CN101307316B - 抗菌肽cad在枯草杆菌中的分泌表达及重组枯草杆菌表达系统 - Google Patents

抗菌肽cad在枯草杆菌中的分泌表达及重组枯草杆菌表达系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种以重组枯草杆菌表达系统表达天蚕素CAD抗菌肽的方法，通过人工合成sumo蛋白酶的表达操纵子、酿酒酵母小分子泛素样蛋白与天蚕素AD的融合蛋白表达操纵子基因，克隆天蚕素AD母体基因枯草杆菌表达载体pNF11，转化重组表达载体pNF 11-CAD，从而使重组枯草杆菌在摇瓶中诱导表达；本发明具有表达系统简单，用于大规模生产，生产成本低，生物活性强，无毒害物质等优点；为临床上的疾病防治和治疗提供一种价格便宜、抗菌力强的药物，也可作为饲料添加剂。

Description

抗菌肽CAD在枯草杆菌中的分泌表达及重组枯草杆菌表达系统
技术领域
本发明涉及一种生产抗菌肽CAD的方法，具体讲涉及一种以重组枯草杆菌表达系统表达抗菌肽CAD的方法。
背景技术
昆虫抗菌肽是一类碱性小分子多肽，具有热稳定性、诱导源的非专一性和广谱的杀菌作用，极有希望开发成一类新型的多肽抗生素。已知当某些致病菌侵染天蚕(hyolophora cecropia)后，可在其血淋巴中诱导产生溶菌酶、Attacin及天蚕素(Cecropin)等三大类包括大约15-20种具有杀菌活性的蛋白质(HultmarkD.et al，Eur.J.Biochem.106：7-16，1980)。基于一级结构的小的差异，天蚕素被分为A、B和D三种类型(Hultmark D.et al，1980，文献同上)。另外，也已从中国柞蚕中分离到一系列类似的抗菌肽。这些来自不同昆虫的对植物病原菌有杀伤作用的肽在本文中统称为抗菌肽，它们之间的氨基酸序列有较高的相似性，分子富含亲水性氨基酸残基，特别是富含赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸；而C端则包含较多的疏水性残基。另外，发现在这类肽的许多特定位置上带有保守的氨基酸残基，如2位上的色氨酸；5、8和9位上的赖氨酸，以及11和20位上的天冬氨酸等(SteinerH.et al，Nature 292：246-248，1981)。
由于抗菌肽在杀菌、抗肿瘤甚至抑制病毒复制方面具有较大的应用潜力，因此国内外在抗菌肽的基因工程方面开展了不少研究工作，有关抗菌肽基因在大肠埃希氏菌、酵母、以及昆虫杆状病毒载体中的表达研究均已有报道。
在“天蚕抗菌肽AD基因在AcNPV载体系统中的表达研究”(黄亚东，中国抗生素杂志，28：304-307，2003)一文中报道了一种利用昆虫杆状病毒载体系统在昆虫培养细胞和虫体中表达多肽抗生素天蚕抗菌肽AD(cecropin AD，CAD)的方法。其实验采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)点突变技术改造CAD基因，改造后的CAD基因先克隆到质粒pGEM-T easy vector中进行鉴定和序列分析，然后亚克隆到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV表达载体pAcGP67B中获得重组病毒载体。用重组病毒载体和野生AcNPV DNA共感染草地夜蛾Sf9细胞，筛选得到重组病毒。以重组病毒转染Sf9细胞和苜蓿丫纹夜蛾幼虫，抑菌活性试验CAD基因在昆虫杆状病毒载体系统获得了表达，表达产物具有抑菌活性。
在“抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达”(黄亚东，华南理工大学学报自然科学版，30：13-16，2003)一文中报道了一种采用PCR技术改造抗菌肽AD基因，将其C末端改造为Asn编码，改造后的抗菌肽Cecropin AD基因克隆到pPICZ-A载体上，构建成酵母重组分泌型表达载体，转化毕赤酵母Pichia pastoris受体菌GS115中。采用zerocin抗性标记筛选重组转化子，经摇瓶发酵，浓缩发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测。结果表明，改造后的Cecropin AD基因在毕赤酵母中获得了表达，表达产物经信号肽引导分泌到胞外，具有较强的杀菌活性。
专利ZL96100376.6公开了四种具有抗菌活性的多肽或其功能的衍生物及其生产抗菌肽的方法，其中培养细胞为大肠杆菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
以上文献和专利公开的生产抗菌肽的方法，采用了在病毒、大肠杆菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达目的基因。而使用病毒载体系统表达目的蛋白质，实验步骤繁琐，条件不易于控制，不适合大规模生产；由于抗菌肽会对大肠杆菌等细菌具有抑制作用，因此难以使用原核生物中的大肠杆菌作为表达系统；抗菌肽虽然对真核细胞没有抑制作用，但研究表明抗菌肽在酵母中表达很难实现酵母的高密度培养，对提高表达量有较大影响，此外，抗菌肽在酵母中表达酰胺化不完全，对其杀菌活性有一定影响，同时真核细胞表达系统具有生产周期长，生产成本高的缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种广谱抗菌的抗菌肽CAD的基因工程生产方法，以克服当前抗菌肽产业化的诸多问题，为临床上的疾病防治和治疗提供一种价格便宜、抗菌力强的药物，也可用作无危害的饲料添加剂。而目前还没有用枯草杆菌表达抗菌肽CAD的报道。枯草杆菌是一种原核细胞，具有培养条件易于控制，繁殖速度快，分泌量高的特点。
本发明采用的技术方案为：
1.sumo蛋白酶的表达操纵子、酿酒酵母小分子泛素样蛋白和天蚕素AD的融合蛋白表达操纵子基因合成：
a)人工合成含编码sumo蛋白酶的表达操众子基因，其核苷酸序列为：
        10            20            30            40            50
atggtcagca    tccgccgcag    cttcgaagcg    tatgtcgatg    acatgaatat
        60            70            80            90           100
cattactgtt    ctgattcctg    ctgaacaaaa    ggaaatcatg    cttgttccgg
       110           120           130           140           150
aacttaatga    aaaagatgat    gatcaagttc    aaaaagcact    tgcatctaga
       160           170           180           190           200
gaaaatacac    aacttatgaa    tagagataat    attgaaatta    cagttagaga
       210           220           230           240           250
ttttaaaaca    cttgcaccga    gaagatggct    taatgataca    attattgaat
       260           270           280           290           300
tttttatgaa    atatattgaa    aaatctacac    cgaatacagt    tgcatttaat
       310           320           330           340           350
tctttttttt    atacaaatct    ttctgaaaga    ggctatcaag    gcgttagaag
       360           370           380           390           400
atggatgaaa    agaaaaaaaa    cacaaattga    taaacttgat    aaaattttta
       410           420           430           440           450
caccgattaa    tcttaatcaa    tctcattggg    cacttggcat    tattgatctt
       460           470           480           490           500
aaaaaaaaaa    caattggcta    tgttgattct    ctttctaatg    gcccgaatgc
       510           520           530           540           550
aatgtctttt    gcaattctta    cagatcttca    aaaatatgtt    atggaagaat
       560           570           580           590           600
ctaaacatac    aattggcgaa    gattttgatc    ttattcatct    tgattgcccg
       610           620           630           640           650
caacaaccga    atggctatga    ttgcggcatt    tatgtttgca    tgaatacact
       660           670           680           690           700
ttatggctct    gcagatgcac    cgcttgattt    tgattataaa    gatgcaatta
       710           720           730           740           747
gaatgagaag    atttattgca    catcttattc ttacagatgc    acttaaa
b)人工合成含编码酿酒酵母小分子泛素样蛋白与天蚕素AD的融合蛋白表达操纵子基因，其核苷酸序列为：
        10            20            30            40            50
taaaaaaaac    gctcacatga    tgtgggcgtt    ttttttatac    aaaaaaacgc
        60            70            80            90           100
actgatttac    aaaaccttaa    cattcggttc    aaaccctttt    tacatagaac
       110           120           130           140           150
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       160           170           180           190           200
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       210           220           230           240           250
ctgttctgat    tcctgctgaa    caaaaggaaa    tcatgatgtc    tgcaaatcaa
       260           270           280           290           300
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       310           320           330           340           350
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       360           370           380           390           400
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       410           420           430           440           450
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       460           470           480           490           500
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       510           520           530           540           550
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       560           570           580           590           600
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       610           620           630           640           650
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       660           670           680           690           700
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       710           720           730           738
ttttgcgtta    gcaaaaacat    aaagggtatg      ggatataa
c)将所述步骤a)中人工的基因片段用EcoRI和BamHI双酶切，将所述步骤b)中人工的基因片段用BamHI和SacI双酶切，构建入载体pBluescriptII SK(+)，构建成命名为D1778-1的质粒。
2.天蚕素AD母体基因枯草杆菌表达载体pNF11的构建；
提取枯草杆菌168菌株的基因组DNA，扩增出枯草杆菌的高效启动子p43，通过T载体克隆后测序得到完整的含启动子基因质粒，构建入质粒pGJ103，构建成重组质粒pGJ284；
质粒pGJ284和D1778-1分别用EcoRI和SacI进行双酶切，回收酶切产物，将两个回收酶切产物用T4DNA连接酶在16℃水浴锅连接，构建成重组质粒pNF11。
3.重组表达载体pNF 11在枯草杆菌1A747的转化：
将感受态枯草杆菌1A747与质粒pNF11混合，转移至0.2cm电转杯，2500V、5ms电击，立即加入800ul预冷的枯草杆菌电转恢复培养基LBSPG，于37℃、200rpm的条件恢复培养1小时，4500rpm离心集菌涂布于Cm5LB平板上，于37℃培养至单菌落出现，挑取阳性转化子培养提取质粒进行EcoRI、SacI双酶切及PCR鉴定；鉴定扩增出1300bp的克隆定义为pNF11-CAD1、pNF11-CAD2、pNF11-CAD3、pNF11-CAD4的阳性转化子。
4.重组枯草杆菌在摇瓶中的诱导表达：
将筛选得到的pNF11-CAD1、pNF11-CAD2、pNF11-CAD3、pNF11-CAD4的阳性转化子接种到25ml的LB培养基中，于32℃、200rpm的条件下振荡培养8～12小时至600nm波长处的吸光值(OD600)达到2～4，加质量百分比浓度为30％麦芽糖5ml，进行诱导表达；于32℃、250rpm的条件下振荡培养24～36小时后，调整pH至8.5、温度25℃培养8～12小时，10000rpm离心10分钟收集培养液上清，即为获得的抗菌肽CAD蛋白。
本发明构建的表达抗菌肽CAD的重组枯草杆菌表达载体，分类命名为：枯草芽孢杆菌，拉丁文学名Bacillus subtilis，保藏登记编号为CGMCC No.2373，保藏日期为：2008年2月21日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。
根据表达要求，针对性的对发酵培养过程pH值设计了6个梯度(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)，通过生长曲线研究得出最佳调整发酵条件时间，在这6个pH条件下，36小时是菌体生长最旺盛时期，因此该时期蛋白质表达量最高。
本发明人工设计合成包含有小分子泛素样修饰物(small ubiquitin-relatedmodifier，SUMO)蛋白酶以及抗菌肽CAD与SUMO融合的双顺反子表达元件基因，以质粒pNF11-CAD为大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体，构建了一个抗菌肽CAD的重组枯草杆菌表达系统。该系统具有优良的质粒稳定性，以及SUMO-CAD蛋白偶合物能有效被分泌表达的SUMO蛋白酶水解成抗菌肽CAD。
为了枯草杆菌能够分泌具有活性构象的抗菌肽CAD，采用与SUMO融合表达体系。由于融合表达后得到的CAD-SUMO融合体底物不具有抗菌肽活性，因此不会对枯草杆菌宿主菌产生毒害作用，能够保证菌体较长时间的持续表达融合体底物。但是该底物需要由SUMO蛋白酶水解后，才能得到活性的抗菌肽CAD底物，而SUMO蛋白酶非常昂贵，所以我们采用让宿主菌经诱导产生SUMO蛋白酶的双顺反子表达体系。重组CAD基因工程菌发酵培养一定时间后，再经过诱导，诱导后培养一定时间，调整SUMO蛋白酶水解需要的适宜条件，抗菌肽CAD能够在枯草杆菌中获得高效分泌表达。
该系统解决了当前抗菌肽产业化的诸多问题：化学合成肽类成本太高，产业化困难；抗菌肽的抗菌、抗病毒能力使其难以用常用的细菌、病毒作表达体系，抗菌肽分子量较小且容易被蛋白酶水解，以及融合表达诱导物成本昂贵；分离纯化工艺复杂；基因表达产量不高。
本发明的有益效果为：
1.表达系统简单：本发明采用了抗菌肽CAD的重组枯草杆菌表达系统与SUMO融合表达体系，由于融合表达后得到的CAD-SUMO融合体底物不具有抗菌肽活性，因此不会对枯草杆菌宿主菌1A747产生毒害作用，因此可以使枯草杆菌持续表达，又不会抑制宿主细胞。
2.本发明可用于大规模生产：本发明采用枯草杆菌表达系统，相对于真核细胞表达系统和病毒表达系统具有生产条件和步骤简单，反应条件易于控制的优点，因此适用于大规模的生产。
3.生产成本低：本生产方法中的培养基价格低廉，生产所用设备为实验室常规设备，易于操作。
4.生物活性强，无毒害物质：本发明分泌的蛋白质浓度高，生物活性强。
附图说明：
图1：抗菌肽CAD的抑菌圈
图1(1)：重组枯草杆菌发酵液对大肠杆菌K88的抑菌圈，如1所示；
图1(2)：重组枯草杆菌发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈，如1所示；
图1(3)：重组枯草杆菌发酵液对沙门氏杆菌的抑菌圈，如1和2所示；
图1(4)：重组枯草杆菌发酵液对粪肠球菌的抑菌圈，如1、2和3所示；
图1(5)：重组枯草杆菌发酵液对粪链球菌的抑菌圈，如1、2和3所示。
图2：抗菌肽CAD的16％Tris-tricine SDS-PAGE分析
1：对照组：1A747上清冻干样品(0.25mg/ul)；
2：实验组：上清冻干样品(0.25mg/ul)；
3：MARK(KD)：分子量(20.100，14.400，7.823，5.856，3.313)；
具体实施方式：
实施例1
1.sumo蛋白酶的表达操纵子、酿酒酵母小分子泛素样蛋白与天蚕素AD的融合蛋白表达操纵子基因合成：
1)人工合成含编码sumo蛋白酶的表达操众子基因，
设计引物为：
F1：
CTTTTTTTTATACAAATCTTTCTGAAAGAGGCTATCAAGGCGTTAGAAGAT
GGATGAAA
R1：
TCAAGTTTATCAATTTGTGTTTTTTTTCTTTTCATCCATCTTCTAACGCCTT
GATAGCC
通过5轮PCR合成；
PCR反应体系为：引物对2μl(10μmol/L)；5μl dNTP Mixture(2.5m mol/L)；
5μl 10xBuffer；35.7μl无菌ddH2O；
PCR反应条件：94℃变性5min；缓慢降温到55℃；分别加入0.3μl PyrobestDNA聚合酶(5U/μl)；然后72℃延伸5min；
2)人工合成含编码酿酒酵母小分子泛素样蛋白与天蚕素AD的融合蛋白表达操纵子基因，
设计引物为：
F1：
CGATGGCGGCGCACATATTAATCTTAAAGTTAAAGGCCAAGATGGCAATGAAGTTTTT
R1：
TTTTAAGTTGTGTGCTTCTTTTAATTCTAAAAAAAACTTCATTGCCATCTTGGCCTTTA
通过5轮PCR合成；
PCR反应体系为：引物2μl(10μmol/L)，5μl dNTP Mixture(2.5m mol/L)；5μl10xBuffer；35.7μl无菌ddH2O；
PCR反应条件：94℃变性5分钟；缓慢降温到55℃；分别加入0.3μl PyrobestDNA聚合酶(5U/μl)；然后72℃延伸5分钟；
3)人工合成的两个片段连入pBluescriptII SK(+)载体：
将所述步骤1)中人工的基因片段用EcoRI和BamHI双酶切，将所述步骤2)中人工的基因片段用BamHI和SacI双酶切，构建入载体pBluescriptIISK(+)，构建成命名为D1778-1的质粒。
2.天蚕素AD母体基因枯草杆菌表达载体pNF11的构建；
提取枯草杆菌168菌株的基因组DNA，扩增出枯草杆菌的高效启动子p43，通过T载体克隆后测序得到完整的含启动子基因质粒，构建入质粒pGJ103，构建成重组质粒pGJ284；
质粒pGJ284和D1778-1分别用EcoR I与Sac I进行双酶切，回收酶切产物，将两个回收酶切产物用T4DNA连接酶在16℃水浴锅连接，构建成重组质粒pNF11；
其中PCR鉴定引物为：
F1：CGTTTGCGCTTGTTCCGGAAC
R1：CTGCCGGGCCTGCAGAAATAAC
PCR扩增体系：质粒pNF11模板2ul；
dNTP，2.5mmol/L，3ul；
LA taq聚合酶buffer，2.5ul；
F1，1.5ul；
R1，1.5ul；
LA taq聚合酶，0.3ul；
灭菌超纯水，14.2ul；
PCR反应条件：94℃预变性3分钟，进入PCR循环：94℃30秒，退火56℃30秒，72℃3分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟；扩增出1300bp片段。3.重组表达载体pNF11在感受态枯草杆菌1A747中的转化：
将感受态枯草杆菌1A74780μl，质粒pNF115μl相混合，转移至0.2cm电转杯，2500V、5ms电击，立即加入800ul预冷的枯草杆菌电转恢复培养基LBSPG，于37℃、200rpm恢复培养1小时，4500rpm离心集菌涂布于Cm5LB平板上，于37℃培养至单菌落出现，挑取阳性转化子培养提取质粒进行EcoRI、SacI双酶切及PCR鉴定；鉴定扩增出1300bp的克隆定义为pNF11-CAD1、pNF11-CAD2、pNF11-CAD3、pNF11-CAD4的阳性转化子。
4.重组枯草杆菌在摇瓶中的诱导表达：
将筛选得到的pNF11-CAD1、pNF11-CAD2、pNF11-CAD3、pNF11-CAD4的阳性转化子接种到25ml的LB培养基中，于32℃、200rpm的条件下振荡培养12小时至600nm波长处的吸光值(OD600)达到2～4，加质量百分比浓度为30％麦芽糖5ml，进行诱导表达；于32℃、250rpm的条件下振荡培养36小时后，调整pH至8.5、温度25℃培养12小时，10000rpm离心10分钟收集培养液上清，即为抗菌肽CAD。
实施例2
抗菌肽CAD抑菌活性的鉴定
采用标准琼脂孔穴扩散法，以大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌为实验菌株，将供试菌悬浮液(OD600＝0.2～0.3)20μl与55℃的LB固体培养基25ml混匀后平铺板待其凝固后，用灭过菌的打孔器(直径5mm)打孔，孔中滴加20μl待测的表达上清，在37℃培养12h。
大肠杆菌K88抑菌圈直径9.3mm直径的抑菌圈，杀菌活力X＝(9.3mm-2.3mm)/2＝3.5，杀菌效价(U/ml)＝7000U/ml；抑菌圈见图1(1)所示，同样表达条件下培养的1A747菌发酵液做抑菌圈阴性对照。
金黄色葡萄球菌：抑菌圈直径12.4mm直径的抑菌圈，杀菌活力X＝(12.4mm-2.3mm)/2＝5.05；杀菌效价(U/ml)＝11000U/ml；抑菌圈见图1(2)所示。
沙门氏杆菌：抑菌圈直径5.8mm直径的抑菌圈，杀菌活力X＝(5.8mm-2.3mm)/2＝1.75；杀菌效价(U/ml)＝3500U/ml；抑菌圈见图1(3)所示。
粪肠球菌：抑菌圈直径3.9mm直径的抑菌圈，杀菌活力X＝(3.9mm-2.3mm)/2＝0.8；杀菌效价(U/ml)＝1600U/ml；抑菌圈见图1(4)所示。
粪链球菌：抑菌圈直径6.1mm直径的抑菌圈，杀菌活力X＝(6.1mm-2.3mm)/2＝1.9；杀菌效价(U/ml)＝3800U/ml；抑菌圈见图1(5)所示。
实施例3
重组枯草杆菌所分泌抗菌肽CAD蛋白的Tris-tricine SDS-PAGE鉴定
发酵上清液经美国MILLIPORE截留分子量10KD的超滤管超滤，然后用截留分子量2000的透析袋透析，再经过冷冻干燥得到枯草杆菌表达产物CAD，用16％的Tricine-SDS-PAGE方法进行蛋白电泳分析及考马斯亮蓝G-250浓度测定。
1.16％的聚丙烯酰胺凝胶(分离胶+浓缩胶)制备
                  分离胶            浓缩胶
30％聚丙烯酰胺    3.3ml             0.63ml
水                2.09ml            1.6ml
胶缓冲液          2ml               0.75ml
尿素              2.16g             无
10％AP            0.1(单位)         0.05(单位)
TEMED             10ul              5ul
2.Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳试剂
10×阳极缓冲液pH8.9
Tris              242.28g
蒸馏水定容至      1000ml
10×阴极缓冲液pH8.25
Tris              121.1g
Tricine           179.16g
SDS               10g
蒸馏水定容至1000ml
胶缓冲液pH8.45
Tris              121.0g
SDS               1g
蒸馏水定容至1000ml
3.电泳
内槽加入阴极缓冲液，外槽加入阳极缓冲液，形成Tricine-SDS-PAGE电泳系统，用50v恒电压5个小时，考马斯亮兰染色，用甘油孵育，并用凝胶成像仪摄影。待溴酚兰指示剂离开凝胶，停止电泳，按常规方法剥胶脱色。见附图2。
结果表明，重组枯草杆菌能明显分泌表达出3.7KD左右的蛋白，与CAD蛋白的理论值一致。
薄层凝胶扫描分析电泳结果图，经band 5.0软件分析估测所分泌表达的蛋白可占菌体上清总蛋白的39.9％。
实施例4
重组枯草杆菌分泌抗菌肽CAD蛋白含量的确定(BCA蛋白定量测定法)
分别取同等条件发酵表达的重组枯草杆菌和1A747菌的发酵上清液，用美国MILLIPORE截留分子量10KD的超滤管超滤，而后用截留分子量2000的透析袋透析，按一定比例计算恢复到发酵液本身的蛋白含量测定。
表1BCA蛋白定量测定的标准曲线
Figure S2008101322581D00121
注：Y轴代表在562nm波长测量的吸光度值，X轴代表BSA的终浓度×100ug/ml。
BSA标准曲线回归方程：c＝-0.0456A+48.3(R＝0.9992，n＝3)，线性范围0-2000ug/ml。
通过BCA蛋白定量试剂盒测定，得到重组枯草杆菌目的蛋白抗菌肽CAD的分泌表达含量为1.08mg/ml。
序列表
<110>北京龙科方舟
<120>抗菌肽CAD在枯草杆菌中的分泌表达及重组枯草杆菌表达系统
<160>
<210>1
<211>747
<212>DNA
<213>人工序列
<220>747
<221>gene
<222>(1)..(747)
<400>1
atggtcagcatccgccgcagcttcgaagcgtatgtcgatgacatgaatatcattactgttctgattcctgctgaacaaa
aggaaatcatgcttgttccggaacttaatgaaaaagatgatgatcaagttcaaaaagcacttgcatctagagaaaatacaca
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<210>2
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>738
<221>gene
<222>(1)..(738)
<400>2
taaaaaaaacgctcacatgatgtgggcgttttttttatacaaaaaaacgcactgatttacaaaaccttaacattcggttc
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a
<210>3
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>59
<221>gene
<222>(1)..(59)
<400>3
cttttttttatacaaatctttctgaaagaggctatcaaggcgttagaagatggatgaaa
<210>4
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>59
<221>gene
<222>(1)..(59)
<400>4
tcaagtttatcaatttgtgttttttttcttttcatccatcttctaacgccttgatagcc
<210>5
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>58
<221>gene
<222>(1)..(58)
<400>5
cgatggcggcgcacatattaatcttaaagttaaaggccaagatggcaatgaagttttt
<210>6
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>59
<221>gene
<222>(1)..(59)
<400>6
ttttaagttgtgtgcttcttttaattctaaaaaaaacttcattgccatcttggccttta
<210>7
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>21
<221>gene
<222>(1)..(21)
<400>7
CGTTTGCGCTTGTTCCGGAAC
<210>8
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>22
<221>gene
<222>(1)..(22)
<400>8
cgtttgcgcttgttccggaac

Claims (3)

1.一种生产抗菌肽CAD的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：1)sumo蛋白酶的表达操纵子基因、酿酒酵母小分子泛素样蛋白和天蚕素AD的融合蛋白表达操纵子基因的合成，包括以下步骤：
a)人工合成编码sumo蛋白酶的表达操纵子基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；
b)人工合成编码酿酒酵母小分子泛素样蛋白和天蚕素AD的融合蛋白表达操纵子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
c)将所述步骤a)中人工的基因片段用EcoRI和BamHI双酶切，将所述步骤b)中人工的基因片段用BamHI和SacI双酶切，构建入载体pBluescriptII SK(+)，构建成命名为D1778-1的质粒；
2)天蚕素AD母体基因枯草杆菌表达载体pNF11的构建，包括以下步骤：
提取枯草杆菌168菌株的基因组DNA，扩增出枯草杆菌的高效启动子p43，通过T载体克隆后测序得到完整的含启动子基因质粒，构建入质粒pGJ103，构建成重组质粒pGJ284；
将质粒pGJ284和D1778-1分别用EcoRI和SacI进行双酶切，回收酶切产物，将两个回收酶切产物用T4 DNA连接酶在16℃水浴锅连接，构建成重组质粒pNF11；
3)重组表达载体pNF11在枯草杆菌1A747中的转化；
4)重组枯草杆菌在摇瓶中的诱导表达。
2.一种如权利要求1所述的生产抗菌肽CAD的方法，其特征在于所述步骤4)中重组枯草杆菌在摇瓶中的诱导表达包括下步骤：
将筛选得到的pNF11-CAD1、pNF11-CAD2、pNF11-CAD3、pNF11-CAD4的阳性转化子接种到25ml的LB培养基中，于32℃、200rpm的条件下振荡培养8～12小时至600nm波长处的吸光值达到2～4，加质量百分比浓度为30％麦芽糖5ml，进行诱导表达；于32℃、250rpm的条件下振荡培养24～36小时后，调整pH至8.5、温度25℃的条件下培养8～12小时，10000rpm离心10分钟收集培养液上清，即为抗菌肽CAD蛋白。
3.一种表达抗菌肽CAD的重组枯草杆菌表达载体，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏登记编号为CGMCC No.2373、由构建的重组质粒pNF11转化枯草杆菌1A747所得的阳性转化子。
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