CN101307315B - 用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法 - Google Patents
用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101307315B CN101307315B CN2008100628585A CN200810062858A CN101307315B CN 101307315 B CN101307315 B CN 101307315B CN 2008100628585 A CN2008100628585 A CN 2008100628585A CN 200810062858 A CN200810062858 A CN 200810062858A CN 101307315 B CN101307315 B CN 101307315B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bac
- silkworm
- growth factor
- vessel growth
- utilize
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 title claims abstract description 37
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 title abstract 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 20
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims abstract description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 4
- 108700020497 Nucleopolyhedrovirus polyhedrin Proteins 0.000 claims description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 238000001814 protein method Methods 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 abstract description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 abstract 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 4
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 150000008195 galaktosides Chemical class 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法。该方法的步骤如下:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建含有人体内皮血管生长因子的重组病毒;利用肝糖层析柱从感染的家蚕体内分离纯化重组的蛋白质。本发明的优点在于利用Bac-to-Bac表达系统能够快速产生含有人体内皮血管生长因子基因的重组杆状病毒,并在家蚕幼虫内高效表达,利用肝糖亲和层析柱实现重组蛋白的快速分离和纯化。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术、杆状病毒基因表达系统,尤其涉及一种利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕内表达人体内皮血管生长因子和纯化的方法。
背景技术
家蚕杆状病毒基因表达系统是目前高效的真核表达系统之一。我们利用细菌转座子原理构建了专门用于家蚕的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统。该系统的优点在于重组杆状病毒可以通过细菌转座子的基因定位转移作用,在大肠杆菌内实现基因的转移重组,快速获得重组病毒,构建了可利用我国特色资源昆虫一家蚕的快速基因表达系统(专利已授权,名称:利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法,专利号:2003101087818)。该系统由供体质粒、含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac构成,其产生重组病毒的原理是:首先将外源目的基因克隆入供体质粒,然后将供体质粒转化入DH10BmBac感受态细胞中,通过细菌转座子的定点转位作用,将启动子和目的基因一并转入家蚕杆状病毒基因组而产生重组病毒DNA,最后转染家蚕培养细胞而获得含有目的基因重组病毒。我们尝试利用该系统快速产生能够表达人体内皮血管生长因子的重组病毒,并利用家蚕作为寄主表达何生产重组人体内皮血管生长因子蛋白,并利用亲和层析技术建立分离该蛋白的方法。
发明内容
本发明公开了一种用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法。主要包含两个方面的内容,一个是利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建含有人体内皮血管生长因子的重组病毒的方法,一个是利用肝糖层析柱从感染的家蚕体内分离纯化重组的蛋白质方法。
为了达到上述目的,本发明采用的技术方案其步骤如下:
1、利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建含有人体内皮血管生长因子的重组病毒的方法:
将人体内皮血管生长因子基因克隆入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统配套的供体质粒pFastBacHT多克隆位点,使该基因位于杆状病毒多角体启动子下游,然后将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内,在含有抗生素的培养板上培养过夜,翌日通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑,随后从阳性菌斑从抽提质粒DNA,该质粒DNA即为重组病毒的基因组,将此DNA转染入家蚕培养细胞BmN,120小时后分离培养基上清液,获得含有人体内皮血管生长因子基因的重组病毒。
2、利用肝糖层析柱从感染的家蚕体内分离纯化重组的蛋白质方法:利用注射法将20微升上述重组病毒注射入家蚕五龄幼虫,120小时后收集感染的家蚕样品,然后加入磷酸缓冲液并匀浆样品,高速离心后取上清液,将上清液作为提取重组人体内皮血管生长因子蛋白的原料,利用肝糖亲和层析柱分离、纯化获得相应的蛋白质,并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质纯度。
本发明具有的有益效果是:利用Bac-to-Bac表达系统能够快速产生含有人体内皮血管生长因子基因的重组杆状病毒,并在家蚕幼虫内高效表达,利用肝糖亲和层析柱实现重组蛋白的快速分离和纯化。
附图说明
附图是供体质粒pFastBacHT图。
具体实施方式
1、研究材料:家蚕Bac-to-Bac杆状病毒表达系统由本研究室构建(专利已授权,名称:利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法,专利号:2003101087818)由本申请人自行构建。DH5α、DH10β菌株等。供体质粒pFastBacHT(图1)购自美国Invitrogen公司。各种限制性内切酶、连接酶等分子生物学操作试剂购自日本Takara公司。人体内皮血管生长因子基因购自美国Clontech公司。肝糖亲和层析柱Heparin Sepharose购于美国GE公司。
2、工作流程:
将人体内皮血管生长因子基因克隆入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统配套的供体质粒pFastBacHT多克隆位点BamHI和HindIII之间,使该基因位于杆状病毒多角体启动子下游,然后将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内,在添加了卡那霉素(浓度50微克/ML)、庆大霉素(浓度35微克/ML)两种抗生素以及半乳糖苷类似物X-Gal的培养板上培养过夜,翌日通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑(白斑,即基因发生了插入重组),随后从阳性菌斑从抽提大质粒DNA,该质粒DNA即为重组病毒的基因组,将此DNA转染入家蚕单层培养细胞BmN内,120小时后分离培养基上清液,获得含有人体内皮血管生长因子基因的重组病毒。将20微升上述重组病毒通过经皮注射的方式接种家蚕五龄幼虫,然后观察家蚕的发病情况,120小时后收集被病毒感染的家蚕,然后以每头家蚕2毫升的比例加入PH7.2d的磷酸缓冲液,并采用匀浆器对样品精心匀浆处理,再高速离心后取上清液,将上清液作为提取重组人体内皮血管生长因子蛋白的原料。利用肝糖亲和层析柱Heparin Sepharose分离、纯化获得相应的蛋白质,将上述原料加入层析柱使之与树脂结合,最后用含有1.5M的NaCl溶液一步洗脱、分离重组的人体内皮血管生长因子蛋白。纯化的样品利用SDS-PAGE电泳分析纯化的蛋白质纯度。
根据实际结果,每头家蚕幼虫的产量估计在600微克左右。
Claims (1)
1.用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法,其特征在于该方法的步骤如下:
1)利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建含有人体内皮血管生长因子基因的重组病毒的方法:
将人体内皮血管生长因子基因克隆入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统配套的供体质粒pFastBacHT多克隆位点,使该基因位于杆状病毒多角体启动子下游,然后将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内,在含有抗生素的培养板上培养过夜,翌日通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑,随后从阳性菌斑从抽提质粒DNA,该质粒DNA即为重组病毒的基因组,将此DNA转染入家蚕培养细胞BmN,120小时后分离培养基上清液,获得含有人体内皮血管生长因子基因的重组病毒;
2)利用肝糖层析柱从感染的家蚕体内分离纯化重组的蛋白质方法:
利用注射法将20微升上述重组病毒注射入家蚕五龄幼虫,120小时后收集感染的家蚕样品,然后加入磷酸缓冲液并匀浆样品,高速离心后取上清液,将上清液作为提取重组人体内皮血管生长因子蛋白的原料,利用肝糖亲和层析柱分离、纯化获得相应的蛋白质,并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质纯度。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2008100628585A CN101307315B (zh) | 2008-06-30 | 2008-06-30 | 用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2008100628585A CN101307315B (zh) | 2008-06-30 | 2008-06-30 | 用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101307315A CN101307315A (zh) | 2008-11-19 |
CN101307315B true CN101307315B (zh) | 2010-06-02 |
Family
ID=40124000
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2008100628585A Expired - Fee Related CN101307315B (zh) | 2008-06-30 | 2008-06-30 | 用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101307315B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102994552A (zh) * | 2012-12-14 | 2013-03-27 | 上海柯莱逊生物技术有限公司 | 一种用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1544625A (zh) * | 2003-11-18 | 2004-11-10 | 浙江大学 | 利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法 |
CN1974776A (zh) * | 2006-12-07 | 2007-06-06 | 浙江大学 | 家蚕重组杆状病毒感染的方法 |
CN101381726A (zh) * | 2008-10-14 | 2009-03-11 | 浙江大学 | 用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法 |
-
2008
- 2008-06-30 CN CN2008100628585A patent/CN101307315B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1544625A (zh) * | 2003-11-18 | 2004-11-10 | 浙江大学 | 利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法 |
CN1974776A (zh) * | 2006-12-07 | 2007-06-06 | 浙江大学 | 家蚕重组杆状病毒感染的方法 |
CN101381726A (zh) * | 2008-10-14 | 2009-03-11 | 浙江大学 | 用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101307315A (zh) | 2008-11-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101307316B (zh) | 抗菌肽cad在枯草杆菌中的分泌表达及重组枯草杆菌表达系统 | |
CN100410383C (zh) | 一种昆虫杆状病毒生物反应器的制备方法 | |
CN104402975B (zh) | 抗衰老短肽及其制备方法 | |
CN107759675A (zh) | 一种来源于枯草芽孢杆菌可提高分泌效率的信号肽及其应用 | |
CN108004239A (zh) | 一种高效表达蛋白酶的新型启动子 | |
Barbosa et al. | Bacterial cellulase from the intestinal tract of the sugarcane borer | |
CN101812459A (zh) | 编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸及其原核表达方法 | |
CN101092618B (zh) | 溶葡萄球菌酶的制备方法和其衍生物及衍生物的制备方法 | |
CN101381726A (zh) | 用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法 | |
CN101629186B (zh) | 以家蚕作为宿主生产重组蝎毒素蛋白的方法 | |
CN101307315B (zh) | 用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法 | |
CN100371449C (zh) | 改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的构建方法 | |
CN107674119A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌可有效提高分泌的信号肽及其应用 | |
CN104673814A (zh) | 一种来自于阴沟肠杆菌的l-苏氨酸醛缩酶及其应用 | |
CN105154417B (zh) | 一种真菌来源的酸性纤维素酶及其基因和应用 | |
CN102286534B (zh) | 表达多外源基因的昆虫生物反应器及其构建方法和应用 | |
CN102242092A (zh) | 一种家蚕肠道益生菌的分离鉴定及其酶基因的克隆与表达 | |
CN101475944B (zh) | 一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法 | |
CN100497612C (zh) | 一种耐高温乳糖酶的制备方法 | |
CN103911337A (zh) | 高粘附性丁酸梭菌及其制备方法 | |
CN102181405B (zh) | 一种重组病毒及利用该病毒生产l-天冬酰胺酶ⅱ的方法 | |
CN114250155A (zh) | 一种在葡萄糖为碳源条件下高产纤维素酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用 | |
CN1818072A (zh) | 家蚕杆状病毒表达系统的分泌型供体质粒的构建方法 | |
CN1239699C (zh) | 利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法 | |
CN104313042A (zh) | 一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因及克隆表达以及发酵生产新普鲁兰酶的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100602 Termination date: 20110630 |