CN107988239B

CN107988239B - 一种寨卡病毒的重组基因及其制备方法和应用

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Publication number: CN107988239B
Application number: CN201711222741.4A
Authority: CN
Inventors: 李红卫; 刘军; 顾为望; 李青青; 仇珍珍; 利晓欣; 万鹏飞; 陈晃耀; 梁文翰
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2017-11-29
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2037-11-29
Also published as: CN107988239A

Abstract

本发明涉及一种寨卡病毒的重组基因，该重组基因的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。将所述的重组基因插入到商用载体pMD19‑T中得到表达载体，再将病毒穿梭载体VSV‑G克隆所述的表达载体中得到克隆载体，然后所得到的克隆载体与含绿色荧光蛋白报告基因的慢病毒包装核心载体pLV‑eGFP和慢病毒辅助质粒psPAX2共转染人胚胎肾细胞HEK‑293T即得到重组假病毒。由于所述的重组假病毒不仅可以替代天然寨卡病毒进行血清中和抗体滴度的评价，而且可用于制备脑或肾脏的靶向载体。

Description

一种寨卡病毒的重组基因及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及DNA重组技术，具体涉及寨卡病毒的Env基因DNA变构重组，该重组基因可用于制备肾脏靶向载体。

背景技术

Zika病毒(ZIKV)是经蚊虫等媒介传播的黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(Flavivirus)病毒。与登革热类似，ZIKV感染可导致轻度或急性发热性疾病，头痛和肌痛。2007年亚太岛爆发后，东南亚，撒哈拉以南非洲地区以及南美洲和中美洲地区出现零星病例。2016年2月，中国卫生部通报了首例输入性ZIKV感染患者。孕妇感染寨卡病毒(Zikavirus，ZIKV)后，病毒穿过胎盘，在胚胎发育过程中特异性侵入皮层神经前期细胞，导致神经细胞死亡，引发婴儿小头症和先天性畸形。ZIKV感染也与成年人的神经系统疾病有关，如吉兰-巴雷综合征，患者失去劳动能力，给家庭和社会造成严重危害。2016年1月WHO宣布ZIKV的爆发和传播已经成为全球紧急公共卫生事件。

由于传染性高，难以获得病原体，从而阻碍了对ZIKV的生物学研究，包括抗病毒药物研究和疫苗开发。假型病毒作为替代方法已经广泛应用于病原体的生物学特征研究，特别是对于难以在体外培养或需要较高生物安全等级设施的病毒。自1996年首次报道慢病毒载体系统以来，基于慢病毒的假型病毒已广泛用于许多鉴定病毒入胞的研究，中和抗体测定，筛选新型宿主细胞受体和抗病毒药物，以及疫苗的开发。ZIKV基因组由编码三个结构蛋白(C，prM/M，E)和七个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)的单股正链RNA组成，文献报道表明,包膜病毒的表面蛋白在靶细胞的感染中起重要作用，因为它介导病毒体与细胞受体的连接。

外源基因进入机体实质器官的细胞中是基因治疗的基础和关键，在基础研究和临床治疗中，寻找肾脏靶向性病毒载体一直是研究的热点和难点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种寨卡病毒的重组基因，该重组基因所制备的重组假病毒可用于制备脑或肾脏的靶向载体。

本发明解决技术问题的方案如下：

一种寨卡病毒(ZIKV)的重组基因，该重组基因的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。

上述重组基因可按SEQ ID NO 1所示序列采用基因合成仪人工合成。

上述重组基因翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

一种表达载体，该表达载体是插入有SEQ ID NO 1所示重组基因的pMD19-T载体。

一种重组假病毒制备方法，该方法由以下步骤组成：

(1)将上述表达载体和慢病毒穿梭载体VSV-G分别进行Xho I单酶切以及琼脂糖凝胶电泳后，胶回收小片段和大片段；然后，对VSV-G酶切回收的大片段进行补平及去磷，对上述表达载体酶切回收的小片段进行补平，再将所得到的两个片段采用NEB的T4连接酶连接，得到克隆载体pCMV-ZIKV-Env/VSV-G-TC；

(2)将所得到的克隆载体pCMV-ZIKV-Env/VSV-G-TC与含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的慢病毒包装核心载体pLV-eGFP和慢病毒辅助质粒psPAX2共转染人胚胎肾细胞HEK-293T；共转染48小时后收集培养上清，离心去细胞碎片，即得所述的重组假病毒；其中，

所述的pCMV-ZIKV-Env/VSV-G-TC、pLV-eGFP和psPAX2三者的摩尔比为pLV-eGFP︰psPAX2︰pCMV-ZIKV-Env/VSV-G-TC＝4︰3︰1；

所述的共转染方法为常用的PEI(聚乙烯亚胺)转染法。

由于本发明所述的重组基因具有与天然寨卡病毒类型的生物学特性，重组假病毒为复制缺陷型病毒颗粒，感染细胞后不能复制产生子代病毒，因此不具有传染性，在BSL2实验室中操作安全。更进步地，采用所述重组基因可制备重组假病毒，该重组假病毒具有以下有益效果：

1、重组假病毒携带ZIKV Env蛋白，而Env蛋白上含有较多的中和表位，因此该重组假病毒可以替代天然寨卡病毒进行血清中和抗体滴度的评价。

2、重组假病毒感染BALB/c小鼠实验表明，该重组假病毒对脑及肾脏组织具有较高的嗜性，因此重组假病毒可以作为脑或肾脏组织转基因的高效载体。

附图说明

图1为克隆载体pCMV-ZIKV-Env/VSV-G-TC的构建示意图。

图2为重组假病毒电镜图，图中A为VSV-G电镜图，B为ZIKV-E电镜图。

图3为重组假病毒感染BALB/c小鼠脑组织GFP表达的电镜图及其局部放大图，图中A为VSV-G感染小鼠脑组织报告基因检测结果，B为ZIKV-E感染小鼠脑组织报告基因检测结果。

图4为假病毒感染BALB/c小鼠肾脏GFP表达的电镜图及其局部放大图，图中A为VSV-G感染小鼠肾脏报告基因检测结果，B为ZIKV-E感染小鼠肾脏报告基因检测结果。

具体实施方式

实施例1(重组基因的设计与合成)

在ZIKV Bahia03株(GenBank:ANA85188.1)Env基因的基础上进行序列表达设计，将Env基因的跨膜区替换成VSV-G蛋白跨膜区，在表达框的起始密码子之前和终止密码子之后均加入Xho I酶切位点，得到如SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

按SEQ ID NO.1所示的DNA序列委托中美太和生物技术有限公司采用基因合成仪人工合成，得到本发明所述寨卡病毒的重组基因。

实施例2(重组假病毒的制备)

1、表达载体的构建

将实施例1所制备的重组基因克隆至商品化载体pMD19-T(Takara公司生产，lotNo.D104A，)中，得到重组的pMD19-T载体，该载体命名为pMD19-Env/VSV-G-TC。

2、克隆载体pCMV-ZIKV-Env/VSV-G-TC的构建及鉴定

将pMD19-Env/VSV-G-TC及慢病毒穿梭载体VSV-G(赛默飞世尔科技(中国)有限公司公司生产)均采用Xho I单酶切，2％琼脂糖凝胶电泳后，分别胶回收小片段和大片段。对VSV-G酶切回收的大片段进行补平及去磷，对pMD19-Env/VSV-G-TC酶切回收的小片段进行补平，再采用NEB的T4连接酶将两个片段进行连接，得到克隆载体并命名为pCMV-ZIKV-Env/VSV-G-TC(见图1)。所得到的克隆载体经测序，其中，1-1482bp为所述重组基因的核酸序列SEQ ID NO1，该序列翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；所述的核酸序列中，1-1347bp为ZIKV Env基因序列，1348-1482bp为VSV G蛋白跨膜区及胞内区序列。

3、假病毒的制备

将克隆载体pCMV-ZIKV-Env/VSV-G-TC与含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的慢病毒包装核心载体pLV-eGFP(赛默飞世尔科技(中国)有限公司公司生产)及慢病毒辅助质粒psPAX2(赛默飞世尔科技(中国)有限公司公司生产)共转染人胚胎肾细胞HEK-293T，共转染48小时后收集培养上清，离心去细胞碎片，即得所述的重组假病毒。将收集的重组假病毒负染，采用电镜观察病毒颗粒形态(图2)。

上述重组假病毒制备方法中，所述的共转染方法为采用PEI(聚乙烯亚胺)方法，该方法所用PEI储存液的制备方法为：称取1.25mg PEI粉末溶解于50ml×HBS(pH7.4)中，0.2μm滤膜过滤，储存于4℃备用；其中，1×HBS的制备方法为：将8.76g NaCl溶解于900ml超纯水，加入20ml 1M的HEPES，调pH值到7.4，定容至1L，0.2μm滤膜过滤后储存于4℃备用。

上述重组假病毒制备方法中，所述PEI转染法为本领域技术人员的常规操作，其转染体系分为如下所示的A液和B液：

A液：

PEI储存液 24μl；

1×HBS 补至1ml；

B液：

实施例3(重组假病毒的效果实验)

将4周龄雌性BALB/c小鼠，随机分为3组(每组5只)，三组分别尾静脉注射5×10⁸TU的ZIKV-E，VSV-G或等体积的PBS。注射3周后小鼠麻醉后，右心室灌注20mlPBS后，再灌注20ml 4％多聚甲醛。之后采集肾脏(见图4)和脑组织(见图3)固定，制作全组织切片，然后采用3DHISTECH公司的载玻片扫描仪大脑并测定GFP表达。由图3可见，ZIKV-E感染小鼠的脑组织中GFP表达强度强于VSV-G感染小鼠脑组织，且ZIKV-E感染主要分布于皮质和皮下白质部位。由图4可见ZIKV-E感染小鼠的肾脏组织中GFP表达强度强于VSV-G感染小鼠肾脏组织，且ZIKV-E感染主要分布肾小管和肾小球。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> 一种寨卡病毒的重组基因及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatcaggt gcataggagt tagcaataga gacttcgtgg agggcatgtc aggtgggacc 60

tgggttgatg ttgtcttgga acatggaggt tgtgtcaccg tgatggcaca ggacaagcca 120

acagttgaca tagagttggt cacgacaacg gttagcaaca tggccgaggt gagatcctac 180

tgctacgagg catcaatatc ggacatggct tcggacagtc gctgcccaac acaaggtgaa 240

gcctaccttg acaagcagtc agacactcaa tatgtctgta aaagaacatt ggtggacaga 300

ggttggggaa atgggtgtgg actttttggc aaggggagct tggtgacgtg tgccaagttt 360

acatgctcca agaaaatgac agggaagagc atccagccgg agaacttgga gtaccggata 420

atgctatcag tgcatggatc ccagcacagt gggatgattg tgaatgacga aaacagagca 480

aaagtcgagg ttacacccaa ttcaccaaga gcagaagcaa ccttgggagg ttttggaagc 540

ctgggacttg attgtgaacc aaggacaggc cttgactttt cagatctgta ttacctgacc 600

atgaacaata agcattggtt ggtgcacaaa gagtggtttc atgacatccc attaccttgg 660

cattctggtg cagacactga aactccacac tggaacaaca aagaggcact ggtggagttc 720

aaggacgccc acgccaagag gcaaactgtt gtggttctgg ggagccaaga aggagccgtt 780

cacacggctc tcgctggagc tctggaggct gagatggatg gtgcgaaggg aaggctatcc 840

tcaggccatt tgaaatgccg cctaaaaatg gacaagctta ggttgaaggg tgtgtcatat 900

tccctgtgta ccgcagcgtt cacattcacc aaggttccag ctgaaacatt gcatggaaca 960

gtcacagtgg aggtgcagta tgcagggagg gatggaccct gcaaggtccc agcccagatg 1020

gcggtggaca tgcagaccct gaccccagtt ggaaggctga taacggctaa ccctgtgatc 1080

actgaaagca ctgagaattc aaagatgatg ttggagctcg acccaccatt tggggattct 1140

tacattgtca taggagtcgg ggacaagaaa atcacccatc actggcatcg gagtggtagc 1200

atcatcggaa aggcatttga agccactgtg agaggcgcca agagaatggc agtcttggga 1260

gacacagcct gggactttgg atcagttggg ggtgtgttta actcattggg caagggtatt 1320

caccagatct ttggagcagc tttcaaattt ttctttatca tagggttaat cattggacta 1380

ttcttggttc tccgagttgg tatccatctt tgcattaaat taaagcacac caagaaaaga 1440

cagatttata cagacataga gatgaaccga cttggaaagt ga 1482

<210> 2

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met

1 5 10 15

Ser Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val

20 25 30

Thr Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr

35 40 45

Thr Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala

50 55 60

Ser Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr

85 90 95

Leu Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly

100 105 110

Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Thr Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly

115 120 125

Lys Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val

130 135 140

His Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Glu Asn Arg Ala

145 150 155 160

Lys Val Glu Val Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala Glu Ala Thr Leu Gly

165 170 175

Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro Arg Thr Gly Leu Asp

180 185 190

Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn Lys His Trp Leu Val

195 200 205

His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro Trp His Ser Gly Ala

210 215 220

Asp Thr Glu Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu Ala Leu Val Glu Phe

225 230 235 240

Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val Val Leu Gly Ser Gln

245 250 255

Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala Leu Glu Ala Glu Met

260 265 270

Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu

275 280 285

Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr

290 295 300

Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Val Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr

305 310 315 320

Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Arg Asp Gly Pro Cys Lys Val

325 330 335

Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg

340 345 350

Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys

355 360 365

Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile

370 375 380

Gly Val Gly Asp Lys Lys Ile Thr His His Trp His Arg Ser Gly Ser

385 390 395 400

Ile Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg Gly Ala Lys Arg Met

405 410 415

Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Val

420 425 430

Phe Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe

435 440 445

Lys Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu

450 455 460

Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg

465 470 475 480

Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

485 490

Claims

1.一种寨卡病毒的重组基因，该重组基因的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。

2.一种表达载体，该表达载体是插入有SEQ ID NO 1所示重组基因的pMD19-T载体。

3.一种重组假病毒制备方法，该方法由以下步骤组成：

(1)将权利要求2所述的表达载体和慢病毒穿梭载体VSV-G分别进行XhoI单酶切以及琼脂糖凝胶电泳后，胶回收小片段和大片段；然后，对VSV-G酶切回收的大片段进行补平及去磷，对上述表达载体酶切回收的小片段进行补平，再将所得到的两个片段采用NEB的T4连接酶连接，得到克隆载体pCMV-ZIKV-Env/VSV-G-TC；

(2)将所得到的克隆载体pCMV-ZIKV-Env/VSV-G-TC与含绿色荧光蛋白报告基因的慢病毒包装核心载体pLV-eGFP和慢病毒辅助质粒psPAX2共转染人胚胎肾细胞HEK-293T；共转染48小时后收集培养上清，离心去细胞碎片，即得所述的重组假病毒；其中，

所述的共转染方法为常用的PEI转染法。