CN104587447A - 一种跨膜蛋白3包装的外泌体在制备抗登革病毒感染药物中的应用 - Google Patents
一种跨膜蛋白3包装的外泌体在制备抗登革病毒感染药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种跨膜蛋白3包装的外泌体在制备抗登革病毒感染药物中的应用，所述外泌体的制备方法为收集高表达跨膜蛋白3的人脐静脉内皮细胞培养基上清，将上清采用蔗糖密度梯度超速离心法即得所述外泌体，其作用机制为高表达跨膜蛋白3的外泌体能够较强抑制登革病毒吸附穿入宿主细胞。本发明建立了以跨膜蛋白3包装的外泌体抗登革病毒的新策略，抗病毒蛋白包装的外泌体是否可以代替干扰素直接应用于抗病毒药物研发，这开拓了人源化抗病毒蛋白在抗病毒防治领域的新视野及新应用，从而为新型抗病毒药物的开发提供新的思路及方向。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域，更具体地，涉及一种跨膜蛋白3包装的外泌体在制备抗登革病毒感染药物中的应用。
背景技术
外泌体（exosome）又称胞外体，是由细胞内的多泡体(multivesicularbody, MVB)与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种膜性囊泡(vesicles)。exosome这个术语最初由Johnstone等报道提出并命名，他们在研究网织红细胞向成熟红细胞转变过程中，从体外培养羊网织红细胞的上清液中，分离纯化了这种小囊泡状物质，它可以带走成熟红细胞不需要的质膜蛋白，如转铁蛋白受体和乙酰胆碱脂酶等。外泌体起源于细胞内吞过程中的内体（endosome），内体的外膜向其腔内出芽，形成一个膜包裹的结构，其基部逐渐与内涵体的膜分离，脱落后就形成了内体内的小囊泡（40～100 nm大小），同时可有多个小囊泡形成，而含有多个小囊泡的内体又称为多泡体（500 nm大小）。多泡体的代谢途径一般有两种：一是与质膜融合，将其中的小囊泡以胞吐的方式排到细胞外环境，即成为外泌体：另一种是在胞内与溶酶体（lysosome）融合，导致其内容物的降解。随后研究报道外泌体又从其他类型细胞的培养基与体液中被分离出来。
外泌体参与机体的多种功能，包括参与清除细胞冗余成分、介导细胞粘附及信号传递、抗原提呈、细胞间传递遗传物质；另外，外泌体具有促病毒感染与抑制病毒感染双重功能：1.外泌体传递病毒颗粒——介导病毒的感染；2.外泌体传递病毒结构或非结构蛋白——参与病毒逃避机体免疫监视；3.外泌体传递宿主细胞抗病毒蛋白——参与宿主天然抗病毒免疫调节。
既然外泌体能够包装各种蛋白，那么在病毒感染时，如果宿主细胞将干扰素诱导的抗病毒蛋白包装成外泌体形式，进行抗病毒蛋白的细胞间传递，直接使宿主形成更强的抗病毒免疫状态，这将提出宿主天然免疫调节新型模式。Khatua等科学家研究发现包装了APOBEC3G蛋白的外泌体可直接传递到宿主细胞而具极强的抗HIV-1病毒感染的功效。作为一种机体天然抗病毒因子，APOBEC3G是一种胞嘧啶脱氨基酶家族成员，近年来因其独特的抗病毒作用机制受到了广泛的关注。HIV-1在宿主细胞复制过程中，APOBEC3G可以大量包装进入新生成的病毒颗粒内部，诱导病毒负链cDNA胞嘧啶(cytimidine, C)脱氨基突变为尿嘧啶(uracil,U)，导致病毒基因组高度突变而丧失活性。但是，HIV编码的Vif蛋白能拮抗APOBEC3G的脱氨基酶作用，二者形成动态平衡，所以HIV最终还是能够逃脱APOBEC3G的抗病毒作用。而APOBEC3G外泌体不但直接参与了宿主抵抗HIV入侵的防御机制，而且可以避免HIV的Vif蛋白的拮抗作用，具体分子机制未明。外泌体传递宿主细胞抗病毒蛋白，为新型抗病毒药物的开发和机体天然免疫机制的研究开拓了新的方向，可对未来的病毒性病原体所致的疾病的防治提供新的线索与思路。本研究通过探索包装抗病毒蛋白的外泌体，是否可以直接代替干扰素的抗病毒作用，如此可拓展人体天然抗病毒蛋白的临床应用。
发明内容
本发明人通过研究发现，跨膜蛋白3作为外泌体的新型生物活性形式，外泌体传递宿主细胞抗病毒蛋白，打破了现有技术中采用干扰素诱导产生抗病毒蛋白的思路，为新型抗病毒药物的开发和机体天然免疫机制的研究开拓了新的方向。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种IFITM3(跨膜蛋白3)包装的外泌体在制备抗登革病毒感染药物中的应用，所述外泌体的制备方法为收集高表达IFITM3的人脐静脉内皮细胞培养基上清，将上清采用蔗糖密度梯度超速离心法即得所述外泌体。
优选地，所述高表达IFITM3重组质粒的制备方法为：
S1：根据IFITM3的基因序列，设计正向引物，如SEQ ID NO：1所示，设计反向引物，如SEQ ID NO：2所示；
S2：根据PCR扩增产物，反应条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸7 min，然后将所有扩增产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；
S3：利用QIAprep spin miniprep kit抽提质粒，将pMSCV质粒DNA与IFITM3基因片段PCR产物进行双酶切反应和连接，测序比对后，利用氯化铯梯度离心法提取pMSCV- IFITM3重组质粒DNA。
优选地，所述IFITM3包装的外泌体的产量鉴定方法为采用IFITM3包装的外泌体处理HeLa受体细胞后，检测HeLa细胞中IFITM3的蛋白水平。
优选地，所述IFITM3包装的外泌体的活性鉴定方法为应用real time RT-PCR检测细胞内感染的登革病毒RNA和培养基上清中病毒RNA。
本研究首先证明了登革病毒感染可诱发宿主细胞内高表达IFITM，继而分别通过逆转录病毒表达质粒和磷酸钙转染技术构建IFITM外源性稳定及瞬时高表达体系，应用western blotting技术、流式细胞术来证明IFITM3蛋白的抗登革病毒感染的活性。同时，还将应用RNA干扰技术沉默IFITM表达，以明确其是否能增强登革病毒感染，用以探讨宿主细胞的内源性IFITM蛋白是否具有抗登革病毒感染能力。另一方面，本实验利用逆转录病毒系统构建稳定高表达IFITM3蛋白的293T细胞系，并且利用超速分级离心技术成功获得了293T-IFITM3细胞系上清中的外泌体，应用透射电镜技术、质谱技术等方法证明上清中的IFITM蛋白是外泌体形式，应real time
RT-PCR技术证明IFITM3蛋白的外泌体形式的高效抗登革病毒活性。由此提出了以IFITM3包装的新型内源性外泌体应用于抗登革病毒治疗的新策略。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所提供的外泌体可以传递宿主细胞抗病毒蛋白，从而为新型抗病毒药物的开发和机体天然免疫机制的研究开拓了新的方向，可对未来的病毒性病原体所致的疾病的防治提供新的线索与思路。同时，抗病毒蛋白外泌体是否可以代替干扰素直接应用于抗病毒药物研发，这将开拓人源性抗病毒蛋白在抗病毒防治的临床应用新领域。
附图说明
图1是一系列易感细胞感染登革病毒后E蛋白的表达情况以及感染后IFITM3蛋白的表达变化情况的电泳图；
图2是稳定高表达外源性IFITM1,2,3的U937-IFITM1,2,3细胞的建立并经电泳证实的结果图；
图3是流式细胞仪检测外源性稳定高表达IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白对U937细胞的抗登革病毒感染作用的结果图；
图4是IFITM内源性高表达的HUVEC的培养基上清中存在IFITM3蛋白的电泳鉴定图；
图5是所述外泌体的透射电子电镜观察鉴定结果图；
图6是所述外泌体中存在IFITM3蛋白的电泳结果图；
图7是所述外泌体中存在IFITM3蛋白质谱技术鉴定结果图；
图8是所述IFITM3外泌体处理HeLa细胞内的IFITM3蛋白变化电泳结果图；
图9是所述IFITM3外泌体处理后HeLa细胞内的IFITM3蛋白变化的时间-效应电泳结果图；
图10是Real time RT-PCR方法检测细胞内感染的DENV
RNA结果图；
图11是Real time RT-PCR方法检测培养基上清中的DENV
RNA结果图。
具体实施方式
下面结合一些具体实施方式对本发明做进一步解释和说明。具体实施例为进一步详细说明本发明，非限定本发明的保护范围。
实施例1：pMSCV-IFITM重组质粒的构建、鉴定及提取
从GenBank数据库下载IFITM1、IFITM2、IFITM3基因序列，利用Primer Premier 5.0软件自行设计一对引物扩增全长IFITM1/2/3基因，引物由上海英俊生物公司合成，引物系列如下：正向引物序列如下：GGAAGATCTGCCATGAATCACACTGTCCAAACCTTC；反向引物序列如下：CCGGAATTCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATCCATAGGCCTGGAAGATCAG。
利用Trizol法提取细胞总RNA后，以核酸蛋白定量仪分别测定 RNA浓度，根据所测得的浓度，将全部RNA用无RNA酶的水稀释成终浓度为1 μg/μl。我们利用提取到的细胞RNA得到IFITM1/2/3基因的cDNA产物，再根据PCR扩增产物，反应条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。将所有扩增产物用1.5 %琼脂糖凝胶（含终浓度为0.5 μg/ml的EB）电泳并切胶回收纯化。
利用QIAprep spin miniprep kit抽提质粒，将pMSCV质粒DNA与IFITM1/2/3基因片段PCR产物进行双酶切反应和连接，在200 μl DH5α感受态细菌中加入10 μl连接产物中，37 ℃培养箱中，倒置平板培养12～16 h至长出菌落。最后挑取单菌落接种于3 ml含氨苄青霉素（50 μg/ml）的LB培养液中，37℃ 300 rpm摇菌过夜。
经双酶切鉴定正确的阳性克隆菌送上海英俊公司测序，利用DNASTAR软件系统的SeqMan模块程序对测序结果进行序列比对分析。确定无误后，利用氯化铯梯度离心法大量提取pMSCV-IFITM1,2,3重组质粒DNA。
实施例2：稳定高表达外源性IFITM细胞系的建立
1.磷酸钙法转染制备逆转录病毒：取对数期生长的登革病毒易感细胞HEK-293T、U937，分别将20μg的各种重组质粒、20μg包装质粒pIK、380 µl 1×TE、60 µl
2M CaCl2 混匀后，再逐滴缓慢加入480 µl 2×HEPES，将混合液均匀加入的HEK-293T的培养基内，同时加入10 µl氯喹（100 µM）并轻柔混匀，将细胞置于37 ℃，5 %CO2细胞培养箱培养。
2.收集病毒并感染U937细胞:次日8时、12时、16时、20时、24时收集病毒液，并用0.22 µm孔径滤器过滤。其中8时、12时、16时、20时收集的病毒液加入Polybrane（40 μg/ml）立即感染U937细胞，24时收集的病毒液冻存于-80 ℃备用，感染病毒结果如图1所示。
3.嘌呤霉素筛选阳性细胞:感染结束后，更换成含有嘌呤霉素（0.5 μg/ml）的培养基筛选阳性细胞。
4.Western blotting:收集细胞的总蛋白，Western
blotting检测IFITM的表达情况，以Actin作为内源性对照。结果证明U937细胞系的IFITM1、2、3蛋白表达均升高，稳定高表达外源性IFITM细胞系建立成功，见图2。图2是稳定高表达外源性U937细胞系的IFITM1、2、3蛋白表达情况的Western Blotting结果。
实施例3：流式细胞技术检测病毒感染情况
固定：将细胞去培养上清，1×PBS洗3次，接着细胞中加入1×PBS，用细胞刮从培养皿上刮取收集细胞，用吸管轻轻反复吹打细胞，制成单细胞悬液，转移至离心管中，1500 rpm，4 ℃离心3 min。弃去上清，用预冷的1×PBS洗涤细胞2次后，1500 rpm离心3 min。去上清，加入1 ml 4 %多聚甲醛重悬细胞，37 ℃固定10 min后，置于冰上1 min。
透化处理：细胞固定完后，离心去多聚甲醛，加入预冷的90 %甲醇，混匀，冰上放置30 min。
免疫染色：细胞透化处理完成后，1500 rpm，4 ℃离心3 min离心去甲醇，并用1×PBS洗3次，接着将细胞用含0.5 % BSA的1×PBS进行重悬，室温封闭10 min。封闭完，加入含抗登革病毒抗体的1×PBS溶液，室温孵育1 h。随后离心，细胞用含有带FITC荧光标记的二抗goat anti-mouse IgG-FITC的1×PBS进行重悬，室温避光孵育30 min。最后，将细胞离心并使用0.5ml
1×PBS重悬后。
整个操作动作要尽量小心轻柔，勿用力吹打细胞，操作时注意避光，反应完毕后1 h内进行下述流式细胞仪的观察和检测。
流式细胞仪分析：用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。FITC 的绿色荧光通过FITC 通道检测。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置
实施例4：外源性稳定高表达IFITM蛋白对登革病毒感染影响
1. 采用实施例3所述流式细胞技术检测病毒对高表达IFITM蛋白的U937细胞系的感染：以病毒滴度为1 MOI的DENV-2
NGC病毒株感染U937细胞系后培养24h，后将细胞去培养上清固定，离心去多聚甲醛，加入预冷的90 %甲醇，混匀，冰上放置30
min作透化处理。细胞透化处理完成后，1500 rpm，4 ℃离心3 min离心去甲醇，并用1×PBS洗3次，接着将细胞用含0.5 % BSA的1×PBS进行重悬，室温封闭10 min。封闭完，加入含抗登革病毒抗体的1×PBS溶液，室温孵育1 h。随后离心，细胞用含有带FITC荧光标记的二抗goat anti-mouse IgG-FITC的1×PBS进行重悬，室温避光孵育30 min。最后，将细胞离心并使用0.5ml
1×PBS重悬后，进行流式细胞仪的观察和检测。
2.结果显示，外源性稳定高表达IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白均能较强的抑制登革病毒的感染，见图3。对于U937-Vector和U937-IFITM1、U937-IFITM2、U937-IFITM3细胞，各组登革病毒感染率分别为56.64
%、18.75 %、20.13
%、15.20 %。
实施例5：绝对定量方法检测登革病毒拷贝数
标准样品制备
（1）以带有登革病毒NS1基因的质粒DNA（pCDEF-NS1）为模板，利用含T7启动子序列的引物进行PCR扩增获得T7-NS1基因产物，并且将该PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化回收，得到目的基因T7-NS1 DNA产物。
（2）接着采用MEGAscript®
T7 Kit（Ambion）对T7-NS1
DNA产物进行体外的RNA转录。
（3）4 h后，往反应物中加入1 μl DNase I，置于37℃，继续反应15 min。
（4）酚-氯仿提纯和异丙醇沉淀：反应物中加入115 μl Nuclease-free Water，以及15 μl Ammonium Acetate Stop Solution，充分混匀，终止反应。加入等体积的酚-氯仿进行RNA纯化，并用异丙醇进行RNA沉淀。最后用Nuclease-free
Water重悬RNA，得到标准样品RNA。
（5）RNA定量和计算拷贝数：用微量核酸定量仪Nanodrop1000 (Thermo)，测定RNA的浓度，并且按以下方法计算RNA的拷贝数：
拷贝数（copies/ml）=
(6.02×1023拷贝数/摩尔)×(浓度 g/ml)/(MW g/mol)
[平均分子量(MW g/mol)：ssRNA=(碱基数)×(340 道尔顿/碱基)]
实施例6：一步法RT-PCR检测病毒核酸
将标准RNA样品进行10倍系列稀释，分别稀释成1010、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100 copies/μl，采用SuperScript®
III One-Step RT-PCR System（Invitrogen）对标准样品以及待测样品进行RT-qPCR反应。
具体反应体系如下：
具体反应条件如下：
反应结束后，利用标准样品数据，以Ct值为纵坐标，Log(拷贝数)为横坐标，描绘标准曲线，并根据待测样品的Ct值计算其拷贝数。
实施例7：外泌体的获得
（1）细胞在含l0 %无exosome-FBS（去除FBS中含有的exosome：120,000 × g, 12h） DMEM培养基中(内含0.1 %青霉素、链霉素)，并置于37 ℃，5 % CO2培养箱内进行培养。当培养到80%~90%的细胞密度时，收集细胞上清，-20 ℃保存。
（2）取细胞培养上清，1000
× g低温（4℃）离心10
min，接着10，000 ×
g离心10 min，为了去除细胞和细胞碎片。然后再用0.22
μm 滤器（Pall Life Sciences, Port Washington, NY）过滤去除大于200 nm的颗粒，以进一步去除细胞和细胞碎片。
（3）将上清转移至超速离心管(Beckman
Coulter Inc.,
Munich, Germany)，150，000 × g低温（4℃）离心2 h，沉淀即为crude exosome。
（4）为了进一步纯化exosome，将已得到的crude exosome与2 ml
2.5 M的蔗糖PBS溶液充分混匀后，转移至超速离心管底(Beckman
Coulter Inc.,
Munich, Germany)，上面一层覆盖6 ml
2 M的蔗糖PBS溶液，再上面一层覆盖3 ml
0.25 M的蔗糖PBS溶液，接着150，000 × g低温（4℃）离心16 h。
（5）收集富集在2
M/0.25 M 这一层的exosome，然后用PBS洗两次，接着150，000 × g低温（4℃）离心90 min。
（6）去上清，收集沉淀，并用PBS进行重悬，-80 ℃保存备用。
（7）采用BCA法定量外泌体的蛋白含量。
（8）外泌体的电镜观察：滴约10 μg
外泌体悬液于载样铜网上，室温放置10 min，用滤纸从侧面吸干液体，滴加2％磷钨酸溶液(pH 6.8)，室温负染2 mim，滤纸吸干负染液，白炽灯下烤干约l0
mim，于透射扫描电镜下观察拍照。
实施例8：证明IFITM3蛋白为外泌体形式
前研究表明IFITM为跨膜蛋白形式，而我们的研究中发现细胞裂解液和细胞培养上清中均能检测到IFTIM蛋白，这就提示我们IFITM是可以分泌到细胞外的，而通过氨基酸序列分析预测，IFITM并不包含有细胞外分泌的信号肽，所以为了探明IFITM的细胞外蛋白形式是否为分泌性蛋白形式，或是外泌体(exosome)形式。我们采用超速离心技术，针对于IFITM内源性高表达的易感细胞HUVEC培养基上清分离纯化获得外泌体，在图4中有体现。将所获的外泌体负染后，应用透射电子电镜观察可见外泌体囊泡形状物（大小40-100
nm），见图5。通过Western
Blotting检测，以外泌体的标志蛋白Flotillin-2和CD63作为外泌体对照，以内质网的标志蛋白calnexin和高尔基体标志蛋白GM130作为非外泌体对照，结果显示纯化的exosome中Flotillin-2和CD63阳性，且均检测到较多的IFITM3蛋白，而calnexin和GM130均为阴性（图6）。采用SDS-PAGE电泳分离外泌体蛋白后，银染凝胶并切下目的条带，再应用质谱技术分析鉴定获得氨基酸序列与人类基因库比对分析后，结果显示为IFITM3蛋白氨基酸序列（图7），证明外泌体中该蛋白条带为IFITM3，因此，在HUVEC细胞中，IFITM3是以外泌体形式分泌到细胞外。
实施例9：IFITM3外泌体形式的抗登革病毒活性检测
本研究采用超速离心技术，针对于IFITM内源性高表达的易感细胞HUVEC，以内源性沉默IFITM3的HUVEC，收集培养基上清分离纯化获得外泌体。分别以总蛋白浓度60 μg的IFITM3外泌体作用于IFITM3内源性沉默后的HeLa细胞，以分别提取各组细胞总蛋白经Western
blotting 检测，以Actin作为内源性对照。结果显示，HUVEC培养基上清来源的IFITM3外泌体处理24 h后，HeLa受体细胞中IFITM3均呈明显增多趋势（图8）。这说明IFITM3外泌体可在细胞间进行传递。
以60 μg总蛋白浓度作用于HeLa细胞不同时间（6 h, 12h, 24 h, 48 h），分别提取各组细胞总蛋白经Western
blotting 检测，以Actin作为内源性对照。如图9所示，IFITM3外泌体处理24 h后，HeLa细胞中IFITM3开始呈明显增多趋势，并呈时间依赖性效应。
为了进一步验证IFITM3通过exosome形式传递到接受细胞后，是否可以传递抗登革病毒的活性，我们的研究中就分别以30 μg、60 μg不同浓度的293T-IFITM3-exosome和HUVEC-IFITM3- exosome作用于HeLa细胞24 h后，再以病毒滴度为2 MOI的DENV-2 NGC病毒株感染24 h后，分别提取细胞的总RNA以及培养基上清中总RNA。应用相对定量法Real time RT-PCR方法检测细胞内感染的病毒RNA，以GAPDH作为内源性对照；并应用绝对定量法Real
time RT-PCR检测培养基上清中病毒RNA。如图10及图11所示，IFITM3外泌体具有明显的抗登革病毒感染活性，并呈浓度依赖性效应。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110>
中山大学
<120>
一种跨膜蛋白3包装的外泌体在制备抗登革病毒感染药物中的应用
<130>
<160>
2
<170>
PatentIn version 3.3
<210>
1
<211>
36
<212>
DNA
<213>
<400>
1
ggaagatctg ccatgaatca cactgtccaa
accttc 36
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2
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60
<212>
DNA
<213>
<400>
2
ccggaattcc taagcgtagt ctgggacgtc gtatgggtat
ccataggcct ggaagatcag 60
Claims (4)
1.一种跨膜蛋白3 (IFITM3)包装的外泌体在制备抗登革病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述外泌体的制备方法为收集高表达IFITM3的人脐静脉内皮细胞培养基上清，将上清采用蔗糖密度梯度超速离心法即得所述外泌体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高表达IFITM3重组质粒的制备方法为：
S1：根据IFITM3的基因序列，设计正向引物，如SEQ
ID NO：1所示，设计反向引物，如SEQ ID NO：2所示；
S2：根据PCR扩增产物，反应条件如下：94
℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸7 min，然后将所有扩增产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；
S3：利用QIAprep spin miniprep kit抽提质粒，将pMSCV质粒DNA与IFITM3基因片段PCR产物进行双酶切反应和连接，测序比对后，利用氯化铯梯度离心法提取pMSCV-
IFITM3重组质粒DNA，即得所述高表达IFITM3重组质粒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述IFITM3包装的外泌体的产量鉴定方法为采用IFITM3包装的外泌体处理HeLa受体细胞后，检测HeLa细胞中IFITM3的蛋白水平。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述IFITM3包装的外泌体的活性鉴定方法为应用real time RT-PCR检测细胞内感染的登革病毒RNA和培养基上清中病毒RNA。
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|---|---|---|---|---|
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-
2015
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