM）并轻柔混匀，将细胞置于37 ℃，5 % CO2细胞培养箱培养。
2. 收集病毒并感染HEK-293T细胞:次日8时、12时、16时、20时、24时收集病毒液，并用0.22 μm孔径滤器过滤。其中8时、12时、16时、20时收集的病毒液加入Polybrane（40 μg/ml）立即感染HEK-293T细胞，24时收集的病毒液冻存于-80 ℃ 备用，感染病毒结果如图1所示。
3. 嘌呤霉素筛选阳性细胞:感染结束后，更换成含有嘌呤霉素（0.5 μg/ml）的培养基筛选阳性细胞。
4. Western blotting:收集细胞的总蛋白，Western blotting检测IFITM的表达情况，以Actin作为内源性对照。
实施例3：绝对定量方法检测登革病毒拷贝数
标准样品制备
（1）以带有登革病毒NS1基因的质粒DNA（pCDEF-NS1）为模板，利用含T7启动子序列的引物进行PCR扩增获得T7-NS1基因产物，并且将该PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化回收，得到目的基因T7-NS1 DNA产物。
（2）接着采用MEGAscript? T7 Kit（Ambion）对T7-NS1 DNA产物进行体外的RNA转录。
（3）4 h后，往反应物中加入1 μl DNase I，置于37℃，继续反应15 min。
（4）酚-氯仿提纯和异丙醇沉淀：反应物中加入115 μl Nuclease-free Water，以及15 μl Ammonium Acetate Stop Solution，充分混匀，终止反应。加入等体积的酚-氯仿进行RNA纯化，并用异丙醇进行RNA沉淀。最后用Nuclease-free Water重悬RNA，得到标准样品RNA。
（5）RNA定量和计算拷贝数：用微量核酸定量仪Nanodrop1000 (Thermo)，测定RNA的浓度，并且按以下方法计算RNA的拷贝数：
拷贝数（copies/ml）= (6.02×1023拷贝数/摩尔)×(浓度 g/ml)/(MW g/mol)
[平均分子量(MW g/mol)：ssRNA=(碱基数)×(340 道尔顿/碱基)]
实施例4：一步法RT-PCR检测病毒核酸
将标准RNA样品进行10倍系列稀释，分别稀释成1010、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100 copies/μl，采用SuperScript? III One-Step RT-PCR System（Invitrogen）对标准样品以及待测样品进行RT-qPCR反应。
具体反应体系如下：
具体反应条件如下：
反应结束后，利用标准样品数据，以Ct值为纵坐标，Log(拷贝数)为横坐标，描绘标准曲线，并根据待测样品的Ct值计算其拷贝数。
实施例5：外泌体的获得
（1）细胞在含l0 %无exosome-FBS（去除FBS中含有的exosome：120,000 × g, 12h） DMEM培养基中(内含0.1 %青霉素、链霉素)，并置于37 ℃ ，5 % CO2培养箱内进行培养。当培养到80%~90%的细胞密度时，收集细胞上清，-20 ℃ 保存。
（2）取细胞培养上清，1000 × g低温（4℃）离心10 min，接着10，000 × g离心10 min，为了去除细胞和细胞碎片。然后再用0.22 μm 滤器（Pall Life Sciences, Port Washington, NY）过滤去除大于200 nm的颗粒，以进一步去除细胞和细胞碎片。
（3）将上清转移至超速离心管(Beckman Coulter Inc., Munich, Germany)，150，000 × g低温（4℃）离心2 h，沉淀即为crude exosome。
（4）为了进一步纯化exosome，将已得到的crude exosome与2 ml 2.5 M的蔗糖PBS溶液充分混匀后，转移至超速离心管底(Beckman Coulter Inc., Munich, Germany)，上面一层覆盖6 ml 2 M的蔗糖PBS溶液，再上面一层覆盖3 ml 0.25 M的蔗糖PBS溶液，接着150，000 × g低温（4℃）离心16 h。
（5）收集富集在2 M/0.25 M 这一层的exosome，然后用PBS洗两次，接着150，000 × g低温（4℃）离心90 min。
（6）去上清，收集沉淀，并用PBS进行重悬，-80 ℃保存备用。
（7）采用BCA法定量外泌体的蛋白含量。
（8）外泌体的电镜观察：滴约10 μg 外泌体悬液于载样铜网上，室温放置10 min，用滤纸从侧面吸干液体，滴加2％磷钨酸溶液(pH 6.8)，室温负染2 mim，滤纸吸干负染液，白炽灯下烤干约l0 mim，于透射扫描电镜下观察拍照。
实施例6：证明培养上清中分离得到的外泌体中包装有IFITM3.
前研究表明IFITM3为跨膜蛋白形式，而我们的研究中发现细胞裂解液和细胞培养上清中均能检测到IFTIM3蛋白，这就提示我们IFITM3是可以分泌到细胞外的，而通过氨基酸序列分析预测，IFITM3并不包含有细胞外分泌的信号肽，所以为了探明IFITM3的细胞外蛋白形式是否为分泌性蛋白形式，或是外泌体(exosome)形式。我们采用超速离心技术，从稳定高表达IFITM3的HEK-293T细胞培养上清中分离提纯得到外泌体，如图1中所示，通过Western Blotting检测，以外泌体的标志蛋白Flotillin-2和CD63作为外泌体对照，以内质网的标志蛋白calnexin和高尔基体标志蛋白GM130作为非外泌体对照，结果显示纯化的exosome中Flotillin-2和CD63阳性，且均检测到较多的IFITM3蛋白，而calnexin和GM130均为阴性（图1）。
实施例7：IFITM3外泌体形式的抗登革病毒活性检测
本研究采用超速离心技术，针对于IFITM内源性高表达的易感细胞HUVEC，以内源性沉默IFITM3的HUVEC，收集培养基上清分离纯化获得外泌体。分别以总蛋白浓度60 μg的IFITM3外泌体作用于IFITM3内源性沉默后的HeLa细胞，以分别提取各组细胞总蛋白经Western blotting 检测，以Actin作为内源性对照。结果显示，HUVEC培养基上清来源的IFITM3外泌体处理24 h后，HeLa受体细胞中IFITM3均呈明显增多趋势（图2）。这说明IFITM3外泌体可在细胞间进行传递。
以60 μg总蛋白浓度作用于HeLa细胞不同时间（6 h, 12h, 24 h, 48 h），分别提取各组细胞总蛋白经Western blotting 检测，以Actin作为内源性对照。如图3所示，IFITM3外泌体处理24 h后，HeLa细胞中IFITM3开始呈明显增多趋势，并呈时间依赖性效应。
为了进一步验证IFITM3通过exosome形式传递到接受细胞后，是否可以传递抗登革病毒的活性，我们的研究中就分别以30 μg、60 μg不同浓度的293T-IFITM3-exosome和293T-Vector- exosome作用于HeLa细胞24 h后，再以病毒滴度为2 MOI的DENV-2 NGC病毒株感染24 h后，分别提取细胞的总RNA以及培养基上清中总RNA。应用相对定量法Real time RT-PCR方法检测细胞内感染的病毒RNA，以GAPDH作为内源性对照；并应用绝对定量法Real time RT-PCR检测培养基上清中病毒RNA。如图4及图5所示，包装有IFITM3外泌体具有明显的抗DENV-2 NGC病毒株感染的活性，并呈浓度依赖性效应。如图6所示，免疫荧光的结果同样验证了包装有IFITM3外泌体具有明显的抗DENV-2 NGC病毒株感染的活性。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> IFITM3蛋白装载的外泌体在制备抗登革病毒干扰素拮抗株感染药物中的应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213>
<400> 1
ggaagatctg ccatgaatca cactgtccaa accttc 36
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213>
<400> 2
ccggaattcc taagcgtagt ctgggacgtc gtatgggtat ccataggcct ggaagatcag 60
Claims (6)
1. IFITM3蛋白装载的外泌体在制备抗登革病毒干扰素拮抗株感染药物中的应用，其特征在于，所述外泌体可以特异性的作用于登革病毒干扰素拮抗株，抑制病毒穿过细胞膜进入细胞内；
所述外泌体的制备方法为构建IFITM3稳定高表达的HEK-293T细胞株，收集高表达IFITM3的293T细胞培养基上清，并采用蔗糖密度梯度超速离心法离心所得上清，即得所述外泌体。
2. 根据权利要求1所述的IFITM3蛋白装载的外泌体在制备抗登革病毒干扰素拮抗株感染药物中的应用，其特征在于，所述外泌体的产量鉴定方法为应用Western Blotting检测蔗糖密度梯度超速离心法得到外泌体中IFITM3的蛋白水平。
3. 根据权利要求1所述的IFITM3蛋白装载的外泌体在制备抗登革病毒干扰素拮抗株感染药物中的应用，其特征在于，所述外泌体将IFITM3传递给受体细胞，鉴定方法为采用所述外泌体处理HeLa受体细胞后，应用Western Blotting检测HeLa细胞中IFITM3的蛋白水平。
4. 根据权利要求1所述的IFITM3蛋白装载的外泌体在制备抗登革病毒干扰素拮抗株感染药物中的应用，其特征在于，所述外泌体的活性鉴定方法为应用实时荧光定量法检测细胞内感染的登革病毒RNA和培养基上清中病毒RNA。
5. 根据权利要求1所述的IFITM3蛋白装载的外泌体在制备抗登革病毒干扰素拮抗株感染药物中的应用，其特征在于，所述外泌体将抗病毒蛋白IFITM3传递给受体细胞后，受体细胞是否能获得抗病毒能力，鉴定方法为应用免疫荧光的方法检测经过所述外泌体处理的HeLa受体细胞的病毒感染情况。
6. 根据权利要求1所述的IFITM3蛋白装载的外泌体在制备抗登革病毒干扰素拮抗株感染药物中的应用，其特征在于，所述外泌体是否会刺激受体细胞产生干扰素，鉴定方法为应用ELISA检测受体细胞HeLa的培养上清中的IFN-α和IFN-β的蛋白水平。
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