CN104059886A - Tat-凋亡素基因修饰t细胞的方法 - Google Patents

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陆玲玲
张俊红
叶永清
苏国新
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本发明涉及一种TAT-凋亡素基因修饰T细胞的方法，将TAT-凋亡素基因从pUC57-TAT-apoptin中亚克隆至Ad5/F35MaxTM系统的穿梭载体pDC316中，构建穿梭质粒pDC316-TAT-凋亡素；将步骤a所得pDC316-TAT-凋亡素与pBHG-fiber5/35骨架质粒运用脂质体法共转染293细胞，通过Cre/loxP系统作用发生定点重组获得含有TAT-凋亡素Ad5/F35-TAT-凋亡素重组腺病毒；将所述Ad5/F35-TAT-凋亡素重组腺病毒通过倍比扩增，富集病毒感染T细胞，获得含有TAT-凋亡素基因修饰的T细胞。该TAT-凋亡素基因修饰的T细胞能够有效增强对肿瘤细胞的杀伤性。在细胞内能够高效的分泌表达并进行有效地内源性递呈，从而在肿瘤存在的部位不断累积，其分泌的凋亡蛋白可以成功作用于病变细胞并诱导凋亡。

Description

TAT-凋亡素基因修饰T细胞的方法
[技术领域]
本发明涉及一种TAT-凋亡素基因修饰T细胞的方法。
[背景技术]
基因治疗是指将目的基因用基因转移技术导入目的细胞进行表达,使其获得特定的功能,从而达到治疗的目的。基因治疗由三个方面组成:受体细胞、载体以及目的基因。T淋巴细胞获取方便,可以在体外大量扩增,容易进行遗传改造的优点,因此T淋巴细胞成为目前基因治疗应用较为广泛的靶细胞。目前,基因治疗面临的瓶颈问题在于转染效率低下,而决定基因治疗转染效率的关键点之一就在于载体的选择。目前基因治疗所应用的载体主要包括病毒载体和非病毒载体,其中应用最多的是病毒载体,包括逆转录病毒,腺病毒,腺相关病毒,疱疹病毒和慢病毒,其中前四种已经被美国FDA批准应用于临床。在人类基因治疗常用的病毒载体中,腺相关病毒(Adeno-associatedviruses,AAV)的安全优势以及长效表达的优点使其成为了基因稳定转染的宠儿。而腺病毒(Adenovirus,Ad)载体则因具有感染效率和外源基因表达水平高、高滴度制备较简单等特点而被广泛用于基因治疗研究和临床试验中。
Ad5/F35腺病毒载体是一种〃改外壳〃的腺病毒嵌合载体(Chimericadenovirus)，即用Ad35的纤毛小节替代第一代腺病毒5型腺病毒的纤毛小节。Ad35属腺病毒B种，对人的各种造血细胞和肿瘤细胞具有良好的感染效率。其原理是pBHG-fiber5/35骨架质粒可以与带有loxP位点的穿梭质粒配合,通过Cre-loxP,使转染进HEK-293细胞的穿梭质粒和骨架质粒发生定点重 组,产生带有外源基因的重组腺病毒(Ad5/F35),这样得到的重组病毒是E1缺失的复制缺陷型腺病毒,病毒在不能够提供E1区的细胞中只能实现外源基因的表达而本身不具备增殖能力。
凋亡素(apoptin)是由鸡贫血病毒（CAV）VP3基因编码的蛋白质，由121个氨基酸组成，NCBI中的序列编号为NC_001427，可以特异性地诱导动物和人体肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有影响。凋亡素选择性诱导肿瘤细胞的凋亡是非p53依赖的bcl-2对抗机制，由于大部分肿瘤细胞具有p53突变或缺少的特性，因此，非p53依赖性凋亡素作为抗肿瘤药物具有很好的应用前景。
天然状态下的凋亡素很难透过细胞膜屏障进入肿瘤细胞内发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用。现已证明，人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的反式激活蛋白(trans-activatortranscription,TAT)具有蛋白转导结构域的特点，能快速有效地将与之相连的肽段或蛋白质直接跨膜转运进入细胞或组织，转导效率很高且对细胞没有损伤。TAT的编码序列为：YGRKKRRQRRR，利用TAT介导蛋白质进入细胞的有效方法是将TAT的编码基因与外源蛋白基因连接，表达融合蛋白。2004年Guelen等研制出含TAT跨膜功能域的凋亡素重组蛋白TAT-凋亡素。纯化的TAT-凋亡素不仅保留了TAT原有的穿透力，而且丝毫不影响凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的活力。
通过Ad5/F35腺病毒载体将TAT-凋亡素基因修饰人外周血T淋巴细胞，再将产生抗肿瘤效应细胞毒T细胞会输给患者，能增强杀伤肿瘤细胞的效果，且减少副作用，达到提高治疗效果。
[发明内容]
基于T细胞治疗肿瘤生物治疗中发挥重要的作用，以及凋亡素对肿瘤细胞的特异杀伤性，提出以Ad5/F35腺病毒载体作为适合的基因导入载体，将TAT-凋亡素编码序列插入腺病毒载体，构建一种重组TAT-凋亡素腺病毒，使TAT-凋亡素能够在T淋巴细胞中表达，达到增强对肿瘤细胞杀伤的目的。
为了实现上述目的，发明一种TAT-凋亡素基因修饰T细胞的方法，由如下步骤组成：
a.将TAT-凋亡素基因从pUC57-TAT-apoptin中亚克隆至Ad5/F35MaxTM系统的穿梭载体pDC316中，构建穿梭质粒pDC316-TAT-凋亡素；
b.将步骤a所得pDC316-TAT-凋亡素与pBHG-fiber5/35骨架质粒运用脂质体法共转染293细胞，通过Cre/loxP系统作用发生定点重组获得含有TAT-凋亡素Ad5/F35-TAT-凋亡素重组腺病毒；
c.将所述Ad5/F35-TAT-凋亡素重组腺病毒通过倍比扩增，富集病毒感染T细胞，获得含有TAT-凋亡素基因修饰的T细胞。
进一步的，其中：
所述的TAT的编码序列位于TAT-凋亡素融合蛋白序列的N-端，能有效将融合蛋白导入肿瘤细胞中。
所述TAT-凋亡素基因连接于pDC316腺病毒穿梭质粒的U6启动子之下。
所述定点重组为pBHG-fiber5/35骨架质粒与带有loxP位点的腺病毒穿梭质粒pDC316配合，利用Cre/loxP系统的作用在293细胞内发生的定点重组。
TAT跨膜肽氨基酸序列（YGRKKRRQRRR）位于TAT跨膜肽-凋亡素融合蛋白序列的N-端，来自于NCBI，序列号为NP_057853。
凋亡素氨基酸序列来自于NCBI,序列号为NP_056774.1。
TAT-凋亡素基因以及T淋巴细胞在肿瘤治疗中发挥重要作用，若本发明构建TAT-凋亡素基因修饰T淋巴细胞方法得以应用，不但为肿瘤的治疗提供一种新的治疗方法，而且具有广泛的临床应用价值。
[附图说明]
图1腺病毒穿梭质粒pDC316-TAT-凋亡素的结构示意图。
图2pDC316-TAT-凋亡素穿梭质粒双酶切鉴定图。其中泳道1为20bp DNA marker;泳道2、3为2个阳性克隆。
图3Ad5/F35-TAT-凋亡素重组腺病毒和对照腺病毒Ad5/F35-EGFP感染LOVO细胞48h后Western blotting检测APE1蛋白表达。
图4MTT法检测经TAT-apoptin处理的HeLa细胞生长曲线图。
图5不同组T淋巴细胞体外杀伤活性比较。
[具体实施方式]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例：
1.研究材料：重组质粒pUC57-TAT-apoptin为外包服务公司提供；DNAmarker、限制性内切酶、T4连接酶等均购于Takara；DMEM、胎牛血清均购于Gibco；Lipofectamine2000(Invitrogen公司）；pDC316、pBHG-fiber5/35质粒购自于加拿大Microbix公司；293细胞购自于美国ATCC。
2.工作流程：
（1）构建穿梭载体pDC316-tat-apoptinL：由BamHⅠ和HindⅢ双酶切pUC57-TAT-apoptin，将切下的TAT-APOPTIN插入至同样由BamHⅠ和HindⅢ双酶切的pDC316，构建成穿梭载体pDC316-tat-apoptin。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组穿梭载体pDC316-tat-apoptin。电泳结果在400bp处有外源片段，表明了重组穿梭质粒pDC316-tat-apoptin构建成功（图2）。
（2）重组腺病毒Ad5/F35-tat-apoptin包装：转染前一天，将293细胞接种于六孔板中，每孔5x105个细胞，培养基为DMEM+10%胎牛血清，置37℃，5%C02的培养箱中培养过夜。用脂质体Lipofectamine2000将腺病毒骨架质粒pBHG-fiber5/35和穿梭质粒pDC316-tat-apoptin共转染293细胞，同源重组产生重组腺病毒Ad5/F35-tat-apopti。10d左右293细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。继续培养1到2天，待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。1000g离心5min收集细胞，将细胞于-80℃和37℃水浴锅中反复冻融3次，使病毒从病变细胞中充分释放。将冻融液63000rpm离心5min，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为第一代毒种（Pl)，作为随后大量病毒扩增的毒种。
（3）重组腺病毒Ad5/F35-tat-apoptin大量扩增：第一代毒种经PCR鉴定正确后再反复感染293细胞进行扩增。将P1病毒在接种了HEK293细胞的15cm培养皿中扩增，当60%细胞发生病变时，吹打收集细胞，1000g离心5min，反复冻融3次裂解细胞释放病毒，充分振荡并离心后收集含病毒的上清。分装保存于-80℃冰箱中。
（4）TCID50方法测定病毒的滴度：按Karber方法计算。100ul病毒稀释液，滴度为T=101+d(s-0.5),10倍稀释时d=1,s为每行出现细胞病变的比率。按每孔100ul(即1x104个细胞)接种96孔板。24h后，将病毒1/10梯度稀释，100～10-7梯度稀释，按每一个梯度一行（12孔）加入96孔板。感染14天后显微镜下观察，100～10-5感染率为100%，10-6感染率为0.73%，10-7感染率为0，则S=7.32，代入公式得到TCID50=107.82。
（5）重组腺病毒Ad5/F35-tat-apoptin感染T淋巴细胞：取健康人外周血，用Ficoll液分离外周血单个核细胞（PBMC），将PBMC加入培养板孵育2小时，然后吸出非黏附细胞。用RPMI1640培养基将细胞数调至2×106/ml，分别移至4瓶培养瓶中竖立培养（20ml/瓶），再加入终浓度10%胎牛血清和终浓度500U/ml的IL-2，37℃培养24h后用于T淋巴细胞。24h后，接种100MOI重组腺病毒Ad5/F35-tat-apoptin到两瓶培养T淋巴细胞的培养瓶中，另外两瓶用作阴性T淋巴细胞，继续放入CO2培养箱培养用做MTT实验。
(6)MTT比色法检测重组腺病毒Ad5/F35-tat-apoptin感染T淋巴细胞抗肿瘤活性的方法：根据吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率＝[实验组吸光度均值－背景组吸光度均值]/[空白组吸光度均值－背景组吸光度均值]×100％。将对数生长期的Hela细胞接种100μl(2×104cell/ml)于96孔培养板，置 37℃,5％CO2培养箱中培养6h后，分别加入2×104感染tat-apoptin基因修饰的T淋巴细胞以及未感染腺病毒的阴性T淋巴细胞100μl，空白对照组加100μl培养液，置37℃,5％CO2培养箱中培养24h。吸去培养基，每孔加入MTT工作液100μl，使MTT终浓度为5μg/mL，于细胞培养条件下保温4h。取出培养板，每孔吸去培养基，加入100μlDMSO，于酶标仪490nm处测吸光度值。实验重复3次。图5显示了TAT-apoptin基因修饰的T淋巴细胞加强了HeLa细胞凋亡的能力。

Claims (4)

1.一种TAT-凋亡素基因修饰T细胞的方法，其特征在于由如下步骤组成：
a.将TAT-凋亡素基因从pUC57-TAT-apoptin中亚克隆至Ad5/F35MaxTM系统的穿梭载体pDC316中，构建穿梭质粒pDC316-TAT-凋亡素；
b.将所述pDC316-TAT-凋亡素与pBHG-fiber5/35骨架质粒运用脂质体法共转染293细胞，通过Cre/loxP系统作用发生定点重组获得含有TAT-凋亡素Ad5/F35-TAT-凋亡素重组腺病毒；
c.将所述Ad5/F35-TAT-凋亡素重组腺病毒通过倍比扩增，富集病毒感染T细胞，获得含有TAT-凋亡素基因修饰的T细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的TAT的编码序列位于TAT-凋亡素融合蛋白序列的N-端，能有效将融合蛋白导入肿瘤细胞中。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述TAT-凋亡素基因连接于pDC316腺病毒穿梭质粒的U6启动子之下。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述定点重组为pBHG-fiber5/35骨架质粒与带有loxP位点的腺病毒穿梭质粒pDC316配合，利用Cre/loxP系统的作用在293细胞内发生的定点重组。
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